Izolacja i charakterystyka egzosomów pochodzących z komórek macierzystych miazgi zębów w przejściach komórkowych

Podsumowanie

Protokół ten określa ustandaryzowany sposób izolowania i charakteryzowania egzosomów pochodzących z komórek macierzystych miazgi zębów (DPSC) w różnych przejściach, umożliwiając powtarzalną ocenę jakości egzosomów i aktywności funkcjonalnej w zastosowaniach regeneracyjnych.

Streszczenie

Komórki macierzyste miazgi zębów (DPSC) stanowią dostępne i klinicznie istotne źródło komórek macierzystych mezenchymalnych, a ich egzosomy okazały się obiecującymi bioaktywnymi pęcherzykami do zastosowań wolnych od komórek w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. Jednak powtarzalne i standaryzowane metody izolowania i funkcjonalnej walidacji egzosomów pochodzących z DPSC pozostają ograniczone, szczególnie pod względem zmienności wprowadzanej podczas ekspansji komórek między przejściami. Tutaj opisujemy kompleksowy, ustandaryzowany, oparty na zestawach workflow do izolacji i oczyszczania egzosomów z ośrodka warunkowanego DPSC, który jest zgodny z rutynową praktyką laboratoryjną. Metoda ta umożliwia spójną odzyskiwanie nienaruszonych pęcherzyków odpowiednich do charakteryzacji morfologicznej, molekularnej i funkcjonalnej przy użyciu powszechnie dostępnych technik. Tożsamość egzosomów ocenia się na podstawie morfologii, rozkładu rozmiarów i ekspresji markerów, natomiast aktywność biologiczna ocenia się za pomocą zdefiniowanego in vitro testu przeciwzapalnego. Aby zbadać efekty związane z przejściem, egzosomy pochodzące z różnych przejść DPSC są porównywane za pomocą tego odczytu funkcjonalnego, co stanowi praktyczne ramy do oceny spójności podczas rozszerzania się komórek. Integrując izolację, oczyszczanie, charakteryzację i walidację funkcjonalną w jednym procesie, protokół ten oferuje powtarzalne i skalowalne podejście do generowania funkcjonalnie zwalidowanych egzosomów pochodzących z DPSC do badań biomateriałów i zastosowań regeneracyjnych.

Wprowadzenie

Egzosomy pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych pełnią kluczową rolę mediatorów komunikacji międzykomórkowej i wykazują znaczący potencjał terapeutyczny w dziedzinach inżynierii tkankowej oraz medycyny regeneracyjnej. Egzosomy to pęcherzyki o średnicy 30–150 nm, zdolne do dostarczania bioaktywnych cząsteczek oraz regulacji różnych funkcji w komórkach biobiorców, takich jak proliferacja, różnicowanie i odpowiedź immunologiczna ^1,2. Spośród różnych źródeł komórek macierzystych mezenchymalnych (MSC), komórki macierzyste miazgi zębów (DPSC) są szczególnie interesujące ze względu na łatwy dostęp, silną zdolność proliferacyjną, niskie ryzyko nowotworowe oraz minimalne kwestie etyczne ^3,4,5. Egzosomy pochodzące z DPSC (DPSC-Exos) zawierają różnorodny repertuar ładunków funkcjonalnych, w tym białka, mRNA i mikroRNA, co pozwala im zachować wiele biologicznych właściwości komórek rodzicielskich. Wcześniejsze badania wykazały, że DPSC-Exos może wspierać angiogenezę, naprawę nerwową, regenerację kości oraz odpowiedzi przeciwzapalne. Poza rolą w inżynierii tkankowej, egzosomy są coraz częściej uznawane za ważne regulatory w onkogenezie i terapii nowotworów, gdzie przyczyniają się do przebudowy mikrośrodowiska guza, oporności na leki oraz unikania odporności⁶. Egzosomy pochodzące z MSC, w tym te z DPSC, posiadają wrodzone zdolności lokalizacyjne na nowotwory i właściwości immunomodulacyjne, co czyni je obiecującymi narzędziami nowej generacji do celowanego dostarczania leków przeciwnowotworowych lub jako bezkomórkowe środki immunoterapeutyczne. Omijając kilka ograniczeń związanych z terapiami komórkowymi, DPSC-Exos stały się obiecującym bezkomórkowym bioaktywnym składnikiem do zastosowań regeneracyjnych 7,8,9,10,11,12.

Pomimo tych zalet, przeniesienie badań DPSC-Exo na powtarzalne zastosowania eksperymentalne lub kliniczne pozostaje wyzwaniem. Głównym ograniczeniem jest brak jednolitych i standaryzowanych protokołów izolacji i oczyszczania egzosomów. Obecnie stosowane podejścia to ultrawirówka¹³, ultrafiltracja, wytrącanie, chromatografia wykluczająca wielkość oraz wychwytywanie immunoaffinity ^14,15. Wśród tych metod wytrącanie na bazie polimerów oferuje praktyczne zalety, w tym wysoką przepustowość, kompatybilność z szerokim zakresem objętości próbek oraz prostotę operacyjną, co czyni ją odpowiednią do badań z dużą liczbą próbek lub wymagań skalowania 16,17,18. Analizy porównawcze różnych metod izolacji, szczególnie dotyczące wydajności białek i stosunku cząstek do białek, zostały szeroko udokumentowane w literaturze¹⁹. Jednak wpływ numeru przejścia DPSC na cechy i aktywność biologiczną pochodnych egzosomów nie został wystarczająco wyjaśniony, co stanowi istotną lukę w standaryzacji i kontroli jakości produkcji DPSC-Exo.

Aby sprostać tym technicznym ograniczeniom, badanie przedstawia ustandaryzowany, oparty na zestawach protokół izolowania i oczyszczania egzosomów z ośrodka warunkowanego DPSC. Oprócz charakterystyki fizycznej i molekularnej, protokół zawiera test funkcjonalny oceniający działanie przeciwzapalne egzosomów pochodzących z różnych przejść DPSC, umożliwiając porównawczą ocenę spójności jakości i funkcji egzosomów zależnych od przejścia. Workflow został zaprojektowany z myślą o prostym wdrożeniu w laboratoriach wyposażonych w standardowe zaplecze do hodowli komórek i biologii molekularnej. Opiera się na komercyjnie dostępnych zestawach, aby zmniejszyć zmienność międzyeksperymentalną i może być łatwo skalowany, aby dostosować się do różnych potrzeb eksperymentalnych. Aby zminimalizować zmienność między dawcami, DPSC są izolowane od poszczególnych zębów i rozszerzane niezależnie, zamiast łączyć je z wieloma dawcami. Protokół ten jest szczególnie przydatny dla badaczy chcących generować funkcjonalnie zweryfikowane egzosomy pochodzące z DPSC do zastosowań kolejnych, w tym gojenia ran, inżynierii tkanki kostnej oraz badań immunomodulacji, gdzie spójność partia do partii jest kluczowa. Ogólnie rzecz biorąc, zapewnia praktyczne i ustandaryzowane ramy do produkcji egzosomów pochodzących z DPSC do zastosowań w inżynierii tkankowej i badaniach medycyny regeneracyjnej.

Protokół

Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej i zatwierdzone przez instytucjonalne komisje etyki. Tkanki miazgi zębów pozyskano z odrzuconych trzecich trzonowców lub ortodontycznych przedtrzonowców pobranych w Szpitalu Stomatologicznym w Ningbo zgodnie z wytycznymi etycznymi instytucji (Protokół nr NBKQYY2025LS-04; Data zatwierdzenia: 30 maja 2025). Tkanki skóry ludzkiej pozyskano z odrzuconych próbek napletka pobranych podczas rutynowych procedur obrzezania w Katedrze Urologii w Szpitalu Ludowym Uniwersytetu Ningbo, zgodnie z wytycznymi etycznymi instytucjonalnymi (Protokół nr 2024104; data zatwierdzenia: 30 października 2024). Przed pobraniem próbki uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich dawców lub ich prawnych opiekunów.

1. Izolacja egzosomów pochodzących z komórek macierzystych z miazgi zębów

1. Izolacja, kultura i identyfikacja DPSC
   1. Pobieranie próbek i transport
      1. Pobierz nienaruszone trzecie trzonowce ludzkie od dawców w wieku 18–25 lat lub przedtrzonowce od dawców w wieku 12–16 lat po ekstrakcji ortodontycznej.
      2. Natychmiast umieścić usunięte zęby w schłodzonej soli fodyjnej z buforem fosforanowym (PBS) z dodatkiem 100 U/mL penicyliny-G oraz 100 μg/mL streptomycyny.
      3. Przetransportuj próbki do laboratorium w temperaturze 4 °C i przetwarzaj w ciągu 6 godzin od pobrania.
   2. Ekspozycja miazgi zębów i dysocjacja tkanek
      1. Zanurz w 70% etanolu przez 30 sekund; myj trzy razy z 1× PBS zawierającym 3% P/S (po 30 sekund każdy). Ostrożnie usuwaj resztki tkanek dziąseł i przyzębia z powierzchni zęba za pomocą sterylnych nożyczek lub skalpela.
      2. Owiń ząb sterylną gazą, a następnie ostrożnie rozbij koronę sterylnym młotkiem, aby odsłonić komorę miazgi.
      3. Delikatnie oddziel tkankę miazgi od zębiny, pokrój ją na małe fragmenty (<1 mm³) sterylnymi ostrzami chirurgicznymi.
      4. Przenieś fragmenty tkanek do probówki wirówki o pojemności 1,5 mL zawierającej roztwór trawienny 2,5 mg/mL Dispaze II oraz 2,5 mg/mL kolagenazy typu I.
      5. Inkubuj mieszankę w inkubatorze 37 °C przez 30–45 minut z delikatnym mieszaniem.
         UWAGA: Czas trawienia enzymatycznego określano na podstawie objętości i stopnia homogenizacji tkanki miazgi zębowej.
   3. Zakończenie trawienia i hodowla komórek pierwotnych
      1. Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając równą ilość zmodyfikowanego Medium Orła (DMEM) Dulbecco, wzbogaconego o 10% surowicę płodową bydła (FBS).
      2. Wiruj zawiesinę komórkową w stężeniu 200 × g przez 5 minut, aby rozpylić komórki i fragmenty tkanek.
      3. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulek w 1 mL kompletnego medium hodowlowego (α-MEM z 20% FBS, 100 U/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny).
      4. Nasiać ponownie zawiesowane komórki i rośliny do 60-mm naczynia hodowlanego i dodać kompletne medium do końcowej objętości 5 mL.
      5. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% CO₂.
   4. Utrzymanie komórek i subkultura
      1. Odświeżaj podłoże co 2–3 dni.
      2. Monitoruj komórki codziennie.
         UWAGA: Pierwotne DPSC zazwyczaj migrują z roślin tkankowych i osiągają 80–90% zbiegu w ciągu 7–14 dni.
      3. Do podhodowli odłącz komórki za pomocą 0,05% trypsyny-etylendiaminetetraoctowego kwasu (EDTA), gdy osiągną 80–90% zbiegu.
         UWAGA: Trypsyna drażni. Noszę odpowiedni sprzęt ochrony osobistej, w tym rękawiczki i okulary ochronne.
      4. Komórki przepuszczane w stosunku 1:3, używając pełnego medium hodowlanego (z 20% FBS).
      5. Używaj DPSC w fragmentach 2, 4 i 6 dla wszystkich dalszych testów izolacji egzosomów i testów funkcjonalnych.
   5. Charakterystyka DPSC za pomocą cytometrii przepływowej
      1. Odłącz DPSC w pożądanym przejściu przy użyciu 0,05% trypsyny-EDTA, neutralizuj go kompletnym medium hodowlowym i zbieraj zawiesinę komórkową.
      2. Wiruj w 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesij osad komórkowy w PBS i policz komórki. Dostosuj gęstość komórek do około 1 × 10^{6 komórek} /mL.
      3. Należy zaznaczyć 100 μL zawiesiny komórkowej do każdej rurki przepływowej. Inkubować komórki przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przeciwko CD44, CD90, CD105, CD45, CD19 i CD14 w rozcieńczeniu 1:100 w PBS przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
      4. Przemyj komórki, dodając 1 ml PBS do każdej probówki, a następnie wiruj w 300 × g przez 5 minut. Ostrożnie odrzuć supernatant i ponownie zawiesić pellet komórkowy w 300–500 μL PBS do analizy.
      5. Uwzględnić odpowiednie przeciwciała kontrolujące izotyp w dopasowanych stężeniach dla każdego fluorochromu, aby umożliwić korekcję tła i gating.
      6. Analizować próbki za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w odpowiednie lasery i filtry dla wybranych fluorochromów. Zbierz co najmniej 10 000 zdarzeń na próbkę.
      7. Przeprowadz analizę danych za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej. Po pierwsze, należy przeprowadzić żywotne komórki oparte na rozpraszaniu do przodu (FSC) i rozpraszaniu bocznym (SSC), aby wykluczyć zanieczyszczenia. Następnie zastosuj kratkę na singlety, aby usunąć dublety.
      8. Określenie ekspresji markerów poprzez porównanie intensywności fluorescencji z odpowiadającymi grupami kontrolnymi izotypów, aby zdefiniować populacje dodatnie i ujemne.
2. Izolacja i oczyszczanie DPSC-Exos
   1. Przygotowanie podłoża kondycjonowanego
      1. Hoduj DPSC w naczyniu o średnicy 10 cm, aż osiągną 70–80% zbiórki.
      2. Usuń zużyte podłoże, a następnie delikatnie umyj monowarstwę komórki dwukrotnie podgrzanym PBS.
      3. Dodaj 10 ml kompletnego medium z 10% wyszczużonym przez egzosomy FBS.
      4. Dalej inkubuj hodowlę w temperaturze 37 °C, aż konfluencja komórek osiągnie 90–100% (proces ten zwykle trwa dłużej niż 24 godziny).
   2. Kolekcja podłoża warunkowanego
      UWAGA: Wszystkie kolejne etapy trzymaj na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
      1. Przenieś podłoże do rurki wirówki.
      2. Wirówka w medium w temperaturze 4 °C i 3 000 × g przez 10 minut, aby usunąć komórki i duże zanieczyszczenia.
      3. Ostrożnie przelej supernatant do nowej rurki wirówki, nie naruszając granulacji.
      4. Wiruj supernatant w temperaturze 4 °C i 10 000 × g przez 10 minut, aby rozpylić mniejsze cząstki i ciała apoptotyczne.
      5. Przefiltruj supernatant przez filtr strzykawkowy o pojemności 0,22 μm do czystej rurki wirówki o pojemności 50 mL.
      6. Natychmiast przetwórz klarowany podłoże w celu izolacji egzosomów, czyli aliquot, i przechowuj go w temperaturze -80 °C.
         UWAGA: Oczyszczony podłoże kondycjonowane można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy. Unikaj powtarzających się cykli zamarzania i rozmrażania.
   3. Izolacja egzosomów za pomocą wytrącenia polimerowego
      1. Jeśli był zamrożony, rozmroz klarowane podłoże na lodzie.
      2. W sterylnej probówce na lodzie połącz podłoże z roztworem o stężeniu egzosomów w stosunku objętościowym 4:1 (np. 20 mL medium: 5 mL roztworu). Rozmiesz mieszankę przez 1 minutę, aby zapewnić jednorodność.
      3. Pozostawić mieszankę niezakłóconą w temperaturze 4 °C przez 16–18 godzin, aby umożliwić wytrącenie egzosomów.
         UWAGA: Czas inkubacji można odpowiednio wydłużyć, aby potencjalnie zwiększyć plony, ale nie powinien przekraczać 24 godzin.
      4. Wiruj mieszankę w temperaturze 4 °C i 10 000 × g przez 75–80 minut, aby rozpylić egzosomy. Ostrożnie zasysaj i odrzucaj supernatant, nie naruszając granulatu.
      5. Ponownie wiruj probówkę w temperaturze 4 °C i 10 000 × g przez 2 minuty. Usuń wszelkie pozostałości nadmiaru pipetą.
      6. Ponownie zawiesij pellet egzosomu w 1x PBS (użyj 200 μL PBS na 20 mL podłoża kondycjonowanego).
      7. Przelej zawiesinę do nowej rurki wirówki o pojemności 1,5 mL i zamieszaj w 4 °C i 12 000 × g przez 2 minuty, zachowując supernatant, wzbogacony o cząstki egzosomów (powtórz w razie potrzeby).
   4. Oczyszczanie egzosomów
      1. Zastosuj zawieszenie egzosomów do kolumny filtra oczyszczającej egzosomy umieszczonej w probówce zbiorczej.
      2. Wiruj kolumnę w temperaturze 4 °C i 3 000 × g przez 10 minut.
      3. Zbieraj ciecz przepływającą z dna probówki. Ta ciecz zawiera oczyszczone egzosomy.
   5. Przechowywanie oczyszczonych egzosomów
      1. Aliquot oczyszczonego zawieszenia egzosomów w jednorazowych objętościach odpowiednich do dalszych eksperymentów.
      2. Przechowuj aliquoty w temperaturze -80 °C.
         UWAGA: Alicytat jest kluczowy, aby uniknąć powtarzających się cykli zamarzania i rozmrażania, które mogą pogorszyć integralność egzosomów i aktywność biologiczną.
   6. Charakterystyka i identyfikacja DPSC-Exo
      1. Przeprowadz analizę morfologiczną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), zgodnie z krokami 1.2.6.2–1.2.6.6.
      2. Użyj pipety, pobierz 10 μL przygotowanej próbki zawiesiny egzosomów i wlej ją na przygotowany Parafilm. Umieść formwar/powlekaną węglem miedzianą siatkę, stroną filmu skierowaną do dołu, na kroplę, pozwalając jej naturalnie się wchłaniać przez 10–15 minut.
      3. Użyj paska papieru filtracyjnego, aby odciąć nadmiar płynów i pozwól mu krótko wyschnąć na powietrzu.
      4. Użyj pipety, nabierz 10 μL 2% roztworu kwasu fosforungstycznego i wlej go na parafilm. Odwróć siatkę, która zakończyła proces adsorpcji tak, aby jej strona filmu była skierowana do roztworu barwienia, i pozostawij ją na 3–5 minut.
      5. Użyj paska papieru filtracyjnego, aby odprowadzić nadmiar płynu i pozwolić kratce wyschnąć pod żarówką żarową.
      6. Obserwuj i rejestruj obrazy za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.
      7. Wykonaj analizę rozkładu rozmiarów i stężenia za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA), zgodnie z krokami 1.2.6.8–1.2.6.12.
      8. Przepłucz komorę próbek trzy razy wodą ultraczystą.
      9. Kalibruj instrument przy użyciu standardowych kulek polistyrenowych o średnicy 100 nm zgodnie z instrukcjami producenta. Po pomyślnej kalibracji przekonuj pomiary.
      10. Przepłucz komorę próbną 1× PBS.
      11. Rozcieńcz próbkę egzosomu w 1× PBS (rozcieńczenie 1:500) i załaduj ją do komory próbki. Monitoruj ruch cząstek w czasie rzeczywistym za pomocą oprogramowania instrumentu.
      12. Zbierz dane i wygeneruj odpowiadający im raport analityczny.
      13. Identyfikacja markerów białkowych za pomocą analizy Western blot, zgodnie z krokami 1.2.6.14–1.2.6.24.
      14. Próbki egzosomów lizy za pomocą buforu lizy białek specyficznego dla egzosomu i ilościowo określają stężenie białek za pomocą testu kwasu bicynchoninowego (BCA).
      15. Przygotuj żele rozwiązujące i układające się w stosy. Ładuj równe ilości białka na tor i dodaj 5 μL markera białka do każdego żelu.
      16. Wykonaj elektroforezę przy stałym napięciu 80 V, aż czoło barwnika dotrze do żelu rozwiązującego, następnie zwiększ do 120 V i kontynuuj, aż przód barwnika dotrze do dna żelu.
      17. Przetnij membranę fluorku poliwinylidenu (PVDF) do odpowiedniego rozmiaru i aktywuj ją, mocząc ją w metanolu przez 5 minut.
      18. Przygotuj bufor transferowy składający się z 25 mM zasady Tris, 192 mM glicyny oraz 20% (v/v) metanolu (pH = 8,3). Wyrównaj wszystkie komponenty transferowe w buforze transferowym.
      19. Złóż kanapkę transferową w następującej kolejności od katody do anody: gąbka – papier filtracyjny – żel – membrana PVDF – papier filtracyjny – gąbka. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza i przeprowadź transfer białka przy stałym prądzie 300 mA.
      20. Po transferze krótko przepłucz membranę PVDF solą fizjologiczną z buforem Tris i zawartością 0,1% Tween20 (TBST) i blokuj ją 5% mlekiem beztłuszczowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając.
      21. Inkubuj błonę przeciwciałami pierwotnymi (np. anty-CD63 i anty-TSG101) rozcieńczonymi w 5% mleku beztłuszczowym przez noc w temperaturze 4 °C i delikatnie potrząsając. Myj błonę trzy razy TBST przez 5 minut każdy.
      22. Inkubuj odpowiednim przeciwciałem wtórnym w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie trzy płukania TBST (po 5 minut każdy).
      23. Przygotuj świeży roztwór roboczy elektrochemiluminescencji (ECL) (mieszaj roztwory A i B w proporcji 1:1), nakładaj na membranę i wykrywaj sygnały za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego.

2. Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów naskórka ludzkiej skóry

1. Pobieranie próbek i transport
   1. Pobierz próbki tkanki napletka od zdrowych dawców mężczyzn w Szpitalu Ludowym Uniwersytetu Ningbo.
   2. Natychmiast umieść pobraną tkankę napletka w 4 °C PBS z dodatkiem 100 U/mL penicyliny-G oraz 100 μg/mL streptomycyny.
   3. Próbki transportować do laboratorium w temperaturze 4 °C i przetwarzać w ciągu 6 godzin.
2. Przygotowanie aseptyczne i fragmentacja tkanek
   1. Zanurz tkankę w 70% etanolu na 30 sekund do 3 minut.
      UWAGA: Dostosuj czas zanurzenia w zależności od wielkości tkanki przy początkowej dezynfekcji.
   2. Za pomocą sterylnych nożyczek lub skalpela rozcieraj i usuń tłuszcz podskórny oraz tkankę łączną z umytej próbki.
   3. Sieknij go na małe fragmenty (rozmiar fragmentu <1 mm³) za pomocą sterylnych ostrzy chirurgicznych.
      UWAGA: Drobne mielenie 3–4 próbek tkanek zazwyczaj zajmuje mniej niż 15 minut. Dodaj niewielką ilość PBS podczas mielenia, jeśli tkanka wydaje się sucha.
   4. Przelej zmieloną zawiesinę tkankową do rurki wirówki o pojemności 50 mL zawierającej roztwór trawienny o stężeniu 2,5 mg/mL kolagenazy typu I oraz 2,5 mg/mL Dispaze II. Dodaj 10–20 ml roztworu trawiennego na kawałek posiekanej tkanki.
   5. Inkubuj mieszankę w inkubatorze 37 °C przez 60 minut. Utrzymuj delikatne pobudzanie przy 80 × g lub mocno poruszaj rurkę ręcznie co 20 minut.
3. Wtórne trawienie i leczenie DNazą
   1. Dodaj 0,25% trypsyny-EDTA do mieszaniny trawiennej w proporcji objętościowej 1:5. Inkubuj rurkę w 37 °C przez 25 minut z delikatnym mieszaniem.
      UWAGA: Trypsyna drażni. Noszę odpowiedni sprzęt ochrony osobistej, w tym rękawiczki i okulary ochronne.
   2. Dodaj roztwór DNazy I (10 mg/mL) do mieszaniny w stosunku 10 μL na mL całkowitej objętości trawienia. Inkubuj w 37 °C przez 5 minut z delikatnym podsycaniem.
4. Zakończenie trawienia i hodowla komórek pierwotnych
   1. Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając równą ilość DMEM z 10% FBS.
   2. Dokładnie trituruj mieszankę, pipetując w górę i w dół około 20 razy, aby rozdzielić fragmenty tkanek. Przefiltruj zawiesinę ogniwa przez sitko ogniwa 100 μm do nowej rurki wirówki 50 mL.
   3. Wiruj zawiesinę komórkową w stężeniu 200 × g przez 5 minut, aby rozpylić komórki i fragmenty tkanek.
   4. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulek w 1 mL kompletnego medium hodowlowego (α-MEM z 20% FBS, 100 U/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny).
   5. Nasiaj ponownie zawiesowane komórki i wysadzenia do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm i dodaj kompletne medium do końcowej objętości 6 mL.
   6. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5%_CO2.
      UWAGA: Uzupełnij hodowle keratynocytów Y-27632 w końcowym stężeniu 5 μM podczas hodowli.
5. Utrzymanie komórek i subkultura
   1. Odświeżaj podłoże co 2–3 dni.
   2. Monitoruj komórki codziennie.
      UWAGA: Pierwotne keratynocyty naskórkowe zazwyczaj migrują z wychodów tkanek i osiągają 80-90% zbiór w ciągu 10-14 dni.
   3. W subkulturze odłącz komórki przy użyciu 0,05% trypsyny-EDTA, gdy osiągną 80–90% zbiegu.
      UWAGA: Trypsyna drażni. Noszę odpowiedni sprzęt ochrony osobistej, w tym rękawiczki i okulary ochronne.

3. Funkcjonalna weryfikacja przeciwzapalnej funkcji egzosomów z różnych przepustek

1. Siew komórkowy i przygotowanie
   1. Nasiąć keratynocyty naskórkowe o gęstości 1,5 × 10^{5 komórek} na dołek do płytki z 12 dołkami. Dodaj 1 mL kompletnego medium do każdego dołka i hoduj komórki przez 24 godziny.
   2. Gdy konfluencja komórek osiągnie około 70%, ostrożnie aspiruj ośrodek, delikatnie myj monowarstwę komórki dwukrotnie podgrzanym 1× PBS.
2. Stymulacja zapalna i leczenie egzosomów
   1. Indukować model komórkowy łuszczycowego, stymulować komórki prozapalną mieszaniną cytokinową "M5" (zawierającą IL-1α, IL-17A, IL-22, onkostatynę M i TNF-α, każda w końcowym stężeniu 10 ng/mL).
   2. W grupach leczonych współinkubuj stymulowane komórki DPSC-Exos (50 μg na dołek).
   3. W grupie kontroli ujemnej (NC) dodaj równoważną objętość PBS zamiast egzosomów.
      UWAGA: Wszystkie stymulacje i zabiegi wykonuj w medium pozbawionym Y-27632, aby zapobiec potencjalnej ingerencji w szlaki sygnalizacji zapalnej.
3. Pobieranie próbek i analiza qRT-PCR (porównanie funkcjonalne między fragmentami)
   1. Pobierz komórki i wyodrębnij RNA po 24 godzinach leczenia.
   2. Przeanalizuj ekspresję kluczowego markera zapalnego IL-23A.
      1. Porównaj efekty hamujące na ekspresję IL-23A wśród grup leczonych egzosomami pochodzącymi z różnych przejśćeń (P2, P4 i P6) za pomocą qRT-PCR w celu oceny zmian funkcji egzosomów zależnych od przejścia.
      2. Wykonaj qRT-PCR w następujących warunkach cyklicznych: początkowa denaturacja w 95 °C przez 3 minuty, następnie 40 cykli denaturacji w 95 °C przez 10 sekund oraz wyżarzanie/przedłużanie w 60 °C przez 30 sekund.
      3. Wykonaj analizę krzywej stopienia od 65 °C do 95 °C, aby potwierdzić specyficzność amplifikacji.
         UWAGA: Sekwencje początkowe: Human-IL-23A (do przodu: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAGAC-3', rewers: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3'); Human-H36B4 (forward: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTGTGTGTGT-3', reverse: 5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3')

Wyniki

Identyfikacja i charakterystyka komórek macierzystych miazgi zębów
Pierwotne komórki macierzyste miazgi zębów (DPSC) izolowane według opisanego protokołu wykazywały stabilny wzrost i typową morfologię mezenchymalną podczas ekspansji in vitro. Jak pokazano na Rysunku 1, DPSC w przepustkach 2, 4 i 6 wykazywały jednorodną populację komórek o kształcie wrzecionowatych, przypominających fibroblasty, bez widocznych różnic morfologicznych ani oznak...

Dyskusja

Standaryzowany protokół opisany w tym badaniu zapewnia powtarzalne ramy do izolacji komórek macierzystych miazgi zębów (DPSC), produkcji egzosomów pochodzących z DPSC (DPSC-Exos) oraz funkcjonalnej walidacji tych pęcherzyków w wielu przejściach komórkowych. Poniższa dyskusja podkreśla kluczowe kwestie proceduralne, strategie optymalizacji, ograniczenia metodologiczne oraz szersze znaczenie tego przepływu pracy dla badań w medycynie regeneracyjnej.

Niezawodność tego protokołu zależy od ścisłej ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% Trypsyna-EDTA Roztwór	Gibco	25300054	Ze względu na swoją siłę trawienną trypsyna jest szeroko stosowana do dysocjacji komórek, rutynowego przekazywania hodowli komórek oraz dysocjacji tkanek pierwotnych.
Naczynie do hodowli komórek i tkanek o średnicy 100 mm	Biofil	TCD010100	Powierzchniowo impregnowana/nieimpregnowana sterylna i sterylna Niepirogeniczne wolne od DNazy/RNazy
Kulki PS o prędkości 100 nm	Thermo Fisher	3100A	Przed przeprowadzeniem eksperymentów analizy śledzenia nanocząstek (NTA) instrument musi być skalibrowany według standardu o dokładnie znanym rozmiarze cząstek (100 nm).
15 mL rurka stożkowa do wirówki o pojemności 15 mL	KIRGEN	KG2611	Bezpłodny, wolny od RNazy/DNAZ i pirogeniczny
Siatka miedziana pokryta Formvarem o średnicy 200 mesh, pokryta węglem	Zhongjing   Naukowy   Instrumenty	AZH200	Wspiera próbki egzosomów do obrazowania TEM. Powłoka Formvar-carbon zwiększa przyczepność i przewodność próbki, a siatka o rozłożeniu 200 siatek zapewnia wystarczającą przestrzeń otwartą dla równomiernego rozkładu cząstek i stabilnego obrazowania.
37 i stopni; Inkubator C	Thermo Scientific	51032877	Inkubator CO2 o temperaturze 37 stopni zapewnia idealne warunki in vitro.
Rurka stożkowa o pojemności 50 mL	KIRGEN	KG2811	Bezpłodny, wolny od RNazy/DNAZ i pirogeniczny
Przeciwciało przeciw CD63 [MX-49.129.5]	Abcam	ab193349	Przeciwciało przeciw CD63 [MX-49.129.5] (ab193349) to mysze monoklonalne przeciwciało wykrywające CD63 in  Western Blot, cytometria przepływowa (intra), cytometria przepływowa, IHC-P, ICC/IF. Odpowiednie na  Człowiek.
Przeciwciało przeciw TSG101 [EPR7130(B)]	Abcam	ab125011	Przeciwciało anty-TSG101 [EPR7130(B)] (ab125011) to przeciwciało monoklonalne królika wykrywające TSG101 in  Western Blot, cytometria przepływowa (intra), cytometria przepływowa, IHC-P, ICC/IF. Odpowiednie na  Człowiek, Mysz, Szczur.
Automatyczny licznik komórek komórkowych	Countstar	IC1000	Automatyczny licznik komórek do szybkiego i precyzyjnego liczenia komórek
Zestaw do testowania białek BCA	Beyotime	P0012	Mają dobrą liniową zależność w zakresie stężenia 50–2000 i mu; G/ML.
Wirówka stołowa	BIORIDGE	TD5	Wirówka stołowa do szybkiego i efektywnego oddzielania próbek w warunkach laboratoryjnych
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	Thermo Scientific	1379	Szafka bezpieczeństwa biologicznego to sterylne urządzenie zabezpieczające, które chroni operatorów, próbki i środowiska przed zagrożeniami biologicznymi poprzez filtrowanie patogenów przenoszonych w powietrzu i zapobieganie zanieczyszczeniu krzyżowemu podczas pracy mikrobiologicznej.
Płytka hodowla komórkowa, 12-dołek	Eppendorf	0030721110	Hodowla tkankowa z pokrywką, płaskim dnem< br/> Sterylna, wolna od wykrywalnych pirogenów, RNaza i DNaza, ludzka i ludzka BACT. DNA Niecytotoksyczne
Płytka hodowla komórkowa, 96-dołek	NEST	701001 0714B	Hodowla tkankowa poddawana, polistyren, niepirogeniczna, sterylna
Cellsaving	NCM	C40100	Medium zamrażającego bez surowicy i białka zwierzęcego< br/>
Kolagenaza, typ I, proszek	Gibco	17100017	Kolagenaza to proteaza, która rozszczepia wiązanie między neutralnym aminokwasem (X) a glicyną w sekwencji Pro-X-Gly-Pro, występującej z wysoką częstotliwością w kolagenie.
Dispase II, proch	Gibco	17105041	Dispaza II (neutralna proteaza) to aminoendo-peptydaza, która hydrolizuje N-końcowe wiązania peptydowe w niepolarnych resztach aminokwasowych.
Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco	Gibco	C11995500BT	[+]4,5g/L D-glukoza [+]L-glutamina [+]110mg/L Pirorowinian sodu
Evo M-MLV Reverse Transcription Kit	AG	AG11707	Dedykowany odczynnik transkrypcji odwrotnej dla RT-PCR w czasie rzeczywistym. Wykorzystuje transkryptoazę odwrotną Evo M-MLV o silnej zdolności rozszerzania, umożliwiając efektywną syntezę cDNA w krótkim czasie.
Roztwór koncentracji egzosomów	Umibio	UR52111	Ekstrakcja egzosomów z supernatantu komórki
Surowica bydła z uszczupłym wyczerpaniem egzosomów	Umibio	UR50202	Bezpłodowe surowicę bydła uzyskano przez filtrowanie sterylnie zebranego zdrowego surowicy płodowej bydła, oraz ≥ Usunięto 99% endogennych egzosomów w surowicy płodowej bydła. Miał takie samo tempo wzrostu komórek i morfologię jak surowica bydła płodu przed przetwarzaniem.
Serum płodowe bydło, kwalifikacja, Australia	Gibco	10099141	Poziom hemoglobiny:  ≤ 30 mg/dL (poziomy rutynowo ≤ 25 mg/dL)
Human-H36B4	Sangon Biotech	SB002	Naprzód: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTGTGTGTGT-3'; Reverse: 5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3'
Człowiek-IL-23A	Sangon Biotech	SB002	Skrzydło: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAGAC-3'; Rewers: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3'
Odwrócony mikroskop biologiczny	Leica	DMI1	Bezpośrednio obserwuj żywe komórki lub tkanki przylegające do ścian pojemników, takich jak kolby hodowlane i szalki Petriego.
Minimalne Niezbędne Medium	Gibco	C12571500BT	[+]L-glutamina [+]Rybonukleozydy [+]Deoksyrybonukleozydy
Szybki zestaw do ekstrakcji RNA NcmSpin	NCM	M5106	Ten zestaw może szybko wyodrębnić całkowite RNA z nawet 3 000 000 komórek i do 10 mg tkanek.
Penicylina-Streptomycyna	NCM	C100C5	Zawiera 10 000 jednostek/ml penicyliny oraz 10 000 mikrogramów/ml streptomycyny. Został przefiltrowany w celu usuwania bakterii i może być bezpośrednio stosowany do hodowli komórek. Skutecznie zapobiega zanieczyszczeniu komórek przez bakterie.
PerfectStart Green qPCR SuperMix	TransGen	AQ601-02-V2	Fluorescencyjne barwnik, który wiąże się z drobnym rowkiem całego dwuniciowego DNA i emituje zielone światło przy wzbudzeniu. Podczas amplifikacji PCR włącza się do nowo amplifikowanego DNA, co skutkuje zwiększoną fluorescencją. Podczas etapu denaturacji nici DNA rozdzielają się, uwalniając barwnik i powodując znaczny spadek sygnału fluorescencji.
Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)	Niech żyją biologie komórek	C3582-0500	Jego funkcją jest utrzymanie pH ośrodka w zakresie fizjologicznym oraz utrzymanie równowagi ciśnienia osmotycznego wewnątrz i na zewnątrz komórki.
Kwas fosforungstyczny	Solarbio	G1870	Używany jako negatywny barwnik do przygotowania próbek TEM.
SW Wodne Łaźnie Wstrząsane	Julabo	(DIN 12876-1)I	Zakres temperatur roboczych od +20 do +99,9 stopni; C
Filtr strzykawkowy, 0,22 μ m/33 mm, PES	Beyotime	FF362	Wolne od DNazy/RNazy Niskobiałkowe wiązanie Niepirogeniczne Indywidualnie opakowane
Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)	HITACHI	HT7700	Wykorzystywany do obrazowania morfologii nanocząstek w wysokiej rozdzielczości, w tym egzosomów. Pracował z napięciem przyspieszającym 80 ndash; 100 kV do wizualizacji próbek negatywnie zabarwionych oraz potwierdzenia wielkości, kształtu i integralności strukturalnej cząstek.
ZetaView_Particle Metrix	Particle Metrix	PMX-120	Służy do pomiaru rozmiaru cząstek, stężenia, potencjału Zeta oraz właściwości fluorescencyjnych nanocząstek.