Artykuł metodologiczny

Identyfikacja zmodyfikowanych histonów jako substratów wiążących członka ludzkiej rodziny spindlin 4 (SPIN4) za pomocą matryc peptydowych i natywnego pulldownu nukleosomów

DOI:

10.3791/70934

⸱

27 marca 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cellular and Molecular Pathogenesis, Department of Pathology, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 2Center for Precision Medicine and Genomics Research, Children's National Research Institute, 3Department of Endocrinology, Children's National Hospital, 4Department of Pediatrics, George Washington University School of Medicine and Health Sciences, 5Massey Comprehensive Cancer Center, Virginia Commonwealth University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Warianty genetyczne u członka rodziny Spindlin 4 (SPIN4) zostały niedawno zidentyfikowane u pacjentów z przerostem kości, co jest nowym zaburzeniem rozwojowym. Przedstawiono protokół oraz nowe wyniki opisujące biochemiczną identyfikację zmodyfikowanych histonów w kontekście nukleosomów jako substratów wiążących SPIN4.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Członek rodziny Human Spindlin 4 (SPIN4) właśnie pojawił się jako nowy regulator wzrostu kości. Warianty utraty funkcji w SPIN4 zidentyfikowano u pacjentów wykazujących zespół przerostu przed- i ponatalnego, który dziedziczy się w sposób dominujący związany z chromosomem X. SPIN4 zawiera trzy powtarzające się tandem domen Tudorów, z których każda tworzy indywidualną klatkę aromatyczną. Te domeny Tudorów są uważane za epigenetyczne domeny czytelników metylowanej argininy i lizyny histonów na podstawie homologii sekwencji. Jednak dokładne substraty wiązania SPIN4 pozostają niejasne. Human SPIN4, zarówno w formie dzikiej, jak i chorobotwórczej, został pomyślnie wygenerowany za pomocą systemu ekspresji komórek owadów. Dzięki układowi peptydów modyfikacji histonów określono różnice wiążących między dzikim typem a mutantem SPIN4. Funkcjonalne weryfikacje wykazały również, że SPIN4 jest prawdziwym czytelnikiem metylacji histonu H3 Lizyny 4 (H3K4me), co potwierdza biochemiczne wycofanie natywnych mononukleosomów. To zintegrowane podejście ułatwia szybkie zidentyfikowanie celów związanych z białkami czytającymi epigenetycznie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Członek rodziny Spindlin 4 (SPIN4) jest epigenetycznym czytelnikiem i ostatnio został powiązany z zespołem przerostu, prezentując się z konstelacją przed- i poporodowej przerostu oraz wzrostem 1,2. Myszy Spin4 knockout (KO) powtórzyły dokładny fenotyp człowieka, potwierdzając przyczynowość. Do tej pory SPIN4 jest jedynym zidentyfikowanym wyłącznym czytelnikiem epigenetycznym, który negatywnie reguluje wzrost kości. Jednak właściwości biochemiczne SPIN4, kluczowego epigenetycznego czytelnika wzrostu, nie zostały scharakteryzowane, co pozostawia istotną lukę w wiedzy w zrozumieniu fundamentalnych, chorobotwórczych mechanizmów tego nowego zaburzenia rozwojowego. SPIN4 zawiera trzy tandemowe powtórzenia domen Tudora, które są zazwyczaj uważane za metylowaną argininę lub lizynę jako domeny czytające histony3. Niedawno zidentyfikowano wariant missenseSPIN4 D82H u pacjenta z zespołem przerostu kości prenatalnej i poporodowej. Ta mutacja dotyczy pierwszej domeny Tudorów SPIN4; jednak odpowiednie substraty wiążące tych domen Tudorów pozostają niejasne, co ogranicza funkcjonalną rozbiórkę regulacji chromatyny zależnej od SPIN4 oraz ekspresji genów podczas rozwoju kości.

Identyfikacja nowych substratów wiążących histony w czytniczych domenach białkowych nie opiera się na jednym, standaryzowanym podejściu. Modyfikacje posttranslacyjne (PTM) histonów występują głównie w ogonach histonowych, które wystają na zewnątrz z cząstek jądra jądrowego. Rozpoznawanie PTM na ogonach histonowych przez domeny białkowe czytające jest bardzo zmienne i często wymaga wielowartościowych, elektrostatycznych interakcji z DNA nukleosomalnym, DNA linkera i/lub innych domen histonowych, aby wspólnie ustabilizować interakcję czytnik-cel4. Obecnie PTM peptydów z ogonem histonów zostały skonstruowane w formie mikromacierzy i skomercjalizowane przez kilku dostawców5. Chociaż przesiewowe PTM oparte na peptydach histonowych na cele wiązania domen czytniczych jest wysokoprzepustowe, często daje fałszywie pozytywne wyniki bez obecności nukleosomów. Ponadto warunki eksperymentalne dla takich badań są wysoce empiryczne i różnią się w zależności od białka, co czyni je technicznie trudnymi do rozwiązania. Syntetyczne badanie PTM oparte na nukleosomach (pulldown) zapewnia znacznie bardziej solidny odczyt, ale jest znacznie droższe i o niskiej przepustowości, ponieważ retworzenie nukleosomów noszących zmienne kombinacje PTM jest z natury wyzwaniem.

Protokół ten opisuje szybkie podejście do identyfikacji histonowych PTM w nukleosomach jako celów wiążących SPIN4. Rekombinowany SPIN4 został zrekonstytuowany i przesiewany na komercyjnej matrycy peptydów histonowych PTM w celu identyfikacji potencjalnych celów wiązania. Natywne mononukleosomy zawierające różnorodne endogenne histonowe PTM zostały następnie wygenerowane z żywych komórek. Pulldown SPIN4 mononukleosomów umożliwił ukierunkowaną walidację histonów PTM opartą na przeciwciałach po wstępnym badaniu. Ta zintegrowana strategia biochemiczna demonstruje podejście proof-of-princip do efektywnego w czasie i kosztowo wykrywaniu celów i może być łatwo stosowana do identyfikacji substratów wiążących innych słabo scharakteryzowanych białek czytających epigenetycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymentalne procedury z udziałem HEK293FT komórek były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Bezpieczeństwa Instytucjonalnego (IBC) Uniwersytetu Wspólnoty Wirginii.

1. Oczyszczenie rekombinowanego ludzkiego SPIN4

  1. Klonuj pełnowymiarowy dziki typ SPIN4 lubSPIN4 D82H z epitopem N-końcowym 1× FLAG do wektora bakulowiryjnego 6,7.
  2. Przygotuj baculowirusa poprzez transfekcję komórek Sf9 wektorami bakulowirusowymi, pobieraj wirusy po pęknięciu komórek, aliquotuj i przechowuj wirusa w temperaturze −80 °C 6,7.
  3. W kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 ml dodaj 100 mL podłoża wzrostowego, 1,5 × 10 8 komórek Sf9 oraz 1 mL baculowirusa P1.
  4. Inkubuj hodowlę w temperaturze 27,5 °C w inkubatorze orbitalnym ustawionym na 125 obr./min przez 72 godziny w ciemności.
  5. Oczyścić FLAG-SPIN4 za pomocą żelu powinowactwa FLAG w buforze lizy BC150 zawierającym inhibitory proteazy i wyluć białko za pomocą peptydu 1× FLAG w stężeniu 0,1 mg/mL.
  6. Aby całkowicie usunąć peptyd FLAG 1×, zdializuj eluowany FLAG-SPIN4 na buforze magazynującym białko BC150 w temperaturze 4 °C w następującej kolejności:
    1. Pierwsza dializa: 1 l, 1 godzina.
    2. Druga dializa: 2 L, nocna.
    3. Trzecia dializa: 1 l, 1 godzina.
  7. Skoncentruj zdializowane białko do pożądanej objętości (dla SPIN4, od 600 μL do 150 μL).
  8. Określ stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) i odpowiednio oblicz stężenie molowe.
  9. Ilość surowego białka odzyskiwanego na każdym etapie oczyszczania oraz odpowiadające im szacowane plony są podsumowane w Tabeli Uzupełniającej 1. Oczyszczanie przeprowadzono na podstawie 250 mL hodowli Sf9 przy użyciu 400 μL żelowej zawiesiny anty-FLAG.
  10. Rozcieńcz skoncentrowany SPIN4 na 10× w buforze magazynującym białko BC150 (Tabela Uzupełniająca 2). Załaduj 1, 2, 5, 10 i 20 μL na żel 15% SDS–PAGE i wizualizuj za pomocą barwienia Coomassie blue (Rysunek 1A).
  11. Ilościowo określ intensywność pasma za pomocą oprogramowania do analizy obrazów, aby określić względną intensywność sygnału między liniami o równych objętościach.
  12. Podziel stosunek intensywności przez masę cząsteczkową każdego białka, aby uzyskać stosunek molowy.
  13. Użyj tego stosunku molowego, aby skorygować stężenie molowe szacowane w kroku 1.8.
  14. Aliquot oczyszczone białko, zamraża je w ciekłym azocie i przechowuje w temperaturze −80 °C. Do krótkotrwałego użytku przechowuj w temperaturze 4 °C przez noc przed kolejnym eksperymentem.

2. Układ peptydów histonów

  1. Przygotuj bufor blokujący matryce peptydów poprzez rozpuszczenie 5 g albuminy surowicy bydłej (BSA) w buforze magazynującym białko BC150 do końcowej objętości 100 mL.
  2. Opcjonalnie wyznacz obszar reakcji na tablicy peptydowej za pomocą hydrofobowego markera, aby zminimalizować zużycie odczynników.
  3. Włóż kilka arkuszy papieru filtracyjnego do 15-centymetrowej szalki Petriego i zwilż je wodą.
  4. Umieść matryce peptydów na zwilżonych papierach filtrujących.
  5. Ostrożnie dodaj bufor blokujący 300 μL, aby całkowicie pokryć każdy obszar matrycy.
  6. Przykryj szalkę Petriego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1–3 godziny.
  7. Przygotuj FLAG-SPIN4 w buforze blokującym do końcowego stężenia 1 μM.
  8. Przygotuj peptyd 1× FLAG w buforze blokującym do końcowego stężenia 1 μM.
  9. Aby poprawić stosunek sygnału do szumu i zmniejszyć niepożądane tło, wykonaj następujące kroki w chłodnym pomieszczeniu. Przenieś zablokowane matryce (z szalką Petriego) do chłodni przed dodaniem białek.
  10. Usuń nadmiar bufora blokującego z tablic.
  11. Ostrożnie dodaj pożądane białko FLAG-SPIN4 lub peptyd FLAG jako kontrolę na każdy blok.
  12. Przykryj szalkę Petriego i inkubuj przez noc w chłodni.
  13. Dodaj około 50 ml bufora do mycia matrycy peptydowej do pojemnika Western blot i przenieś go do chłodni.
  14. Usuń roztwór białkowy i natychmiast przenieś matryce do buforu płukania, stroną reakcyjną do góry.
  15. Myj tablice pięć razy, w następujący sposób: pierwsze dwa washy przez 1 minutę, a pozostałe trzy przez 5 minut każda.
  16. Przepłucz matryce buforem blokującym matryce peptydów, aby usunąć resztki detergentu, a następnie przełóż je z powrotem do szalki Petriego.
  17. Przygotuj roztwór przeciwciał anty-FLAG w rozcieńczeniu 1:2000 i dodaj 300 μL na blok.
  18. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  19. Powtórz kroki od 2.14 do 2.16, aby wymyć tablice.
  20. Przygotuj roztwór przeciwmyszego IgG (przeciwciała wtórnego) sprzężonego z HRP w rozcieńczeniu 1:6000 i dodaj 300 μL na blok.
  21. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  22. Powtórz kroki od 2.14 do 2.16, aby wymyć tablice.
  23. Umieść matryce wewnątrz przezroczystej folii osłonowej.
  24. Dodaj około 1 mL podłoża z rozszerzoną chemiluminescencją (ECL), zapewniając równomierne pokrycie powierzchni reakcji.
  25. Usuń pęcherzyki powietrza i wykonuj obrazy chemiluminescencyjne oraz w jasnym polu za pomocą odpowiedniego systemu obrazowania (np. cyfrowych obrazowców lub filmów autoradiograficznych) (Rysunek 1B).
  26. Analizuj intensywność sygnału zgodnie z oprogramowaniem matryc peptydowych oraz powiązanymi narzędziami online (Rysunek 2A–C).

3. Wielkoskalowa ekspresja FLAG-SPIN4 do testu pulldown

  1. W kolbce Erlenmeyera o pojemności 500 mL dodaj 125 mL ESF921 medium, 1,8 × 10 8 komórek Sf9 oraz 1,2 mL baculowirusa P1 ekspresującego FLAG-SPIN4lub FLAG-SPIN4 D82H.
  2. Inkubuj w temperaturze 27,5 °C w inkubatorze orbitalnym (125 obr./min) przez 72 godziny.
  3. Określ kulturę w następujący sposób:
    1. 4 mL hodowli do probówki 15 mL do miareczkowania.
    2. 30 mL hodowli do czterech probówek po 50 mL.
  4. Wiruj probówki w 600 × g przez 15 minut i wyrzuć supernatant.
  5. Zamroz granulki na szybko, w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze −80 °C do czasu użycia.

4. Dawkowanie stosunku kulki do lizatu dla FLAG-SPIN4 i FLAG-SPIN4D82H

  1. Dodaj 1 mL buforu lizyzowego BC150 do każdego z pelletów Sf9 z 5 mL hodowli Sf9 opisanej w Sekcji 3, Krok 3.1.
  2. Sonikować lizaty, aby zapewnić całkowite zakłócenie: 30% amplitudy, 5 s włącznie/5 s wyłączone, co daje łączny czas sonakacji 15 s.
  3. Wirować w 20 000 × g, 4 °C, przez 10 minut, a następnie przelać supernatant do świeżych probówek 1,5 mL.
  4. Przygotuj 20 μL żelowy zawiesina anty-FLAG dla każdej reakcji pulldown (60 μL na 3 miarkowania)
  5. Przemyj koraliki buforem lizysowym BC150:
    1. Dodaj 1 mL buforu lizyzowego BC150 i krótko zrób wir.
    2. Wirówka 3 000 × g przez 1 minutę.
    3. Aspiruj i odrzucaj supernatant.
  6. Ponownie zawiesz kulki w buforze lizyjnym 40 μL BC150 przy każdej jednej reakcji pulldown (120 μL przy 3 miareczkach).
  7. Połącz lizat w probówkach o pojemności 1,5 mL zawierających bufor lizyczny BC150 oraz zawiesinę kulek (Tabela uzupełniająca 3)
  8. Inkubuj rurki na rotatorze rurowym ustawionym na 15 obr./min przy 4 °C przez 1,5 godziny.
  9. Wiruj w 3000 × g przez 1 minutę i aspiruj supernatant.
  10. Umyj koraliki trzy razy w następujący sposób:
    1. Krótko ponownie zawiesić kulki w buforze lizy i wirze 500 μL BC150.
    2. Wirówka 3 000 × g przez 1 minutę.
    3. Aspiruj nadwysoka.
  11. Ponownie zawiesij kulki w buforze Laemmli o pojemności 20 μL 1× i inkubuj w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
  12. Wirówka 3 000 × g przez 1 minutę.
  13. Uruchom supernatant na żelu 15% SDS–PAGE i barw na modrym Coomassie, aby oszacować wydajność białka.
  14. Na podstawie danych wybierz stosunek lizatu do koralików, który nasyca miejsca wiązania przeciwciał na kulkach. W eksperymentach ≥300 μL lizatu na 20 μL kulek wystarczało do pełnej zdolności wiązania.
    UWAGA: "Saturacja miejsc wiązania przeciwciał" definiuje się jako moment, w którym zwiększenie objętości lizatu przestaje powodować większy odbudowę docelowego białka.
    UWAGA: Przy tej samej trzoności SPIN4D82H wykazuje niższe powinowactwo wiązania z żelem powinowactwa FLAG niż odpowiednik typu dzikiego.
    UWAGA: W tym układzie eksperymentalnym 1 mL lizatu pozyskano z 6 milionów komórek Sf9 (obliczanych jako 1,5 × 106 komórek /mL × 4 mL), co wskazuje, że SPIN4 wyrażony z ~6 milionów komórek Sf9 wystarcza do nasycenia 20 μL zawiesiny żelu anty-FLAG.

5. Wielkoskalowe przygotowanie żelu FLAG-SPIN4 powiązanego z powinowactwem anty-FLAG jako przynęty

  1. Dla każdego badanych białek pobierz dwa granulki z hodowli 30 mL. Każdą granulkę ponownie zawiesz w buforze lizycznym BC150 o pojemności 6 mL, przelej do rurki wirówki 15 mL i dostosuj całkowitą objętość do 13 mL z buforem lizystycznym BC150.
  2. Sonikuj każdą próbkę na lodzie z amplitudą 100%, 15 sekund włączony/30 sekund wyłączony, co daje łączny czas sonakcji 2 minuty.
  3. Przelej lizaty do schłodzonych rurek wirówek o dużej prędkości i wiruj w temperaturze 20 000 × g, 4 °C, przez 15 minut.
  4. Dodaj 200 × (liczba próbek + 1) × 1,1 μL zawiesiny żelowej anty-FLAG do probówki wirówki o pojemności 1,5 mL.
  5. Oprać koraliki >5 kolumnowymi objętościami (CV) buforu lizyzowego BC150 raz.
  6. Ponownie zawiesić kulki w 400 × (liczba próbek + 1) × 1,1 μL buforu lizyzowego BC150.
  7. Przenieś supernatanty uzyskane w kroku 4 do rurek wirówek o pojemności 15 mL.
  8. Dodaj 500 μL zawieszenia kulek Step 5.7 do każdej rurki.
  9. W jednej probówce dodaj 3 mL buforu lizyzowego BC150 oraz 60 μL peptydu 1× FLAG (100 mM) jako kontrolę ujemną.
  10. Inkubuj próbki na rotatorze rurkowym ustawionym na 120 obr./min przy 4 °C przez 1,5 godziny.
  11. Wiruj w wirówce 2000 × g przez 5 minut i wyrzuć supernatant.
  12. Ponownie zawiesij kulki w odpowiedniej ilości supernatantu i przenieś do probówek 1,5 mL.
  13. Wiruj w 3 000 × g przez 1 minutę i aspiruj supernatant.
  14. Przemyj kulki pięć razy buforem lizowym BC150 w następujący sposób:
    1. Ponownie zawiesij kulki w 1 mL bufora lizyzowego BC150.
    2. Podczas czwartego i piątego płukania umieszczaj próbki na rotatorze rurki ustawionym na 20 obr./min przy 4 °C przez 10 minut.
    3. Wiruj w 3000 × g przez 1 minutę i aspiruj supernatant.
  15. Ponownie zawiesić kulki w buforze lizy 200 μL BC150.
  16. Pobierz 9 μL zawiesiny z kulek/buforu i przeanalizuj zawartość białek w 15% SDS–PAGE, a następnie przejdź barwienie na błękit Coomassie.
  17. Ponieważ ilość białka wejściowa przekracza zdolność wiązania kulek, ilość białka związanego na objętość kulki powinna być podobna w różnych próbkach. Półilościowe określenie intensywności pasma za pomocą analizy obrazów cyfrowych i dostosowanie ilości kulek pod kolejne reakcje.

6. Przygotowanie mononukleosomów z komórek HEK293FT

  1. Hodować HEK293FT komórki w naczyniach do hodowli tkanek o średnicy 15 cm do około 90% współbydła, używając 10% płodowego surowika bydłego (FBS) w podłożu DMEM w temperaturze 37 °C w inkubatorze nawilżającym 5%CO2 .
  2. Komórki wczesnego przejścia HEK293FT są pozyskiwane komercyjnie i uwierzytelniane przez profilowanie STR.
    UWAGA: Jedna antena o średnicy 15 cm daje ~27 milionów komórek, co wystarcza do reakcji 1–2 z wyciąganiem w dół. Dla sześciu reakcji (w tym negatywnych kontroli) przygotuj co najmniej trzy dania o średnicy 15 cm. Jeśli docelowa modyfikacja histonów po translacji (PTM) jest rzadka lub niestabilna, należy odpowiednio zwiększyć liczbę komórek 2–10× odpowiednio.
  3. (Opcjonalnie) W zależności od interesującej modyfikacji histonów należy dodać odpowiednie inhibitory PTM (Tabela Uzupełniająca 2) do podłoża i inkubować przez 24 godziny.
    UWAGA: Ten krok może zostać pominięty, jeśli obecne są obfite histonowe PTM.
  4. Gdy komórki osiągną prawie 100% zbiórkę, zbierz je w następujący sposób:
    1. Aspiruj medium kulturowe.
    2. Delikatnie płucz komórki 10 ml lodowatego PBS, a następnie aspiruj.
    3. Dodaj 5 ml lodowatego PBS.
    4. Zeskrobaj komórki na lodzie i przelej do probówki 50 mL (wszystkie naczynia można połączyć).
    5. Wirówka w 13 000 × g, 4 °C, przez 10 minut.
    6. Usuń nadmiar.
  5. (Opcjonalnie) Albo natychmiast przystąpić, albo zamroź granulkę komórkową do późniejszego użycia:
    1. Oszacuj objętość granulek.
    2. Ponownie zawiesić w objętości 9× granulek buforu G, aby osiągnąć końcowe stężenie glicerolu na poziomie 20%.
    3. Zamrożenie na szybko-zamrożenie w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze −80 °C.
  6. Jeśli przystosujesz zamrożone granulki, rozmroz granulat na lodzie, wiruj w 1300 × g, 4 °C, przez 5 minut i wyrzuć supernatant.
  7. Ponownie zawiesij (świeży lub rozmrożony) pellet w objętości 10× granulatu buforu TMSD (40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 250 mM sacharozy, 1 mM DTT) zawierających inhibitory proteazy za pomocą pipety serologicznej.
  8. Przygotuj świeżo 10% NP-40 w buforze TMSD i dodaj 0,11× całkowitej objętości reakcji, aby uzyskać końcowe stężenie NP-40 na poziomie ~1%.
  9. Inkubuj zawieszenie na rotatorze rurowym ustawionym na 120 obr./min przy 4 °C przez 5 minut.
  10. Wymieszaj 10 μL zawiesziny z 10 μL trypanowego niebieskiego i obserwuj pod mikroskopem, aby monitorować barwienie jądrowe. Upewnij się, że jądra są całkowicie izolowane od cytosolu (rysunek 3A).
  11. Gdy około 95% jąder jest trypanowo-niebiesko-dodatnich, przejdź do kolejnego kroku. Dla HEK293FT komórek zazwyczaj wystarcza inkubacja 1% NP-40 przez 5 minut. W przypadku innych typów komórek zweryfikować i dostosować czas inkubacji.
  12. Wirówka w 1300 × g, 4 °C przez 5 minut, a następnie wyrzuć supernatant.
  13. Ponownie zawiesić pellet w 10× objętości granulek buforu TMSD.
  14. Powtórz kroki 6.12 do 6.13 pięć razy, aby całkowicie usunąć pozostałe NP-40.
  15. Ponownie zawiesij granulkę w objętości 5× Buffer B.
  16. Dodaj 1 jednostkę mikrokokowej nukleazy (MNazy) na każde 10 000 jąder i inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Okazjonalnie poruszaj rurkę podczas inkubacji, aby jądra były równomiernie zawieszone
  17. W wskazanych punktach czasowych (0,5, 1 i 2,5 h) należy pobrać 50 μL reakcji do probarek po 1,5 mL, natychmiast dodać 1 μL 0,5 M EDTA-Na (pH 8,0) i wprowadzić wir.
  18. Ekstraktuj DNA z każdego punktu czasowego zgodnie z poniższą procedurą:
    1. Dodaj 80 μL H₂O, 30 μL 10% SDS oraz 20 μL 5 M NaCl; Wir.
    2. Dodaj 200 μL fenolu/chloroformu; Dokładnie wiruj.
    3. Wirówka przy 20 000 × g, RT, 3 min.
    4. Ostrożnie przelej supernatant do nowej probówki 1,5 mL.
    5. Dodaj 1 mL 100% etanolu i 20 μL 3 M octana sodu (pH 5,2); Wir.
    6. Wirówka przy 20 000 × g, RT, 5 min.
    7. Usuń supernatant, dodaj 1 ml 70% etanolu.
    8. Wirówka przy 20 000 × g, RT, 1 minuta.
    9. Usuń supernatant i susz granulat w temperaturze 55 °C z otwartą kapsułką przez 10 minut.
    10. Ponownie zawiesić pellet w buforze 50 μL TE.
  19. Pobierz próbki na żelu agarozowym o stężeniu 1% TBE, aby potwierdzić wielkość mononukleosomowego DNA (147 bp) (Rysunek 3B).
  20. (Opcjonalnie) Efektywność trawienia nukleazy mikrokokialnej (MNazy) różni się w zależności od typu komórek, w razie potrzeby w trakcie reakcji można dodać dodatkową MNazę, aby całkowicie usunąć polinukleosomy. Na przykład, jeśli próbki 1 h i 2h wydają się podobne, dodaj więcej MNase po 3 godzinach.
  21. Gdy zaobserwuje się dominujący pas ~147 bp lub gdy dodatkowa inkubacja MNazy/przedłużona nie zmienia już rozmiaru fragmentu, zatrzymaj reakcję, dodając 0,5 M EDTA-Na (pH8,0) do końcowego stężenia 2 mM.
  22. Wirówka w 1 300 × g, 4 °C, przez 5 minut. Zbierz supernatant (S1).
  23. Ponownie zawiesić pellet w objętości 10× peletu z inhibitorami buforu TE + proteazy i inkubować próbkę na rotatorze rurkowym ustawionym na 20 obr./min przy 4 °C przez co najmniej 30 minut.
    UWAGA: Efektywność ekstrakcji mononukleosomów różni się w zależności od typu komórek. Do efektywnej ekstrakcji nukleosomów można użyć NaCl o objętości 0-300 mM.
  24. Wirówka w 1 300 × g, 4 °C, przez 5 minut. Zbierz supernatant (S2).
  25. Przelej po 50 μL S1 i S2, aby oddzielić rurki po 1,5 mL.
  26. Przeanalizuj wszystkie frakcje za pomocą elektroforezy żelowej agarozy (kroki 6.17 do 6.18), aby ocenić rozkład wielkości DNA i efektywność ekstrakcji. Większość mononukleosomów znajduje się w frakcji S2 (Rysunek 3C).
  27. Przelej S2 do rurek wirówek o dużych prędkościach i obróć w temperaturze 20 000 × g, 4 °C, przez 10 minut, aby usunąć materiał nierozpuszczalny.
  28. Pobierz supernatant i zdializuj przeciwko buforowi lizycznemu BC150 (bez inhibitorów):
    1. Pierwsza dializa: 1 l, 1 godzina.
    2. Druga dializa: 2 L, nocna.
  29. Po dializach ponownie wiruj w 20 000 × g, 4 °C, przez 10 minut, aby usunąć wszelkie nierozpuszczalne zanieczyszczenia.
  30. Zbierz ostatni supernatant.
  31. Wymieszaj 5 μL supernatantu z 35 μL buforem lizyzowym BC150 oraz 10 μL buforem Laemmli 5× podgrzewaj w temperaturze 95 °C przez 5 minut i załaduj 1, 2, 5, 10 i 20 μL na żel 15% SDS–PAGE.
  32. Ładuj 1, 2 i 5 μL 0,1 mg/mL BSA do bufora Laemmli jako odniesienie do szacowania wydajności.
  33. Barwimy błękitem Coomassie i oszacuj wydajność nukleosomów półilościowo za pomocą oprogramowania do analizy obrazów (Rysunek 3D).

7. Zmodyfikowane ściągnięcie nukleosomu

  1. Przygotuj bufor blokujący kulki 2× poprzez rozpuszczenie 1 g BSA w buforze lizy BC150 do ostatecznej objętości 10 mL, a następnie w wirze, aż do całkowitego rozpuszczenia.
  2. Przenieś kulki FLAG-SPIN4-WT i FLAG-SPIN4D82H zawierające równoważne molowe ilości białka (z sekcji 5, kroki 5.16 do 5.17) do oddzielnych probarek o pojemności 1,5 mL.
  3. Dodaj równą objętość kulek kontroli ujemnej (z sekcji 5, krok 10) do próbki FLAG-SPIN4-WT.
  4. Dostosuj całkowitą objętość wszystkich próbek koralików tak, aby była identyczna, używając bufora lizyzowego BC150.
  5. Do każdej rurki zawierającej kulki i bufor lizowy BC150 dodaj równą objętość bufora blokującego kulki 2×.
  6. Inkubuj próbki na rotatorze rurkowym ustawionym na 20 obr./min przy 4 °C przez noc (O/N).
  7. Rozmrozić odpowiednią ilość 1× nukleosomu pobranego z HEK293FT komórek na lodzie. Wymagana objętość zależy od pożądanego stosunku molowego nukleosomu do SPIN4. Do początkowej optymalizacji stosuj stosunek molowy 1:1 nukleosomu do SPIN4.
  8. Dokładnie wymieszaj 1× nukleosomu o równej objętości 2× buforu blokującego kulki.
  9. Połącz mieszankę ze Kroku 7.8 z wcześniej zablokowanymi kulkami w probówce 15 mL.
  10. Inkubuj mieszankę na rotatorze rurkowym ustawionym na 20 obr./min przy 4 °C przez 4 godziny lub przez noc.
  11. Wirówka w 3 000 × g, 4 °C, przez 3 minuty.
  12. Ostrożnie wyrzuć supernatant.
  13. Ponownie zawiesić kulki w 1 mL buforze lizy BC150 i przenieść do probówek 1,5 mL.
  14. Umyj koraliki trzy razy w następujący sposób:
    1. Wiruj w wirówce 3 000 × g, 1 minutę, i zasysaj supernatant.
    2. Ponownie zawiesij kulki w 1 mL bufora lizyzowego BC150.
    3. Od czasu do czasu mieszaj tubkę, aby koraliki równomiernie zawieszały się podczas prania.
  15. Umyj kulki jeszcze dwa razy, w następujący sposób:
    1. Wiruj w 3000 × g, 1 minutę, i zasysaj supernatant.
    2. Ponownie zawiesz kulki w 1 mL buforu lizyzowego BC150.
    3. Obróć z prędkością 20 obr./min, 4 °C, przez 10 minut.
  16. Po umyciu ponownie zawiesij kulki w 9-kolumnowych objętościach (CV) buforu lizyzowego BC150.
  17. Z każdej próbki pobrać 160 μL, wymieszać z buforem Laemmli 5× 40 μL i podgrzewać w 95 °C przez 5 minut.
    UWAGA: Zaleca się elucię peptydów flagowych kompleksu białko-nukleosomów, co daje czystsze wyniki przy mniejszej ilości tła.
  18. Wirówka w temperaturze 3 000 × g, w temperaturze pokojowej, przez 5 minut.
  19. Załaduj 5 μL supernatantu na żel 15% SDS–PAGE i wykonaj barwienie srebrem (Rysunek 4A).
  20. Załaduj kolejne 5 μL supernatantu na żel 15% SDS–PAGE, przelej do membrany PVDF i przebadaj z odpowiednimi przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi specyficznymi dla PTM z histonami docelowymi (Rysunek 4B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać substraty wiążące ludzki SPIN4, dziki typ SPIN4 oraz mutant pochodzący od pacjenta związany z zespołem przerostu zostały rekonstytuowane przy użyciu systemu ekspresji komórek owadów Sf9. Konkretnie, jest to mutacja niewłaściwa kwasu asparcynowego (D) do histydyny (H) w pozostałości 82 (D82H), która znajduje się w pierwszej domenie Tudorów SPIN4, co sugeruje jego rolę w regulacji wiązania substratu SPIN4. Do ekspresji białek w komórkach Sf9 zastosowano wektor bakulowiratowy kodujący pojedynczy FLAG-tagowany SPI...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono efektywną w czasie i kosztowo metodę biochemicznego określenia specyficznych histonowych PTM jako celów słabo scharakteryzowanego białka oraz ocenę, jak jego mutacja związana z chorobą wpływa na powinowactwa wiązania celu. Zaletą tej metody jest to, że nie wymaga kosztownej ani czasochłonnej rekonstrukcji syntetycznych nukleosomów. Podejście to wykorzystywało wygodę komercjalizowanych matryc peptydowych histonowych PTM, jednocześnie zapewniając, że SPIN4 jest prawdziwym czytelnikiem H3K4me, wykorzystując na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują wszystkim byłym i obecnym członkom Yu and Jee Lab za wsparcie techniczne. J.-R.Y. otrzymał wsparcie od NIH NIGMS Maximizing Investigators' Research Award (MIRA) R35GM160046. YH. J był wspierany przez Children's National Hospital oraz Children's Research Institute.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mLSarstedt72.690.001Eksperymenty ogólne
Naczynie do hodowli tkanek o średnicy 15 cmSarstedt83.3903.300Eksperymenty ogólne
Stożkowe rurki do wirówek o pojemności 15 mLSarstedt62.554.101Eksperymenty ogólne
Stożkowe rurki wirówkowe 50 mLSarstedt62.548.004Eksperymenty ogólne
Kolba Erlenmeyera 500 mLStellar ScientificCT229809Hodowla komórek Sf9
Amersham ImageQuant 800 CCD ImagerCytivaIMQ800System obrazowania CCD
Żel powiązań anty-FLAG M2Sigma-AldrichA2220Biochemiczny pulldown
Przeciwciało anty-FLAG M2Sigma-AldrichF1804Western blot
AprotyninaMedChemExpressHY-P0017Inhibitor proteazy
Array Analysis SofrwareMotyw aktywnyhttps://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zipAnaliza danych matryc peptydowych MODified
ASI Agarose LEAlkali ScientificA7700Żel DNA
System ekspresji bac-to-bac baculowirusaThermo Scientific10359016Ekspresja bakulowirusowa
Benzamidyna chlorowodorekMedChemExpressHY-W018781Inhibitor proteazy
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA9647Standard ilościowej ilościowania białek
Bromofenol BlueThermo ScientificA18469.08Bufor Lammeli
Coomassie Brilliant Blue R-250Thermo Scientific20278Barwienie żelem proteinowym
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich D5545Bufor lizy
EDTAProdukty badawcze RPIE58100Bufor lizy
Podłoże o zwiększonej chemiluminescencji (ECL)CytivaRPN2232Western blot
ESF 921 Medium do hodowli komórek owadówSystemy ekspresji96-001Hodowla komórek Sf9
Etanol (200 proof)Spectrum ChemicalET107Wytrącanie DNA
System obrazowania EVOS M5000InvitrogenM5000Obrazowanie ogólne
Peptyd FLAGMedChemExpressHY-P7006Elucia pulldown
GlicerolSigma-Aldrich G77893Bufor pamięci
Przeciwciało H3K4me1 & nbsp;Motyw aktywny39300Western blot
Przeciwciało H3K4me2 & nbsp;Sygnalizacja komórkowa9725TWestern blot
Przeciwciało H3K4me3 Sygnalizacja komórkowa9751TWestern blot
HEK293FT komórkiThermo ScientificR70007Ludzka embrionalna linia fibroblastkomórkowa nerki
HEPESSigma-Aldrich H3375Bufor lizy
ImageJNarodowe Instytuty Zdrowiahttps://imagej.net/ij/download.html  Program do przetwarzania obrazów oparty na Javie
Hemisiarczan LeupeptynyMedChemExpressHY-18234AInhibitor proteazy
Nukleaza mikrokokowa (MNaza)NEB M0247SEndonukleaza do trawienia chromatyny
Model 120 Sonic DisembratorFisher ScientificFB120110Sonication
Matryca peptydów histonowych MODifiedMotyw aktywny13005Badanie wiązania białek
Pepstatin AMedChemExpressHY-P0018Inhibitor proteazy
Frakcja Peroksydazy IgG Monoklonalny anty-myszy kozi IgG, specyficzny dla łańcucha lekkiegoJackson ImmunoResearch115-035-174Western blot
pFastBac1-Flag-SPIN4Thermo Scientific10360014Wektor ekspresji bakulowiratowej
pFastBac1-Flag-SPIN4-D82HThermo Scientific10360014Wektor ekspresji bakulowiratowej
Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1)Sigma-AldrichP2069Oczyszczanie DNA
Zestaw do testowania białka BCA Pierce Rapid GoldThermo ScientificPIA53226Kwantyfikacja białek
Zestaw do plamy Pierce SilverThermo Scientific24612Detekcja białek
Inhibitor proteazy PMSFThermo Scientific36978Inhibitor proteazy
Żel poliakrylamidowyWykonane we własnościNie maŻel białkowy
Komórki owadów Sf9ATCCCRL-1711Linia komórkowa owadów do ekspresji baculowirusa
Urządzenie do dializ Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCOThermo Scientific69572Dializa białkowa
Octan soduSigma-AldrichS8750Wytrącanie DNA
Chlorek sodu Fischer  BP358-1Bufory ogólne
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma-Aldrich L3771Bufory ogólne
Trypan Blue Solution (0,4%)Thermo Scientific15250061Barwienie jąder

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lui, J. C., et al. Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome. JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).
  2. Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. Clinical observation of a rare Binder phenotype with fetal overgrowth due to a SPIN4 mutation. Matern Fetal Med. 7 (1), e0030(2025).
  3. Lu, R., Wang, G. G. Tudor: a versatile family of histone methylation readers. Trends Biochem Sci. 38 (11), 546-555 (2013).
  4. Ruthenburg, A. J., Li, H., Patel, D. J., Allis, C. D. Multivalent engagement of chromatin modifications by linked binding modules. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 983-994 (2007).
  5. Mauser, R., Jeltsch, A. Application of modified histone peptide arrays in chromatin research. Arch. Biochem Biophys. 661, 31-38 (2019).
  6. Hsu, C. I., et al. Paraspeckle protein NONO regulates active chromatin by allosterically stimulating NSD1. Cell Rep. 44 (1), 116247(2025).
  7. Hsu, C. I., Yeh, E., Chen, C. C. L., Sahn, M., Yu, J. R. Protocol for reconstituting enzymatic activities for ultra-large histone methyltransferases NSD1 and SETD2 using a baculovirus expression system. STAR Protoc. 6 (1), 103963(2025).
  8. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).
  9. Fuhrmann, J., Thompson, P. R. Protein arginine methylation and citrullination in epigenetic regulation. ACS Chem Biol. 11, 654(2015).
  10. Zhao, F., et al. Molecular basis for histone H3 “K4me3-K9me3/2” methylation pattern readout by Spindlin1. J Biol Chem. 295 (49), 16877(2021).
  11. Padeken, J., Methot, S. P., Gasser, S. M. Establishment of H3K9-methylated heterochromatin and its functions in tissue differentiation and maintenance. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (9), 623-640 (2022).
  12. Greschik, H., et al. The histone code reader Spin1 controls skeletal muscle development. Cell Death Dis. 8 (11), e3173(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

SPIN4 ProteinHistone ModificationPeptide ArrayNative Nucleosome PulldownTudor DomainHistone ReaderH3K4 MethylationWestern BlotBone Growth RegulationPost Translational Modification

Powiązane artykuły