Wykrywanie hormonów płciowych w błonie łzowej człowieka za pomocą enzymatycznych testów immunopochłaniających

Nutchaarpa Puangmalai; Anna A. Tichenor

doi:10.3791/70979

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie hormonów płciowych w błonie łzowej człowieka za pomocą enzymatycznych testów immunopochłaniających

195 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70979

⸱

12 czerwca 2026

Nutchaarpa Puangmalai¹^,² , Anna A. Tichenor¹

¹School of Optometry, Indiana University, ²Faculty of Optometry, Ramkhamhaeng University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zoptymalizowaną metodę enzymatycznego testu immunopochłaniania (ELISA) do wykrywania i ilościowego oznaczania 17β-estradiolu i testosteronu w ludzkiej cieczy łzowej pobranej za pomocą mikrokapillark. Takie podejście umożliwia minimalnie inwazyjne pomiary stężenia hormonów w łzach.

Streszczenie

Film łzowy jest złożoną, wielowarstwową substancją płynną, niezbędną do utrzymania zdrowia powierzchni oka, jasności widzenia oraz ochrony przed patogenami i czynnikami stresującymi środowiskowe. Składając się głównie z lipidów, płynu wodnego, rozpuszczalnych białek i mukoprotein, służy nie tylko smarowaniu i ochronie oka, ale także jako cenne medium diagnostyczne w przypadku zaburzeń powierzchni oka, takich jak choroba suchego oka (DED). Hormony płciowe, w tym androgeny i estrogeny, wpływają na skład filmu łzowego, ale pomiar tych hormonów w płynie łzowym jest ograniczony przez małą objętość próbki i wyzwania techniczne. Protokół ten opisuje krok po kroku metodę adaptacji komercyjnie dostępnych zestawów ELISA (enzymaticzny test immunopochłanianiowy) do wykrywania i ilościowego oznaczania 17β-estradiolu i testosteronu w łzach podskórnych pobieranych za pomocą mikrokapillarkowych rurek. Przepływ pracy obejmuje zoptymalizowane strategie pobierania próbek, rozcieńczania i przygotowywania testu, aby umożliwić analizę próbek łez o małej objętości. Protokół pokazuje wykonalność i powtarzalność wykrywania hormonów w płynie łzowym przy użyciu przystosowanych metod ELISA. Wyniki reprezentatywne są pochodne od zbiorczych próbek pilotażowych i mają na celu zilustrowanie wydajności testu, a nie różnic biologicznych. Takie podejście może wspierać przyszłe badania badające płyn łzowy jako matrycę do pomiaru hormonów w badaniach nad powierzchnią oka.

Wprowadzenie

Warstwa łzowa pełni istotne role w ochronie, odżywianiu i smarowaniu powierzchni oka¹. Ma grubość około 2–5,5 µm i objętość 3–10 µL, a jej tempo wymiany wynosi 1–2 µL na minutę w zdrowym oku²^,³. Gruczoły łzowe wydziela komponent wodny łez, bogaty w wodę, elektrolity, białka i czynniki przeciwdrobnoustrojowe, podczas gdy gruczoły Meiboma wytwarzają lipidy, które spowalniają parowanie warstwy łzowej, a komórki kubełkowe spojówek uwalniają muczyny, które wspierają smarowanie powierzchni oka⁴. Produkcja łez odbywa się na dwa główne sposoby: 1) sekrecja bazalna, która utrzymuje stabilną warstwę łzową na zdrowej powierzchni oka, oraz 2) sekrecja odruchowa, która jest wyzwalana przez bodźce takie jak podrażnienie, emocje lub jasne światła. Różnica biochemiczna między nimi może ostatecznie wpłynąć na metodę stosowaną do pobierania łez w celu analizy⁵^,⁶. Łzy bazalne ogólnie zawierają wyższe stężenia białek i lipidów, które wspierają stabilność warstwy łzowej i zdrowie rogówki, podczas gdy łzy odruchowe mają tendencję do wyższej objętości wodnej i są bardziej rozcieńczone, aby spłukać substancje drażniące i chronić powierzchnię oka⁷^,⁸^,⁹.

Ponieważ łzy pełnią funkcję modulacji stanu zapalnego, obrony przed patogenami i dostarczania składników odżywczych do bezzaczepkowej rogówki¹, stały się punktem centralnym badań nad biomarkerami¹⁰. Łzy zapewniają minimalnie inwazyjną i stosunkowo niedrogą alternatywę dla pobierania próbek krwi w celu monitorowania zmian fizjologicznych, szczególnie tych występujących w pobliżu miejsca choroby⁸. Aby dokładnie uchwycić te dane, konieczne jest odpowiednie pobieranie próbek¹⁰. Szklane mikrokapilary są szeroko stosowane do pobierania łez bazalnych, ponieważ pozwalają na pobieranie przy minimalnym podrażnieniu i rozcieńczeniu łez⁵. Ta metoda minimalizuje ryzyko wywołania odruchu łzawienia, który może zmienić skład łez⁹^,¹¹, poprzez staranne ustawienie kapilary, aby uniknąć kontaktu z spojówką rogówkową i marginesem powieki. Korzystając z tego podejścia, naukowcy mogą uzyskać nieskrępowane łzy bazalne, które odzwierciedlają fizjologiczny stan powierzchni oka. Zapewnia to, że próbka pozostaje niezawodnym medium do ilościowego określania wrażliwych analitów, takich jak hormony płciowe¹⁰^,¹². Jednak ograniczona objętość uzyskanych próbek stanowi wyzwanie analityczne dla dalszych oznaczeń biochemicznych. Pobieranie łez bazalnych za pomocą mikrokapil dostarcza zazwyczaj kilka mikrolilitrów na próbkę, co ogranicza zgodność ze standardowymi testami.

Ludzka powierzchnia oka jest coraz częściej rozpoznawana jako tkanką docelową dla hormonów płciowych¹³^,¹⁴. Dowodem na to są wykryte transkrypty mRNA receptorów androgenowych (AR), estrogenowych (ER) i progesteronu (PR) w komórkach gruczołowych gruczołów łzowych i Meiboma, a także w komórkach nabłonkowych rogówki, spojówkę i komórkach kubełkowych spojówkę¹⁵. Ponadto w tych tkankach zidentyfikowano mRNA kodujące enzymy steroidogenne, co sugeruje zdolność do lokalnego przekształcania prekursorów steroidów w biologicznie czynne hormony płciowe¹⁶. Wskazuje to na potencjał in situ syntezy hormonów na powierzchni oka i wznosi krytyczne pytanie, czy te hormony są wydzielane do warstwy łzowej na wykrywalnym poziomie.

Obecne dowody sugerują, że hormony płciowe są integralnym elementem utrzymania homeostazy powierzchni oka, choć dokładne mechanizmy molekularne są nadal przedmiotem badań¹³^,¹⁴. Androgeny, takie jak testosteron, wydają się stymulować wydzielanie lipidów i hamować stany zapalne; w konsekwencji, niedobór androgenów jest powszechnie uznany za czynnik wysuszającego suchego oka¹³^,¹⁴^,¹⁷. Natomiast rola estrogenów jest bardziej złożona i zależna od kontekstu¹³^,¹⁴^,¹⁸. Chociaż współuczestniczą w modulowaniu składu i objętości łez, wahania estrogenów, takie jak te występujące podczas menopauzy, ciąży lub stosowania doustnych środków antykoncepcyjnych, są często związane z osłabioną sekrecją wodną, zmniejszoną stabilnością warstwy łzowej i stanem zapalnym powierzchni oka¹⁹^,²⁰. W rezultacie osoby doświadczające tych zaburzeń hormonalnych reprezentują populację o podwyższonym ryzyku rozwoju suchego oka