Artykuł metodologiczny

Generowanie i różnicowanie ludzkich organoidalnych nabłonków węchowych z dorosłych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/70917

⸱

3 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Department of Otolaryngology, People's Hospital of Tibet Autonomous Region, 2The Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 3The Department of Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University, 4The Department of Otolaryngology, People's Hospital of Shannan City in Tibet Autonomous Region, 5The Upper Airways Research Laboratory, Department of Otolaryngology, Ghent University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje ustaloną metodę izolowania komórek prążkowitych węchowych z dorosłych ludzkich tkanek wiązki górnych łezowych w celu wygenerowania organoidów nabłonka węchowego. Zawiera również szczegółową strategię indukcji chemicznej, aby skłonić te organoidy do różnicowania się w dojrzałe, węchowe neurony czuciowe, umożliwiając modelowanie neurogenezy węchowej u ludzi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie nabłonek węchowe posiada niezwykłą zdolność neurogenezy, utrzymywaną przez rezydującą populację komórek macierzystych bazalnych; jednak stworzenie dynamicznego modelu in vitro, który wiernie odtworzyłby ten regeneracyjny proces, okazało się zaskarbione. Przedstawiamy tu ustalony protokół generowania organoidalnych struktur węchowych z komórek progenitorowych izolowanych z ludzkiego tkanki górnego koszyka. Te struktury zachowują komórkową tożsamość, co widać na podstawie ekspresji SOX2, i wykazują przestrzennie uporządkowany wzór różnicowania, charakteryzujący się jednorodną ekspresją niedojrzałego markera neuronów GAP43 i peryferyjną lokalizacją markera dojrzałych neuronów sensorycznych OMP. Następnie, ukierunkowana różnicowanie z inhibitorem Notch LY411575, aktywatorem Wnt CHIR-99021 i kwasem retinowym wygenerowało komórki przypominające neurony sensoryczne węchowe, które ekspresowały zarówno OMP jak i marker neuronowy Tuj1 (klasa III β-tubuliny). Ten opisany ludzki model omija ograniczenia systemów mysich i dostarcza solidnej platformy in vitro do badania neurogenezy węchowej, agenezji związanej z COVID-19 i innych neurodegeneracyjnych zaburzeń związanych z węchem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ węchowy człowieka wspiera ciągłą neurogenezę,1 proces napędzany głównie przez komórki macierzyste podstawne w nabłonku węchowym, a konkretnie komórki podstawne poziome (HBC) i komórki podstawne kuliste (GBC).2,3 GBC różnicują się staliście na czujniki węchowe (OSN), podczas gdy HBC pozostają w spoczynku aż do aktywacji przez uszkodzenie.4,5 Percepcja węchowa rozpoczyna się, gdy cząsteczki zapachowe wiążą się z receptorami na rzęskach OSN, wyzwalając kaskadę przekazywania sygnału, która przekazuje informacje do żarłacza węchowego i kory.6 Rozwój i utrzymanie tej funkcji zmysłowej są rządzone przez nabłonek węchowy.

Zaburzenie węchu spowodowane urazami fizycznymi, chemicznymi lub biologicznymi często ustępuje samoistnie.7 Niemniej jednak, dotyka ono 1,5% do 25% globalnej populacji8 i może wynikać z różnorodnych etiologii, w tym z traum,9 infekcji,10 i zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera i Parkinsona11; w tych przypadkach, samoistne powrót do zdrowia jest często niekompletny lub nieobecny. Obecne podejścia terapeutyczne, takie jak trening węchowy i podawanie kortykosteroidów, wykazują ograniczoną skuteczność.12,13 Ta luka terapeutyczna wynika z niekompletnego zrozumienia mechanizmów rządzących przetrwaniem i regeneracją neuroepitelium węchowego po uszkodzeniu, luka w wiedzy pogłębiona przez nieodpowiedni charakter istniejących modeli in vitro do badania biologii węchu człowieka.

W ostatnich latach rozwój różnorodnych modeli organoidów ludzkich stworzył nowe platformy technologiczne do badania chorób ludzkich.14 Organoidy pochodzące od komórek macierzystych dorosłych (AdSC), nazywane również komórkami macierzystymi tkankowymi, zostały z powodzeniem wygenerowane dla szerokiej gamy tkanek pochodzenia endodermalnego, w tym żołądka, wątroby, trzustki, płuc i pęcherza.15,16,17,18,19 W przeciwieństwie do tego, utworzenie organoidów nabłonka węchowego u ludzi z ektodermalnego zawiązka węchowego pozostaje technicznie trudne. Głównym wyzwaniem praktycznym jest trudność w konsekwentnym uzyskiwaniu żywego tkanki nabłonka węchowego z ludzkiego górnego rzepki. Lokalizacja i rozmiar obszaru węchowego znacznie się różnią wśród osób i podlegają wyraźnej związanej z wiekiem degeneracji. Przypadkowe pobranie nabłonka oddechowego zamiast węchowego kompromitują wyniki kultur. Aby temu zaradzić, doprecyzowaliśmy protokół z 2021 roku Ren i wsp., którzy z powodzeniem hodowali klastery komórek z ludzkiej błony śluzowej węchowej,20 aby niezawodnie generować ludzkie organoidy nabłonka węchowego. Nasze podejście generuje ludzkie organoidy nabłonka węchowego o trójwymiarowej, hierarchicznie zorganizowanej architekturze i wspiera ich różnicowanie na czujniki węchowe. Ten model zapewnia cenny eksperymentalny platformę do badania mechanizmów, które decydują o losie komórek macierzystych nabłonka węchowego i do przesiewania potencjalnych leków przeciw zaburzeniom węchowym.

Aby wyraźnie podsumować, głównym celem tej metody jest ustanowienie standaryzowanego przepływu pracy do generowania i różnicowania ludzkich organoidów nabłonka węchowego z dorosłych komórek przodujących. Uzasadnieniem tego podejścia jest uzupełnienie krytycznej luki spowodowane brakiem fizjologicznie istotnych modeli in vitro ludzkiego układu węchowego. W porównaniu z tradycyjnymi dwuwymiarowymi (2D) kulturami monowarstwowymi lub modelami mysimi, ten trójwymiarowy (3D), ludzki system pochodzenia oferuje wyraźną zaletę wiernego odwzorowania złożonej przestrzennej organizacji i ludzkiego specyficznego kontekstu genetycznego błony śluzowej węchowej. Aby badacze mogli rozważyć ten protokół, konieczne jest uznanie, że precyzyjne izolowane żywe nabłonka węchowego z ludzkiego górnego rzepki, unikając skażenia nabłonkiem oddechowym, jest wyjątkowo trudne i wysoce zależy od wieku pacjenta i indywidualnej różnorodności anatomicznej. W konsekwencji, ten protokół jest szczególnie dobrze przystosowany dla badaczy, którzy mają stały dostęp do ludzkich próbek klinicznych i pragną opracować model neurogenezy węchowej u ludzi, anosmii wywołanej wirusem lub niedoborów węchowych związanych z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badania przeprowadzono z uzyskaniem zgody Instytucjonalnej Komisji Bioetycznej (IRB) z West China Hospital of Sichuan University (Numer zgody 2024 (31)). Pisemną, świadomą zgodę na udział w badaniu uzyskaano od wszystkich uczestników przed pobraniem tkanki i opublikowaniem danych. Próbki tkanki górnego rzepki pobrane zostały od pacjentów poddawanych operacjom endoskopowym podstawy czaszki lub zatok sitowych z powodu wodorowęglowodanowego wycieku z nosa.

1. Przetwarzanie i transport próbek tkanki

  1. Natychmiast po pobraniu umieść próbki tkanki w wstępnie schłodzonym, sterylnym medium transportowym, składającym się z podłoża DMEM/F12/HEPES uzupełnionego o 10% fetalnego surowicy wołowej i 5% roztworu penicyliny i streptomycyny, i przetransportuj je do laboratorium w temperaturze 4 °C.
    ​UWAGA: Surowica pomaga zachować żywotność komórek, a mieszanina antybiotyków zapobiega potencjalnemu zakażeniu mikrobiologicznemu podczas transportu. Czas transportu powinien wynosić mniej niż 2 h, aby zachować żywotność komórek.

2. Wstępne przetwarzanie tkanki (przeprowadzone na lodzie)

  1. Przenieś próbkę do wstępnie schłodzonej, sterylnej kulturalki, usuń medium transportowe i przepłucz tkankę zmodyfikowanym buforem PBS zawierającym 5% roztworu penicyliny i streptomycyny. Przepłukiwanie przeprowadź w następujący sposób: dodaj 5 mL schłodzonego roztworu przepłuczającego do kulturalki, delikatnie potrząśnij tkanką 5-7 razy, a następnie całkowicie odsysz płyn. Powtórz cykl przepłukiwania 3 razy, aby usunąć krwinki i zanieczyszczenia tkankowe.
  2. Za pomocą sterylnych mikronożyczek pokroić tkankę na fragmenty o wielkości około 1-2 mm3.
    UWAGA: Podczas tego etapu należy zachować nawodnienie tkanki, mocno przytrzymać ją za pomocą tępo zakończonych kleszczyków i minimalizować czas krojenia, aby zachować żywotność komórek.

3. Trawienie enzymatyczne

  1. Przenieś mechanicznie rozdrobnioną tkankę do 15 mL probówki do wirówki i dodaj 3 mL wstępnie rozgrzanego (37 °C) buforu do trawienia złożonego (zawierającego 0,125% trypsyny i 10 U/mL DNAzy I), zachowując stosunek objętości enzymu do tkanki w proporcji 3:1. Inkubuj probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C z delikatnym mieszaniem przez 20 min. Co 5 min sprawdzaj próbkę, aby monitorować postęp trawienia i zapobiegać skupianie się tkanki.
  2. Zatrzymaj trawienie, dodając równą objętość roztworu kończącego, czyli podłoża DMEM/F12/HEPES uzupełnionego o 10% fetalnej surowicy wołowej. Delikatnie pipetuj mieszaninę w górę i w dół 10 razy, aby zapewnić całkowite wymieszanie i skuteczny kontakt enzymów z komponentami hamującymi.
    ​UWAGA: Alfa-1-antytrypsyna obecna w surowicy skutecznie neutralizuje aktywność trypsyny.

4. Przygotowanie pojedynczej zawiesiny komórkowej

  1. Umieść sitko komórkowe o średnicy 40 μm na szczycie 50 mL probówki do wirówki. Za pomocą przyciętego kończyka pipety 1 mL przenieś strawioną tkankę i płyn z 15 mL probówki na sitko. Delikatnie obracaj materiał na filtrze za pomocą kończyka pipety, aby ułatwić przejście, a następnie przepłucz sitko dodatkowymi 1-2 mL roztworu kończącego. Gdy cały płyn przejdzie przez sitko, przenieś filtrate z 50 mL probówki do nowej 15 mL probówki do wirówki.
  2. Wiruj zawiesinę przez 5 min w 300 x g w temperaturze 4 °C. Zauważ oddzielającą się zawiesinę komórek na dnie probówki i delikatnie odsysz nadstan, pozostawiając około 100 μL, aby uniknąć zaburzenia lub utraty zawiesiny komórek.

5. Ustanowienie trójwymiarowego układu kulturowego

  1. Bez ponownego zawieszania zawiesiny komórek w podłożu kulturowym, bezpośrednio połącz ją z Matrigel przy użyciu wstępnie schłodzonego kończyka pipety o niskim poziomie wiązania, aby uzyskać precyzyjną gęstość 10 000 komórek/μL. Rozdaj 40 μL tej mieszanki komórek i Matrigel do każdej kultówki 24-kultkowej płytki i 20 μL do każdej szklanej dna kultówki konfokalnej. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 30 min, aby pozwolić na polimerizację Matrigel i utworzenie trójwymiarowej podstawy.
  2. Po zestaleniu się Matrigel delikatnie dodaj 500 μL surowicy wolnego środowiska kulturowego komórek macierzystych nerwowych z narządu węchu wzdłuż ścianki kultówki, aby uniknąć zakłócenia żelu. Utrzymuj kultury w inkubatorze o wilgotności 37 °C z 5% CO₂, wymieniając medium co 3 dni na świeże, wstępnie rozgr

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja tkanki nabłonka węchowego i hodowlę pierwotnych organoidalnych nabłonka węchowego
Aby ustanowić system hodowli organoidalnych nabłonka węchowego, izolowaliśmy nabłonek węchowy z ludzkiej tkanki skorupy górnej i osadziliśmy go w trójwymiarowej matrycy Matrigel (Rysunek 1). Korzystając z określonych warunków hodowli zgłoszonych przez Ren et al., zweryfikowaliśmy i doprecyzowaliśmy stężenia kluczowych czynników wzrostowych, EGF, Noggin, Wnt3a i R-pondin 1, wraz z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy reprezentują unikalny in vitro model, ponieważ ich samoorganizująca się, trójwymiarowa architektura w bliski sposób naśladuje strukturę ludzkich tkanek i w niektórych przypadkach może być histologicznie nieodróżnialna od rzeczywistych narządów.14 Stworzenie ludzkich modeli organoidów jest zatem kluczowe dla badań nad chorobami ludzkimi. Przedstawiamy tutaj protokół generowania systemu kultury organoidalnej z pierwotnych ludzkich komórek nabłonka węchowego, która niezawodnie różn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zadeklarowania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy szczerze dziękują wszystkim pacjentom, którzy hojnie przekazali próbki tkanki łechątki górnej, niniejsze badanie nie byłoby możliwe bez ich wkładu. Wsparcie finansowe na badania, autorstwo i/lub publikację tego artykułu zostało otrzymane. Praca ta była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Ba L: 82160209 i 82460217), Specjalny Fundusz Współpracy Naukowo-Technologicznej między Uniwersytetem Syczuańskim a Rządem Miasta Zigong (Yang H: 2023CDZG-18) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych Tybetańskiego Regionu Autonomicznego (Cong TC: XZ2023ZR-ZY10(Z)).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ALEXA FLUOR 488 DONKEYThermoA110551:500
ALEXA FLUOR 555 DONKEYThermoA315721:500
Anti-GAP43 antibodyAbcamab75810 1:160
Anti-OMP antibodySANTA CRUZsc-3658181:50
Anti-Sox-2 antibodySANTA CRUZsc-3658231:50
B-27 SupplementGibco175040442%
CHIR99021NovoproteinHY-101823 μM
DMEM/F12/HEPESProcellPM150310/
Glutamax (L-glutamine supplement)Gibco350500611%
LY411575NovoproteinHY-507525 μM
Matrigel (basement membrane matrix)Corning3562314% (Vol/Vol)
N-2 SupplementGibco175020481%
Organoid Dissociation ReagentPrecedoPRS-ODR/
Organoid Recovery SolutionThewellbioMS04-100/
Primocin (primary antimicrobial agent)Invivogenant-pm-05100 μg/mL
Recombinant Human EGFNovoproteinC02950 ng/mL
Recombinant Human NogginNovoproteinCB89100 ng/mL
Recombinant Human RSPO1NovoproteinCX83200 ng/mL
Recombinant Human Wnt3aNovoproteinC18K50 ng/mL
Retinoic acidMCEHY-146491 μM
Y27632MCEHY-1007110 μM

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hummel, T., et al. Olfactory dysfunction: etiology, diagnosis, and treatment. Dtsch Arztebl Int. 120 (9), 146-154 (2023).
  2. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
  3. Peterson, J., et al. Activating a reserve neural stem cell population in vitro enables engraftment and multipotency after transplantation. Stem Cell Rep. 12 (4), 680-695 (2019).
  4. Schnittke, N., et al. Transcription factor p63 controls the reserve status but not the stemness of horizontal basal cells in the olfactory epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (36), E5068-E5077 (2015).
  5. Schwob, J. E., et al. Stem and progenitor cells of the mammalian olfactory epithelium: taking poietic license. J Comp Neurol. 525 (4), 1034-1054 (2017).
  6. Takeuchi, H. Olfactory cilia, regulation and control of olfaction. Physiol Rep. 12 (19), e70057 (2024).
  7. Lin, B., et al. Injury induces endogenous reprogramming and dedifferentiation of neuronal progenitors to multipotency. Cell Stem Cell. 21 (6), 761-774.e5 (2017).
  8. Huang, T., Wei, Y., Wu, D. Effects of olfactory training on posttraumatic olfactory dysfunction: a systematic review and meta-analysis. Int Forum Allergy Rhinol. 11 (7), 1102-1112 (2021).
  9. Hura, N., et al. Treatment of post-viral olfactory dysfunction: an evidence-based review with recommendations. Int Forum Allergy Rhinol. 10 (9), 1065-1086 (2020).
  10. Doty, R. L. Olfactory dysfunction in neurodegenerative diseases: is there a common pathological substrate?. Lancet Neurol. 16 (6), 478-488 (2017).
  11. Patel, Z. M., et al. International consensus statement on allergy and rhinology: olfaction. Int Forum Allergy Rhinol. 12 (4), 327-680 (2022).
  12. Liu, J., et al. A novel surgical treatment for long lasting unilateral peripheral parosmia: olfactory cleft blocking technique. Auris Nasus Larynx. 48 (6), 1209-1213 (2021).
  13. Seo, B. S., et al. Treatment of postviral olfactory loss with glucocorticoids, ginkgo biloba, and mometasone nasal spray. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135 (10), 1000 (2009).
  14. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  15. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528.e17 (2018).
  16. Loomans, C. J. M., et al. Expansion of adult human pancreatic tissue yields organoids harboring progenitor cells with endocrine differentiation potential. Stem Cell Rep. 10 (3), 712-724 (2018).
  17. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  18. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  19. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136.e6 (2015).
  20. Ren, W., et al. Expansion of murine and human olfactory epithelium/mucosa colonies and generation of mature olfactory sensory neurons under chemically defined conditions. Theranostics. 11 (2), 684-699 (2021).
  21. Li, X., et al. Age-dependent activation and neuronal differentiation of Lgr5+ basal cells in injured olfactory epithelium via notch signaling pathway. Front Aging Neurosci. 12, 602688 (2020).
  22. Dai, Q., et al. Notch signaling regulates Lgr5+ olfactory epithelium progenitor/stem cell turnover and mediates recovery of lesioned olfactory epithelium in mouse model. Stem Cells. 36 (8), 1259-1272 (2018).
  23. Wang, L., et al. Chitinase-like protein Ym2 (Chil4) regulates regeneration of the olfactory epithelium via interaction with inflammation. J Neurosci. 41 (26), 5620-5637 (2021).
  24. Ma, Z., et al. TMEM59 ablation leads to loss of olfactory sensory neurons and impairs olfactory functions via interaction with inflammation. Brain Behav Immun. 111, 151-168 (2023).
  25. Li, W., et al. A single-cell transcriptomic census of mammalian olfactory epithelium aging. Dev Cell. 59 (22), 3043-3058.e8 (2024).
  26. Chen, Z. H., et al. Matrix metalloprotease-mediated cleavage of neural glial-related cell adhesion molecules activates quiescent olfactory stem cells via EGFR. Mol Cell Neurosci. 108, 103552 (2020).
  27. Shechtman, L. A., et al. Generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells. J Vis Exp. (170), e62300 (2021).
  28. Liu, M., et al. Multimodal spatiotemporal monitoring of basal stem cell-derived organoids reveals progression of olfactory dysfunction in Alzheimer’s disease. Biosens Bioelectron. 246, 115832 (2024).
  29. Abranches, E., et al. Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo. PLoS One. 4 (7), e6286 (2009).
  30. McLean, W. J., et al. Clonal expansion of Lgr5-positive cells from mammalian cochlea and high-purity generation of sensory hair cells. Cell Rep. 18 (8), 1917-1929 (2017).
  31. Freemantle, S. J., et al. Developmentally-related candidate retinoic acid target genes regulated early during neuronal differentiation of human embryonal carcinoma. Oncogene. 21 (18), 2880-2889 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organoidy w choweludzkie kom rki macierzystenab onek w chowyr nicowanie organoid wkom rki macierzyste podstawoweizolacja kom rek progenitorowychekspresja SOX2neurony sensoryczne w chur nicowanie inhibitorem Notchmodel neurogenezy

Powiązane artykuły