Wykrywanie hormonów płciowych w błonie łzowej człowieka za pomocą enzymatycznych testów immunopochłaniających

Nutchaarpa Puangmalai; Anna A. Tichenor

doi:10.3791/70979

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie hormonów płciowych w błonie łzowej człowieka za pomocą enzymatycznych testów immunopochłaniających

236 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70979

⸱

12 czerwca 2026

Nutchaarpa Puangmalai¹^,² , Anna A. Tichenor¹

¹School of Optometry, Indiana University, ²Faculty of Optometry, Ramkhamhaeng University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zoptymalizowaną metodę enzymatycznego testu immunopochłaniania (ELISA) do wykrywania i ilościowego oznaczania 17β-estradiolu i testosteronu w ludzkiej cieczy łzowej pobranej za pomocą mikrokapillark. Takie podejście umożliwia minimalnie inwazyjne pomiary stężenia hormonów w łzach.

Streszczenie

Film łzowy jest złożoną, wielowarstwową substancją płynną, niezbędną do utrzymania zdrowia powierzchni oka, jasności widzenia oraz ochrony przed patogenami i czynnikami stresującymi środowiskowe. Składając się głównie z lipidów, płynu wodnego, rozpuszczalnych białek i mukoprotein, służy nie tylko smarowaniu i ochronie oka, ale także jako cenne medium diagnostyczne w przypadku zaburzeń powierzchni oka, takich jak choroba suchego oka (DED). Hormony płciowe, w tym androgeny i estrogeny, wpływają na skład filmu łzowego, ale pomiar tych hormonów w płynie łzowym jest ograniczony przez małą objętość próbki i wyzwania techniczne. Protokół ten opisuje krok po kroku metodę adaptacji komercyjnie dostępnych zestawów ELISA (enzymaticzny test immunopochłanianiowy) do wykrywania i ilościowego oznaczania 17β-estradiolu i testosteronu w łzach podskórnych pobieranych za pomocą mikrokapillarkowych rurek. Przepływ pracy obejmuje zoptymalizowane strategie pobierania próbek, rozcieńczania i przygotowywania testu, aby umożliwić analizę próbek łez o małej objętości. Protokół pokazuje wykonalność i powtarzalność wykrywania hormonów w płynie łzowym przy użyciu przystosowanych metod ELISA. Wyniki reprezentatywne są pochodne od zbiorczych próbek pilotażowych i mają na celu zilustrowanie wydajności testu, a nie różnic biologicznych. Takie podejście może wspierać przyszłe badania badające płyn łzowy jako matrycę do pomiaru hormonów w badaniach nad powierzchnią oka.

Wprowadzenie

Film łzowy odgrywa kluczową rolę w ochronie, odżywianiu i nawilżaniu powierzchni oka¹. Ma on grubość około 2–5.5 µm i objętość 3–10 µL, a w zdrowym oku szybkość jego wymiany wynosi 1–2 µL na minutę²^,³^,⁴. Gruczoły łzowe wydzielają wodną komponent łez, bogatą w wodę, elektrolity, białka i czynniki przeciwbakteryjne, podczas gdy gruczoły Meibomiusza produkują lipidy, które spowalniają parowanie filmu łzowego, a komórki kubkowe spojówki wydzielają mucyny wspierające nawilżanie powierzchni oka⁵^,⁶. Produkcja łez odbywa się na dwa główne sposoby: 1) wydzielanie podstawowe, które utrzymuje stabilny film łzowy na zdrowej powierzchni oka, oraz 2) wydzielanie odruchowe, wyzwalane przez bodźce takie jak podrażnienie, emocje lub jasne światło. Skład biochemiczny różni się w obu przypadkach, co w konsekwencji może wpływać na metodę stosowaną do pobierania łez do analizy⁷^,⁸. Łzy podstawowe zazwyczaj zawierają wyższe stężenia białek i lipidów, które wspierają stabilność filmu łzowego i zdrowie rogówki, natomiast łzy odruchowe charakteryzują się większą objętością wodną i są bardziej rozcieńczone, aby wypłukać substancje drażniące i chronić powierzchnię oka⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹².

Ponieważ łzy pełnią funkcję modulowania stanu zapalnego, obrony przed patogenami oraz dostarczania składników odżywczych do beznaczyniówkowej rogówki¹, stały się one kluczowym punktem badań nad biomarkerami¹³. Łzy stanowią małoinwazyjną i stosunkowo tanią alternatywę dla pobierania krwi w celu monitorowania zmian fizjologicznych, zwłaszcza tych występujących w pobliżu miejsca choroby¹⁰. Aby dokładnie zarejestrować te dane, niezbędny jest prawidłowy sposób pobierania próbek¹³. Szklane rurki mikrokapilarne są powszechnie stosowane do pobierania łez bazalnych, ponieważ umożliwiają one kolekcję przy minimalnym podrażnieniu i rozcieńczeniu łez⁷. Metoda ta, polegająca na ostrożnym ustawieniu rurki w celu uniknięcia kontaktu z spojówką bulbarną i brzegiem powieki, minimalizuje ryzyko wywołania odruchowego łzawienia, które może zmienić skład łez¹²^,¹⁴. Stosując to podejście, badacze mogą uzyskać nierozcieńczone łzy bazalne odzwierciedlające stan fizjologiczny powierzchni oka. Zapewnia to, że próbka pozostanie wiarygodnym medium do ilościowego oznaczania wrażliwych analitów, takich jak hormony płciowe¹³^,¹⁵. Jednak ograniczona objętość uzyskanej próbki stwarza wyzwania analityczne dla późniejszych testów biochemicznych. Pobieranie łez bazalnych za pomocą rurek mikrokapilarnych zazwyczaj dostarcza zaledwie kilka mikrolitrów na próbkę, co ogranicza kompatybilność ze standardowymi analizami.

Powierzchnia oka u ludzi jest coraz częściej rozpoznawana jako tkanka docelowa dla hormonów płciowych¹⁶^,¹⁷. Dowody potwierdzające tę tezę obejmują wykrycie transkryptów mRNA dla receptorów androgenowych (AR), receptorów estrogenowych (ER) i receptorów progesteronu (PR) w komórkach acynarnych gruczołów łzowych i Meiboma, a także w komórkach nabłonkowych rogówki, spojówki oraz w komórkach kubkowych spojówki¹⁸. Co więcej, w tkankach tych zidentyfikowano mRNA kodujące enzymy steroidogenne, co sugeruje zdolność do lokalnej konwersji prekursorów steroidowych w biologicznie aktywne hormony płciowe¹⁹. Wskazuje to na potencjał do syntezy hormonów in situ na powierzchni oka i rodzi kluczowe pytanie, czy hormony te są wydzielane do filmu łzowego na poziomach możliwych do wykrycia.

Obecne dowody sugerują, że hormony płciowe są niezbędne do utrzymania homeostazy powierzchni oka, choć dokładne mechanizmy molekularne pozostają przedmiotem badań¹⁶^,¹⁷. Androgeny, takie jak testosteron, wydają się stymulować wydzielanie lipidów i hamować stan zapalny; w związku z tym niedobór androgenów jest powszechnie uznawany za czynnik wywołujący parującą postać suchego oka¹⁶^,¹⁷^,²⁰. Z kolei rola estrogenów jest bardziej złożona i zależna od kontekstu¹⁶^,¹⁷^,²¹. Mimo że biorą one udział w modulowaniu składu i objętości łez, wahania poziomu estrogenów, takie jak te występujące podczas menopauzy, ciąży lub stosowania doustnych środków antykoncepcyjnych, są często związane z upośledzonym wydzielaniem fazy wodnistej, zmniejszoną stabilnością filmu łzowego oraz stanem zapalnym powierzchni oka²²^,²³^,²⁴. W rezultacie osoby doświadczające tych zaburzeń hormonalnych stanowią populację o podwyższonym ryzyku rozwoju zespołu suchego oka (DED)¹⁶^,¹⁷^,²³.

Pomimo tych dowodów, monitorowanie statusu hormonalnego u pacjentów z DED pozostaje wyzwaniem. W szczególności nie ustalono jeszcze, czy systemowe poziomy hormonów w surowicy dokładnie odzwierciedlają lokalne poziomy hormonów w oku²⁵. Rozróżnienie to jest kluczowe, ponieważ wykazano, że tkanki powierzchni oka posiadają receptory hormonów płciowych oraz ekspresję enzymów steroidogennych, które wspierają lokalną syntezę i metabolizm steroidów płciowych¹⁸^,¹⁹. Ta zdolność intrakrynna sugeruje, że lokalne stężenia hormonów w filmie łzowym mogą znacząco różnić się od krążących poziomów w surowicy¹⁶. Dlatego też, aby lepiej zrozumieć lokalne efekty hormonalne na powierzchni oka, konieczny jest bezpośredni pomiar stężenia hormonów w płynie łzowym. Jednakże takie pomiary są trudne technicznie ze względu na małą objętość próbek łez dostępnych do analizy. Zaawansowane techniki analityczne, takie jak chromatografia cieczowa sprzężona z spektrometrią mas (LC-MS), były stosowane do ilościowego oznaczania hormonów we krwi i płynach łzowych z wysoką czułością, lecz metoda ta wymaga specjalistycznej aparatury i wiedzy technicznej, które mogą nie być łatwo dostępne dla wszystkich badaczy²⁵^,²⁶.

Test immunoenzymatyczny (ELISA) jest powszechnie stosowaną techniką detekcji i ilościowego oznaczania białek, przeciwciał oraz hormonów. W celu analizy małych cząsteczek, takich jak steroidy płciowe, w niniejszym protokole zastosowano format wiązania konkurencyjnego. W tej metodzie nieznakowany hormon obecny w próbce łez konkuruje z analogiem hormonu znakowanym enzymem o ograniczoną liczbę miejsc wiążących przeciwciał. Ze względu na tę konkurencję intensywność sygnału, mierzona jako gęstość optyczna, jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia hormonu w próbce; w praktyce słabszy sygnał wskazuje na wyższe stężenie badanego hormonu²⁷^,²⁸.

ELISA oferuje szereg praktycznych zalet w przypadku ukierunkowanego oznaczania ilościowego. Metoda ta jest kosztowo efektywna i dostępna technicznie, co pozwala na jej wdrożenie w standardowych warunkach laboratoryjnych bez konieczności stosowania specjalistycznej aparatury. Ponadto ELISA umożliwia wysokoprzepustowe przesiewy w formacie płytek 96-dołkowych przy minimalnym przygotowaniu próbek, co zapewnia zarówno oszczędność czasu, jak i wysoką powtarzalność²⁷. Jednakże komercyjnie dostępne zestawy ELISA są zazwyczaj optymalizowane dla próbek biologicznych o większej objętości, takich jak surowica lub osocze, a ich skuteczność w przypadku małymi objętościami próbek łez nie jest dobrze określona. Aby rozwiązać ten problem, protokół obejmuje zoptymalizowane strategie rozcieńczania i obchodzenia się z próbkami, aby umożliwić detekcję hormonów w zakresie czułości testu.

W niniejszym badaniu prezentujemy wizualizowany protokół adaptujący komercyjnie dostępne zestawy ELISA do wykrywania i ilościowego oznaczania 17β-estradiolu oraz testosteronu w próbkach łez ludzkich o małej objętości, pobranych za pomocą szklanych rurek mikrokapilarnych. Protokół ten kładzie nacisk na praktyczne modyfikacje w zakresie pobierania próbek, ich obróbki oraz przygotowania analizy, aby umożliwić powtarzalny pomiar hormonów z ograniczonej objętości łez. Praca ta koncentruje się na opracowaniu wykonalnego schematu postępowania w celu zastosowania istniejącej metodologii ELISA do analizy płynu łzowego. Takie podejście może stanowić podstawę dla przyszłych badań nad lokalnym poziomem hormonów na powierzchni oka.