Nowela połączenia przeciwutleniaczy do przywrócenia zdrowej komunikacji międzykomórkowej w modelu in vitro przy użyciu pożywki warunkowej z komórek starzejących się

Podsumowanie

Ta metoda bada, jak senny fibroblast skóry wpływa na zdrowe. Starzenie jest indukowane poprzez ekspozycję na UVB, a uodparniony medium jest stosowany na normalne fibroblasty. Pomaga to ocenić aktywne biologicznie związki, które mają na celu zmienioną komunikację między komórkami w starzeniu się skóry.

Streszczenie

Starzenie się skóry to wieloczynnikowy proces napędzany zmianami na poziomie molekularnym i komórkowym, znanym również jako cechy starzenia się. Jedna z tych zmian polega na zmienionej komunikacji międzykomórkowej, która przyczynia się do dysfunkcji tkanki skóry i uszkodzeń strukturalnych. Przedstawiono tutaj in vitro model naśladujący te cechy starzenia się skóry poprzez inkubację zdrowych fibroblastów z warunkowanym medium z senescencyjnych fibroblastów. Po pierwsze, fibroblasty napromieniowane UVB mogą być analizowane pod kątem zmian w ekspresji genów związanych ze starzeniem się skóry wywołanym promieniowaniem. Po drugie, warunkowe medium z fibroblastów senescencyjnych wywołanych UVB może być zebrane i przeniesione do zdrowych fibroblastów, co prowadzi do downregulacji białek macierzy zewnątrzkomórkowej i upregulacji ekspresji genów cytokin prozapalnych. Te zmiany są przeciwdziałane poprzez stosowanie nowej kombinacji przeciwutleniaczy (witamina C + idebenon). Te wyniki pokazują, że model in vitro może być wykorzystany do oceny skuteczności nowych związków na cechy starzenia się komórek skóry w warstwie skóry właściwej, a tym samym do wyboru związków, które mogą modyfikować procesy komórkowe regeneracji i odmładzania skóry.

Wprowadzenie

Starzenie się skóry to naturalny proces zmniejszenia funkcji i właściwości skóry, w tym utraty jędrności i elastyczności oraz zwiększonego obwisania. Jest to przyspieszane przez czynniki zewnętrzne, takie jak ekspozycja na promieniowanie ultrafioletowe (UV) i zanieczyszczenia, które uszkadzają komórki i powodują zmiany na poziomie molekularnym¹. Zmiany te zostały dobrze scharakteryzowane przez ostatnie badania i zidentyfikowane jako znamiona starzenia się, w tym niestabilność genomowa, zużycie telomerów, zmiany epigenetyczne, utrata proteostazy, defektywna makroautofagia, deregulowany zmysł odczuwania składników odżywczych, dysfunkcja mitochondrialna, senescencja komórkowa, wyczerpanie komórek macierzystych, zmieniona komunikacja międzykomórkowa, przewlekła zapalność i dysbioza². Te cechy wyjaśniają, jak uszkodzenie subkomórkowe przekłada się na dysfunkcję tkankową, sprzyjając w ten sposób procesowi starzenia się. Co ciekawe, te zmiany nie działają niezależnie, ale raczej tworzą współzależną sieć. Pierwotne uszkodzenie, takie jak uszkodzenie genomowe lub zmiany epigenetyczne, gromadzi się i ostatecznie powoduje starzenie się komórek. W przypadku skóry jest to głównie spowodowane uszkodzeniem UV, przy czym fotostarzenie jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do cech starzenia się skóry³. Komórki senescencyjne wykazują zwiększoną produkcję cytokin prozapalnych, metaloproteaz macierzy pozakomórkowej i czynników wzrostu, co jest również znane jako fenotyp sekrecyjny związany z senescencją (SASP) i obejmuje IL6, IL8, MMP1, MMP3, TNFA lub IL1A, między innymi^4,5,6. Te wydzielane czynniki nie tylko wpływają na właściwości strukturalne skóry, takie jak dermalna macierz pozakomórkowa, ale także zakłócają funkcjonowanie komórek otaczających. Obejmuje to uwalnianie cytokin, które stymulują aktywację melanocytów, aby wywołać przebarwienia skóry związane z wiekiem (takie jak czynnik komórek macierzystych lub IL18) lub inne uszkadzające białka, które zmieniają funkcję otaczających zdrowych fibroblastów, kompromitując ich funkcję i przyczyniając się do zwiększonego wzmocnienia fenotypu senescencyjnego^7,8,9,10,11. W rezultacie przewlekła zapalność i zmieniona komunikacja międzykomórkowa są kluczowymi promotorami stanu uszkodzeń, które przekładają te molekularne zmiany na wizualne oznaki starzenia się skóry, takie jak zmarszczki, obwisłość, plamy starcze lub utrata jędrności.

Swoiste białka przyczyniające się do szkodliwych efektów SASP można badać za pomocą dobrze znanych technik, takich jak immunosorbencyjny test enzymatyczny (ELISA), Luminex, ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) lub Western Blot, między innymi^5,12. Jednakże, to podejście jest przydatne do identyfikacji określonych białek z perspektywy indywidualnej i charakteryzacji konkretnego mechanizmu działania, ale nie uwzględnia efektów pełnego SASP na komórki otaczające. W związku z tym proponowany jest in vitro protokół do badania wpływu SASP wytwarzanego przez fibroblasty skóry senescencyjnej indukowane UVB na zdrowe sąsiednie fibroblasty, naśladując zmienioną cechę komunikacji międzykomórkowej związaną ze starzeniem się. Jak wspomniano wcześniej, UV jest głównym czynnikiem senescencji komórkowej w skórze. Dlatego też uszkodzenie UV jest wybierane jako źródło uszkodzeń nad senescencją replikatywną lub indukowaną onkogenem, aby zbudować obecny model³. W tym celu stosuje się medium zawierające czynniki wydzielane przez fibroblasty senescencyjne (medium warunkowe), a markery funkcji komórkowej są ilościowo określane w zdrowych fibroblastach inkubaowanych z tym medium. Zgodnie z tym protokołem, po przeniesieniu medium warunkowego z komórek senescencyjnych do zdrowych, fibroblasty senescencyjne indukowane UVB są zbierane do ilościowego określenia cech molekularnych, takich jak geny zaangażowane w sygnalizację prozapalną i parakrynową. Po drugie, zdrowe fibroblasty traktowane medium warunkowym z fibroblastów senescencyjnych są zbierane w celu scharakteryzowania wpływu SASP na komórki otaczające, ilościowo określając geny zaangażowane w macierz pozakomórkową, czynniki wzrostu i aktywację fibroblastów. W ten sposób efekt substancji o zainteresowaniu (COI) jest analizowany zarówno początkowo w fibroblastach senescencyjnych, jak i następnie w zdrowych fibroblastach traktowanych medium warunkowym. Jeśli chodzi o te związki, wcześniejsze badania wykazały, że antyoksydanty są skuteczne w ochronie przed i korygowaniu oznak starzenia się skóry indukowanego fotostarzeniem. W związku z tym, kombinacja dwóch antyoksydantów (witamina C i idebenon) jest wykorzystywana do odwrócenia niektórych zmian wywołanych przez UVB, zarówno w komórkach senescencyjnych, jak i zdrowych komórkach inkubaowanych z medium warunkowym z komórek senescencyjnych^13,14,15

Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół został zaprojektowany, a

Protokół

Fibroblaty ludzkie pochodzenia skóry wykorzystane w tym badaniu zostały uzyskane od komercyjnego dostawcy linii komórkowych. Ponieważ nie były zaangażowane żadne pierwotne próbki ludzkie, dane pacjenta lub eksperymenty in vivo, zatwierdzenie Instytucjonalnej Rady ds. Przeglądu (IRB) i zgoda na udział w badaniu nie były wymagane w tym badaniu.

1. Indukcja starzenia w fibroblastach skóry za pomocą UVB

1. Rozdać fibroblasty ludzkie w pojemnikach o gęstości 6 × 10⁴ komórek na studzienkę w płytce 6-studzienkowej, używając pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej o 10% fetalnego surowicy wołowej (FBS).
2. Po 24 h usunąć pożywkę kultury komórkowej i zastąpić ją 1 ml buforu fosforanowego (PBS) na studzienkę.
3. Napromieniować komórki światłem UVB przy 25 mJ/cm².
   UWAGA: Ta energia została zoptymalizowana dla urządzenia do napromieniowywania UVB użytego w tym protokole (patrz Tabela Materiałów), aby wywołać wystarczające uszkodzenie, aby wywołać starzenie, jednocześnie unikając nadmiernego uszkodzenia, które może prowadzić do apoptozy. Przy użyciu innych urządzeń dostosować energię napromieniowania odpowiednio.
   UWAGA: Promieniowanie UVB jest niebezpieczne. Stosować odpowiednie wyposażenie ochronne i osłony, aby uniknąć narażenia.
4. Usunąć PBS i dodać 2 ml świeżej pożywki kultury komórkowej na studzienkę.
5. Po 72 h usunąć pożywkę kultury komórkowej, dodać 1 ml PBS na studzienkę i powtórzyć napromieniowywanie UVB zgodnie z opisem w kroku 1.3.
6. Po 72 h usunąć pożywkę kultury komórkowej i dodać 0,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA na studzienkę. Inkuować przez 1–2 min. w 37 °C, następnie zebrać komórki za pomocą 1,5 ml świeżej pożywki kultury komórkowej.
7. Rozdać komórki w pojemnikach o gęstości 8 × 10⁴ komórek na studzienkę w płytce 6-studzienkowej, używając pożywki kultury komórkowej (DMEM uzupełnione o 10% FBS). Starzenie komórkowe jest indukowane po tym kroku.

2. Leczenie starzejących się komórek związkami o zainteresowaniu

1. Po 24 h usunąć pożywkę kultury komórkowej i dodać 2 ml pożywki kultury komórkowej zawierającej związki o zainteresowaniu.
2. Po kolejnych 24 h, rozdać osobną partię fibroblastów ludzkich skóry (jak opisano w kroku 1.1) w płytkach 6-studzienkowych. Te komórki posłużą jako zdrowe fibroblasty skóry do transferu pożywki warunkowej.

3. Transfer pożywki warunkowej od starzejących się komórek do zdrowych komórek

1. Po 48 h od leczenia związkami starzejących się komórek i 24 h od zasiewu zdrowych fibroblastów, zebrać 2 ml pożywki warunkowej na studzienkę od starzejących się komórek i przenieść ją do zdrowych fibroblastów.
   UWAGA: Natychmiast usunąć pożywkę kultury z zdrowych fibroblastów przed dodaniem pożywki warunkowej, aby zapewnić efektywny transfer.
2. Dodać 1 ml PBS do starzejących się komórek i zebrać je za pomocą trypsyny zgodnie z opisem w kroku 1.6. Użyć tych komórek do analizy markerów starzenia lub stanu zapalnego za pomocą zestawu ELISA lub qPCR.
   UWAGA: Pellety komórkowe można przechowywać w temperaturze -80 °C, jeśli nie są wykonywane natychmiastowe dalsze analizy.
3. Inkubować zdrowe fibroblasty otrzymywające pożywkę warunkową w 37 °C z 5% CO₂ przez 24 h.

4. Zebranie zdrowych komórek do analizy aktywacji fibroblastów za pomocą analizy ekspresji genów

1. Po 24 h inkubacji z pożywką warunkową, zebrać zdrowe fibroblasty za pomocą trypsyny zgodnie z opisem w kroku 1.6. Przeprowadzić analizę ekspresji genów macierzy pozakomórkowej za pomocą qPCR.
2. Przeprowadzić analizę qPCR.
   1. Ekstrakować RNA z pelletów komórkowych zgodnie z instrukcjami producenta (zestaw do ekstrakcji RNA).
   2. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję 200 ng RNA zgodnie z instrukcjami producenta (zestaw odwrotnej transkrypcji).
   3. Amplifikację cDNA zgodnie z instrukcjami producenta (miks qPCR). Przeprowadzić qPCR w następujących warunkach: 95 °C przez 30 s, następnie 40 cykli po 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 30 s. Użyte primery są wymienione w Tabeli 1.

Gen	Sekwencja do przodu	Sekwencja do tyłu
CDKN2A	5’-GGCATTGTGAGCAACCACTG-3’	5’-CCTGTAGGACCTTCGGTGAC-3&#

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje metodę symulacji zmienionej komunikacji międzylkomórkowej, charakterystycznej dla procesu starzenia się, in vitro. Rycina 1 przedstawia schemat graficzny ilustrujący główne etapy protokołu, w tym indukcję starzenia komórkowego, ilościowe oznaczanie markerów oraz analizę zaburzonej komunikacji międzylkomórkowej w komórkach skóry in vitro.

Dyskusja

Zrozumienie procesu starzenia na poziomie molekularnym jest kluczowym elementem w opracowywaniu nowych podejść i interwencji, które opóźniają cechy związane ze starzeniem i przedłużają długowieczność oraz działanie komórek i tkanek. Definicja i identyfikacja cech charakterystycznych starzenia się były niezbędne do ustanowienia naukowej ramy dla rozwoju tych interwencji^2,16. Wśród rozpoznanych cech charakterystycznych starzenia się, zaburzona komunikacja międzykom...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
6-well plates	Fisher Scientific	10578911	Cell culture multiwell plates to use during the assay (senescence induction and compound treatment)
Bio-LINK Crosslinker BLX-312/36 (UVB irradiation device)	Vilber Lourmat	VL-6111-1090-1	Urządzenie używane do wywoływania uszkodzeń poprzez napromieniowanie UVB i w konsekwencji indukcji starzenia
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Merck Life science	D6046-500ML	Standardowe medium do hodowli komórek dla fibroblastów skóry
Fetal bovine serum (FBS)	Fisher Scientific	17593595	Suppelementt żywnościowy używany jako źródło czynników wzrostu, hormonów, białek i niezbędnych mikroelementów dla wzrostu komórek
H3K27me3 ELISA kit	Epigentek	P-3014T-096	Swoiste badanie immunologiczne do wykrywania modyfikacji epigenetycznych H3K27me3 w próbkach biologicznych
Human dermal fibroblasts	Promocell	C-12302	Główna komórka skóry w skórze właściwej i regulator starzenia skóry pod wpływem światła
Phosphate buffered saline (PBS)	Merck Life science	D8537-500ML	Roztwór buforowy naśladujący środowisko fizjologiczne. Stosowany do płukania komórek bez wywoływania stresu lub obniżania żywotności komórek
PrimeScript RT reagent kit (reverse transcription kit)	Takara Bio	RR037A	Zestaw do uzyskania cDNA z RNA izolowanego z komórek. 2. krok dla badania qPCR po oczyszczeniu RNA.
TB Green Premix Ex Taq  (qPCR master mix)	Takara Bio	RR420A	Zestaw do wytwarzania reakcji łańcuchowej polimerazy z cDNA w celu ilościowego określania poziomów ekspresji genów. 3. krok dla badania qPCR po odwróceniu transkrypcji.
Total RNA Purification Kit (RNA extraction kit)	Norgen	17200	Zestaw do uzyskania RNA z komórek po zebraniu. 1. krok dla badania qPCR po zebraniu komórek.
Trypsin/EDTA 0.05%	Merck Life science	T2601-100ML	Roztwór enzymatyczny stosowany w krokach zbioru/przeszczepu w celu oderwania komórek z płytek hodowlanych