Propentofyllina łagodzi hiperalgezję po nacięciu poprzez regulację fosforylacji ERK1/2 w astrocytach i mikrogleju rdzenia kręgowego

Podsumowanie

Niniejsze badanie ocenia wpływ propentofiliny podanej dokanałowo na łagodzenie hiperalgezji po nacięciu oraz sprawdza, czy efekt ten wiąże się ze zmianami markerów glejowych w rdzeniu kręgowym i fosforylacją kinazy 1 i 2 regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym u szczurów.

Streszczenie

Astrocyty rdzenia kręgowego, mikroglej oraz kinaza regulowana sygnałami zewnątrzkomórkowymi 1 i 2 (ERK1/2) są zaangażowane w przetwarzanie bólu. Niniejsze badanie miało na celu sprawdzenie, czy przedoperacyjne dostarczenie propentofylliny (PPF) drogą dokanałową łagodzi ostrą hiperalgezję po nacięciu u szczurów oraz czy efekt ten wiąże się z markerami gleju rdzeniowego i fosforylacją ERK1/2. Sześćdziesiąt sześć samców szczurów linii Sprague–Dawley randomly przydzielono do grup: kontrolnej (blank), bólu po nacięciu, soli fizjologicznej, dimetylosulfoksydu, PPF oraz U0126. Hiperalgezję mechaniczną i termiczną oceniano w punkcie wyjściowym oraz 2, 4, 8, 24 i 72 h po nacięciu. Markery neuronalne i glejowe rdzenia kręgowego, p-ERK1/2 oraz mediatory stanu zapalnego oceniano za pomocą metody Western blotting i immunofluorescencji. Dodatkowo przeprowadzono doświadczenia na pierwotnych astrocytach rdzenia kręgowego, aby zbadać zależne od ERK1/2 uwalnianie mediatorów zapalnych. Przedoperacyjna podaż dokanałowa PPF łagodziła hiperalgezję mechaniczną i termiczną przez cały 72-godzinny okres obserwacji, podczas gdy U0126 łagodziło hiperalgezję głównie we wczesnej fazie po nacięciu. W 4 h po nacięciu obie terapie wiązały się ze zmniejszoną ekspresją GFAP, Iba-1 i p-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym oraz zmniejszoną immunoreaktywnością TNF-α i COX-2. W hodowlanych astrocytach PPF redukowała indukowane LPS uwalnianie mediatorów zapalnych, natomiast konstytutywnie aktywna ERK1/2 osłabiała ten efekt. Wyniki te potwierdzają związek między efektem antyhiperalgetycznym PPF a modulacją odpowiedzi glejowej, związanej z ERK1/2 oraz odpowiedzi zapalnej w rdzeniu kręgowym po nacięciu.

Wprowadzenie

Ból pooperacyjny, częsty rodzaj ostrego bólu występujący po zabiegach chirurgicznych, zazwyczaj nie utrzymuje się dłużej niż 7 dni, lecz charakteryzuje się złożonymi mechanizmami patologicznymi, które różnią się od mechanizmów bólu zapalnego i neuropatycznego^1,2. Jeśli ból pooperacyjny nie jest odpowiednio kontrolowany w fazie jego rozwoju, może on przejść w zespół bólu przewlekłego, a jego charakter może zmienić się z bólu związanego z ostrym uszkodzeniem tkanek na ból neuropatyczny lub mieszany³. Zazwyczaj najpowszechniejszą formą analgezji po nacięciu jest podawanie leków przeciwbólowych, takich jak opioidy i niesteroidowe leki przeciwzapalne. Jednak ciągłe stosowanie tych leków lub podawanie ich w wysokich dawkach może powodować wiele skutków ubocznych, co podkreśla potrzebę opracowania bezpieczniejszych i skuteczniejszych strategii przeciwbólowych.

Niezawodne dowody wskazują, że propentofyllina (PPF) łagodzi hiperalgezję w różnych procesach bólowych^4,5. Co więcej, efekt przeciwbólowy PPF może być częściowo osiągnięty poprzez hamowanie ekspresji rdzeniowej kinaz białkowych aktywowanych mitogenem (MAPK), takich jak p38 oraz kinazy c-Jun N-końcowe (JNK)⁶. Choć wpływ PPF na szlaki p38 i JNK został ustalony, jej potencjalna modulacja szlaku kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym 1 i 2 (ERK1/2), kolejnej kluczowej podrodziny MAPK zaangażowanej w przesyłanie sygnałów bólowych, pozostaje nie zbadana w przypadku ostrego bólu po nacięciu. Ta luka w wiedzy jest szczególnie istotna, biorąc pod uwagę, że aktywacja ERK1/2 wykazuje odmienne wzorce czasowe i komórkowe w porównaniu z p38 i JNK, co sugeruje potencjalnie unikalne możliwości terapeutyczne.

Pierwotnie uważano, że komórki glejowe, w tym astrocyty, mikroglej i oligodendrocyty, stanowią jedynie strukturę łączną i wspierającą tkankę nerwową. Jednakże najnowsze badania wykazały, że astrocyty i mikroglej odgrywają istotną rolę w regulacji plastyczności synaptycznej oraz przekazywaniu informacji o bólu⁷. Jako rezydentne makrofagi mózgu i rdzenia kręgowego, mikroglej może być aktywowany przez szereg sygnałów stymulujących z zewnątrz na bardzo wczesnym etapie procesu bólowego, a następnie proliferować i uwalniać duże ilości cytokin zapalnych, co zwiększa przewodzenie sygnałów bólowych z rdzenia kręgowego do mózgu^8,9. Jednocześnie aktywowane astrocyty mogą zwiększać uwalnianie pobudzającego neuroprzekaźnika glutaminianu i przesyłać informacje bezpośrednio do neuronów sensorycznych poprzez wzmacnianie komunikacji międzykomórkowej¹⁰.

Badania wykazały, że aktywacja astrocytów występuje we wczesnym stadium (w ciągu pierwszych 24 h) bólu wywołanego nacięciem, podczas gdy aktywacja mikrogleju pojawia się znacznie później^11,12. Dodatkowo jedno badanie wskazało, że aktywowany mikroglej ma ograniczony wpływ na hiperalgezję mechaniczną w bólu wywołanym nacięciem¹³. Wyniki te podkreślają nierozstrzygnięte kwestie dotyczące odmiennych ról astrocytów i mikrogleju w ostrym bólu. Doniesiono, że propentofyllina, środek modulujący glej, łagodzi hiperalgezję poprzez regulację aktywacji astrocytów i mikrogleju po chronicznym uciśnięciu nerwu, ostrym uszkodzeniu nerwu oraz ostrym uszkodzeniu tkanek^4,5. Jednakże, według obecnej wiedzy, żadne badanie nie analizowało wpływu PPF na aktywację astrocytów lub mikrogleju w ostrym bólu wywołanym nacięciem.

Zewnątrzkomórkowa sygnale-regulowana kinaza 1 i 2, główna podrodzina MAPK aktywowana w szlaku sygnałowym za kinazą białkową aktywowaną mitogenami 1 i 2 (MEK1/2), jest szeroko wiązana z procesami nocyceptywnymi oraz plastycznością neuronalną^14,15. Wcześniejsze badania wykazały, że p-ERK1/2 (fosfo-ERK1/2) może być indukowane w neuronach rdzeniowych przez stymulację nocyceptywną, a także może być wykrywane w astrocytach i mikrogleju w stanach bólu zapalnego lub neuropatycznego^16,17,18,19. Ponadto zgłoszono, że farmakologiczne hamowanie sygnalizacji MEK1/2–ERK1/2 łagodzi hiperalgezję mechaniczną i termiczną w kilku modelach bólu^{20,21,22,23,24,25}.

Jednakże rozkład komórkowy rdzeniowego ERK1/2, szczególnie w astrocytach i mikrogleju, aktywowanego przez ostre nacięcie, oraz jego rola w bólu wywołanym nacięciem pozostają niewystarczająco zdefiniowane. Poprzednie badania grupy badawczej wskazują, że PPF łagodzi ostrą hiperalgezję po nacięciu u szczurów poprzez redukcję rdzeniowego sygnalizowania JNK i p38, lecz nie jest jasne, czy PPF moduluje również sygnalizację związaną z ERK1/2 w rdzeniowych komórkach glejowych podczas bólu wywołanego nacięciem. W związku z tym niniejsze badanie należy uznać za rozszerzenie istniejących ram dotyczących gleju i MAPK w badaniach nad bólem, a nie za całkowicie niezależny paradygmat mechanistyczny. Jego główna odrębność od wcześniejszych prac polega na skupieniu się konkretnie na ostrym bólu po nacięciu, badaniu ERK1/2 zamiast p38/JNK jako interesującego komponentu MAPK oraz ocenie wczesnego rdzeniowego rozkładu komórkowego p-ERK1/2 w relacji do leczenia PPF.

Celem niniejszej pracy było zbadanie, czy przedoperacyjne podanie PPF drogą dokanałową łagodzi hiperalgezję po nacięciu w szczurzym modelu nacięcia podeszwy stopy oraz czy efekt ten jest powiązany z fosforylacją ERK1/2 lub zmianami w ekspresji rdzeniowych markerów neuronalnych i glejowych oraz mediatorów zapalnych, takich jak czynnik martwiczyczo-stymulujący TNF-α oraz cyklooksygenaza-2 (COX-2). W szczególności badanie to różni się od wcześniejszych doniesień połączeniem oceny behawioralnej z czasową analizą metodą Western blot, porównaniem farmakologicznym z inhibitorem MEK1/2 U0126 oraz jakościową lokalizacją p-ERK1/2 za pomocą immunofluorescencji w neuronach rdzeniowych, astrocytach i mikrogleju w ostrym modelu bólu po nacięciu. Choć ramy mechanistyczne opierają się na wcześniejszej literaturze łączącej modulację gleju i sygnalizację MAPK z bólem, niniejsza praca ma na celu dostarczenie dodatkowych dowodów na możliwy udział rdzeniowych odpowiedzi glejowych związanych z ERK1/2 we wczesnej fazie hiperalgezji po nacięciu.

W porównaniu z konwencjonalnymi lekami przeciwbólowymi stosowanymi po operacjach, podejścia celowane w konkretne szlaki mogą pozwolić na badanie określonego komponentu sygnałowego, lecz mogą zapewniać korzyści jedynie przez ograniczony czas i mogą wymagać inwazyjnych metod podania; hamowanie MEK1/2–ERK1/2 wykazało działanie antyhiperalgetyczne w kilku eksperymentalnych modelach bólu^{20,21,22,23,24,25}. PPF różni się od inhibitorów pojedynczego szlaku tym, że moduluje odpowiedzi glejowe i został powiązany z więcej niż jednym procesem zależnym od MAPK^4,5,6. Praktyczne zastosowanie kliniczne pozostaje ograniczone przez projekt przedkliniczny, przedoperacyjne podanie dokanałowe, wykorzystanie wyłącznie samców szczurów oraz brak badań nad zakresem dawek i bezpieczeństwem w większych modelach chirurgicznych.

Protokół

Przeprowadzone eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Drugiego Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu w Lanzhou, prowincja Gansu, Chiny (numer zgody etycznej 2017-070). Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi International Association for the Study of Pain²⁶. Wykorzystano łącznie 66 dorosłych samców szczurów Sprague–Dawley o masie 200–250 g, pozyskanych z akredytowanego centrum zwierząt laboratoryjnych. Do badania włączono wyłącznie samce, aby ograniczyć potencjalną zmienność związaną z hormonami zależnymi od płci. Wszystkie protokoły wykonano zgodnie z wytycznymi International Association for the Study of Pain²⁶, podejmując niezbędne starania w celu zminimalizowania cierpienia zwierząt. Szczegółowe informacje na temat odczynników, materiałów eksploatacyjnych, instrumentów i oprogramowania wykorzystanego w tej pracy znajdują się w Tabeli materiałów.

Zwierzęta

Szczury trzymano w parach przed operacją i indywidualnie po nacięciu, z dostępem do jedzenia i wody ad libitum. W pomieszczeniu utrzymywano 12-godzinny cykl światła i ciemności oraz kontrolowaną temperaturę 24 °C ± 2 °C.

Model bólu po nacięciu i iniekcja dokanałowa

W celu podania roztworów drogą dokanałową, szczury zanieczulono sewofluranem w stężeniu 1,5%–3% (podawanym przez maskę nosową) i ułożono w pozycji brzusznej z wygiętą kręgosłupem. Wygolono sierść w okolicy lędźwiowej, a skórę nad przestrzenią międzykręgową L5–L6 zdezynfekowano. Mikrostrzykawkę wprowadzono przezskórnie w przestrzeni międzykręgowej L5–L6. Prawidłowe wprowadzenie do przestrzeni podpajęczynowej sygnalizował gwałtowny ruch ogona podczas posuwania igły, co dodatkowo potwierdzono pojawieniem się płynu mózgowo-rdzeniowego podczas delikatnej aspiracji. W przypadku braku tych objawów korygowano położenie igły przed wykonaniem iniekcji. Iniekcję przeprowadzano dopiero po spełnieniu obu kryteriów potwierdzenia, a zwierzęta wykazujące nieprawidłowe objawy neurologiczne po wstrzyknięciu wykluczano z badania. Następnie powoli wstrzykiwano odpowiedni roztwór, a po zakończeniu procedury ponownie oczyszczano skórę. Zabieg chirurgiczny trwał około 3 min, a szczury zazwyczaj budziły się z narkozy w ciągu 5–10 min.

Szczurzy model bólu po nacięciu utworzono zgodnie z wcześniejszym opisem²⁷. Po podaniu znieczulenia powierzchnię podeszwową tylnej łapy zdezynfekowano 10% roztworem powidonu z jodem. W skórze podeszwowej wykonano podłużne nacięcie o długości 1 cm, zaczynając około 0,5 cm od pięty i prowadząc w stronę palców. Nacięcie przechodziło przez skórę i powięź. Mięsień podeszwowy delikatnie uniesiono pęsetą okulistyczną i nacięto wzdłużnie, zachowując ogólną ciągłość tkanki. Następnie przywrócono mięsień na miejsce, zastosowano delikatny ucisk w celu uzyskania hemostazy, a ranę zamknięto dwoma szwami materacowymi przy użyciu nici nylonowej 3-0. Po zamknięciu rany miejsce nacięcia ponownie zdezynfekowano. Po zabiegu szczury zamknięto w pojedynczych klatkach i pozostawiono do rekonwalescencji w cichym, ciepłym środowisku, chronionym przed silnym światłem, z wolnym dostępem do pożywienia i wody. Zwierzęta monitorowano po operacji, a te, które nie spełniały zdefiniowanych wcześniej kryteriów, niezwłocznie wykluczono. Zakażenie rany określano na podstawie zaczerwienienia, obrzęku i podwyższonej lokalnej temperatury wokół rany, obecności nieprawidłowej żółto-zielonej ropnej wydzieliny o nieprzyjemnym zapachu, opóźnionego gojenia z trwałą szczeliną rany, martwicy i powiększenia się rany oraz objawów ogólnoustrojowych, w tym podwyższonej temperatury ciała, letargu i odmowy przyjmowania pokarmu. Dodatkowe kryteria wykluczenia obejmowały: brak wybudzenia z narkozy w ciągu 30 min, śródoperacyjne przecięcie mięśnia lub uszkodzenie naczyniowo-nerwowe, pooperacyjną automutilację, niepowodzenie w utworzeniu modelu oraz deficyty neurologiczne, takie jak paraliż tylnych kończyn lub niezdolność do obciążania kończyny niezwiązaną z bólem po nacięciu. Szczury z zakażeniem rany lub rozejściem się brzegów rany wykluczono z badania.

Pomiar behawioralny

Mechaniczny próg wycofania łapy (PWMT) oraz czas latencji termicznej wycofania łapy (PWTL) były mierzone przez badacza, który nie znał przydziału zwierząt do grup. Badania przeprowadzano w cichym pomieszczeniu o stałej porze dnia, po co najmniej 10 min aklimatyzacji; zapewniono stałe warunki dotyczące klatek, rodzaju podłoża (siatka lub szkło), oświetlenia otoczenia oraz intensywności źródła ciepła dla wszystkich grup. W badaniu PWMT skalibrowane włókna von Freya (0.4 g, 0.6 g, 1.0 g, 1.4 g, 2.0 g, 4.0 g, 6.0 g, 8.0 g, 10.0 g oraz 15.0 g) przykładano prostopadle do powierzchni podeszwowej w pobliżu rany, aż do momentu ugięcia włókna o około 1–2 mm. Kolejne stymulacje oddzielano 2 min odstępu, a wartość 50% PWMT określano metodą up-and-down²⁸. W badaniu PWTL szczury umieszczano w indywidualnych przezroczystych klatkach na szklanej podłodze, a promiennicze źródło ciepła ustawiano w linii z powierzchnią podeszwową obok rany. Aby zapobiec uszkodzeniu tkanek zastosowano 30 s czas odcięcia, kolejne ekspozycje oddzielano 2 min odstępu, a zapisywano średnią z trzech pomiarów²⁹. Podniesienie, potrząsanie lub lizanie łapy uznawano za pozytywną reakcję wycofania; próby zakłócone przez pielęgnację, ruch lub utratę osiowości źródła ciepła powtarzano po ponownej aklimatyzacji.

Analiza Western blot

W wyznaczonych punktach czasowych szczury uśpiono poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych, a rdzeń kręgowy z odcinka lędźwiowego L4–L6 szybko pobrano do buforu lizującego do analizy radioimmunoprecypitacyjnej z dodatkiem inhibitora proteaz w stosunku 100:1. Tkankę zhomogenizowano, pozostawiono w lodzie na 20 min i odwirowano przy 15 000 × g przez 20 min w temperaturze 4 °C. Nadlodzynę zmieszano z 4× buforem do ładowania w stosunku 3:1, podgrzano w wrzącej wodzie przez 5 min i przechowywano w temperaturze −80 °C. Próbki białek (30 µg na ścieżkę) rozdzielono na 10% żelach poliakrylamidowych z dodecylosiarczanem sodu i przeniesiono na membrany z polifluorku winylidenu o porach 0,45 lub 0,22 µm. Prawidłowość transferu sprawdzono, potwierdzając oczekiwaną migrację wstępnie zabarwionego markera masy cząsteczkowej oraz brak wyraźnych nierównomiernych lub przerwanych obszarów transferu. Membrany blokowano 5% mlekiem odtłuszczonym i 3% albuminą surowicy bydlęcej przez 2 h w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano przez noc w 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko NeuN (1:8 000), GFAP (1:4 000), Iba-1 (1:3 000), p-ERK1/2 (1:1 000), t-ERK1/2 (1:3 000) lub GAPDH (1:2 000). Po przemyciu w soli fizjologicznej buforowanej Trisem z dodatkiem 0,05% Tween 20 (pH 7,4), membrany inkubowano z odpowiednim wtórnym przeciwciałem sprzężonym z peroksydazą chrzanową (1:5 000) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Sygnały wywołano za pomocą wzmocnionej chemiluminescencji i zarejestrowano na kliszy, stosując ten sam zakres ekspozycji dla każdego celu. Badacz nieznający przydziału grup analizował gęstość prążków za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Obrazy przekształcono na 8-bitową skalę szarości, do każdego prążka zastosowano identyczny prostokątny obszar zainteresowania, odjęto lokalne tło z sąsiedniego pustego obszaru i zarejestrowano zintegrowaną gęstość. Ten sam rozmiar obszaru i procedura odejmowania tła zostały zastosowane dla wszystkich ścieżek na danej blocie. Poziomy NeuN, GFAP, Iba-1 oraz t-ERK1/2 znormalizowano względem GAPDH; p-ERK1/2 znormalizowano względem t-ERK1/2, a następnie wartości wyrażono w stosunku do grupy kontrolnej.

Immunofluorescencja

W wyznaczonych punktach czasowych szczury zanestezjowano 3% pentobarbitalem sodu (1,5 mL/kg) i przeprowadzono perfuzję przez serce 300 mL schłodzonego 0,01 mol/L roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; pH 7,4), a następnie 250 mL schłodzonej 4% paraformaldehydu. Odcinek rdzenia kręgowego L4–L6 poddano post-fiksacji w 4% paraformaldehydzie przez 6 h, krioprotekcji przez noc w 20%–30% sacharozie w PBS w temperaturze 4 °C, a następnie pocięto na sekcje o grubości 10 µm w temperaturze −22 °C. Sekcje przemyto w 0,01 mol/L PBS, blokowano w 10% surowicy koziej przez 1 h w temperaturze pokojowej i inkubowano przez noc w 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko NeuN (1:100), GFAP (1:1 000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) lub COX-2 (1:50). Po trzykrotnym przemyciu w PBS sekcje inkubowano z odpowiednim przeciwciałem wtórnym sprzężonym z zielonym lub czerwonym fluorophorem (1:400) przez 1 h w temperaturze pokojowej, przemyto ponownie trzykrotnie w PBS i zamontowano z użyciem medium anty-fade oraz szkiełka cover-slip. W każdej serii barwień uwzględniono sekcje kontrolne negatywne, przetworzone bez przeciwciała pierwszorzędowego. Obrazy zostały pozyskane przez badacza w procedurze ślepej próby przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Przeglądowe obrazy przy niskim powiększeniu wykonano przy użyciu obiektywu 10×, natomiast obrazy immunoreaktywności komórkowej i kolokalizacji pozyskano przy użyciu obiektywów 20× lub 40×, zgodnie z odpowiednim panelem rysunku. Dla porównań w obrębie tego samego rysunku i serii barwień powiększenie obiektywu, natężenie oświetlenia, czas ekspozycji, wzmocnienie detektora, ustawienia kamery oraz parametry przetwarzania obrazu zostały ustalone po optymalizacji poniżej poziomu nasycenia. Osobne kanały fluorescencyjne pozyskiwano sekwencyjnie, aby zminimalizować nakładanie się kanałów. W przypadku każdego zwierzęcia zarejestrowano trzy niezachodzące na siebie pola w ipsilateralnym rogu tylnym. Natężenie fluorescencji ilościowo określono za pomocą oprogramowania do analizy obrazu po konwersji do 8 bitów, odjęciu tła z wykorzystaniem obszaru wolnego od komórek oraz zastosowaniu identycznego obszaru zainteresowania (ROI) i progu w każdej serii barwień; wartości z pól uśredniono, aby uzyskać jedną wartość na zwierzę. Pola z prześwietleniami, pofałdowaniami tkanki, rozdarciami, słabym ogniskowaniem lub nierównym tłem zostały wykluczone i ponownie pozyskane przy tych samych nienasycających ustawieniach. Barwienie uznano za prawidłowe, gdy architektura tkanki była nienaruszona, sygnał docelowy przekraczał poziom kontroli bez przeciwciała pierwszorzędowego i analiza nie była zaburzona przez żadne istotne pofałdowanie, rozdarcia lub region nasycony.

In vitro eksperymenty na pierwotnych astrocytach rdzenia kręgowego

Pierwotne astrocyty rdzenia kręgowego szczura hodowano w standardowych warunkach sterylnych w pełnej pożywce hodowlanejj w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaną atmosferą zawierającą 5% CO₂. Komórki wykorzystywano po osiągnięciu konfluencji na poziomie około 70%–80% i przydzielano do grup: kontrolnej, stymulowanej LPS, LPS + PPF, LPS + U0126 oraz grupy ratowania ERK1/2. PPF oraz U0126 dodawano w stężeniu 10 µM. Warunki stymulacji LPS, traktowania lekami oraz zbioru materiału były identyczne dla równoległych dołków w każdym eksperymencie. W celu analizy selektywności szlaków pobrano lizaty komórkowe do analizy Western blotting w celu oznaczenia p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, całkowitego p38, p-JNK, całkowitego JNK oraz odpowiedniej kontroli załadunku. Nadnadkładowe pożywki z równoległych dołków pobrano, klarowano poprzez wirowanie i analizowano pod kątem zawartości TNF-α, PGE2 i IL-6 za pomocą testu ELISA zgodnie z instrukcjami producenta. Densitometria Western blot była przeprowadzana zgodnie z opisanymi powyżej zasadami analizy obrazu. W eksperymentach z ratowaniem ekspresję endogennego ERK1/2 wyciszano poprzez transfekcję siRNA, a przed traktowaniem wprowadzano konstrukt ekspresyjny konstytutywnie aktywnego ERK1/2 (CA-ERK1/2). Efektywność wyciszenia i nadekspresji potwierdzono metodą Western blotting przed interpretacją danych dotyczących cytokin. Komórki poddane działaniu odczynnika do transfekcji bez aktywnego siRNA lub konstruktu służyły, w zależności od potrzeb, jako kontrole proceduralne.

Projekt doświadczalny

Podział zwierząt doświadczalnych na podgrupy

Szczury przydzielono do sześciu grup przy użyciu metody tablicy liczb losowych; przydział do grup zakończono przed testami behawioralnymi i pobraniem tkanek. Sześć grup obejmowało grupę kontrolną (blank) (n = 6), grupę z bólem po nacięciu (IP) (n = 18), grupę z solą fizjologiczną (NS) (0,9% NS, 10 µL; n = 9), grupę PPF (10 µg w 10 µL; n = 12), grupę z dimetylosulfotlenkiem (DMSO) (10% DMSO, 10 µL; n = 9) oraz grupę U0126 (10 µg w 10 µL; n = 12). Szczury w grupie kontrolnej nie otrzymały ani nacięcia podeszwy, ani wstrzyknięcia do przestrzeni dokanałowej, pełniąc rolę kontroli nieleczonej. Szczury w grupie IP poddano nacięciu podeszwy bez wcześniejszego podania leku drogą dokanałową. Szczury w grupach NS, PPF, DMSO i U0126 otrzymały odpowiednie substancje w wstrzyknięciu dokanałowym na 30 min przed nacięciem podeszwy. Grupa NS służyła jako kontrola nośnika dla PPF, natomiast grupa DMSO jako kontrola nośnika dla U0126.

Dawki propentofylliny i U0126

Propentofyllina jest modulatorem glejowym; wybrano dawkę 10 µg, ponieważ w poprzednich badaniach przeprowadzonych przez grupę badawczą łagodziła ona ostrą hiperalgezję. U0126 jest inhibitorem MEK1/2 nieskonkurującym z adenozynotrifosforanem, stosowanym w celu zablokowania fosforylacji ERK1/2. W różnych modelach bólu zgłaszano skuteczne dawki dokanałowe w zakresie 1–10 µg^30,31,32; w niniejszym badaniu zastosowano dawkę 10 µg. U0126 rozpuszczono w 10% dimetylosulfoksydzie, natomiast PPF rozpuszczono w 0,9% soli fizjologicznej. Końcowe stężenia wynosiły 1 µg/µL. Leki i roztwory nośnikowe przygotowano przed zabiegiem chirurgicznym, przechowywano w temperaturze 4 °C i wykorzystano w ciągu 12 h.

Wpływ przedoperacyjnego podania dopłynnego propentofylliny lub U0126 na hiperalgezję

Sześć szczurów z każdej grupy wybrano losowo do pomiarów behawioralnych na 24 h przed operacją, a uzyskane wartości PWMT i PWTL wyznaczono jako wartości bazowe. Iniekcje dokanaściowe podano 30 min przed operacją. Aby ocenić wpływ przedoperacyjnego dokanaściowego podania PPF i U0126 na hiperalgezję mechaniczną i termiczną, PWMT oraz PWTL oceniano po 2 h, 4 h, 8 h, 24 h i 72 h od nacięcia.

Projekt eksperymentalny do oceny wpływu przedoperacyjnego wewnątrzoponowego podania propentofylliny lub U0126 na ekspresję markerów neuronalnych i glejowych w rdzeniu kręgowym po nacięciu

Aby określić odpowiedni punkt czasowy po nacięciu do oceny efektu leczenia, w grupie IP przeprowadzono wstępną analizę przebiegu czasowego. W szczególności szczury w grupie IP zostały poddane eutanazji w 2 h, 4 h, 24 h i 72 h po nacięciu, a poziomy ekspresji markerów komórkowych NeuN, GFAP i Iba-1 w rdzeniu kręgowym zmierzono za pomocą metody Western blot (n = 3 na punkt czasowy). Na podstawie tej wstępnej analizy pierwsze 4 h po nacięciu wybrano jako wczesne okno obserwacyjne, ponieważ ekspresja NeuN osiągnęła najwyższy poziom w 4 h, a wczesne zmiany molekularne uznano za najistotniejsze dla początkowego rozwoju hiperalgezji po nacięciu. Punkt czasowy 4 h nie miał jednak reprezentować wszystkich czasowych zmian molekularnych po nacięciu.

W wybranym punkcie czasowym szczury, którym podano zastrzyk dokanałowy, zostały uśmiercone w celu przeprowadzenia analizy Western blot dla różnych markerów komórkowych (n = 3 na grupę) oraz oceny immunofluorescencyjnej morfologii różnych typów komórek (n = 3 na grupę). W grupie kontrolnej (blank) szczury zostały randomly uśmiercone, aby określić podstawowe poziomy ekspresji różnych markerów komórkowych (NeuN, GFAP i Iba-1) w rdzeniu kręgowym metodą Western blot (n = 3) oraz morfologię różnych komórek (neuronów, astrocytów i mikrogleju) za pomocą immunofluorescencji (n = 3). Zatem grupa kontrolna służyła jako baseline dla zwierząt nienaciętych i nieleczonych.

Wpływ leczenia na poziom p-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym oraz na mediatory stanu zapalnego

Aby ustalić odpowiedni punkt czasowy po nacięciu do oceny wpływu leczenia na ekspresję p-ERK1/2 oraz poziomy cytokin zapalnych, w grupie IP przeprowadzono wstępną analizę przebiegu czasowego. W szczególności szczury w grupie IP uśpiono po 2 h, 4 h, 24 h i 72 h od nacięcia, a ekspresję p-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym zmierzono za pomocą techniki Western blot (n = 3 na punkt czasowy). Na podstawie tego eksperymentu z przebiegiem czasowym oraz punktu czasowego, w którym ekspresja NeuN była najwyższa po nacięciu, wybrano 4 h po nacięciu jako stały punkt czasowy dla późniejszej oceny wpływu przedoperacyjnie podanego do przestrzeni podpajęczynówkowej PPF lub U0126 na ekspresję p-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym oraz cytokiny zapalne. Punkt czasowy ten wybrano jako wczesne okno obserwacji mechanistycznej, a nie jako kompleksową reprezentację wszystkich zmian czasowych po nacięciu.

W wybranym punkcie czasowym szczury, którym podano wstrzyknięcie dokanalne, poddano eutanazji w celu przeprowadzenia analizy Western blot w kierunku ekspresji p-ERK1/2 (n = 3 na grupę) oraz oceny immunofluorescencyjnej cytokin zapalnych (n = 3 na grupę). W grupie kontrolnej (blank) szczury uśmiercono w sposób losowy, aby za pomocą Western blot określić podstawowe poziomy ekspresji p-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym (n = 3) oraz cytokin zapalnych (TNF-α i COX-2) metodą immunofluorescencji (n = 3). Zatem grupa kontrolna służyła jako grupa bazowa, bez nacięć i bez podanego leczenia.

Lokalizacja komórkowa p-ERK1/2 w neuronach, astrocytach i mikrogleju rdzenia kręgowego

Aby dalej ocenić dystrybucję komórkową p-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym po nacięciu, w grupach Blank i IP przeprowadzono barwienie immunofluorescencyjne 4 h po nacięciu (n = 3).

Analiza statystyczna

Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. Wielkość próby określono w oparciu o wcześniejsze badania grupy badawczej oraz eksperymenty wstępne. Dane behawioralne przeanalizowano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami, przyjmując grupę jako czynnik międzyosobniczy, a czas jako czynnik wewnątrzobiektowy. Dane z Western blot w funkcji czasu oceniono za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA, a następnie przeprowadzono porównania parowe z korektą Bonferroniego. Dane z Western blot i immunofluorescencji dla ustalonych punktów czasowych oceniono za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA z zaplanowanymi porównaniami z korektą Bonferroniego; porównania dwóch grup oceniono za pomocą testu t Studenta. Normalność rozkładu oraz jednorodność wariancji oceniono odpowiednio testem Shapiro-Wilka i testem Levene'a. Obustronną wartość p < 0,05 uznano za istotną statystycznie. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej wymienionego w Tabeli Materiałów. W przypadku eksperymentów in vitro na astrocytach, niezależne hodowle traktowano jako jednostkę analizy; gęstość prążków w Western blot oraz stężenia cytokin porównywano za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA, a następnie zaplanowanych porównań z korektą Bonferroniego lub testu t Studenta dla określonych porównań dwóch grup, zależnie od potrzeb.

Dostępność danych:

Dane potwierdzające wyniki niniejszego badania znajdują się w Pliku uzupełniającym 1.

Wyniki

Wpływ nacięcia oraz przedoperacyjnego podania dopłonka do przestrzeni podpłownikowej propentofylliny lub U0126 na hiperalgezję po nacięciu

Hyperalgezja mechaniczna

Nie stwierdzono istotnych różnic w PWMT między sześcioma grupami na 24 h przed operacją (p > 0.05; Rycina 1A,B). W grupie IP wartość PWMT spadła po nacięciu i pozostała istotnie niższa od wartości wyjściowej od 2 h do 72 h po nacięciu (p < 0.05 względem wartości wyjściowej; Rycina 1A). W grupach NS i DMSO nie odnotowano istotnych różnic w PWMT między punktami czasowymi po nacięciu (p > 0.05 względem grupy IP; Rycina 1B). W grupie PPF wartość PWMT była istotnie wyższa niż w grupie IP od 2 h do 72 h po nacięciu (p < 0.05 względem grupy IP; Rycina 1A), a w 72 h po nacięciu nie różniła się już istotnie od wartości wyjściowej (p > 0.05 względem wartości wyjściowej; Rycina 1A). W grupie U0126 wartości PWMT były istotnie wyższe niż w grupie IP podczas pierwszych 24 h po nacięciu (p < 0.05 względem grupy IP; Rycina 1A), lecz efekt ten nie utrzymał się w 72 h po nacięciu, kiedy PWMT pozostał istotnie niższy od wartości wyjściowej i nie różnił się już istotnie od wartości w grupie IP (p < 0.05 względem wartości wyjściowej; p > 0.05 względem grupy IP; Rycina 1A).

Hipersensitivity termiczna

Nie stwierdzono istotnych różnic w PWTL między sześcioma grupami na 24 h przed operacją (p > 0,05; Rysunek 1C,D). W grupie IP PWTL spadło z 24,85 s ± 1,06 s przed operacją do 4,38 s ± 1,02 s w 4 h po nacięciu, a następnie częściowo wzrosło do 18,37 s ± 1,38 s w 72 h po nacięciu, jednak przez cały okres obserwacji pozostało istotnie niższe niż wartość wyjściowa (p < 0,05 vs wartość wyjściowa; Rysunek 1C). W grupach NS i DMSO nie stwierdzono istotnych różnic w PWTL między punktami czasowymi po nacięciu (p > 0,05 vs grupa IP; Rysunek 1D). W grupie PPF PWTL było istotnie wyższe niż w grupie IP przez cały 72-godzinny okres obserwacji (p < 0,05 vs grupa IP; Rysunek 1C), a w 72 h po nacięciu powróciło do poziomu, który nie różnił się istotnie od wartości wyjściowej (p > 0,05 vs wartość wyjściowa; Rysunek 1C). W grupie U0126 PWTL było istotnie wyższe niż w grupie IP podczas pierwszych 24 h po nacięciu (p < 0,05 vs grupa IP; Rysunek 1C); efekt ten nie utrzymał się w 72 h po nacięciu, kiedy PWTL pozostało istotnie niższe od wartości wyjściowej i nie różniło się już istotnie od wartości w grupie IP (p < 0,05 vs wartość wyjściowa; p > 0,05 vs grupa IP; Rysunek 1C).

Analiza Western blot zmian czasowych w ekspresji markerów komórek rdzeniowych oraz fosforylacji kinazy 1 i 2 regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym po nacięciu

Na membranach PVDF zidentyfikowano kilka prążków o dokładnych masach cząsteczkowych przy użyciu specyficznych przeciwciał, w tym NeuN (48 i 50 kD), GFAP (50 kD), Iba-1 (17 kD), p-ERK1/2 (p-ERK1 = 44 kD; p-ERK2 = 42 kD), t-ERK1/2 (t-ERK1 = 44 kD; t-ERK2 = 42 kD) oraz GAPDH (36 kD). Prążek GAPDH służył jako kontrola dla NeuN, GFAP, Iba-1 i t-ERK1/2, natomiast prążek t-ERK1/2 służył jako kontrola dla p-ERK1/2.

Dane z analizy Western blotting rdzeni kręgowych w grupie IP wykazały wzrosty o różnym stopniu po nacięciu (Rysunek 2A). Ekspresja białka jądrowego specyficznego dla neuronów osiągnęła najwyższą wartość 4 h po nacięciu (p < 0,001 w stosunku do poziomu bazowego; Rysunek 2A) i pozostała znacząco podwyższona 72 h po nacięciu (p < 0,001 w stosunku do poziomu bazowego; Rysunek 2A). Poziomy kwaśnego białka włókienistego glejowego wzrastały stopniowo w ciągu 72-godzinnego okresu obserwacji (p < 0,001 w stosunku do poziomu bazowego; Rysunek 2A), przy czym najwyższy poziom zaobserwowano w 72. godzinie spośród wszystkich mierzonych punktów czasowych. Podobnie, poziom Iba-1 również uległ znacznemu zwiększeniu 4 h po nacięciu (p < 0,001 w stosunku do poziomu bazowego; Rysunek 2A) i fluktuował w niewielkim zakresie. Co istotne, dane z analizy Western blotting rdzeni kręgowych w grupie IP wykazały, że aktywacja ERK1/2 wzrosła jedynie w ciągu pierwszych 24 h po nacięciu (p < 0,05 w stosunku do poziomu bazowego; Rysunek 2B), natomiast uległa obniżeniu 72 h po nacięciu (p < 0,05 w stosunku do poziomu bazowego; Rysunek 2B), podczas gdy ekspresja t-ERK/2 nie wykazała istotnych zmian w żadnym punkcie czasowym.

Analiza Western blot efektów przedoperacyjnego podania dokanalnego propentofylliny lub U0126 na ekspresję markerów komórkowych oraz fosfo-zewnątrzkomórkową kinazę regulowaną sygnałem 1 i 2 w rdzeniu kręgowym

Dane z analizy Western blotting wykazały, że ekspresja NeuN osiągnęła najwyższy poziom 4 h po nacięciu, kiedy próg pomiaru behawioralnego był najniższy. W związku z tym wpływ PPF i U0126 podanych dostawowo 30 min przed operacją na ekspresję markerów komórkowych oraz fosforylację ERK1/2 oceniono 4 h po nacięciu.

Dane z analizy Western blotting wykazały, że w porównaniu z grupą kontrolną (blank), ekspresja wszystkich markerów komórkowych w rdzeniu kręgowym była istotnie zwiększona w grupie IP 4 h po nacięciu (p < 0,05 względem wartości bazowej; Rycina 3). W porównaniu z grupą IP, przedoperacyjne dokanałowe podanie PPF zredukowało ekspresję w rdzeniu kręgowym NeuN (p < 0,05 vs grupa IP; Rycina 3A), GFAP (p < 0,05 vs grupa IP; Rycina 3B) oraz Iba-1 (p < 0,01 vs grupa IP; Rycina 3C). W porównaniu z grupą IP, przedoperacyjne dokanałowe podanie U0126 również zredukowało ekspresję w rdzeniu kręgowym NeuN (p < 0,01 vs grupa IP; Rycina 3D), GFAP (p < 0,05 vs grupa IP; Rycina 3E) oraz Iba-1 (p < 0,01 vs grupa IP; Rycina 3F). Jednak w porównaniu z grupą kontrolną, ekspresja NeuN w grupie PPF pozostała istotnie wyższa od wartości bazowej (p < 0,01 vs wartość bazowa; Rycina 3A), podczas gdy ekspresja NeuN w grupie U0126 była istotnie niższa niż w grupie kontrolnej (p < 0,01 vs wartość bazowa; Rycina 3D). W przypadku GFAP i Iba-1 tekst podkreśla teraz porównanie z grupą IP, jak pokazano na Rycynie 3. Przedoperacyjne dokanałowe podanie NS i DMSO nie miało istotnego wpływu na ekspresję żadnego z markerów komórkowych.

Dane z analizy Western blotting wykazały, że ekspresja t-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym nie różniła się istotnie pomiędzy grupami Blank, IP, NS i PPF w 4 h po nacięciu (Rysunek 4A). W przeciwieństwie do tego, w porównaniu z grupą Blank, ekspresja p-ERK1/2 była istotnie zwiększona w grupach IP i NS w 4 h po nacięciu (p < 0,001 vs grupa Blank; Rysunek 4B). W porównaniu z grupą IP, przedoperacyjne dostarczenie PPF drogą dokanalną istotnie zredukowało ekspresję p-ERK1/2 w 4 h po nacięciu (p < 0,001 vs grupa IP; Rysunek 4B). W porównaniu z grupą NS, ekspresja p-ERK1/2 w grupie PPF była również istotnie niższa (p < 0,01 vs grupa NS; Rysunek 4B). Jednakże, w porównaniu z grupą Blank, ekspresja p-ERK1/2 w grupie PPF pozostała istotnie podwyższona w 4 h po nacięciu. Podobnie, ekspresja t-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym nie różniła się istotnie pomiędzy grupami Blank, IP, DMSO i U0126 w 4 h po nacięciu (Rysunek 4C). W porównaniu z grupą Blank, ekspresja p-ERK1/2 była istotnie zwiększona w grupach IP i DMSO w 4 h po nacięciu (p < 0,001 vs grupa Blank; Rysunek 4D). W porównaniu z grupą IP, przedoperacyjne dostarczenie U0126 drogą dokanalną istotnie zredukowało ekspresję p-ERK1/2 (p < 0,001 vs grupa IP; Rysunek 4D). W porównaniu z grupą DMSO, ekspresja p-ERK1/2 w grupie U0126 była również istotnie niższa (p < 0,001 vs grupa DMSO; Rysunek 4D). Co istotne, w porównaniu z grupą Blank, ekspresja p-ERK1/2 w grupie U0126 nie różniła się istotnie od tej w grupie Blank w 4 h po nacięciu. Wstępne podanie NS lub DMSO nie miało istotnego wpływu na ekspresję p-ERK1/2 w porównaniu z grupą IP.

Obserwacje immunofluorescencyjne markerów komórek rdzenia kręgowego i mediatorów zapalnych

Wyniki immunofluorescencji jakościowo wykazały silniejszą immunoreaktywność NeuN w ipsilateralnym rogu tylnym 4 h po nacięciu w porównaniu ze stroną kontralateralną (Rysunek 5). W grupie kontrolnej reprezentatywne obrazy wykazały bazową immunoreaktywność NeuN, GFAP i Iba-1 w ipsilateralnym rogu tylnym rdzenia kręgowego (Rysunek 6A–C). W grupie IP immunoreaktywność NeuN była jakościowo silniejsza niż w grupie kontrolnej (Rysunek 6D vs Rysunek 6A), immunoreaktywność GFAP była również silniejsza (Rysunek 6E vs Rysunek 6B), a immunoreaktywność Iba-1 była zwiększona (Rysunek 6F vs Rysunek 6C). Jednocześnie astrocyty i mikroglej w grupie IP wydawały się hipertroficzne, z powiększonymi ciałami komórkowymi i grubszymi, silniej rozgałęzionymi wypustkami (Rysunek 6E,F).

W grupie PPF reprezentatywne obrazy sugerowały słabszą immunoreaktywność NeuN niż w grupie IP (Rysunek 6G vs Rysunek 6D), słabszą immunoreaktywność GFAP (Rysunek 6H vs Rysunek 6E) oraz słabszą immunoreaktywność Iba-1 (Rysunek 6I vs Rysunek 6F). W grupie U0126 reprezentatywne obrazy w podobny sposób sugerowały słabszą immunoreaktywność NeuN niż w grupie IP (Rysunek 6J vs Rysunek 6D), słabszą immunoreaktywność GFAP (Rysunek 6K vs Rysunek 6E) oraz słabszą immunoreaktywność Iba-1 (Rysunek 6L vs Rysunek 6F). W obu grupach, PPF i U0126, astrocyty i mikroglej wydawały się mniej hipertroficzne, z mniejszymi ciałami komórkowymi i rzadszymi, cieńszymi wypustkami (Rysunek 6H,I,K,L). Odpowiednia analiza intensywności fluorescencji NeuN, GFAP i Iba-1 była zgodna z reprezentatywnymi obserwacjami immunofluorescencyjnymi (Rysunek 6M–O, odpowiednio).

W 4 h po nacięciu, immunoreaktywność TNF-α i COX-2 oraz względna intensywność fluorescencji były zwiększone w ipsilateralnym rogu tylnym grupy IP w porównaniu z grupą kontrolną. Obie wartości były niższe po przedoperacyjnym dostaniu do przestrzeni dokanałowej PPF lub U0126 (Rycina 7A–C).

Lokalizacja komórkowa rdzeniowego p-ERK1/2 za pomocą immunofluorescencji

Wyniki immunofluorescencji wykazały, że w grupie kontrolnej immunoreaktywność p-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym była słaba i obserwowano ją wyłącznie w neuronach wykazujących pozytywną reakcję z NeuN (Rycina 8A–C). W przeciwieństwie do tego, 4 h po nacięciu immunoreaktywność p-ERK1/2 była wyraźnie zwiększona w tylnym rogu rdzenia kręgowego po stronie ipsilateralnej i współwystępowała nie tylko z neuronami, ale także z astrocytami pozytywnymi dla GFAP oraz mikroglejem pozytywnym dla Iba-1 (Rycina 8D–I). Wynik ten wskazuje, że nacięcie wywołało szerszy rozkład komórkowy p-ERK1/2 – od samych neuronów w warunkach bazowych do neuronów, astrocytów i mikrogleju po urazie.

In vitro walidacja mechanizmu zależnego od ERK1/2 w astrocytach rdzenia kręgowego

Aby dalej ocenić, czy PPF może hamować uwalnianie mediatorów zapalnych poprzez sygnalizację związaną z ERK1/2 na poziomie komórkowym, pierwotne astrocyty rdzenia kręgowego szczura stymulowano LPS i traktowano PPF lub U0126 (10 µM). Analiza Western blot wykazała, że PPF zredukował indukowaną LPS ekspresję p-ERK1/2, podczas gdy fosforylacja p-p38 i p-JNK nie uległa wyraźnej zmianie (Rysunek 9A), co potwierdza względną selektywność szlaku ERK1/2 w tych warunkach. Równocześnie PPF obniżył poziomy TNF-α, PGE2 (produktu końcowego aktywności COX-2) oraz IL-6 w supernatancie hodowli w porównaniu z grupą Stim; U0126 wywołał podobne efekty hamujące (Rysunek 9B).

Aby sprawdzić, czy uporczywa aktywacja ERK1/2 może osłabić przeciwzapalny efekt PPF, przeprowadzono eksperymenty ratunkowe. Endogenny ERK1/2 został wyciszony za pomocą siRNA, a następnie wprowadzono konstrukt konstytutywnie aktywnego ERK1/2 (CA-ERK1/2) (Rysunek 9C). W astrocytach wykazujących ekspresję CA-ERK1/2, PPF nie obniżał już poziomów TNF-α, PGE2 lub IL-6 w takim samym stopniu (Rysunek 9D), co wskazuje, że hamowanie fosforylacji ERK1/2 przyczynia się do efektu przeciwzapalnego PPF w tym systemie astrocytów in vitro.

Wspólnie te wyniki in vitro stanowią mechanistyczne wsparcie na poziomie komórkowym dla tezy, że PPF osłabia uwalnianie mediatorów zapalnych poprzez mechanizm zależny od ERK1/2 w astrocytach rdzenia kręgowego, co uzupełnia dane obserwacyjne in vivo.

Rysunek 1: Wpływ przedoperacyjnego dokanałowego podania PPF lub U0126 na indukowaną nacięciem mechaniczną i termiczną hiperalgezję. (A) PWMT w grupach: kontrolnej (blank), IP, PPF i U0126. (B) PWMT w grupach IP i kontroli nośnika (vehicle-control). (C) PWTL w grupach: kontrolnej (blank), IP, PPF i U0126. (D) PWTL w grupach IP i kontroli nośnika (vehicle-control). Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 6 szczurów na grupę) i zostały przeanalizowane za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami (two-way repeated-measures ANOVA). ***p < 0.001 względem wartości bazowej; #p < 0.05, ##p < 0.01 oraz ###p < 0.001 względem grupy IP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 2: Przebieg czasowy ekspresji markerów komórek rdzeniowych i fosforylacji ERK1/2 po nacięciu. (A) Ilościowe oznaczenie i reprezentatywne analizy Western blot NeuN, GFAP oraz Iba-1 w grupie IP od stanu podstawowego do 72 h po nacięciu. (B) Ilościowe oznaczenie i reprezentatywne analizy Western blot t-ERK1/2 oraz p-ERK1/2 w tym samym okresie. Wartości znormalizowano względem grupy kontrolnej (100%) i przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3 szczury na punkt czasowy). Różnice ogólne analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z wskazanymi porównaniami parzystymi. *p < 0,05, **p < 0,01 oraz ***p < 0,001 względem stanu podstawowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 3: Wpływ przedoperacyjnego intratekalnego podania PPF lub U0126 na markery neuronalne i glejowe rdzenia kręgowego 4 h po nacięciu. (A–C) NeuN, GFAP i Iba-1 w grupach: blank, IP, soli fizjologicznej oraz PPF. (D–F) NeuN, GFAP i Iba-1 w grupach: blank, IP, dimetylosulfoksydu oraz U0126. Po prawej stronie przedstawiono reprezentatywne wyniki Western blot. Wartości znormalizowano względem grupy blank (100%) i przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3 szczurów na grupę). *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001 względem grupy blank; #p < 0,05 i ##p < 0,01 względem grupy IP; Δp < 0,05, ΔΔp < 0,01 i ΔΔΔp < 0,001 względem odpowiadającej grupy kontrolnej (vehicle). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wpływ przedoperacyjnego dokanałowego podania PPF lub U0126 na fosforylację ERK1/2 w rdzeniu kręgowym 4 h po nacięciu. (A,B) Poziomy t-ERK1/2 i p-ERK1/2 w grupach: kontrolnej (blank), IP, soli fizjologicznej i PPF. (C,D) Poziomy t-ERK1/2 i p-ERK1/2 w grupach: kontrolnej (blank), IP, dimetylosulfoksydu i U0126. Reprezentatywne wyniki Western blot przedstawiono po prawej stronie. Wartości zostały znormalizowane względem grupy kontrolnej (100%) i przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3 szczury na grupę). **p < 0,01 i ***p < 0,001 względem grupy kontrolnej; ###p < 0,001 względem grupy IP; ΔΔp < 0,01 i ΔΔΔp < 0,001 względem odpowiedniej grupy nośnika. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rycina 5: Ipsilateralna i kontralateralna immunoreaktywność NeuN w rdzeniu kręgowym po nacięciu. Reprezentatywny przekrój poprzeczny rdzenia kręgowego w odcinku lędźwiowym z grupy IP 4 h po nacięciu wykazuje barwienie NeuN w kontralateralnych i ipsilateralnych rogach tylnych. Obraz jest reprezentatywny dla n = 3 szczurów i służy do jakościowego porównania anatomicznego. Pasek skali = 500 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 6: Wpływ PPF i U0126 na immunoreaktywność neuronów i gleju rdzeniowego 4 h po nacięciu. (A–C) NeuN, GFAP i Iba-1 w grupie kontrolnej (blank). (D–F) Odpowiednie barwienia w grupie IP. (G–I) Odpowiednie barwienia po leczeniu PPF. (J–L) Odpowiednie barwienia po leczeniu U0126. (M–O) Względna intensywność fluorescencji odpowiednio dla NeuN, GFAP i Iba-1. Słupki przedstawiają średnią ± SD (n = 3 szczurów na grupę); *p < 0,05, **p < 0,01 oraz ***p < 0,001 dla wskazanych porównań. Paski skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 7: Immunoreaktywność TNF-α i COX-2 w rdzeniu kręgowym po nacięciu i leczeniu. (A) Reprezentatywne obrazy TNF-α i COX-2 z grup kontrolnej (blank), IP, PPF i U0126 4 h po nacięciu. (B) Względna intensywność fluorescencji TNF-α. (C) Względna intensywność fluorescencji COX-2. Słupki przedstawiają średnią ± SD (n = 3 szczurów na grupę); ***p < 0.001 dla wskazanych porównań. Paski skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 8: Lokalizacja komórkowa p-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym 4 h po nacięciu. (A–C) Podwójne barwienie p-ERK1/2 z NeuN, GFAP i Iba-1 odpowiednio w grupie kontrolnej. (D–F) Odpowiednie podwójne barwienia w grupie IP; strzałki wskazują reprezentatywne komórki kolokalizowane. Kolor czerwony oznacza p-ERK1/2, zielony marker komórkowy, a żółty kolokalizację. (G–I) Względne intensywności fluorescencji związane odpowiednio z obszarami dodatnimi dla NeuN, GFAP i Iba-1. Słupki przedstawiają średnią ± SD (n = 3 szczurów na grupę); **p < 0.01 i ***p < 0.001 dla wskazanych porównań. Paski skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Zależne od ERK1/2 przeciwzapalne działanie PPF w pierwotnych astrocytach rdzenia kręgowego szczura. (A) Reprezentatywne analizy Western blot wykazujące, że PPF zredukował indukowaną LPS fosforylację p-ERK1/2 bez widocznego wpływu na p-p38 lub p-JNK. (B) Stężenia TNF-α, PGE2 i IL-6 w supernatantach hodowlanych po traktowaniu LPS, PPF lub U0126. (C) Analizy Western blot potwierdzające wyciszenie ERK1/2 za pomocą siRNA oraz ekspresję konstytutywnie aktywnej formy ERK1/2 (CA-ERK1/2). (D) Stężenia TNF-α, PGE2 i IL-6 po ekspresji CA-ERK1/2 z dodatkiem lub bez dodatku PPF. Słupki przedstawiają średnią ± SD z niezależnych eksperymentów in vitro; ***p < 0,001 dla wskazanych porównań; ns, brak istotności statystycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Dane wspierające wyniki niniejszego badania.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Większość pacjentów cierpi z powodu ostrego bólu po operacji, nie tylko fizycznie, ale czasami również psychicznie³³, jednak wiele szczegółowych mechanizmów ostrego bólu pooperacyjnego pozostaje nieznanych. Silne działanie leków przeciwbólowych wiąże się z nieuniknionymi skutkami ubocznymi, co sprawia, że poszukiwanie bezpieczniejszych i skutecznych analgetyków ma kluczowe znaczenie. Niniejsze badanie oparto na wcześniej zwalidowanym szczurzym modelu nacięcia skóry do symulacji ostrego bólu pooperacyjnego, który był łatwy i wykonalny w przygotowaniu²⁷. W obecnym badaniu oceniono zmiany markerów neuronalnych i glejowych w rdzeniu kręgowym, fosforylację ERK1/2 oraz mediatorów zapalnych po wykonaniu nacięcia, a także sprawdzono, czy działanie przeciwhiperalgetyczne przedoperacyjnego doglejowego podania PPF wiązało się z równoległymi zmianami w fosforylacji ERK1/2 w rdzeniu kręgowym oraz ekspresji cytokin zapalnych.

Po nacięciu u szczurów z grupy IP rozwinęła się silna hiperalgezja mechaniczna i termiczna, podczas gdy wstępne podanie nośnika nie miało mierzalnego wpływu na wyniki behawioralne ani molekularne. Wyniki te potwierdzają stabilność modelu i wskazują, że zaobserwowane efekty w grupach PPF i U0126 prawdopodobnie nie wynikały z samej procedury wstrzyknięcia ani z zastosowanego nośnika. Ponadto, mimo że ekspresja NeuN wzrosła po nacięciu, zmianę tę należy interpretować ostrożnie, jako zmianę ekspresji markera neuronalnego, a nie jako bezpośredni dowód na aktywację neuronów. Wspólnie obserwacje te stanowią podstawę do badania odpowiedzi glejowych i związanych z ERK1/2 we wczesnej fazie rozwoju bólu pooperacyjnego.

Wykazano, że komórki glejowe odgrywają istotną rolę w tworzeniu synaps, przekazywaniu i integracji informacji synaptycznych oraz regulacji plastyczności synaptycznej. Funkcje immunologiczne i prozapalne komórek glejowych w procesach bólowych, a w szczególności aktywowanych astrocytów i mikrogleju rdzenia kręgowego, mogą nasilać uwrażliwienie ośrodkowe uczestniczące w pośredniczeniu hiperalgezji oraz pooperacyjnych zmianach behawioralnych^7,34. Nieadaptacyjne zmiany neurologiczne w rdzeniu kręgowym mogą prowadzić do zwiększonej reaktywności na bodźce nocycyjne lub nienocycyjne. Istnieją znaczące dowody wskazujące na to, że aktywacja astrocytów i mikrogleju rdzenia kręgowego bierze udział w rozwoju i utrzymywaniu hiperalgezji w modelach uszkodzenia nerwów rdzeniowych³⁵, bólu indukowanego aktywatorem plazminogenu tkankowego¹⁶, bólu po nacięciu^11,12 oraz bólu w raku kości^19,31. Zatem aktywacja gleju rdzeniowego wydaje się być wspólną cechą wielu stanów bólowych, a dalsze badanie jego roli w bólu po nacięciu może rozszerzyć obecne rozumienie mechanizmów bólu pooperacyjnego.

Niniejsze wyniki wspierają tezę, że astrocyty i mikroglej rdzenia kręgowego uczestniczą w wczesnej odpowiedzi neurozapalnej następującej po nacięciu¹². Zamiast wykazywać identyczne wzorce czasowe, GFAP, Iba-1 i p-ERK1/2 wykazały częściowo odmienne przebiegi czasowe, co sugeruje, że różne procesy związane z glejem mogą przyczyniać się do różnych faz rozwoju bólu pooperacyjnego^31,35. Wyniki immunofluorescencji dodatkowo potwierdziły tę interpretację, wykazując hipertroficzne zmiany morfologiczne w astrocytach i mikrogleju po nacięciu. Wraz ze wzrostem immunoreaktywności TNF-α i COX-2 obserwacje te są zgodne z koncepcją, że zapalne sygnalizowanie związane z glejem przyczynia się do ostrej hiperalgezji po nacięciu^7,36.

Propentofyllina, pochodna metyloxantyny, była początkowo badana jako lek działający na naczynia mózgowe ze względu na jej aktywność antyagregacyjną oraz wsparcie w utrzymaniu pamięci długotrwałej³⁷. Jednakże regulacyjny wpływ PPF na komórki glejowe sprawia, że może ona być również wartościowa jako lek przeciwbólowy. Badania wskazują, że PPF może hamować aktywację mikrogleju poprzez blokowanie rozkładu wewnątrzkomórkowego cyklicznego adenozynomonofosforanu oraz ograniczanie wychwytu zewnątrzkomórkowej adenozyny^4,5. W badaniu in vitro PPF hamował proliferację astrocytów poprzez blokowanie szlaku mammalian target of rapamycin indukowanego przez TNF-α⁶. Zatem to regulacyjny wpływ PPF na komórki glejowe umożliwia jego udział w modulacji procesów bólowych.

Utrzymujący się efekt przeciwhiperalgetyczny PPF w niniejszym badaniu, wraz z obniżeniem ekspresji GFAP i Iba-1, wspiera interpretację, zgodnie z którą modulacja glejowa jest istotnym elementem działania przeciwbólowego PPF w tym modelu. Poprzednie badania sugerowały również, że PPF może hamować związane z glejem przekaźnictwo zapalne w stanach bólowych^5,31. Ponadto równoległa redukcja TNF-α i COX-2 sugeruje, że PPF może łagodzić ból po nacięciu częściowo poprzez tłumienie związanych z glejem reakcji zapalnych. Jednakże, ponieważ obecne dane mają charakter asocjacyjny, a nie mechanistyczny, wyniki te należy interpretować jako wsparcie dla tezy o udziale gleju, a nie jako dowód na bezpośrednią ścieżkę przyczynową.

Udowodniono udział ERK1/2, pary ważnych wewnątrzkomórkowych kinaz regulowanych sygnałami, w rozwoju i utrzymywaniu się różnych procesów bólowych (poprzez modulowanie pobudliwości neuronalnej i plastyczności synaptycznej w mózgu i rdzeniu kręgowym)²¹. Na przykład badanie wykazało, że wstrzyknięcie kapsaicyny lub formaliny wywołało krótki i szybki wzrost poziomu p-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym, natomiast aktywacja ERK1/2 w rdzeniu utrzymywała się znacznie dłużej po wstrzyknięciu pełnego adiuwantu Freunda lub jadu pszczelego (po krótkim okresie utajenia)^38,39. Z kolei w innym badaniu aktywacja ERK1/2 w rdzeniu kręgowym wywołana uszkodzeniem nerwu osiągnęła szczyt bardzo wcześnie i utrzymywała się przez pewien czas, przy czym hiperalgezja rozwijała się po szczycie poziomu p-ERK1/2³⁵. Zatem fosforylacja ERK1/2 może występować na różnych etapach różnych procesów bólowych, a zwiększona ekspresja p-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym może być istotna zarówno dla natychmiastowej indukcji, jak i długoterminowej odpowiedzi genetycznej.

W niniejszym badaniu fosforylacja ERK1/2 indukowana nacięciem uległa znacznemu zwiększeniu w ciągu pierwszych 24 h po nacięciu w porównaniu z grupą kontrolną, a ekspresja p-ERK1/2 osiągnęła szczyt w 4 h po nacięciu (jak opisano wcześniej)²⁴, co zbiegało się w czasie z najwyższą ekspresją NeuN. Jednocześnie, jak wykazały wyniki immunofluorescencji, indukowana nacięciem fosforylacja ERK1/2 była rozmieszczona jednocześnie w neuronach, astrocytach i mikrogleju w przeciwległym rogach tylnych rdzenia kręgowego, co wspiera pogląd, że sygnalizacja związana z ERK1/2 jest szczególnie istotna w wczesnej fazie hiperalgezji po nacięciu. Ponadto przedoperacyjne podanie dokanalne U0126 zredukowało ekspresję rdzeniowych markerów glejowych, NeuN oraz p-ERK1/2 w 4 h po nacięciu i złagodziło zarówno hiperalgezję mechaniczną, jak i termiczną we wczesnym okresie po nacięciu, co sugeruje, że rdzeniowe p-ERK1/2 może być zaangażowane we wczesnym stadium ostrej hiperalgezji po nacięciu. Jednakże, ponieważ GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 oraz wyniki behawioralne wykazały różne profile czasowe, obecna interpretacja mechanistyczna powinna ograniczać się do wczesnego stadium po nacięciu reprezentowanego przez punkt czasowy 4 h, a nie być uogólniana na cały okres pooperacyjny.

Ponadto w niniejszym badaniu przedoperacyjne podanie PPF do przestrzeni podpłukowej zmniejszyło również fosforylację ERK1/2 4 h po nacięciu, co sugeruje, że obserwowane zmiany w ekspresji NeuN, GFAP i Iba-1 w rdzeniu kręgowym mogą być związane, przynajmniej częściowo, z sygnalizacją zależną od ERK1/2. Przedoperacyjne podanie U0126 do przestrzeni podpłukowej obniżyło również immunoreaktywność TNF-α i COX-2, co potwierdza możliwy związek między fosforylacją ERK1/2 a ekspresją mediatorów zapalnych po nacięciu. Dodatkowe eksperymenty na astrocytach in vitro przedstawione na Rysunku 9 dostarczyły dowodów na poziomie komórkowym na istnienie przeciwzapalnego komponentu zależnego od ERK1/2, ponieważ trwała aktywacja ERK1/2 osłabiła zdolność PPF do redukcji uwalniania TNF-α, PGE2 i IL-6. Jednakże, ponieważ eksperymenty ratunkowe przeprowadzono na hodowlach astrocytów, a nie w nienaruszonym rdzeniu kręgowym, oraz ponieważ nie wykonano ratunków in vivo ani manipulacji selektywnych względem typu komórek, wnioski in vivo należy interpretować jako wspierające, a nie stanowiące ostatecznego dowodu na przyczynowy mechanizm zależny od ERK1/2.

W celu dalszej analizy możliwych zależności pomiędzy aktywacją komórek glejowych, ekspresją p-ERK1/2 a uwalnianiem cytokin zapalnych, rozważono wzorce lokalizacji przestrzennej zaobserwowane w badaniu immunofluorescencji. Po nacięciu, p-ERK1/2 uległ koekspresji z astrocytami GFAP-dodatnimi oraz mikroglejem Iba-1-dodnim w rogach tylnych rdzenia kręgowego w 4 h po zabiegu. W połączeniu z wynikami analizy Western blot i immunofluorescencji, które wykazały, że zarówno PPF, jak i U0126 wiązały się ze zmniejszoną ekspresją p-ERK1/2, TNF-α oraz COX-2, dane te sugerują, że fosforylacja ERK1/2 w komórkach glejowych rdzenia kręgowego może uczestniczyć w odpowiedzi zapalnej po nacięciu. Dane in vitro uzyskane z pierwotnych astrocytów dodatkowo potwierdzają bezpośredni związek komórkowy pomiędzy leczeniem PPF, supresją ERK1/2 a uwalnianiem mediatorów zapalnych. Niemniej jednak dowody in vivo wykazują jedynie współzależność i równoległe zmiany związane z leczeniem, podczas gdy eksperymenty komórkowe uzupełniają, ale nie zastępują specyficznej dla typu komórek walidacji przyczynowo-skutkowej in vivo. Ponieważ analiza immunofluorescencji opierała się na ograniczonej liczbie zwierząt i pól widzenia, obserwacje te należy interpretować ostrożnie i w powiązaniu z wynikami analizy Western blot oraz badaniami in vitro.

Kilka kroków proceduralnych ma nieproporcjonalnie duży wpływ na powtarzalność. Wstrzyknięcie dokanałowe wymaga zarówno charakterystycznej reakcji ogona, jak i potwierdzenia poprzez obecność płynu mózgowo-rdzeniowego; opór podczas wstrzykiwania, brak potwierdzenia lub nowy deficyt neurologiczny powinny skutkować wykluczeniem zwierzęcia zamiast ponownego wstrzyknięcia w to samo miejsce. Testy behawioralne są wrażliwe na aklimatyzację, warunki w klatkach, rozmieszczenie bodźca oraz oczekiwania badacza, dlatego niezbędne są ślepa próba, stałe odstępy czasowe i spójne warunki środowiskowe. Równie ważne są czas poboru tkanek, jednorodny transfer białek, inkubacja przeciwciał oraz identyczne ustawienia mikroskopu w obrębie każdej partii barwień. Do typowych problemów należą zmienne progi wycofania wynikające z niewystarczającej aklimatyzacji, słabe lub nierównomierne prążki w analizie Western blot spowodowane niepełnym transferem lub prześwietleniem, a także wysokie tło fluorescencji wynikające z niewystarczającego przemywania, zbyt wysokiego stężenia przeciwciał lub nasyconych ustawień akwizycji.

Protokół można modyfikować w zależności od postawionego pytania badawczego. W przypadku zainteresowania późnymi odpowiedziami glejowymi można zastosować szerszy przebieg czasowy, a w celu priorytetyzacji wykonalności translacyjnej można wprowadzić badanie zależności dawka-odpowiedź lub alternatywne drogi podania. W porównaniu z modelami bólu zapalnego lub neuropatycznego, model nacięcia podeszwowego jest stosunkowo szybki i praktyczny oraz odtwarza określony uraz pooperacyjny²⁷. Połączenie testów behawioralnych, analizy Western blotting oraz immunofluorescencji związanej z komórkami dostarcza uzupełniających informacji funkcjonalnych, molekularnych i przestrzennych; jest to jednak bardziej zasobożerne niż analiza z jednym punktem końcowym i samo w sobie nie pozwala na ustalenie przyczynowości specyficznej dla konkretnego typu komórek. Porównanie farmakologiczne z użyciem U0126 wzmacnia interpretację szlaków sygnałowych, lecz pozostaje mniej specyficzne niż manipulacje genetyczne lub selektywne dla konkretnego typu komórek^{20,21,22,23,24,25}.

Przyszłe zastosowania obejmują badanie obu płci, większych obrażeń chirurgicznych, klinicznie wykonalnych dróg podawania leków, dodatkowych punktów czasowych po operacji oraz interwencji celowanych w konkretne populacje glejowe. Opisany schemat postępowania jest praktyczny w przesiewowym badaniu potencjalnych leków przeciwbólowych lub modulatorów gleju, ponieważ model nacięcia jest szybki, punkty końcowe behawioralne są powtarzalne, a analizy molekularne opierają się na standardowych metodach laboratoryjnych. Powtarzalność zależy jednak od uprzednio określonych kryteriów wykluczenia, ślepej oceny wyników, spójnego pozyskiwania obrazów oraz pełnego raportowania surowych danych i ustawień analizy.

Ograniczenia

Niniejsze badanie posiada kilka ograniczeń. Po pierwsze, model nacięcia podeszwy łapy reprezentuje stosunkowo niewielki uraz chirurgiczny i może nie w pełni odzwierciedlać rozległe procedury operacyjne, takie jak torakotomia czy laparotomia. W związku z tym należy zachować ostrożność przy ekstrapolowaniu obecnych wyników na inne rodzaje bólu pooperacyjnego. Ponadto do badania włączono wyłącznie samce szczurów Sprague–Dawley, co ogranicza możliwość generalizacji tych wyników na obie płcie. Biorąc pod uwagę znane różnice w odpowiedziach bólowych, efektach przeciwbólowych i wzorcach aktywacji glejowej w zależności od płci, uzasadnione jest przeprowadzenie dalszych badań z uwzględnieniem samic.

Główne obserwacje molekularne i histologiczne koncentrowano na punkcie czasowym 4 h po nacięciu. Ponieważ różne punkty końcowe, w tym GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 oraz wyniki behawioralne, wykazały odmienne profile czasowe po nacięciu, interpretacja mechanistyczna niniejszych wyników powinna ograniczać się głównie do wczesnego etapu po nacięciu. Co więcej, eksperymenty molekularne opisane w niniejszej pracy przeprowadzono na stosunkowo ograniczonej liczbie próbek, co mogło zmniejszyć istotność statystyczną tych obserwacji.

Kinazę regulowaną sygnałem zewnątrzkomórkowym 1 i 2 oceniano wspólnie jako p-ERK1/2; ich poszczególne wkłady nie były badane osobno. W związku z tym w niniejszym badaniu nie można było określić odpowiednich ról ERK1 i ERK2 w przetwarzaniu bólu wywołanego nacięciem. Ponadto ilościowe oznaczenie intensywności fluorescencji oparto na ograniczonej liczbie zwierząt i pól, a analiza nie obejmowała stereologicznego liczenia komórek ani formalnych współczynników ko-lokalizacji. Obserwacje te należy zatem interpretować z ostrożnością, w połączeniu z wynikami analizy Western blot.

Wreszcie, choć eksperymenty z ratowaniem astrocytów in vitro dostarczyły dowodów mechanistycznych na regulację mediatorów zapalnych zależną od ERK1/2, zdarzenia regulacyjne powyżej tego procesu po nacięciu oraz zdarzenia poniżej w nienaruszonym tkance rdzenia kręgowego nie zostały zgłębione. System hodowli in vitro nie może również w pełni odwzorować oddziaływań między neuronami, astrocytami, mikroglejem i infiltrującymi komórkami odpornościowymi w tylnym rogu rdzenia kręgowego. W związku z tym niniejsze badanie wspiera mechanizm związany z ERK1/2, ale nie ustanawia pełnej przyczynowości specyficznej dla komórek in vivo.

Wnioski

Niniejsze badanie wykazuje, że zwiększona ekspresja NeuN, GFAP i Iba-1 w rdzeniu kręgowym wywołana nacięciem została osłabiona przez przedoperacyjne doprzwiałe podanie PPF. Efekt ten towarzyszyło ustąpienie ostrej hiperalgezji mechanicznej i termicznej oraz zmniejszenie fosforylacji ERK1/2 oraz ekspresji TNF-α i COX-2 po nacięciu. Jednakże wyniki te wspierają (choć nie stanowią ostatecznego dowodu mechanistycznego) istnienie związku między działaniem antyhiperalgetycznym PPF a zmniejszoną fosforylacją ERK1/2 w komórkach glejowych rdzenia kręgowego (związanym ze zmniejszoną ekspresją mediatorów zapalnych). Działanie antyhiperalgetyczne PPF utrzymywało się przez cały okres obserwacji po nacięciu, podczas gdy efekt inhibitora MEK1/2 U0126 ograniczał się głównie do wczesnego okresu po nacięciu. Wyniki te sugerują, że sygnalizacja ERK1/2 może być szczególnie istotna podczas wczesnego rozwoju bólu po nacięciu. Dłużej utrzymujący się efekt PPF wskazuje, że jego mechanizm działania może obejmować dodatkowe szlaki poza samą inhibicję ERK1/2. Zatem PPF może stanowić potencjalną interwencję terapeutyczną, a nie cel biologiczny, w celu poprawy leczenia ostrego bólu pooperacyjnego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
bufor PBS 0,01 M	Solarbio	P1020
bufor Tris-HCl 1,0 M (pH 6,8)	Solarbio	T1020
bufor Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8)	Solarbio	T1010
10% siarczan dodecylu sodu (SDS)	Solarbio	S1010
10× roztwór stokowy TBST	Solarbio	T1081
30% akrylamid	Solarbio	A1010
4× bufor do ładowania białek	Solarbio	P1041
Adobe Photoshop	Adobe	—
Wodoronadtlenian amonu	Solarbio	A1030
Automatyczna maszyna do lodu łuskowego	Changshu Xueke	IMS-40
Albumin surowicy bydlęcej (BSA)	Solarbio	A8020
Kriostat CM150	Leica	CM150
Cyfrowy pH-metr	—	PHS-3C
Dimetylosulfoksyd (DMSO)	Solarbio	D8371
Elektroniczna waga analityczna	Cany	—
odczyn do wzmocnionej chemiluminescencji (ECL)	Solarbio	PE0010
Film	Kodak	—
Mikroskop fluorescencyjny DP71	Olympus	DP71
Kryjanka do mrożenia tkanek	Sakura	4583
Aparatura do elektroforezy żelowej	BIO-RAD	—
Glicerol	Solarbio	IG0910
Glicyna	Solarbio	G8200
przeciwciało wtórne kozie anty-mysie Alexa Fluor 594	Proteintech	SA00013-3
przeciwciało wtórne przeciwko mysim przeciwciałom z koziego surowicy sprzężone z peroksydazą chrzanową	ZSGB-BIO	ZB2305
kozi przeciwciało wtórne antykrólicze Alexa Fluor 488	Proteintech	SA00013-2
przeciwciało wtórne kozie przeciwko króliczym, sprzężone z peroksydazą chrzanową	ZSGB-BIO	ZB2301
Surowica kozia	Solarbio	SL038
GraphPad Prism	Oprogramowanie GraphPad	5
Chłodzona wirówka wysokoprędkościowa 3K15	Sigma	3K15
Horyzontalna inkubator-potrząsarka orbitalna TS-1000	Haimen Qilinbeier	TS-1000
ImageJ	Narodowe Instytuty Zdrowia	1.51j8
Metanol	Tianjin Guangfu	—
Pierwotne przeciwciało mysie przeciwko szczurej GAPDH	Proteintech	60004-1-Ig
pierwotne przeciwciało mysie anty-szczurze przeciwko p-ERK1/2	CST	9101S
Na2HPO3	Tianjin Beichen Fangzheng	—
NaH2PO3	Tianjin Damao	—
Paraformaldehyd	Biosharp	BL539A
Preparaty mikroskopowe klasy patomorfologicznej	Shitai	—
Fluorek fenylometanosulfonylowy (PMSF)	Beyotime	ST506
Test podeszewny 37370	UGO BASILE	37370
Membrana z polifluorku winylidenu	Solarbio	—
Propentofyllina (PPF)	Taosu	T19812
Królicze przeciwciało pierwszorzędowe anty-COX-2 szczura	Abcam	Ab179800
Przeciwciało pierwszorzędowe królicze anty-szczurze GFAP	Proteintech	16825-1-AP
pierwotne przeciwciało królicze anty-rat Iba-1	Proteintech	10904-1-AP
Królicze przeciwciało pierwszorzędowe anty-szczur NeuN	Abcam	Ab279297
królicze przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko szczurzemu t-ERK1/2	Proteintech	11257-1-AP
przeciwciało królicze przeciwko szczurzemu TNF-α przeciwciało pierwszorzędowe	Proteintech	29652-1-AP
bufor lizujący RIPA	Solarbio	R0010
SDS	Solarbio	S8010
Odskórzone mleko w proszku	Solarbio	D8340
SPSS	IBM	22
tetrametyloetylenodiamina (TEMED)	Solarbio	T8090
Tris	Solarbio	T8060
Triton X-100	Solarbio	T8200
U0126-EtOH	Selleck	S1102
Zamrażarka ultra niskotemperaturowa	Haier	—
Zamrażarka niskotemperaturowa	Sanyo	—
System oczyszczania wody ultraczystej	Siła Leczenia	—
filamenty von Freya	North Coast Medical	—