Solidne izolowanie i wielokrotne identyfikowanie krążących rzadkich komórek za pomocą ciągłej mikrofluidyki wirówkowej i immunocytochemii żelowej

Podsumowanie

Niniejsze badanie przedstawia ciągły mikropłynkowy przepływ odśrodkowy do efektywnego izolowania i identyfikacji krążących rzadkich komórek. System umożliwia precyzyjne sterowanie płynami i minimalizuje utratę komórek, pozwalając na jednoczesną analizę wielu podtypów CRC, w tym CTC i cCAF, w celu poprawy dokładności diagnostycznej.

Streszczenie

Wędrujące rzadkie komórki (CRCs), w tym krążące komórki nowotworowe (CTCs) i krążące komórki fibroblastów związane z rakiem (cCAFs), są obiecującymi biomarkerami do diagnozy i prognozy raka. Jednak ich niezwykle niska obfitość i heterogeniczność fenotypową sprawiają, że wydajne izolacja i wieloparametrowa analiza są technicznie wymagające. Przedstawiamy tutaj ciągły mikrofluidyczny przepływ wirowania do sekwencyjnej izolacju i identyfikacji CRCs z pełnej krwi. Wkładka składa się z pięciu połączonych ze sobą komór z sterowanymi zaworami, które umożliwiają precyzyjne operowanie gradientem gęstości medium i warstwami krwi podczas wirowania. Oparty na wcześniej zweryfikowanym platformie wzbogacania, obecny przepływ integruje ucieczkę komórek w oparciu o żel z wielokrotną immunocytochemią w celu wsparcia identyfikacji i charakteryzacji wielu podtypów CRC, w tym CTCs i cCAFs. Po izolację, komórki są unieruchomione w macierzy żelowej, aby wspierać retencję komórek podczas wielokrotnego barwienia immunologicznego i analizy opartej na obrazach. Korzystając z tego przepływu, zarówno CTCs jak i cCAFs zostały zidentyfikowane z tego samego próbki, co pokazuje wykonalność zintegrowanej analizy wielu krążących populacji rzadkich komórek w ramach jednego przepływu biopsji płynowej. Ta platforma zapewnia praktyczne i powtarzalne podejście do charakteryzacji rzadkich komórek w zastosowaniach biopsji płynowej.

Wprowadzenie

Kojące się rzadkie komórki (CRC) są definiowane jako komórki, które występują w krwioobiegu z niezwykle niską częstotliwością w porównaniu z normalnymi składnikami krwi, takimi jak czerwone krwinki, białe krwinki i płytki krwi. CRC pochodzą z różnych źródeł, takich jak produkty uboczne procesów biologicznych, przebudowy tkankowej, gojenia ran lub uszkodzeń naczyń krwionośnych. Reprezentatywnymi przykładami są kojące się komórki śródbłonkowe, kojące się komórki płodowe, megakariocyty, erytroblasty oraz różne komórki progenitorowe lub komórki macierzyste^1,2. Chociaż istnienie CRC samo w sobie niekoniecznie oznacza stan patologiczny, podwyższone poziomy często wskazują na nieprawidłowe stany fizjologiczne lub patologiczne^3,4. W związku z tym, wrażliwe wykrywanie i charakterystyka CRC dostarcza cennych informacji na temat dynamicznych procesów fizjologicznych i patologicznych zachodzących w organizmie.

Wśród podtypów CRC, kojące się komórki nowotworowe (CTC) i kojące się komórki fibroblastów związanych z rakiem (cCAF) są głównymi biomarkerami raka. CTC dostarczają bezpośrednich dowodów na rozsiewanie komórek nowotworowych i są szeroko badane⁵. Zmiany w liczeniu CTC są często związane z wczesnym wykrywaniem, rokowaniem i monitorowaniem odpowiedzi terapeutycznej⁶. Równolegle, cCAF reprezentują składniki stromy wydzielane do krwioobiegu, odzwierciedlające interakcje mikrośrodowiska nowotworu i tworzenie niszy przedprzerzuchowej⁷. Jednak w porównaniu z CTC, badania nad cCAF są nadal ograniczone, a ich przydatność kliniczna zaczyna być dopiero badana⁸.

CTC i cCAF mogą dostarczać uzupełniających się informacji biologicznych w biopsji płynowej, ponieważ CTC odzwierciedlają rozsiewanie komórek nowotworowych i cechy przerzutowe, podczas gdy cCAF mogą reprezentować przebudowę stromy i sygnały postępowania związane z mikrośrodowiskiem nowotworu. Jednoczesna analiza tych dwóch populacji kojących się rzadkich komórek może zatem wspierać bardziej zintegrowane zrozumienie postępu raka niż analiza każdej z populacji osobno. Jednak ich przydatność kliniczna i translacyjna jest znacznie ograniczona przez ich skrajną rzadkość we krwi obwodowej, brak powszechnie akceptowanych markerów cCAF oraz znaczną niejednorodność ekspresji markerów wśród subpopulacji komórek, co razem utrudnia niezawodne identyfikowanie. Dlatego minimalizowanie utraty komórek podczas wzbogacania i identyfikacji jest krytyczne dla zapewnienia solidnej i niezawodnej analizy. Ponadto, kompleksowa charakterystyka funkcjonalna i różnorodność markerów CTC i cCAF jest niezbędna do wyjaśnienia ich roli w przerzutach i opracowania klinicznie znaczących biomarkerów^8,9.

Przedstawiamy tu metodę jednoczesnego izolowania cCAF i CTC^10,11, w połączeniu z wielomarkerowym identyfikowaniem za pomocą enkapsulacji żelową immunocytochemii (ICC) kojących się rzadkich komórek¹². Obecne metody izolacji CRC często napotykają na ograniczenia techniczne, w tym utratę komórek podczas wieloetapowego przetwarzania, ograniczone wychwytywanie fenotypowo heterogenicznych komórek oraz stronniczość selekcji związaną z strategiami wzbogacania zależnymi od markerów. W przeciwieństwie do tego, ciągła mikropłytka wirująca stosowana w niniejszym badaniu opiera się na kompleksowej ramie wzbogacania, zmniejszając w ten sposób zależność od konwencjonalnych markerów pozytywnej selekcji. Wydajność analityczna i przepływ pracy podstawowej platformy wzbogacania została opisana w naszych poprzednich badaniach⁹.

Bazując na tej zweryfikowanej platformie, niniejsze badanie koncentruje się na integracji unieruchamiania komórek na bazie żelu i wielokrotnej immunocytochemii, aby umożliwić kompleksowe izolację i identyfikację wielu kojących się rzadkich populacji komórek, w tym CTC i cCAF, w ramach jednolitego przepływu pracy. Łącząc wzbogacanie, stabilne utrzymanie komórek i analizę zgodną z wielokrotnym barwieniem, ten protokół zapewnia praktyczną ramę dla zintegrowanej analizy rzadkich komórek z próbek biopsji płynowej.

Protokół

Wszystkie procedury związane z próbkami krwi ludzkiej od pacjentów i zdrowych dawców zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu Etycznego (IRB) Szpitala Severance. Protokół badania został zatwierdzony przez Komitet Etyczny Szpitala Severance (IRB nr 4-2013-0059). Zużyte reagenty i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie urządzenia

1. Naciśnij przełącznik zasilania, aby włączyć instrument.
2. Aktywuj przełącznik zabezpieczenia laserowego, a następnie włącz przełącznik zasilania lasera.
3. Uruchom oprogramowanie operacyjne i upewnij się, że system inicjalizuje się normalnie.
4. Z głównego interfejsu oprogramowania wybierz Operację urządzenia i wybierz predefiniowany protokół dla standardowych próbek krwi pełnej w EDTA.

2. Operacja urządzenia - 1^szy krok

UWAGA: Szczegóły dotyczące pozycji wlotów i struktury kasetonu są przedstawione na Rysunku 1A.

1. Z wlotu 6 dodaj 2 mL Reagentu A (medium gradientu gęstości) do komory początkowej.
2. Z wlotu 8 dodaj 875 μL Reagentu A do komory zubożonej.
3. Zamontuj kaseton na stojaku dysków, upewniając się prawidłowego ustawienia dla wirowania.
4. Naciśnij przycisk Drzwi na CTCeptorze, aby otworzyć uchwyt, a następnie zamontuj stójka dysków na CTCeptorze i zabezpiecz ją za pomocą śrub mocujących.
5. Naciśnij przycisk Drzwi, aby zamknąć uchwyt, a następnie uruchom krok Odwirowania za pomocą oprogramowania CTCeptor (około 30 s).
6. Po potwierdzeniu, że Reagent A został przeniesiony do dolnej części komory początkowej, zwolnij śruby mocujące i usuń stójkę dysków z urządzenia, zachowując zamontowany kaseton.

3. Operacja urządzenia - 2^gi krok

1. Przed przetwarzaniem próbek krwi wykonaj wszystkie procedury w certyfikowanym szafie bezpieczeństwa biologicznego i założyj odpowiednie wyposażenie ochronne, w tym rękawiczki, fartuch laboratoryjny i ochronę oczu, zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.
2. Po usunięciu kasetonu z urządzenia wstrzyknij 3 mL krwi do komory początkowej przez wlot 6.
3. Zamontuj stójka dysków na CTCeptorze i zabezpiecz ją za pomocą śrub mocujących.
4. Uruchom krok Usunięcia RBC za pomocą oprogramowania CTCeptor (około 40 min). W tym kroku wirowanie oddziela osocza, RBC i komórki mononuklearne krwi obwodowej (PBMC) wewnątrz kasetonu, a frakcja zawierająca PBMC jest przenoszona do następnej komory na dalsze usuwanie leukocytów.
5. Po zakończeniu kroku Usunięcia RBC usuń stójkę dysków z urządzenia.

4. Operacja urządzenia - 3^ci krok

1. Starannie zdezynfekuj obszar roboczy, aby zachować sterylność.
2. Wiruj Reagent B (perełki do izolacji leukocytów), aby zapewnić jednorodną zawiesinę.
3. Przygotuj bufor myjący, mieszając bezwapnione DPBS Ca²/Mg² z 0,1% BSA i 2 mM EDTA (pH 7,4).
4. Przenieś pożądany objętość Reagentu B do 1,5 mL probówki (na przykład 50 μL na kaseton).
5. Dodaj bufor myjący pięciokrotnie większy niż objętość Reagentu B i delikatnie wymieszaj pipetując.
6. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym przez 1 min, aby perełki w Reagensie B mogły się zgromadzić, a następnie ostrożnie odrzuć nadstan.
7. Resuspenduj perełki w buforze myjącym w objętości równej początkowej objętości perełek.
8. Przechowuj perełki w 4 °C do momentu użycia.
9. Natychmiast przed użyciem zmieszaj 50 μL przygotowanej zawiesiny perełek z 50 μL DPBS, a następnie załaduj 100 μL mieszanki do wlotu 7.
10. Zamontuj stójka dysków na CTCeptorze i zabezpiecz ją za pomocą śrub mocujących.
11. Uruchom krok Usunięcia WBC za pomocą oprogramowania CTCeptor (około 50 min). W tym zaprogramowanym kroku załadowane perełki do izolacji leukocytów są mieszane z frakcją zawierającą PBMC poprzez wstrząsanie, aby promować wiązanie perełek z WBC, a następnie usuwanie frakcji związanej z perełkami poprzez wirowanie.
12. Po zakończeniu kroku Usunięcia WBC usuń stójkę dysków z urządzenia.

5. Odzyskiwanie próbek

1. Włóż końcówkę pipety do wylotu 9 końcowej komory i resuspenduj zawartość, a następnie przenieś zebraną próbkę do probówki 15 mL.
2. Wstrzyknij 2 mL DPBS do wylotu 9, do

Wyniki

Rysunek 1A przedstawia obraz pojedynczego wkładu używanego do izolacji rzadkich komórek. Wkład składa się z pięciu osobnych komór połączonych mikrokanalami i sterowanymi zaworami, które regulują przepływ płynu. Struktura wkładu jest następująca: (1) komora plazmowa, która zbiera osocze oddzielone od pełnej krwi; (2) początkowa komora, w której pełna krew jest dzielona na osocze, komórki czerwone i warstwy PBMC; (3) komora mieszająca, w której izolowane PBMC są łączone z kulkami do izolacji l...

Dyskusja

CRC to ważne biomarkery o potencjalnej wartości zarówno w diagnostyce raka, jak i w prognozowaniu. Aby jednak poprawić przydatność kliniczną analizy CRC, ważne jest uchwycenie szerszej gamy fenotypowo zróżnicowanych populacji CRC oraz wsparcie równoległej wieloparametrycznej charakteryzacji¹³. Ponadto, rosnące dowody w onko-immunologii wskazują, że składniki immunologiczne i mikrośrodowisko nowotworowe odgrywają kluczowe role w kształtowaniu odpowiedzi terapeutycznej, podkreślając potrzebę wyjścia...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
15 mL Conical Tube	SPL	50015
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28908
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-545-152
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-585-003
Bovine Serum Albumin	GenDepot	A0100-010
CD45 antibody	Biolegend	304060
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CTCD	CTCELLS	CTD-C103	Disc cartridge
CTCD rack	CTCELLS	CTDR-CM3	Disc rack
CTCeptor	CTCELLS	CTM-C2203	CTCeptor
CTR-S Reagent A	CTCELLS	CTR-S1001	density gradient media
CTR-S Reagent B	CTCELLS	CTR-S1002	leukocyte isolation beads
FAP antibody	Invitrogen	PA5-99313
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
HypICC Photoinitiator	CTCELLS	CTR-G1002
HypICC Solution A	CTCELLS	CTR-G1001
HypICC Unit	CTCELLS	CTH-V01	HypICC chamber
Latex glove	Ansell	93743080
Magnetic stand			Fabricated in-house using a 3D printer
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
pancytokeratin antibody	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Welegene	LB001-02
SMA antibody	Invitrogen	PA5-18292
Tip, 10 µL	TipOne	9104020333
Tip, 1250 µL	TipOne	9104020740
Tip, 200 µL	TipOne	9104020422
Triton X-100	Signma	X100-100ML
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA
β actin antibody	abcam	ab8226