Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Przeciążenie żelazem zmniejszyło ekspresję MEG3 w tkankach trzustki. MEG3 może odgrywać ochronną rolę przed apoptozą komórek β wysp trzustkowych wywołaną przez żelazo, potencjalnie z modulacją szlaku NF-κB. Mechanizm ten może przyczyniać się do dysfunkcji wysp trzustkowych u pacjentów z β-TM z przeciążeniem żelaza.
Pacjenci z beta-talasemią ciężką (β-TM) często wykazują nieprawidłowy metabolizm glukozy, a czynniki takie jak nadmiar żelaza, przewlekłe niedokrwienne, zaburzenia hormonalne, dysfunkcja wątroby i insulinooporność związana z zapaleniem są uważane za ważne czynniki przyczyniające się do dysfunkcji wysp trzustkowych. Długie niekodujące kwasy rybonukleinowe (lncRNA) są coraz bardziej rozpoznawane ze względu na ich rolę regulacyjną w apoptozie komórkowej i homeostazie glukozy. Niniejsze badanie bada funkcję lncRNA, genu ekspresowanego u matki 3 (MEG3), w uszkodzeniu komórek β wyspy trzustki wywołanym żelazem. Model nadmiaru żelaza u myszy został wywołany przez dootrzewnowe wstrzyknięcie żelaza dekstranu. Depozycję żelaza i uszkodzenie tkanki w trzustce oceniono za pomocą barwienia pruskiego i barwienia hematoksyliną i eozyną, a ekspresję MEG3 określono za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR). In vitro komórki MIN6 przetrącono małym interferencyjnym RNA MEG3, aby zbadać apoptozę za pomocą cytometrii przepływowej, a aktywność szlaku sygnalizacyjnego NF-kappa (κ)B oceniono za pomocą Western blot. Barwienie histologiczne potwierdziło znaczącą depozycję żelaza i uszkodzenie struktury w tkankach trzustki myszy z nadmiarem żelaza. Analiza RT-PCR wykazała znaczne zmniejszenie ekspresji MEG3 w trzustce (p<0,05). In vitro wyciszenie MEG3 znacząco zwiększyło apoptozę komórek MIN6 w porównaniu z kontrolami. Analiza Western blot wykazała podwyższony poziom NF-κB, co wskazuje na aktywację szlaku sygnalizacyjnego NF-κB w komórkach z wyciszonym MEG3. Te wyniki sugerują, że zmniejszenie ekspresji MEG3 może zwiększać apoptozę komórek β wyspy trzustki za pośrednictwem sygnałowania NF-κB w warunkach nadmiaru żelaza. Gen MEG3 może odgrywać rolę ochronną przed apoptozą komórek β wyspy trzustki wywołaną żelazem, potencjalnie za pośrednictwem modulacji szlaku NF-κB. Mechanizm ten może przyczyniać się do dysfunkcji wysp trzustkowych u pacjentów z β-TM z nadmiarem żelaza.
Talasemia beta (β) to grupa dziedzicznych zaburzeń krwiotwórczych charakteryzujących się zmniejszoną lub nieobecną produkcją łańcucha β-globiny, co powoduje przewlekłe niedokrwistość i nieskuteczne erytropoezę1. U pacjentów z talasemiami zależnymi od przetoki krwi (talasia major β-TM), wielokrotne transfuzje krwi i hemoliza często prowadzą do ogólnoustrojowego przeciążenia żelazem, które może uszkodzić wiele narządów i przyczyniać się do wielu powikłań endokrynologicznych, w tym nieprawidłowego metabolizmu glukozy2. Ponadto, przewlekła niedokrwistość zwiększa obciążenie trzustki, zaburzenia hormonalne wpływające na regulację glukozy, zaburzenia czynności wątroby upośledzające metabolizm glukozy oraz insulinooporność indukowana procesami zapalnymi mogą wszystkie przyczyniać się do hiperglikemii u pacjentów z talasemia β-TM. Dlatego zaburzenia metaboliczne glukozy w talasemia β-TM mają wieloczynnikową naturę2,3. Niedawna metaanaliza poinformowała, że częstość występowania upośledzonego gościnnego poziomu glukozy, upośledzonej tolerancji glukozy (IGT) oraz cukrzycy (DM) u pacjentów z talasemia β-TM wynosi odpowiednio 17,21%, 12,46% i 6,54%, co wskazuje na rosnące obciążenie zaburzeniami metabolicznymi glukozy w tej populacji3.
Mimo rosnącej znaczności klinicznej, mechanizmy leżące u podstaw nieprawidłowego metabolizmu glukozy w talasemia β-TM są słabo poznane. Poprzednie badania wykazały, że przewlekłe przeciążenie żelazem, głównie z powodu wielokrotnych transfuzji i hemolizy, może prowadzić do nadmiernego osadzania żelaza w trzustce, szczególnie w komórkach beta wysp trzustkowych. To nagromadzenie sprzyja generowanie reaktywnych form tlenu i pogarsza stres oksydacyjny, wyzwalając dysfunkcję mitochondriów, upośledzając syntezę i wydzielanie insuliny, a ostatecznie indukując apoptosis komórek beta i niedobór insuliny4,6. Ponadto, przeciążenie żelazem może przyczyniać się do oporności na insulinę obwodowego poprzez zapalenie pośredniczone przez stres oksydacyjny i ingerencję w ścieżki sygnalizacyjne insuliny. Jednakże ścieżki molekularne łączące przeciążenie żelazem z uszkodzeniem komórek beta i ogólnoustrojowym zaburzeniem równowagi glukozy są złożone i nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione. Długie niekodujące kwasy rybonukleinowe (lncRNA) – klasa transkryptów dłuższych niż 200 nukleotydów, które nie kodują białek – okazały się ważnymi regulatorami w różnorodnych procesach biologicznych, w tym homeostazie glukozy, wydzielaniu insuliny i reakcjach na stres oksydacyjny7,8,9. Wiedzono, że komórki beta wysp trzustkowych wyrażają ponad 1000 lncRNA, co sugeruje ich potencjalną rolę regulacyjną w utrzymaniu funkcji endokrynnyej10.
Jednakże niewiele wiadomo o profilach ekspresji lncRNA i ich funkcyjnych rolach w kontekście uszkodzenia komórek beta wysp trzustkowych wywołanego przeciążeniem żelazem, szczególnie w talasemia β-TM. Ostatnie osiągnięcia ujawniły, że LncRNA MEG3 (MEG3) promuje wydzielanie insuliny i hamuje apoptosis komórek beta trzustki11. Jednakże jego wpływ na komórki beta trzustki w warunkach przeciążenia żelazem pozostaje niejasny. W innych patologicznych kontekstach, lncRNA wykazały interakcję z kluczowymi ścieżkami sygnalizacyjnymi takimi jak NF-kappa (κ)B, JNK i Nrf2, które są również zaangażowane w stres oksydacyjny i uszkodzenie komórek związane z przeciążeniem żelazem12,13,14. W szczególności, NF-κB jest centralnym czynnikiem transkrypcyjnym aktywowanym w warunkach stresu oksydacyjnego i został zaangażowany w apoptosis komórek beta w warunkach przeciążenia żelazem15,16,17. Dlatego niniejsze badanie bada, czy zmniejszenie ekspresji MEG3 może zwiększyć apoptosis komórek beta wysp trzustkowych poprzez sygnalizację NF-κB w warunkach przeciążenia żelazem. Ta praca może dostarczyć nowych wglądów w mechanizmy molekularne leżące u podstaw nieprawidłowego metabolizmu glukozy w talasemia β-TM.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zastosowane w niniejszym badaniu protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny Szpitala Generalnego Hainan (numer protokołu 2021-239). We wszystkich procedurach eksperymentalnych ściśle przestrzegano Wytycznych Narodowych Instytutów Zdrowia USA dotyczących opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i Deklaracji Helsińskiej. Reagenty oraz sprzęt użyty w tym badaniu wymieniono w Tabeli Materiałów.
1. Model zwierzęcy i projekt eksperymentu
W badaniu tym wykorzystano trzydzieści sześć samców myszy C57BL/6J (4 tygodnie, ok. 20 g). Wszystkie myszy były trzymane w standardowych warunkach laboratoryjnych (20–25 °C, 50%–65% wilgotność względna, cykl 12-godzinne światło/ciemność) z dostępem do żywności i wody ad libitum. Po okresie przystosowania trwającym 7 dni myszy losowo podzielono na dwie grupy (n=18 w każdej): grupę z przeciążeniem żelaza (grupa modelowa), która otrzymała dootrzewnowe wstrzyknięcia żelaza w dekstran (0,2 g/kg) dwa razy w tygodniu przez 4 tygodnie; oraz grupę kontrolną, otrzymującą odpowiednie objętości izotonicznego roztworu soli fizjologicznej dootrzewnowo. Po 4 tygodniach myszy uśmiercono, a tkanki trzustki zebrano do dalszej analizy.
2. Oznaczanie stężenia żelaza w surowicy
Probki krwi pobrane były z zatok oczodołowych podczas znieczulenia 1% pentobarbitalem w okresie dyjnym. Po pozostawieniu na 1 h w temperaturze pokojowej, krew wyśrodkowano przy 4 °C, 3000 obr./min przez 15 min. Surowicę oddzielono i przechowano w temperaturze -80 °C. Stężenie żelaza w surowicy oznaczono za pomocą zestawu kolorymetrycznego do oznaczania żelaza zgodnie z protokołem producenta.
3. Analiza histologiczna
Próbki tkanek trzustki zanurzono w 4% paraformaldehydzie w celu utrwalenia, a następnie zatopiono w parafinie przed przygotowaniem sekcji. Uzyskano sekcje tkankowe o grubości od 4 do 5 μm, które poddano standardowym procedurom odparafinowania i odwodnienia. Następnie przeprowadzono badanie histologiczne za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną, podczas gdy osadzanie żelaza w tkankach trzustki oceniono za pomocą barwienia metodą pruską zgodnie z konwencjonalnymi protokołami barwienia histologicznego.
4. Hodowla komórek i transfekcja małych interferencyjnych kwasów nukleinowych rybonukleinowych
Komórki trzustkowe MIN6 myszy kultivowano w pożywce Dulbecco’s modyfikowanej z wysokim stężeniem glukozy, uzupełnionej o 15% surowicy płodowej wołowej, 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny, 10 mM HEPES, 50 mM pirobinianu sodu i 50 μmol/L β-merkaptoetanol. Wszystkie eksperymenty przeprowadzano w 80% konfluencji komórek. Podczas hodowli komórek pobiera się zawsze 6–8 ml pożywki hodowlowej. Komórki utrzymywano w 37 °C w 5% wilgotnej atmosferze CO2. Do badań funkcjonalnych komórki MIN6 w fazie wzrostu wykładniczego przeprowadzano transfekcję małymi interferencyjnymi (si)RNA (RNAi) selektywnymi dla lncRNA (w oparciu o wyniki mikromacierzy; grupa inhibitora) lub negatywnym RNAi kontrolnym (grupa inhibitora NC) za pomocą Lipofectamine 2000 zgodnie z instrukcją producenta. Po 24-godzinnej kulturze komórki analizowano metodą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qRT-PCR) lub western blot w celu określenia efektywności wyciszenia. Sekwencje docelowe tego siRNA brzmiały: siMEG3: GCGUCUUCCUGUGCCAUUUTTAAAUGGCACAGGAAGACGCTT; siNC: UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT. Każde z badań przeprowadzano w trzech powtórzeniach i powtarzano trzykrotnie.
5. Oznaczanie odwrotnej transkryptazy reakcji łańcuchowej polimerazy
Całkowity RNA wyodrębniono z próbek tkanek trzustki i komórek MIN6 za pomocą komercyjnie dostępnego środka do izolacji RNA opartego na fenolu zgodnie z instrukcją producenta. Komplementarny DNA syntetyzowano za pomocą zestawu do odwrotnej transkryptazy w całkowitej objętości reakcji wynoszącej 20 μL. Po odwrotnej transkrypcji stężenie cDNA większości próbek wynosiło około 1 μg/μL na podstawie analizy ilościowej próbek. Następnie 1 μL szablonu cDNA wykorzystano do ilościowego amplifikacyjnego PCR w czasie rzeczywistym. qRT-PCR przeprowadzono za pomocą zestawu wykrywania PCR opartego na SYBR Green zgodnie z następującymi warunkami cyklu: 95 °C przez 30 s, 90 °C przez 15 s, 60 °C przez 34 s i 68 °C przez 30 s. Poziom ekspresji genu wyznaczono metodą porównawczych cykli progowych (metoda 2-ΔCT). GAPDH wykorzystano jako gen referencyjny wewnętrzny do normalizacji danych PCR w czasie rzeczywistym. Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzano zgodnie z protokołami producentów, a
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ocena modelu przeładowania żelazem u myszy i pomiar ekspresji genu wyrażanego matczynie w tkankach trzustki
Aby zbadać rolę MEG3 in vivo, stworzyliśmy model przeładowania żelaza u myszy poprzez podawanie dootrzewnowe dekstrany żelaza. W porównaniu z grupą kontrolną, poziom żelaza w surowicy w grupie Model był znacząco podwyższony (p<0,05) (Rysunek 1A). Badanie histologiczne ujawniło znaczne osadzenie żelaza w tkankach trzustki, co wykazało barw...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Nienormalny metabolizm glukozy jest częstym i poważnym powikłaniem u pacjentów z β-TM, często objawiającym się jako IGT lub DM. W niniejszym badaniu stwierdziliśmy, że przeciążenie żelazem prowadziło do uszkodzenia trzustki i znacząco zmniejszało ekspresję lncRNA MEG3 w tkance trzustki, wraz ze zwiększoną apoptozą komórek beta wysp trzustkowych. Co więcej, wyłączenie MEG3 w komórkach MIN6 sprzyjało apoptozie komórek beta i było związane z aktywacją NF-ĸB, co wskazuje na potencjalny związek mechanizmu między MEG3 a przeci...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Badanie to było sfinansowane przez Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (822QN445) oraz Foundation of Hainan Educational Committee (Hnky2024-30).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1M Tris-HCL (pH=6.8) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | T1020 | |
| 50bp DNA Ladder | TIANGEN | MD108 | |
| 50bp DNA Ladder | TIANGEN | MD108 | |
| 6×DNA Loading Buffer | TIANGEN | GH101-01 | |
| 6×DNA Loading Buffer | TRANS | GH101-01 | |
| -80ºC refrigerator | BIOBASE | BDF-86V348 | |
| ABI 7500 real-time PCR system | Applied Biosystems, USA | ||
| Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit | MULTI SCIENCES | AP101-100-kit | |
| BCA Protein Assay Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd. | E-BC-K318-M | |
| Biopulverizer | biospec | ||
| BSA | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | A8020 | |
| C57BL/6J male mice | Gempharmatech Co,Jiangsu,China | ||
| CCK-8 Cell Proliferation Assay Kit | KeyGEN BioTECH | KGA317 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| DMEM | KeyGEN BioTECH | ||
| Flow cytometry | ACEA Biosciences, USA | NovoCyte 2060R | |
| Fluorescence PCR instrument | Bio-Rad Laboratories, Shanghai | ||
| Glycine | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | G8200 | |
| High-capacity cDNA reverse transcription kit | Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA | ||
| HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Servicebio | GB23301 | 1/2000 |
| HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Servicebio | GB23303 | 1/2000 |
| Human LncRNA Array V5.0 | Arraystar,Rockville, Maryland, USA | ||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| Microarray scanner | Agilent Technologies,California, USA | ||
| MIN6 cell | procell | KGM12800N | |
| Mini-Bead-Beater-16 | biospec | ||
| Mouse Anti-GAPDH | TransGen Biotech | HC301 | 1/2000 |
| NanoDrop spectrophotometer | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | ND-2000 | |
| PAGE Pre-Solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | A1010 | |
| Primers | Generay Biotech,Anhui, China | ||
| PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser | CWBIO,Jiangsu, China | ||
| PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Rabbit Anti Bax | proteintech | 50599-2-ig | 1/5000 |
| Rabbit Anti Bcl-2 | abcam | ab194583 | 1/1000 |
| Rabbit Anti Caspase3 | abcam | ab184787 | 1/2000 |
| Rabbit Anti P65 | abcam | ab32536 | 1/8000 |
| Rabbit Anti p-P65 | Affinity | af2006 | 1/1000 |
| TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa, Japan | ||
| TRIzol | Invitrogen life technologies, Carlsbad, CA, USA | ||
| TRIzol reagent | CWBIO,Jiangsu, China | ||
| Ultra-sensitive chemiluminescence imaging system instrument | Bio-Rad Laboratories, Shanghai | Chemi DocTM XRS+ | |
| Ultraviolet spectrophotometer | NanoPhotometer | NP80 |