Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł badawczy

Propentofyllina łagodzi hiperalgezję po nacięciu poprzez regulację fosforylacji ERK1/2 w astrocytach i mikrogleju rdzenia kręgowego

32 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70927

⸱

14 sierpnia 2026

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Zhang Ye People's Hospital Affiliated To Hexi University, 2Department of Stomatology, Zhangye Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Anesthesiology, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejsze badanie ocenia wpływ propentofiliny podanej dokanałowo na łagodzenie hiperalgezji po nacięciu oraz sprawdza, czy efekt ten wiąże się ze zmianami markerów glejowych w rdzeniu kręgowym i fosforylacją kinazy 1 i 2 regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym u szczurów.

Streszczenie

Astrocyty rdzenia kręgowego, mikroglej oraz kinaza regulowana sygnałami zewnątrzkomórkowymi 1 i 2 (ERK1/2) są zaangażowane w przetwarzanie bólu. Niniejsze badanie miało na celu sprawdzenie, czy przedoperacyjne dostarczenie propentofylliny (PPF) drogą dokanałową łagodzi ostrą hiperalgezję po nacięciu u szczurów oraz czy efekt ten wiąże się z markerami gleju rdzeniowego i fosforylacją ERK1/2. Sześćdziesiąt sześć samców szczurów linii Sprague–Dawley randomly przydzielono do grup: kontrolnej (blank), bólu po nacięciu, soli fizjologicznej, dimetylosulfoksydu, PPF oraz U0126. Hiperalgezję mechaniczną i termiczną oceniano w punkcie wyjściowym oraz 2, 4, 8, 24 i 72 h po nacięciu. Markery neuronalne i glejowe rdzenia kręgowego, p-ERK1/2 oraz mediatory stanu zapalnego oceniano za pomocą metody Western blotting i immunofluorescencji. Dodatkowo przeprowadzono doświadczenia na pierwotnych astrocytach rdzenia kręgowego, aby zbadać zależne od ERK1/2 uwalnianie mediatorów zapalnych. Przedoperacyjna podaż dokanałowa PPF łagodziła hiperalgezję mechaniczną i termiczną przez cały 72-godzinny okres obserwacji, podczas gdy U0126 łagodziło hiperalgezję głównie we wczesnej fazie po nacięciu. W 4 h po nacięciu obie terapie wiązały się ze zmniejszoną ekspresją GFAP, Iba-1 i p-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym oraz zmniejszoną immunoreaktywnością TNF-α i COX-2. W hodowlanych astrocytach PPF redukowała indukowane LPS uwalnianie mediatorów zapalnych, natomiast konstytutywnie aktywna ERK1/2 osłabiała ten efekt. Wyniki te potwierdzają związek między efektem antyhiperalgetycznym PPF a modulacją odpowiedzi glejowej, związanej z ERK1/2 oraz odpowiedzi zapalnej w rdzeniu kręgowym po nacięciu.

Wprowadzenie

Ból pooperacyjny, częsty rodzaj ostrego bólu występujący po zabiegach chirurgicznych, zazwyczaj nie utrzymuje się dłużej niż 7 dni, lecz charakteryzuje się złożonymi mechanizmami patologicznymi, które różnią się od mechanizmów bólu zapalnego i neuropatycznego1,2. Jeśli ból pooperacyjny nie jest odpowiednio kontrolowany w fazie jego rozwoju, może on przejść w zespół bólu przewlekłego, a jego charakter może zmienić się z bólu związanego z ostrym uszkodzeniem tkanek na ból neuropatyczny lub mieszany3. Zazwyczaj najpowszechniejszą formą analgezji po nacięciu jest podawanie leków przeciwbólowych, takich jak opioidy i niesteroidowe leki przeciwzapalne. Jednak ciągłe stosowanie tych leków lub podawanie ich w wysokich dawkach może powodować wiele skutków ubocznych, co podkreśla potrzebę opracowania bezpieczniejszych i skuteczniejszych strategii przeciwbólowych.

Niezawodne dowody wskazują, że propentofyllina (PPF) łagodzi hiperalgezję w różnych procesach bólowych4,5. Co więcej, efekt przeciwbólowy PPF może być częściowo osiągnięty poprzez hamowanie ekspresji rdzeniowej kinaz białkowych aktywowanych mitogenem (MAPK), takich jak p38 oraz kinazy c-Jun N-końcowe (JNK)6. Choć wpływ PPF na szlaki p38 i JNK został ustalony, jej potencjalna modulacja szlaku kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym 1 i 2 (ERK1/2), kolejnej kluczowej podrodziny MAPK zaangażowanej w przesyłanie sygnałów bólowych, pozostaje nie zbadana w przypadku ostrego bólu po nacięciu. Ta luka w wiedzy jest szczególnie istotna, biorąc pod uwagę, że aktywacja ERK1/2 wykazuje odmienne wzorce czasowe i komórkowe w porównaniu z p38 i JNK, co sugeruje potencjalnie unikalne możliwości terapeutyczne.

Pierwotnie uważano, że komórki glejowe, w tym astrocyty, mikroglej i oligodendrocyty, stanowią jedynie strukturę łączną i wspierającą tkankę nerwową. Jednakże najnowsze badania wykazały, że astrocyty i mikroglej odgrywają istotną rolę w regulacji plastyczności synaptycznej oraz przekazywaniu informacji o bólu7. Jako rezydentne makrofagi mózgu i rdzenia kręgowego, mikroglej może być aktywowany przez szereg sygnałów stymulujących z zewnątrz na bardzo wczesnym etapie procesu bólowego, a następnie proliferować i uwalniać duże ilości cytokin zapalnych, co zwiększa przewodzenie sygnałów bólowych z rdzenia kręgowego do mózgu8,9. Jednocześnie aktywowane astrocyty mogą zwiększać uwalnianie pobudzającego neuroprzekaźnika glutaminianu i przesyłać informacje bezpośrednio do neuronów sensorycznych poprzez wzmacnianie komunikacji międzykomórkowej10.

Badania wykazały, że aktywacja astrocytów występuje we wczesnym stadium (w ciągu pierwszych 24 h) bólu wywołanego nacięciem, podczas gdy aktywacja mikrogleju pojawia się znacznie później11,12. Dodatkowo jedno badanie wskazało, że aktywowany mikroglej ma ograniczony wpływ na hiperalgezję mechaniczną w bólu wywołanym nacięciem13. Wyniki te podkreślają nierozstrzygnięte kwestie dotyczące odmiennych ról astrocytów i mikrogleju w ostrym bólu. Doniesiono, że propentofyllina, środek modulujący glej, łagodzi hiperalgezję poprzez regulację aktywacji astrocytów i mikrogleju po chronicznym uciśnięciu nerwu, ostrym uszkodzeniu nerwu oraz ostrym uszkodzeniu tkanek4,5. Jednakże, według obecnej wiedzy, żadne badanie nie analizowało wpływu PPF na aktywację astrocytów lub mikrogleju w ostrym bólu wywołanym nacięciem.

Zewnątrzkomórkowa sygnale-regulowana kinaza 1 i 2, główna podrodzina MAPK aktywowana w szlaku sygnałowym za kinazą białkową aktywowaną mitogenami 1 i 2 (MEK1/2), jest szeroko wiązana z procesami nocyceptywnymi oraz plastycznością neuronalną14,15. Wcześniejsze badania wykazały, że p-ERK1/2 (fosfo-ERK1/2) może być indukowane w neuronach rdzeniowych przez stymulację nocyceptywną, a także może być wykrywane w astrocytach i mikrogleju w stanach bólu zapalnego lub neuropatycznego16,17,18,19. Ponadto zgłoszono, że farmakologiczne hamowanie sygnalizacji MEK1/2–ERK1/2 łagodzi hiperalgezję mechaniczną i termiczną w kilku modelach bólu20,21,22,23,24,25.

Jednakże rozkład komórkowy rdzeniowego ERK1/2, szczególnie w astrocytach i mikrogleju, aktywowanego przez ostre nacięcie, oraz jego rola w bólu wywołanym nacięciem pozostają niewystarczająco zdefiniowane. Poprzednie badania grupy badawczej wskazują, że PPF łagodzi ostrą hiperalgezję po nacięciu u szczurów poprzez redukcję rdzeniowego sygnalizowania JNK i p38, lecz nie jest jasne, czy PPF moduluje również sygnalizację związaną z ERK1/2 w rdzeniowych komórkach glejowych podczas bólu wywołanego nacięciem. W związku z tym niniejsze badanie należy uznać za rozszerzenie istniejących ram dotyczących gleju i MAPK w badaniach nad bólem, a nie za całkowicie niezależny paradygmat mechanistyczny. Jego główna odrębność od wcześniejszych prac polega na skupieniu się konkretnie na ostrym bólu po nacięciu, badaniu ERK1/2 zamiast p38/JNK jako interesującego komponentu MAPK oraz ocenie wczesnego rdzeniowego rozkładu komórkowego p-ERK1/2 w relacji do leczenia PPF.

Celem niniejszej pracy było zbadanie, czy przedoperacyjne podanie PPF drogą dokanałową łagodzi hiperalgezję po nacięciu w szczurzym modelu nacięcia podeszwy stopy oraz czy efekt ten jest powiązany z fosforylacją ERK1/2 lub zmianami w ekspresji rdzeniowych markerów neuronalnych i glejowych oraz mediatorów zapalnych, takich jak czynnik martwiczyczo-stymulujący TNF-α oraz cyklooksygenaza-2 (COX-2). W szczególności badanie to różni się od wcześniejszych doniesień połączeniem oceny behawioralnej z czasową analizą metodą Western blot, porównaniem farmakologicznym z inhibitorem MEK1/2 U0126 oraz jakościową lokalizacją p-ERK1/2 za pomocą immunofluorescencji w neuronach rdzeniowych, astrocytach i mikrogleju w ostrym modelu bólu po nacięciu. Choć ramy mechanistyczne opierają się na wcześniejszej literaturze łączącej modulację gleju i sygnalizację MAPK z bólem, niniejsza praca ma na celu dostarczenie dodatkowych dowodów na możliwy udział rdzeniowych odpowiedzi glejowych związanych z ERK1/2 we wczesnej fazie hiperalgezji po nacięciu.

W porównaniu z konwencjonalnymi lekami przeciwbólowymi stosowanymi po operacjach, podejścia celowane w konkretne szlaki mogą pozwolić na badanie określonego komponentu sygnałowego, lecz mogą zapewniać korzyści jedynie przez ograniczony czas i mogą wymagać inwazyjnych metod podania; hamowanie MEK1/2–ERK1/2 wykazało działanie antyhiperalgetyczne w kilku eksperymentalnych modelach bólu20,21,22,23,24,25. PPF różni się od inhibitorów pojedynczego szlaku tym, że moduluje odpowiedzi glejowe i został powiązany z więcej niż jednym procesem zależnym od MAPK4,5,6. Praktyczne zastosowanie kliniczne pozostaje ograniczone przez projekt przedkliniczny, przedoperacyjne podanie dokanałowe, wykorzystanie wyłącznie samców szczurów oraz brak badań nad zakresem dawek i bezpieczeństwem w większych modelach chirurgicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Przeprowadzone eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Drugiego Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu w Lanzhou, prowincja Gansu, Chiny (numer zgody etycznej 2017-070). Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi International Association for the Study of Pain26. Wykorzystano łącznie 66 dorosłych samców szczurów Sprague–Dawley o masie 200–250 g, pozyskanych z akredytowanego centrum zwierząt laboratoryjnych. Do badania włączono wyłącznie samce, aby ograniczyć potencjalną zmienność związaną z hormonami zależnymi od płci. Wszystkie protokoły wykonano zgodnie z wytycznymi International Association for the Study of Pain26, podejmując niezbędne starania w celu zminimalizowania cierpienia zwierząt. Szczegółowe informacje na temat odczynników, materiałów eksploatacyjnych, instrumentów i oprogramowania wykorzystanego w tej pracy znajdują się w Tabeli materiałów.

Zwierzęta

Szczury trzymano w parach przed operacją i indywidualnie po nacięciu, z dostępem do jedzenia i wody ad libitum. W pomieszczeniu utrzymywano 12-godzinny cykl światła i ciemności oraz kontrolowaną temperaturę 24 °C ± 2 °C.

Model bólu po nacięciu i iniekcja dokanałowa

W celu podania roztworów drogą dokanałową, szczury zanieczulono sewofluranem w stężeniu 1,5%–3% (podawanym przez maskę nosową) i ułożono w pozycji brzusznej z wygiętą kręgosłupem. Wygolono sierść w okolicy lędźwiowej, a skórę nad przestrzenią międzykręgową L5–L6 zdezynfekowano. Mikrostrzykawkę wprowadzono przezskórnie w przestrzeni międzykręgowej L5–L6. Prawidłowe wprowadzenie do przestrzeni podpajęczynowej sygnalizował gwałtowny ruch ogona podczas posuwania igły, co dodatkowo potwierdzono pojawieniem się płynu mózgowo-rdzeniowego podczas delikatnej aspiracji. W przypadku braku tych objawów korygowano położenie igły przed wykonaniem iniekcji. Iniekcję przeprowadzano dopiero po spełnieniu obu kryteriów potwierdzenia, a zwierzęta wykazujące nieprawidłowe objawy neurologiczne po wstrzyknięciu wykluczano z badania. Następnie powoli wstrzykiwano odpowiedni roztwór, a po zakończeniu procedury ponownie oczyszczano skórę. Zabieg chirurgiczny trwał około 3 min, a szczury zazwyczaj budziły się z narkozy w ciągu 5–10 min.

Szczurzy model bólu po nacięciu utworzono zgodnie z wcześniejszym opisem27. Po podaniu znieczulenia powierzchnię podeszwową tylnej łapy zdezynfekowano 10% roztworem powidonu z jodem. W skórze podeszwowej wykonano podłużne nacięcie o długości 1 cm, zaczynając około 0,5 cm od pięty i prowadząc w stronę palców. Nacięcie przechodziło przez skórę i powięź. Mięsień podeszwowy delikatnie uniesiono pęsetą okulistyczną i nacięto wzdłużnie, zachowując ogólną ciągłość tkanki. Następnie przywrócono mięsień na miejsce, zastosowano delikatny ucisk w celu uzyskania hemostazy, a ranę zamknięto dwoma szwami materacowymi przy użyciu nici nylonowej 3-0. Po zamknięciu rany miejsce nacięcia ponownie zdezynfekowano. Po zabiegu szczury zamknięto w pojedynczych klatkach i pozostawiono do rekonwalescencji w cichym, ciepłym środowisku, chronionym przed silnym światłem, z wolnym dostępem do pożywienia i wody. Zwierzęta monitorowano po operacji, a te, które nie spełniały zdefiniowanych wcześniej kryteriów, niezwłocznie wykluczono. Zakażenie rany określano na podstawie zaczerwienienia, obrzęku i podwyższonej lokalnej temperatury wokół rany, obecności nieprawidłowej żółto-zielonej ropnej wydzieliny o nieprzyjemnym zapachu, opóźnionego gojenia z trwałą szczeliną rany, martwicy i powiększenia się rany oraz objawów ogólnoustrojowych, w tym podwyższonej temperatury ciała, letargu i odmowy przyjmowania pokarmu. Dodatkowe kryteria wykluczenia obejmowały: brak wybudzenia z narkozy w ciągu 30 min, śródoperacyjne przecięcie mięśnia lub uszkodzenie naczyniowo-nerwowe, pooperacyjną automutilację, niepowodzenie w utworzeniu modelu oraz deficyty neurologiczne, takie jak paraliż tylnych kończyn lub niezdolność do obciążania kończyny niezwiązaną z bólem po nacięciu. Szczury z zakażeniem rany lub rozejściem się brzegów rany wykluczono z badania.

Pomiar behawioralny

Mechaniczny próg wycofania łapy (PWMT) oraz czas latencji termicznej wycofania łapy (PWTL) były mierzone przez badacza, który nie znał przydziału zwierząt do grup. Badania przeprowadzano w cichym pomieszczeniu o stałej porze dnia, po co najmniej 10 min aklimatyzacji; zapewniono stałe warunki dotyczące klatek, rodzaju podłoża (siatka lub szkło), oświetlenia otoczenia oraz intensywności źródła ciepła dla wszystkich grup. W badaniu PWMT skalibrowane włókna von Freya (0.4 g, 0.6 g, 1.0 g, 1.4 g, 2.0 g, 4.0 g, 6.0 g, 8.0 g, 10.0 g oraz 15.0 g) przykładano prostopadle do powierzchni podeszwowej w pobliżu rany, aż do momentu ugięcia włókna o około 1–2 mm. Kolejne stymulacje oddzielano 2 min odstępu, a wartość 50% PWMT określano metodą up-and-down28. W badaniu PWTL szczury umieszczano w indywidualnych przezroczystych klatkach na szklanej podłodze, a promiennicze źródło ciepła ustawiano w linii z powierzchnią podeszwową obok rany. Aby zapobiec uszkodzeniu tkanek zastosowano 30 s czas odcięcia, kolejne ekspozycje oddzielano 2 min odstępu, a zapisywano średnią z trzech pomiarów29. Podniesienie, potrząsanie lub lizanie łapy uznawano za pozytywną reakcję wycofania; próby zakłócone przez pielęgnację, ruch lub utratę osiowości źródła ciepła powtarzano po ponownej aklimatyzacji.

Analiza Western blot

W wyznaczonych punktach czasowych szczury uśpiono poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych, a rdzeń kręgowy z odcinka lędźwiowego L4–L6 szybko pobrano do buforu lizującego do analizy radioimmunoprecypitacyjnej z dodatkiem inhibitora proteaz w stosunku 100:1. Tkankę zhomogenizowano, pozostawiono w lodzie na 20 min i odwirowano przy 15 000 × g przez 20 min w temperaturze 4 °C. Nadlodzynę zmieszano z 4× buforem do ładowania w stosunku 3:1, podgrzano w wrzącej wodzie przez 5 min i przechowywano w temperaturze −80 °C. Próbki białek (30 µg na ścieżkę) rozdzielono na 10% żelach poliakrylamidowych z dodecylosiarczanem sodu i przeniesiono na membrany z polifluorku winylidenu o porach 0,45 lub 0,22 µm. Prawidłowość transferu sprawdzono, potwierdzając oczekiwaną migrację wstępnie zabarwionego markera masy cząsteczkowej oraz brak wyraźnych nierównomiernych lub przerwanych obszarów transferu. Membrany blokowano 5% mlekiem odtłuszczonym i 3% albuminą surowicy bydlęcej przez 2 h w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano przez noc w 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko NeuN (1:8 000), GFAP (1:4 000), Iba-1 (1:3 000), p-ERK1/2 (1:1 000), t-ERK1/2 (1:3 000) lub GAPDH (1:2 000). Po przemyciu w soli fizjologicznej buforowanej Trisem z dodatkiem 0,05% Tween 20 (pH 7,4), membrany inkubowano z odpowiednim wtórnym przeciwciałem sprzężonym z peroksydazą chrzanową (1:5 000) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Sygnały wywołano za pomocą wzmocnionej chemiluminescencji i zarejestrowano na kliszy, stosując ten sam zakres ekspozycji dla każdego celu. Badacz nieznający przydziału grup analizował gęstość prążków za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Obrazy przekształcono na 8-bitową skalę szarości, do każdego prążka zastosowano identyczny prostokątny obszar zainteresowania, odjęto lokalne tło z sąsiedniego pustego obszaru i zarejestrowano zintegrowaną gęstość. Ten sam rozmiar obszaru i procedura odejmowania tła zostały zastosowane dla wszystkich ścieżek na danej blocie. Poziomy NeuN, GFAP, Iba-1 oraz t-ERK1/2 znormalizowano względem GAPDH; p-ERK1/2 znormalizowano względem t-ERK1/2, a następnie wartości wyrażono w stosunku do grupy kontrolnej.

Immunofluorescencja

W wyznaczonych punktach czasowych szczury zanestezjowano 3% pentobarbitalem sodu (1,5 mL/kg) i przeprowadzono perfuzję przez serce 300 mL schłodzonego 0,01 mol/L roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; pH 7,4), a następnie 250 mL schłodzonej 4% paraformaldehydu. Odcinek rdzenia kręgowego L4–L6 poddano post-fiksacji w 4% paraformaldehydzie przez 6 h, krioprotekcji przez noc w 20%–30% sacharozie w PBS w temperaturze 4 °C, a następnie pocięto na sekcje o grubości 10 µm w temperaturze −22 °C. Sekcje przemyto w 0,01 mol/L PBS, blokowano w 10% surowicy koziej przez 1 h w temperaturze pokojowej i inkubowano przez noc w 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko NeuN (1:100), GFAP (1:1 000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) lub COX-2 (1:50). Po trzykrotnym przemyciu w PBS sekcje inkubowano z odpowiednim przeciwciałem wtórnym sprzężonym z zielonym lub czerwonym fluorophorem (1:400) przez 1 h w temperaturze pokojowej, przemyto ponownie trzykrotnie w PBS i zamontowano z użyciem medium anty-fade oraz szkiełka cover-slip. W każdej serii barwień uwzględniono sekcje kontrolne negatywne, przetworzone bez przeciwciała pierwszorzędowego. Obrazy zostały pozyskane przez badacza w procedurze ślepej próby przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Przeglądowe obrazy przy niskim powiększeniu wykonano przy użyciu obiektywu 10×, natomiast obrazy immunoreaktywności komórkowej i kolokalizacji pozyskano przy użyciu obiektywów 20× lub 40×, zgodnie z odpowiednim panelem rysunku. Dla porównań w obrębie tego samego rysunku i serii barwień powiększenie obiektywu, natężenie oświetlenia, czas ekspozycji, wzmocnienie detektora, ustawienia kamery oraz parametry przetwarzania obrazu zostały ustalone po optymalizacji poniżej poziomu nasycenia. Osobne kanały fluorescencyjne pozyskiwano sekwencyjnie, aby zminimalizować nakładanie się kanałów. W przypadku każdego zwierzęcia zarejestrowano trzy niezachodzące na siebie pola w ipsilateralnym rogu tylnym. Natężenie fluorescencji ilościowo określono za pomocą oprogramowania do analizy obrazu po konwersji do 8 bitów, odjęciu tła z wykorzystaniem obszaru wolnego od komórek oraz zastosowaniu identycznego obszaru zainteresowania (ROI) i progu w każdej serii barwień; wartości z pól uśredniono, aby uzyskać jedną wartość na zwierzę. Pola z prześwietleniami, pofałdowaniami tkanki, rozdarciami, słabym ogniskowaniem lub nierównym tłem zostały wykluczone i ponownie pozyskane przy tych samych nienasycających ustawieniach. Barwienie uznano za prawidłowe, gdy architektura tkanki była nienaruszona, sygnał docelowy przekraczał poziom kontroli bez przeciwciała pierwszorzędowego i analiza nie była zaburzona przez żadne istotne pofałdowanie, rozdarcia lub region nasycony.

In vitro eksperymenty na pierwotnych astrocytach rdzenia kręgowego

Pierwotne astrocyty rdzenia kręgowego szczura hodowano w standardowych warunkach sterylnych w pełnej pożywce hodowlanejj w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaną atmosferą zawierającą 5% CO2. Komórki wykorzystywano po osiągnięciu konfluencji na poziomie około 70%–80% i przydzielano do grup: kontrolnej, stymulowanej LPS, LPS + PPF, LPS + U0126 oraz grupy ratowania ERK1/2. PPF oraz U0126 dodawano w stężeniu 10 µM. Warunki stymulacji LPS, traktowania lekami oraz zbioru materiału były identyczne dla równoległych dołków w każdym eksperymencie. W celu analizy selektywności szlaków pobrano lizaty komórkowe do analizy Western blotting w celu oznaczenia p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, całkowitego p38, p-JNK, całkowitego JNK oraz odpowiedniej kontroli załadunku. Nadnadkładowe pożywki z równoległych dołków pobrano, klarowano poprzez wirowanie i analizowano pod kątem zawartości TNF-α, PGE2 i IL-6 za pomocą testu ELISA zgodnie z instrukcjami producenta. Densitometria Western blot była przeprowadzana zgodnie z opisanymi powyżej zasadami analizy obrazu. W eksperymentach z ratowaniem ekspresję endogennego ERK1/2 wyciszano poprzez transfekcję siRNA, a przed traktowaniem wprowadzano konstrukt ekspresyjny konstytutywnie aktywnego ERK1/2 (CA-ERK1/2). Efektywność wyciszenia i nadekspresji potwierdzono metodą Western blotting przed interpretacją danych dotyczących cytokin. Komórki poddane działaniu odczynnika do transfekcji bez aktywnego siRNA lub konstruktu służyły, w zależności od potrzeb, jako kontrole proceduralne.

Projekt doświadczalny

Podział zwierząt doświadczalnych na podgrupy

Szczury przydzielono do sześciu grup przy użyciu metody tablicy liczb losowych; przydział do grup zakończono przed testami behawioralnymi i pobraniem tkanek. Sześć grup obejmowało grupę kontrolną (blank) (n = 6), grupę z bólem po nacięciu (IP) (n = 18), grupę z solą fizjologiczną (NS) (0,9% NS, 10 µL; n = 9), grupę PPF (10 µg w 10 µL; n = 12), grupę z dimetylosulfotlenkiem (DMSO) (10% DMSO, 10 µL; n = 9) oraz grupę U0126 (10 µg w 10 µL; n = 12). Szczury w grupie kontrolnej nie otrzymały ani nacięcia podeszwy, ani wstrzyknięcia do przestrzeni dokanałowej, pełniąc rolę kontroli nieleczonej. Szczury w grupie IP poddano nacięciu podeszwy bez wcześniejszego podania leku drogą dokanałową. Szczury w grupach NS, PPF, DMSO i U0126 otrzymały odpowiednie substancje w wstrzyknięciu dokanałowym na 30 min przed nacięciem podeszwy. Grupa NS służyła jako kontrola nośnika dla PPF, natomiast grupa DMSO jako kontrola nośnika dla U0126.

Dawki propentofylliny i U0126

Propentofyllina jest modulatorem glejowym; wybrano dawkę 10 µg, ponieważ w poprzednich badaniach przeprowadzonych przez grupę badawczą łagodziła ona ostrą hiperalgezję. U0126 jest inhibitorem MEK1/2 nieskonkurującym z adenozynotrifosforanem, stosowanym w celu zablokowania fosforylacji ERK1/2. W różnych modelach bólu zgłaszano skuteczne dawki dokanałowe w zakresie 1–10 µg30,31,32; w niniejszym badaniu zastosowano dawkę 10 µg. U0126 rozpuszczono w 10% dimetylosulfoksydzie, natomiast PPF rozpuszczono w 0,9% soli fizjologicznej. Końcowe stężenia wynosiły 1 µg/µL. Leki i roztwory nośnikowe przygotowano przed zabiegiem chirurgicznym, przechowywano w temperaturze 4 °C i wykorzystano w ciągu 12 h.

Wpływ przedoperacyjnego podania dopłynnego propentofylliny lub U0126 na hiperalgezję

Sześć szczurów z każdej grupy wybrano losowo do pomiarów behawioralnych na 24 h przed operacją, a uzyskane wartości PWMT i PWTL wyznaczono jako wartości bazowe. Iniekcje dokanaściowe podano 30 min przed operacją. Aby ocenić wpływ przedoperacyjnego dokanaściowego podania PPF i U0126 na hiperalgezję mechaniczną i termiczną, PWMT oraz PWTL oceniano po 2 h, 4 h, 8 h, 24 h i 72 h od nacięcia.

Projekt eksperymentalny do oceny wpływu przedoperacyjnego wewnątrzoponowego podania propentofylliny lub U0126 na ekspresję markerów neuronalnych i glejowych w rdzeniu kręgowym po nacięciu

Aby określić odpowiedni punkt czasowy po nacięciu do oceny efektu leczenia, w grupie IP przeprowadzono wstępną analizę przebiegu czasowego. W szczególności szczury w grupie IP zostały poddane eutanazji w 2 h, 4 h, 24 h i 72 h po nacięciu, a poziomy ekspresji markerów komórkowych NeuN, GFAP i Iba-1 w rdzeniu kręgowym zmierzono za pomocą metody Western blot (n = 3 na punkt czasowy). Na podstawie tej wstępnej analizy pierwsze 4 h po nacięciu wybrano jako wczesne okno obserwacyjne, ponieważ ekspresja NeuN osiągnęła najwyższy poziom w 4 h, a wczesne zmiany molekularne uznano za najistotniejsze dla początkowego rozwoju hiperalgezji po nacięciu. Punkt czasowy 4 h nie miał jednak reprezentować wszystkich czasowych zmian molekularnych po nacięciu.

W wybranym punkcie czasowym szczury, którym podano zastrzyk dokanałowy, zostały uśmiercone w celu przeprowadzenia analizy Western blot dla różnych markerów komórkowych (n = 3 na grupę) oraz oceny immunofluorescencyjnej morfologii różnych typów komórek (n = 3 na grupę). W grupie kontrolnej (blank) szczury zostały randomly uśmiercone, aby określić podstawowe poziomy ekspresji różnych markerów komórkowych (NeuN, GFAP i Iba-1) w rdzeniu kręgowym metodą Western blot (n = 3) oraz morfologię różnych komórek (neuronów, astrocytów i mikrogleju) za pomocą immunofluorescencji (n = 3). Zatem grupa kontrolna służyła jako baseline dla zwierząt nienaciętych i nieleczonych.

Wpływ leczenia na poziom p-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym oraz na mediatory stanu zapalnego

Aby ustalić odpowiedni punkt czasowy po nacięciu do oceny wpływu leczenia na ekspresję p-ERK1/2 oraz poziomy cytokin zapalnych, w grupie IP przeprowadzono wstępną analizę przebiegu czasowego. W szczególności szczury w grupie IP uśpiono po 2 h, 4 h, 24 h i 72 h od nacięcia, a ekspresję p-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym zmierzono za pomocą techniki Western blot (n = 3 na punkt czasowy). Na podstawie tego eksperymentu z przebiegiem czasowym oraz punktu czasowego, w którym ekspresja NeuN była najwyższa po nacięciu, wybrano 4 h po nacięciu jako stały punkt czasowy dla późniejszej oceny wpływu przedoperacyjnie podanego do przestrzeni podpajęczynówkowej PPF lub U0126 na ekspresję p-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym oraz cytokiny zapalne. Punkt czasowy ten wybrano jako wczesne okno obserwacji mechanistycznej, a nie jako kompleksową reprezentację wszystkich zmian czasowych po nacięciu.

W wybranym punkcie czasowym szczury, którym podano wstrzyknięcie dokanalne, poddano eutanazji w celu przeprowadzenia analizy Western blot w kierunku ekspresji p-ERK1/2 (n = 3 na grupę) oraz oceny immunofluorescencyjnej cytokin zapalnych (n = 3 na grupę). W grupie kontrolnej (blank) szczury uśmiercono w sposób losowy, aby za pomocą Western blot określić podstawowe poziomy ekspresji p-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym (n = 3) oraz cytokin zapalnych (TNF-α i COX-2) metodą immunofluorescencji (n = 3). Zatem grupa kontrolna służyła jako grupa bazowa, bez nacięć i bez podanego leczenia.

Lokalizacja komórkowa p-ERK1/2 w neuronach, astrocytach i mikrogleju rdzenia kręgowego

Aby dalej ocenić dystrybucję komórkową p-ERK1/2 w rdzeniu kręgowym po nacięciu, w grupach Blank i IP przeprowadzono barwienie immunofluorescencyjne 4 h po nacięciu (n = 3).

Analiza statystyczna

Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. Wielkość próby określono w oparciu o wcześniejsze badania grupy badawczej oraz eksperymenty wstępne. Dane behawioralne przeanalizowano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami, przyjmując grupę jako czynnik międzyosobniczy, a czas jako czynnik wewnątrzobiektowy. Dane z Western blot w funkcji czasu oceniono za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA, a następnie przeprowadzono porównania parowe z korektą Bonferroniego. Dane z Western blot i immunofluorescencji dla ustalonych punktów czasowych oceniono za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA z zaplanowanymi porównaniami z korektą Bonferroniego; porównania dwóch grup oceniono za pomocą testu t Studenta. Normalność rozkładu oraz jednorodność wariancji oceniono odpowiednio testem Shapiro-Wilka i testem Levene'a. Obustronną wartość p < 0,05 uznano za istotną statystycznie. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej wymienionego w Tabeli Materiałów. W przypadku eksperymentów in vitro na astrocytach, niezależne hodowle traktowano jako jednostkę analizy; gęstość prążków w Western blot oraz stężenia cytokin porównywano za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA, a następnie zaplanowanych porównań z korektą Bonferroniego lub testu t Studenta dla określonych porównań dwóch grup, zależnie od potrzeb.

Dostępność danych:

Dane potwierdzające wyniki niniejszego badania znajdują się w Pliku uzupełniającym 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wpływ nacięcia oraz przedoperacyjnego doprzewodowego podania propentofylliny lub U0126 na hiperalgezję po nacięciu

Hiperalgezja mechaniczna

Nie stwierdzono istotnych różnic w PWMT pomiędzy sześcioma grupami na 24 h przed operacją (p > 0,05; Rycina 1A,B). W grupie IP PWMT spadło po nacięciu i pozostało istotnie niższe niż wartość wyjściowa od 2 h do 72 h po nacięciu (p < ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Większość pacjentów cierpi z powodu ostrego bólu po operacji, nie tylko fizycznie, ale czasami również psychicznie33, jednak wiele szczegółowych mechanizmów ostrego bólu pooperacyjnego pozostaje nieznanych. Silne działanie leków przeciwbólowych wiąże się z nieuniknionymi skutkami ubocznymi, co sprawia, że poszukiwanie bezpieczniejszych i skutecznych analgetyków ma kluczowe znaczenie. Niniejsze badanie oparto na wcześniej zwalidowanym szczurzym modelu nacięcia skóry do symulacji ostrego bólu pooper...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występuje między nimi żaden osobisty, finansowy, komercyjny ani akademicki konflikt interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Haijiao Zhou oraz Ming Wang za wsparcie techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
bufor PBS 0,01 MSolarbioP1020
bufor Tris-HCl 1,0 M (pH 6,8)SolarbioT1020
bufor Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8)SolarbioT1010
10% siarczan dodecylu sodu (SDS)SolarbioS1010
10× roztwór stokowy TBSTSolarbioT1081
30% akrylamidSolarbioA1010
4× bufor do ładowania białekSolarbioP1041
Adobe PhotoshopAdobe—
Wodoronadtlenian amonuSolarbioA1030
Automatyczna maszyna do lodu łuskowegoChangshu XuekeIMS-40
Albumin surowicy bydlęcej (BSA)SolarbioA8020
Kriostat CM150LeicaCM150
Cyfrowy pH-metr—PHS-3C
Dimetylosulfoksyd (DMSO)SolarbioD8371
Elektroniczna waga analitycznaCany—
odczyn do wzmocnionej chemiluminescencji (ECL)SolarbioPE0010
FilmKodak—
Mikroskop fluorescencyjny DP71OlympusDP71
Kryjanka do mrożenia tkanekSakura4583
Aparatura do elektroforezy żelowejBIO-RAD—
GlicerolSolarbioIG0910
GlicynaSolarbioG8200
przeciwciało wtórne kozie anty-mysie Alexa Fluor 594ProteintechSA00013-3
przeciwciało wtórne przeciwko mysim przeciwciałom z koziego surowicy sprzężone z peroksydazą chrzanowąZSGB-BIOZB2305
kozi przeciwciało wtórne antykrólicze Alexa Fluor 488ProteintechSA00013-2
przeciwciało wtórne kozie przeciwko króliczym, sprzężone z peroksydazą chrzanowąZSGB-BIOZB2301
Surowica koziaSolarbioSL038
GraphPad PrismOprogramowanie GraphPad5
Chłodzona wirówka wysokoprędkościowa 3K15Sigma3K15
Horyzontalna inkubator-potrząsarka orbitalna TS-1000Haimen QilinbeierTS-1000
ImageJNarodowe Instytuty Zdrowia1.51j8
MetanolTianjin Guangfu—
Pierwotne przeciwciało mysie przeciwko szczurej GAPDHProteintech60004-1-Ig
pierwotne przeciwciało mysie anty-szczurze przeciwko p-ERK1/2CST9101S
Na2HPO3Tianjin Beichen Fangzheng—
NaH2PO3Tianjin Damao—
ParaformaldehydBiosharpBL539A
Preparaty mikroskopowe klasy patomorfologicznejShitai—
Fluorek fenylometanosulfonylowy (PMSF)BeyotimeST506
Test podeszewny 37370UGO BASILE37370
Membrana z polifluorku winylidenuSolarbio—
Propentofyllina (PPF)TaosuT19812
Królicze przeciwciało pierwszorzędowe anty-COX-2 szczuraAbcamAb179800
Przeciwciało pierwszorzędowe królicze anty-szczurze GFAPProteintech16825-1-AP
pierwotne przeciwciało królicze anty-rat Iba-1Proteintech10904-1-AP
Królicze przeciwciało pierwszorzędowe anty-szczur NeuNAbcamAb279297
królicze przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko szczurzemu t-ERK1/2Proteintech11257-1-AP
przeciwciało królicze przeciwko szczurzemu TNF-α przeciwciało pierwszorzędoweProteintech29652-1-AP
bufor lizujący RIPASolarbioR0010
SDSSolarbioS8010
Odskórzone mleko w proszkuSolarbioD8340
SPSSIBM22
tetrametyloetylenodiamina (TEMED)SolarbioT8090
TrisSolarbioT8060
Triton X-100SolarbioT8200
U0126-EtOHSelleckS1102
Zamrażarka ultra niskotemperaturowaHaier—
Zamrażarka niskotemperaturowaSanyo—
System oczyszczania wody ultraczystejSiła Leczenia—
filamenty von FreyaNorth Coast Medical—

Bibliografia

  1. Bateman C. Pain management—the global sound of silence. S Afr Med J. 2015;105:621-3.
  2. Pogatzki-Zahn EM, Segelcke D, Schug SA. Postoperative pain—from mechanisms to treatment. Pain Rep. 2017;2:e588.
  3. Kaiser U, Kopkow C, Deckert S, Neustadt K, Jacobi L, Cameron P, et al. Validation and application of a core set of patient-relevant outcome domains to assess the effectiveness of multimodal pain therapy (VAPAIN): a study protocol. BMJ Open. 2015;5:e008146.
  4. Tawfik VL, Nutile-McMenemy N, Lacroix-Fralish ML, DeLeo JA. Efficacy of propentofylline, a glial modulating agent, on existing mechanical allodynia following peripheral nerve injury. Brain Behav Immun. 2007;21:238-46.
  5. Wu F, Li H, Sun J, Li X, Jiang W, Huang Y, et al. Inhibition of GAP-43 by propentofylline in a rat model of neuropathic pain. Int J Clin Exp Pathol. 2013;6:1516-22.
  6. Norsted Gregory E, Codeluppi S, Gregory JA, Steinauer J, Svensson CI. Pentoxifylline and propentofylline prevent proliferation and activation of the mammalian target of rapamycin and mitogen-activated protein kinase in cultured spinal astrocytes. J Neurosci Res. 2013;91:300-12.
  7. Ji RR, Chamessian A, Zhang YQ. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 2016;354:572-7.
  8. Grace PM, Hutchinson MR, Maier SF, Watkins LR. Pathological pain and the neuroimmune interface. Nat Rev Immunol. 2014;14:217-31.
  9. Ji RR, Berta T, Nedergaard M. Glia and pain: is chronic pain a gliopathy? Pain. 2013;154 Suppl 1:S10-28.
  10. Chen G, Park CK, Xie RG, Ji RR. Connexin-43 induces chemokine release from spinal cord astrocytes to maintain late-phase neuropathic pain in mice. Brain. 2014;137:2193-209.
  11. Liu Y, Hou B, Zhang W, Wang D, Wang H, Yu G, et al. The activation of spinal astrocytes contributes to preoperative anxiety-induced persistent postoperative pain in a rat model of incisional pain. Eur J Pain. 2015;19(5):733-40.
  12. Obata H, Eisenach JC, Hussain H, Bynum T, Vincler M. Spinal glial activation contributes to postoperative mechanical hypersensitivity in the rat. J Pain. 2006;7:816-22.
  13. Masaki E, Mizuta K, Ohtani N, Kido K. Early postoperative nociceptive threshold and production of brain-derived neurotrophic factor induced by plantar incision are not influenced by minocycline in a rat: role of spinal microglia. Neurosignals. 2016;24:15-24.
  14. Cargnello M, Roux PP. Activation and function of the MAPKs and their substrates, the MAPK-activated protein kinases. Microbiol Mol Biol Rev. 2011;75:50-83.
  15. Roskoski R Jr. ERK1/2 MAP kinases: structure, function, and regulation. Pharmacol Res. 2012;66:105-43.
  16. Berta T, Liu YC, Xu ZZ, Ji RR. Tissue plasminogen activator contributes to morphine tolerance and induces mechanical allodynia via astrocytic IL-1β and ERK signaling in the spinal cord of mice. Neuroscience. 2013;247:376-85.
  17. Bi RY, Meng Z, Zhang P, Wang XD, Ding YQ, Gan YH, et al. Involvement of trigeminal ganglionic Nav1.7 in hyperalgesia of inflamed temporomandibular joint is dependent on ERK1/2 phosphorylation of glial cells in rats. Eur J Pain. 2013;17(7):983-94.
  18. Mikuzuki L, Saito H, Katagiri A, Okada S, Kubo A, Suzuki T, et al. Phenotypic change in trigeminal ganglion neurons associated with satellite cell activation via extracellular signal-regulated kinase phosphorylation is involved in lingual neuropathic pain. Eur J Neurosci. 2017;46:2190-202.
  19. Song Z, Xie W, Chen S, Strong JA, Print MS, Wang JI, et al. STAT1 as a downstream mediator of ERK signaling contributes to bone cancer pain by regulating MHC II expression in spinal microglia. Brain Behav Immun. 2017;60:161-73.
  20. Duncia JV, Santella JB III, Higley CA, Pitts WJ, Wityak J, Frietze WE, et al. MEK inhibitors: the chemistry and biological activity of U0126, its analogs, and cyclization products. Bioorg Med Chem Lett. 1998;8:2839-44.
  21. Ji RR, Gereau RW IV, Malcangio M, Strichartz GR. MAP kinase and pain. Brain Res Rev. 2009;60:135-48.
  22. Li F, Zhang H, Ma X, Zhang X, Wang Y, Zhang J, et al. Annexin A10 contributes to chronic constrictive injury-induced pain through activating ERK1/2 signalling in rats. Int J Neurosci. 2018;128(2):125-32.
  23. Qiu Q, Chai S, Jiang Z, Zhang Y, Liu X, Li M, et al. Propofol produces preventive analgesia via GluN2B-containing NMDA receptor ERK1/2 signaling pathway in a rat model of inflammatory pain. Mol Pain. 2017;13:1744806917737462.
  24. van den Heuvel I, Reichl S, Segelcke D, Zahn PK, Pogatzki-Zahn EM. Selective prevention of mechanical hyperalgesia after incision by spinal ERK1/2 inhibition. Eur J Pain. 2015;19(2):225-35.
  25. Zhang YB, Guo Y, Li H, Wang LN. Gabapentin effects on PKC-ERK1/2 signaling in the spinal cord of rats with formalin-induced visceral inflammatory pain. PLoS One. 2015;10:e0141142.
  26. Zimmermann M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 1983;16:109-10.
  27. Brennan TJ, Vandermeulen EP, Gebhart GF. Characterization of a rat model of incisional pain. Pain. 1996;64:493-9.
  28. Dixon WJ. Efficient analysis of experimental observations. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1980;20:441-62.
  29. Hargreaves K, Dubner R, Brown F, Flores C, Joris J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 1988;32:77-88.
  30. Hao J, Chen H, Madigan MC, Coote JH, Zhang Y, Xu XJ, et al. Roles of peripheral mitogen-activated protein kinases in melittin-induced nociception and hyperalgesia. Neuroscience. 2008;152:1067-75.
  31. Wang LN, Yao M, Yang JP, Peng J, Peng Y, Li CF, et al. Cancer-induced bone pain sequentially activates the ERK/MAPK pathway in different cell types in the rat spinal cord. Mol Pain. 2011;7:48.
  32. Yang F, Sun W, Yang Y, Wang Y, Li CL, Fu H, et al. SDF1-CXCR4 signaling contributes to persistent pain and hypersensitivity via regulating excitability of primary nociceptive neurons: involvement of ERK-dependent Nav1.8 up-regulation. J Neuroinflammation. 2015;12:219.
  33. Apfelbaum JL, Chen C, Mehta SS, Gan TJ. Postoperative pain experience: results from a national survey suggest postoperative pain continues to be undertreated. Anesth Analg. 2003;97:534-40.
  34. Latremoliere A, Woolf CJ. Central sensitization: a generator of pain hypersensitivity by central neural plasticity. J Pain. 2009;10:895-926.
  35. Zhuang ZY, Gerner P, Woolf CJ, Ji RR. ERK is sequentially activated in neurons, microglia, and astrocytes by spinal nerve ligation and contributes to mechanical allodynia in this neuropathic pain model. Pain. 2005;114:149-59.
  36. Marchand F, Perretti M, McMahon SB. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 2005;6:521-32.
  37. Bath PM, Bath-Hextall FJ. Pentoxifylline, propentofylline and pentifylline for acute ischemic stroke. Cochrane Database Syst Rev. 2004;3:CD000162.
  38. Cui XY, Chen Y, Chen J, Ma ZL, Zhao YL, Li YQ, et al. Differential activation of p38 and extracellular signal-regulated kinase in spinal cord in a model of bee venom-induced inflammation and hyperalgesia. Mol Pain. 2008;4:17.
  39. Ji RR. ERK MAP kinase activation in superficial spinal cord neurons induces prodynorphin and NK-1 upregulation and contributes to persistent inflammatory pain hypersensitivity. J Neurosci. 2002;22:478-85.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mikrogleja rdzeniowaleczenie propentofyllinhiperalgezja mechanicznahiperalgezja termicznawestern blottinganaliza immunofluorescencyjnamediatory stanu zapalnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.