Ten protokół opisuje zoptymalizowaną metodę enzymatycznego testu immunopochłaniania (ELISA) do wykrywania i ilościowego oznaczania 17β-estradiolu i testosteronu w ludzkiej cieczy łzowej pobranej za pomocą mikrokapillark. Takie podejście umożliwia minimalnie inwazyjne pomiary stężenia hormonów w łzach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie hormonów płciowych w błonie łzowej człowieka za pomocą enzymatycznych testów immunopochłaniających
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Film łzowy jest złożoną, wielowarstwową substancją płynną, niezbędną do utrzymania zdrowia powierzchni oka, jasności widzenia oraz ochrony przed patogenami i czynnikami stresującymi środowiskowe. Składając się głównie z lipidów, płynu wodnego, rozpuszczalnych białek i mukoprotein, służy nie tylko smarowaniu i ochronie oka, ale także jako cenne medium diagnostyczne w przypadku zaburzeń powierzchni oka, takich jak choroba suchego oka (DED). Hormony płciowe, w tym androgeny i estrogeny, wpływają na skład filmu łzowego, ale pomiar tych hormonów w płynie łzowym jest ograniczony przez małą objętość próbki i wyzwania techniczne. Protokół ten opisuje krok po kroku metodę adaptacji komercyjnie dostępnych zestawów ELISA (enzymaticzny test immunopochłanianiowy) do wykrywania i ilościowego oznaczania 17β-estradiolu i testosteronu w łzach podskórnych pobieranych za pomocą mikrokapillarkowych rurek. Przepływ pracy obejmuje zoptymalizowane strategie pobierania próbek, rozcieńczania i przygotowywania testu, aby umożliwić analizę próbek łez o małej objętości. Protokół pokazuje wykonalność i powtarzalność wykrywania hormonów w płynie łzowym przy użyciu przystosowanych metod ELISA. Wyniki reprezentatywne są pochodne od zbiorczych próbek pilotażowych i mają na celu zilustrowanie wydajności testu, a nie różnic biologicznych. Takie podejście może wspierać przyszłe badania badające płyn łzowy jako matrycę do pomiaru hormonów w badaniach nad powierzchnią oka.
Wprowadzenie
Warstwa łzowa pełni istotne role w ochronie, odżywianiu i smarowaniu powierzchni oka1. Ma grubość około 2–5,5 µm i objętość 3–10 µL, a jej tempo wymiany wynosi 1–2 µL na minutę w zdrowym oku2,3. Gruczoły łzowe wydziela komponent wodny łez, bogaty w wodę, elektrolity, białka i czynniki przeciwdrobnoustrojowe, podczas gdy gruczoły Meiboma wytwarzają lipidy, które spowalniają parowanie warstwy łzowej, a komórki kubełkowe spojówek uwalniają muczyny, które wspierają smarowanie powierzchni oka4. Produkcja łez odbywa się na dwa główne sposoby: 1) sekrecja bazalna, która....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To badania zostały zatwierdzone przez Indiana University Institutional Review Board (IRB#1908362633), a pisemna zgoda świadoma została uzyskana od wszystkich uczestników przed pobraniem próbki.
1. Pobieranie łez
- Przygotowanie
- Określ objętość łez do pobrania, mając na uwadze, że 2 repliki są potrzebne dla statystycznej wiarygodności wyników ELISA.
- Przygotuj mikroprobówkę 1,5 ml do przechowywania łez.
- Wybierz odpowiednie mikroprobówki do pobierania łez. Zaleca się zacząć od 3,33 µL lub 5 µL i przejść na mniejszy rozmiar, jeśli pobierane są łzy z niższej objętości na powierzchni ok....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Pilot Tear Film Study
W badaniu tym wzięło udział łącznie 20 kobiet (45–63 lata). Klasyfikacja DED opierała się na objawach i co najmniej jednym klinicznym objawie DED. W szczególności wszystkie uczestniczki z DED miały wynik Ocular Surface Disease Index (OSDI) > 12 i co najmniej jedno oko z czasem rozpadu łez fluoresceinowych (TBUT) < 5 s lub wynikiem punktowym barwienia rogówki fluoresceiną (CFSS) > 3 (skala NEI25). Osoby zaklasyfikowane jako non-DED .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zbieranie i analiza łez umożliwiają łatwy dostęp do naukowej oceny zdrowia powierzchni oka oraz identyfikacji potencjalnych biomarkerów10,22. Nasz protokół opisuje pomyślne dostosowanie powszechnie stosowanych metod ELISA do analizy próbek płynu łzowego pod kątem hormonów płciowych. Opracowaliśmy tę metodę, aby przeciwdziałać głównej ograniczenia analizy łez, czyli stosunkowo małej objętości dostępnych łez. Poprzez optymalizację przepływu pracy, aby sprostać tym .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
NP: Żadne ujawnienia.
AAT: Alcon (finansowanie badań), Abbvie (doradztwo), Lumenis (prelegent), i Tarsus (prelegent). Brak konfliktu interesów w odniesieniu do przedstawionej tu pracy.
Podziękowania
To prace były częściowo wspierane przez NIH K23 EY027845 oraz grant na wsparcie badań wydziałowych programu IU Faculty Research Support Program.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 17 beta Estradiol ELISA Kit | Abcam | ab108667 | |
| Aluminium foil | Reynolds Wrap | 10900000154 | Każda dostępna folia aluminiowa do kuchni, aby chronić odczynniki przed światłem |
| Microcapillary tube 3.33 μL | Drummond | 1-000-0033 | Zawierają gumową kulkę do transferu płynu |
| Microcapillary tube 5 μL | Drummond | 1-000-0050 | Zawierają gumową kulkę do transferu płynu |
| Microcentrifuge device | Benchmark Scientific | C1012 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Fisher | 05-408-129 | |
| Microplate reader | Promega | GM3000 | |
| Orbital microplate shaker | Labnet International Inc. | S2030-1000-B | |
| Język komputerowy R | Posit Software, PBC (formerly RStudio Inc.) | R wersja 4.5.1 | Pobierz język R przed Rstudio przez https://cran.r-project.org/ |
| Oprogramowanie RStudio | Posit Software, PBC (formerly RStudio Inc.) | RStudio 2023.06.1 Build 524 "Mountain Hydrangea" | https://posit.co/downloads/ |
| Pakiety R "drc", "ggplot2", "patchwork", "ggpp", "dplyr", "readr", "tidyr", "writexl" | Posit Software, PBC (formerly RStudio Inc.) | Zainstaluj pakiet w Rstudio | |
| Testosterone Control kit | R&D Parameter | QC165 | Sprzedane oddzielnie od zestawu ELISA (KGE010) |
| Testosterone ELISA kit | R&D Parameter | KGE010 |
Przedruki i uprawnienia
