Kompleksowy model szczura do oceny dróg transportu wątrobowego poprzez jednoczesne pobieranie próbek limfatycznych i krwionośnych

Podsumowanie

Ten protokół eksperymentalny opisuje model szczura z kanalikiem limfatycznym wątroby, który umożliwia bezpośrednią i ilościową ocenę limfatycznego i naczyniowego drenażu wątroby. Model pozwala na jednoczesne pobieranie limfy wątrobowej i krwi ogólnoustrojowej w celu zbadania transportu, metabolizmu i sygnalizacji odpornościowej wątroby, wspierając badania farmakokinetyki leków i biologii specyficznej dla wątroby.

Streszczenie

Wątroba jest centralnym metabolizującym i immunologicznym centrum, które przetwarza składniki odżywcze, substancje obce i krążące mediatory immunologiczne. Substancje dostają się do hepatocytów i innych komórek wątroby poprzez kapilary sinusoidalne, które otrzymują krew z jelit poprzez żyłę wrotną i z krążenia ogólnego poprzez tętnicę wątrobową. Filtrat osocza z kapilar sinusoidalnych spływa do przestrzeni Dissego, gdzie może podlegać przemianie metabolicznej, uczestniczyć w nadzorze immunologicznym lub spływać do naczyń limfatycznych, tworząc limfę wątrobową. Pobieranie próbek limfy wątrobowej i krwi może pomóc w szczegółowej analizie transportu wątrobowego, procesów metabolicznych i aktywności immunologicznej. Opisano chirurgiczny model szczura umożliwiający jednoczesne pobieranie próbek limfy wątrobowej i krwi obwodowej przez trzy odrębne miejsca wkłucia: przewód limfatyczny wątroby, tętnicę szyjną i żyłę szyjną. Wkłucia do limfy wątrobowej i tętnicy umożliwiają ciągłe pobieranie próbek, podczas gdy wkłucie do żyły szyjnej może służyć do ciągłego nawadniania i wsparcia płynowego lub pobierania krwi żylnej, umożliwiając porównanie między krwią tętniczą a żylną. Udana punkcja daje przepływ limfy wątrobowej około 0,1 mL/h u znieczulonych szczurów, umożliwiając ciągłe pobieranie limfy przez do 8 godzin, podczas gdy jednocześnie wykonuje się pobieranie krwi tętniczej i żylnej. To ustawienie pozwala na bezpośrednie porównanie krwi tętniczej układowej i wypływu limfy wątrobowej, umożliwiając kompleksowe zbadanie transportu wątrobowego i czyszczenia, a także procesów sygnałowych metabolicznych i immunologicznych. Aby dalsze rozszerzyć model, terminalne pobieranie próbek z tętnicy wątrobowej i żyły wrotnej można wykonać pod koniec procedury, aby umożliwić bezpośrednie porównanie napływu, odpływu i drenażu limfatycznego wątroby. Ostatecznie, te techniki zapewniają wszechstrenną platformę do oceny procesów wątrobowych, w tym farmakokinetyki leków, przepływu i metabolizmu składników odżywczych oraz reakcji specyficznych dla wątroby, w różnych warunkach patofizjologicznych.

Wprowadzenie

Wątroba jest kluczowym organem metabolicznym i immunologicznym, odpowiedzialnym za przetwarzanie składników odżywczych, detoksykację ksenobiotyków oraz nadzór immunologiczny. Wątroba jest największym organem produkującym chłonkę w organizmie. Badania przeprowadzone na dużych ssakach sugerują, że odpowiada ona za 25%–50% całkowitego przepływu chłonki^1,2. U gryzoni badania z wykorzystaniem kaniulacji wskazują, że około 10%–20% całkowitego przepływu chłonki w klatce piersiowej pochodzi z wątroby^3,4. Chłonka wątrobowa powstaje z osocza filtrowanego przez okienkowate śródbłonie kapilar zatokowych w miąższu wątroby. Filtrat ten gromadzi się w przestrzeni Dissego, która jest przedziałem śródmiąższowym między hepatocytami a komórkami śródbłonka zatokowego. Następnie filtrat przechodzi przez przestrzeń Malla do wrotnych naczyń limfatycznych, które zbiegają się w naczyniach zbiorczych odprowadzających chłonkę w kierunku wrota wątroby i cysterny chłonnej^5,6.

Wątrobowy układ limfatyczny jest anatomicznie podzielony na sieci wrotne, podtorebkowe i podpłacikowe^6,7. Niedawne badania obrazowe w volumetric imaging wykazują, że limfatyka wątrobowa tworzy silnie rozgałęzioną sieć zależną od czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego C (VEGF-C), ograniczoną w znacznym stopniu do dróg wrotnych. Sieć ta składa się głównie z naczyń limfatycznych, które odprowadzają chłonkę wstecznie w kierunku żyły wrotnej. Z kolei naczynia limfatyczne podtorebkowe i podpłacikowe, rozmieszczone odpowiednio wzdłuż powierzchni wątroby oraz w obszarach żył centralnych, stanowią dodatkowe drogi drenażu. Obrazowanie pośmiertne u ludzi ujawniło ponadto gęstą sieć naczyń limfatycznych wzdłuż żył wątrobowych, co wskazuje, że limfatyka okołowrotna i żył wątrobowych wspólnie regulują odpływ chłonki z wątroby⁸.

Chłonka wątrobowa stanowi ultrafiltrat pochodzący z osocza, który odzwierciedla zarówno procesy metaboliczne, jak i immunologiczne^9,10. Analizy biochemiczne wykazują, że chłonka wątrobowa zawiera albuminy, lipoproteinami, cytokiny oraz metabolity pochodzące z aktywności miąższu wątroby^3,4,6, co jest zgodne z ogólnym profilem proteomicznym chłonki raportowanym dla innych tkanek¹⁰. Wczesne badania wykazały, że chłonka wątrobowa zawiera odrębne klasy lipoprotein, w których frakcja lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL) dominuje, co koreluje z centralną rolą wątroby w syntezie i przebudowie HDL¹¹. Co istotne, nowsze prace wykazały, że chłonka wątrobowa jest bogatsza w HDL i estry cholesterolu w porównaniu z chłonką krezkową, co podkreśla jej odrębny wkład w transport lipidów i odwrotny transport cholesterolu³. Ponadto chłonka wątrobowa pełni funkcję kanału immunologicznego, przenosząc mediatory odpornościowe, komórki prezentujące antygen oraz pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, które łączą mikrośrodowisko wątroby z odpornością systemową⁹.

Zmiany w tworzeniu i drenażu limfy wątrobowej są kluczowymi cechami chorób wątroby. W marskości i nadciśnieniu wrotnym podwyższone ciśnienie zatokowe powoduje kilkukrotny wzrost produkcji limfy, co prowadzi do limfangektazji, włóknienia i wodobrzusza po przekroczeniu wydolności drenażu. Przewlekłe uszkodzenie wątroby sprzyja również limfangiogenezie zależnej od VEGF-C/VEGFR-3, przy czym nadmierne lub aberracyjne przebudowy naczyniowe układu limfatycznego przyczyniają się do stanu zapalnego wątroby, obrzęków i gromadzenia lipidów^9,12. Ponadto w stłuszczeniowej chorobie wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną (MASLD) oraz w raku hepatokomórkowym wykazano, że zwiększona gęstość naczyń limfatycznych wątroby koreluje z progresją choroby i przerzutami^13,14.

Pomimo centralnej roli fizjologicznej i klinicznej limfy wątrobowej, pozostaje ona słabo zbadaną i mało zgłębioną w badaniach eksperymentalnych, głównie ze względu na trudności techniczne w izolacji czystej limfy wątrobowej. Modele pobierania limfy klatki piersiowej i krezkowej były opisywane szerzej, jednak dostarczają one jedynie pośredniego wglądu w mechanizmy transportu w wątrobie. Ograniczenie w tej dziedzinie zostało rozwiązane poprzez opracowanie modelu kaniulacji limfy wątrobowej u szczura, który umożliwił bezpośrednie pobieranie limfy wątrobowej⁴. Zastosowanie tego podejścia wykazało, że większość chłonnego wchłaniania dożylnie podawanych białek terapeutycznych zachodzi w wątrobie i krezce. Wyniki te wskazują na limfę wątrobową jako kluczową drogę wymiany makromolekularnej między układem krwi i limfatycznym, co ma istotne znaczenie dla farmakokinetyki i dystrybucji leków biologicznych⁴.

Aby uzupełnić istniejące luki w wiedzy, niniejsze badanie opisuje kompleksowy model szczura umożliwiający jednoczesne pobieranie limfy wątrobowej i krwi systemowej poprzez kanulację przewodu limfatycznego wątroby, tętnicy szyjnej oraz żyły szyjnej. Podejście to pozwala na ocenę w czasie rzeczywistym transportu substancji oraz wymiany między przedziałem śródmiąższowym wątroby a przedziałem systemowym, zapewniając solidną platformę eksperymentalną do badania transportu wątrobowego, metabolizmu, sygnalizacji immunologicznej oraz dystrybucji leków w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Model obejmuje również opcjonalne końcowe pobranie próbek z tętnicy wątrobowej i żyły wrotnej, co umożliwia bezpośrednie porównanie dopływu do wątroby, odpływu z niej oraz drenażu limfatycznego.

Rycina 1. Schemat modelu wielokrotnej kanulacji do jednoczesnego pobierania limfy i krwi. Kompleksowy model kanulacji ilustrujący jednoczesne pobieranie próbek z tętnicy szyjnej, żyły szyjnej, tętnicy wątrobowej, przewodu limfatycznego wątroby i żyły wrotnej. (A) Tętnica szyjna jest kanulowana w celu okresowego pobierania krwi. (B) Zewnętrzna żyła szyjna jest kanulowana w celu ciągłego wlewu soli fizjologicznej w celu utrzymania nawodnienia i rekompensaty utraty płynów podczas pobierania próbek. (C) Wspólna tętnica wątrobowa, przebiegająca równolegle do przewodu limfatycznego wątroby, jest kanulowana w celu końcowego pobrania krwi. (D) Przewód limfatyczny wątroby jest kanulowany w celu ciągłego pobierania limfy. (E) Dostęp do żyły wrotnej uzyskuje się poprzez nakłucie igłą w celu końcowego pobrania krwi. Procedury przedstawione w punktach (A), (B) i (D) są wykonywane przed pobieraniem końcowym, po których następuje (C) pobranie krwi z tętnicy wątrobowej, a następnie (E) pobranie z żyły wrotnej. Skróty: EJV, zewnętrzna żyła szyjna; CA, tętnica szyjna; SVC, górna żyła główna; IVC, dolna żyła główna; Ao, aorta; CHA, wspólna tętnica wątrobowa; HL, przewód limfatyczny wątroby; ML, przewód limfatyczny krezkowy; SMA, górna tętnica krezkowa; PV, żyła wrotna. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem zwierząt zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Monash Institute of Pharmaceutical Sciences (Ethics ID #46283) i przeprowadzono w ścisłej zgodności z wytycznymi Australian and New Zealand Council for the Care of Animals in Research and Teaching (ANZCCART) oraz Australian Code for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes (National Health and Medical Research Council, Australia)¹⁵.

Modele zwierzęce: Wykorzystano samce lub samice nieinbredowanych albinosów Rattus norvegicus, lub szczury Sprague–Dawley (SD) o masie 250–350 g. Zwierzęta pozyskano z licencjonowanych dostawców zwierząt laboratoryjnych (Monash Animal Research Platform) i utrzymywano w indywidualnie wentylowanych klatkach w kontrolowanej temperaturze (22 ± 2 °C) i 12-godzinnym cyklu światło-ciemność, z wolnym dostępem do pożywienia i wody przed rozpoczęciem eksperymentów. Przed operacją zwierzęta poddano aklimatyzacji przez co najmniej jeden tydzień, aby zminimalizować fizjologiczną zmienność związaną ze stresem.

Opisano model kaniulacji przewodu limfatycznego wątroby, tętnicy szyjnej oraz żyły szyjnej, umożliwiający jednoczesne pobieranie limfy wątrobowej i krwi systemowej. W ramach opcji, pod narkozą można przeprowadzić końcowe pobranie próbek z tętnicy wątrobowej i żyły wrotnej w celu analizy porównawczej dopływu krwi do wątroby i odpływu limfy. Wykorzystane odczynniki i sprzęt wymieniono w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowania w dniu poprzedzającym operację

1. Jeśli wymaga tego konkretny protokół eksperymentalny, poddać szczura głodzeniu przez noc. Zapewnić stały dostęp do wody.
2. Przygotować sterylną sól fizjologiczną do infuzji dożylnej podczas pobierania limfy. Ustalić wymaganą objętość na podstawie czasu pobierania (zazwyczaj 3–5 godzin) i sugerowanej szybkości infuzji 1,5–3,0 mL/h, aby uzupełnić ubytki płynów wynikające z poboru limfy i krwi, a także straty fizjologiczne, takie jak wydalanie moczu.
3. Przygotować trzy kaniule polietylenowe do kaniulacji przewodu limfatycznego wątroby, tętnicy szyjnej oraz żyły szyjnej w następujący sposób:
   1. Przewód limfatyczny wątroby
      1. Odciąć kaniulę o średnicy zewnętrznej (O.D.) 0,8 mm i średnicy wewnętrznej (I.D.) 0,5 mm na długość 30–35 cm. Upewnić się, że długość pozwala na pobieranie bez naprężenia.
      2. Ściąć końcówkę wprowadzającą pod kątem ok. 45° za pomocą sterylnego skalpela chirurgicznego, aby ułatwić wprowadzenie.
   2. Tętnica szyjna
      1. Odciąć kaniulę o średnicy 0,8 mm O.D. i 0,5 mm I.D. na długość 20–30 cm. Zaznaczyć odległość ok. 2–2,5 cm od końca wewnętrznego, aby określić głębokość wprowadzenia.
   3. Żyła szyjna
      1. Odciąć kaniulę o średnicy 0,8 mm O.D. i 0,5 mm I.D. lub 0,96 mm O.D. i 0,58 mm I.D. na długość 50 cm lub więcej. Zaznaczyć 1–1,5 cm od końca wewnętrznego dla głębokości wprowadzenia. Upewnić się, że długość pozwala na dotarcie do pompy infuzyjnej bez naprężenia.
4. Przygotować roztwór przeciwkrzepliwy składający się z 0,1% EDTA w wodzie sterylnej lub 20 IU/mL heparyny w sterylnej soli fizjologicznej.
5. Napełnić strzykawkę 1 mL roztworem przeciwkrzepliwym i przymocować igłę 25G do kaniul o średnicy 0,8 mm O.D. lub igłę 23G do kaniul o średnicy 0,96 mm O.D.
6. Przepłukać każdą kaniulę objętością wynoszącą około trzech jej objętości wewnętrznych, upewniając się, że nie pozostały pęcherzyki powietrza.
7. Przechowywać kaniule wypełnione przeciwkrzepliwym środkiem, zamknięte za pomocą przymocowanej igły i strzykawki przez noc. Wstępne namaczanie w przeciwkrzepliwym środku minimalizuje tworzenie się skrzepów.
8. Przygotować probówki do pobierania krwi i limfy. Dodać roztwór przeciwkrzepliwy tak, aby po pobraniu próbki osiągnąć końcowe stężenie 1 mg/mL EDTA lub 10 IU/mL heparyny.

2. Przygotowania bezpośrednio przed operacją

1. Przepłucz wszystkie kaniule antykoagulantem, aby potwierdzić ich drożność. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
2. Wprowadź szczura w stan znieczulenia, stosując 5% izofluranu w tlenie z przepływem 1 L/min w komorze indukcyjnej.
3. Monitoruj oddychanie i upewnij się, że częstotliwość oddechów spadła do około 1,5 oddechu na sekundę (około 90 oddechów/min), co wskazuje na odpowiednią głębokość znieczulenia.
   OSTRZEŻENIE: Izofluran jest lotnym środkiem znieczulającym i powinien być stosowany w odpowiednio wentylowanym systemie anestezjologicznym lub pod wyciągiem (dygestorium), aby zminimalizować narażenie zawodowe.
4. Przenieś szczura na podgrzewaną podkładkę chirurgiczną (37°C) i utrzymuj znieczulenie, podając 1–3% izofluranu w tlenie z przepływem 0,4–0,6 L/min poprzez stożek nosowy.
5. Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu rogówkowego oraz odruchu na uciśnięcie palca. Utrzymuj znieczulenie przez cały czas trwania zabiegu chirurgicznego oraz okresu pobierania limfy.
   UWAGA: Ciągłe znieczulenie jest niezbędne, aby zapobiec bólowi podczas operacji oraz uniknąć wysunięcia kaniuli w wyniku ruchów zwierzęcia.
6. Ogól obszary operacyjne, w tym prawą ćwiartkę brzucha (od linii środkowej do prawego boku, około 2 cm poniżej klatki piersiowej) oraz prawy lub lewy obszar obojczykowy.
7. Zdezynfekuj wszystkie obszary operacyjne, stosując 0,5% chloreksydynę, a następnie 70% etanol.

3. Kanulacja tętnicy szyjnej

UWAGA: Kanulację tętnicy szyjnej można przeprowadzić przed lub po kanulacji żyły szyjnej. Do obu procedur można wykorzystać to samo cięcie szyjne.

1. Umyścić szczura w pozycji grzbietnej z wyprostowaną szyją. Wykonać cięcie szyjne o długości 1–1,5 cm w celu odsłonięcia pola operacyjnego.
2. Umieścić niewielkie podparcie (np. strzykawkę 3 mL) pod szyją, aby unieść obszar tętnicy szyjnej.
   UWAGA: Ten krok jest opcjonalny.
3. Rozdzielić mięśnie szyi, aby odsłonić tętnicę szyjną na głębokości około 1 cm pod powierzchnią skóry.
4. Wyizolować tętnicę za pomocą zakrzywionych pincet irydowych. Zidentyfikować i ostrożnie oddzielić przylegający nerw błędny, aby zapobiec jego uszkodzeniu.
5. Umieścić proste pincety Graefe pod tętnicą, aby zablokować przepływ krwi, i przełożyć pod nią dwie nici jedwabne 4-0. Mocno zawiązać szew proksymalny (czaszkowy).
6. Wykonać niewielkie nacięcie na powierzchni tętnicy.
7. Ostrożnie unieść kłaczek naczynia końcem pincety soczewkowej, aby ustabilizować światło naczynia przed wprowadzeniem kaniuli.
8. Wprowadzić kaniulę na zaznaczoną głębokość 2–2,5 cm. Możliwy jest niewielki cofanie się krwi; jeśli jest ono nadmierne, należy ponownie zablokować naczynie i oczyścić je przed kontynuacją.
   OSTRZEŻENIE: Punkcja naczyniowa i kaniulacja wiążą się z użyciem ostrych narzędzi i powinny być wykonywane ostrożnie, aby zapobiec przypadkowym obrażeniom.
9. Potwierdzić prawidłowe umieszczenie kaniuli poprzez delikatne odessanie niewielkiej objętości krwi i podanie roztworu przeciwzakrzepowego z powrotem przez kaniulę, bez odczuwania oporu i bez obserwacji obrzęku podskórnego.
10. Zabezpieczyć kaniulę szwami i zamknąć zewnętrzny koniec korkiem.
11. Procedurę można na krótko przerwać po kaniulacji tętnicy szyjnej, utrzymując znieczulenie.
12. Zamknąć ranę na szyi sterylnymi szwami. Przegląd izolacji tętnicy szyjnej i pomyślnej kaniulacji przedstawiono na Rysunku 2.

Rysunek 2: Kanulacja tętnicy szyjnej. (A) Pary mięśni szyi flankujące tętnicę szyjną (pomarańczowe strzałki). Gruczoł ślinowy (niebieskie strzałki) jest odsunięty ku górze. (B) Odsłonięta tętnica szyjna znajduje się około 1 cm poniżej powierzchni skóry. Gruczoł ślinowy (niebieskie strzałki) jest odsunięty ku górze. (C) Przygotowanie chirurgiczne przed wprowadzeniem kaniuli, pokazujące zatamowanie przepływu krwi za pomocą prostych pęset Graefe oraz dwa szwy jedwabne izolujące tętnicę, z podwiązanym końcem górnym. (D) Około 2 cm kaniuli zostało pomyślnie wprowadzone do tętnicy szyjnej (żółte strzałki). Kaniulę tętnicy szyjnej wskazują zielone strzałki. (E) Pomyślną kanulację tętnicy szyjnej potwierdzono poprzez pobranie krwi do kaniuli. (F) Trzy szwy (rozmiar 4-0) są zawiązane wokół tętnicy szyjnej i kaniuli w celu ich zabezpieczenia (fioletowe strzałki). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Kanulacja żyły szyjnej

1. Utrzymaj szczura w pozycji na plecach z wyprostowaną szyją i głową lekko odchyloną w lewo.
2. Wykorzystując istniejące nacięcie szyjne, zidentyfikuj żyłę szyjną powyżej obojczyka na podstawie jej położenia i widocznego przepływu krwi.
3. Wykonaj tępe rozcięcie tkanki podskórnej, aby odsłonić żyłę.
4. Oddziel żyłę od otaczającej tkanki łącznej, używając zakrzywionej pęsety irysowej. Potwierdź izolację, przesuwając pęsetę pod żyłą.
5. Umieść dwa szwy jedwabne 4-0 pod żyłą na obu końcach odsłoniętego segmentu. Mocno zawiąż szew kranialny (górny), aby zablokować przepływ krwi.
6. Aby zapobiec cofaniu się krwi, umieść prostą pęsetę Graefe pod żyłą i oprzyj uchwyty o strzykawkę lub podparcie.
7. Za pomocą nożyczek irysowych wykonaj małe nacięcie (~1 mm) na górnej części żyły w jednej trzeciej długości izolowanego segmentu.
8. Delikatnie unieś płatek naczynia końcówką pęsety soczewkowej, aby ustabilizować światło naczynia przed wprowadzeniem kaniuli.
9. Wprowadź końcówkę kaniuli do nacięcia za pomocą pęsety irysowej i przesuń ją do wcześniej zaznaczonej głębokości (1–1.5 cm).
10. Zwolnij zablokowanie przepływu po ustabilizowaniu kaniuli, aby umożliwić przepływ krwi.
    UWAGA: Zachowaj stabilny uchwyt, aby zapobiec cofaniu się krwi żylnej. W przypadku wystąpienia krwawienia natychmiast ponownie zablokuj przepływ i oczyść pole operacyjne przed kontynuowaniem procedury.
11. Potwierdź prawidłowe umiejscowienie, delikatnie odsysając niewielką ilość krwi i wstrzykując roztwór przeciwzakrzepowy z powrotem przez kaniulę, bez odczuwania oporu i bez obserwacji obrzęku podskórnego.
12. Zabezpiecz kaniulę szwami na końcu proksymalnym i dystalnym.
13. Tymczasowo zablokuj zewnętrzną rurkę, usuń strzykawkę i zamknij kaniulę korkiem.
14. Przykryj nacięcie gazikiem zwilżonym ciepłą solą fizjologiczną do czasu zakończenia kaniulacji tętnicy szyjnej. Reprezentatywne obrazy izolacji i kaniulacji żyły szyjnej przedstawiono na Rysunku 3.

Rysunek 3: Kaniulacja żyły szyjnej wewnętrznej. (A) Żyła szyjna wewnętrzna (czarna przerywana linia) znajduje się bezpośrednio pod skórą powyżej obojczyka. W pobliżu żyły szyjnej widoczna jest wcześniej wprowadzona kaniula tętnicy szyjnej (zielone strzałki). (B) Żyła szyjna wewnętrzna zostaje odizolowana za pomocą dwóch szwów jedwabnych; koniec górny zostaje podwiązany. (C) Około 1 cm kaniuli zostaje pomyślnie wprowadzony do żyły szyjnej wewnętrznej (żółte strzałki). Kaniulę żyły szyjnej wskazują niebieskie strzałki, a kaniulę tętnicy szyjnej wskazują zielone strzałki. (D) Trzy szwy (rozmiar 4-0) zostają zawiązane wokół żyły szyjnej i kaniuli w celu ich stabilizacji (fioletowe strzałki). Pomyślną kaniulację żyły szyjnej potwierdzono poprzez płynny wtrysk soli fizjologicznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Kanulacja przewodu chłonnego wątroby

1. Ułóż szczura w pozycji grzbietnej pod mikroskopem chirurgicznym.
2. Wykonaj poziome nacięcie skóry o długości 4–5 cm od linii środkowej do prawego boku, około 1,5–2 cm poniżej klatki piersiowej (Rysunek 4A, B).
3. Odciągnij skórę i wykonaj analogiczne nacięcia w mięśniach skośnych zewnętrznych i wewnętrznych brzucha.
4. Wypal lub podwiąż wszelkie napotkane duże naczynia krwionośne, aby zapobiec nadmiernej utracie krwi.
5. Delikatnie przemieść organy za pomocą nasączonych solą fizjologiczną patyczków bawełnianych: przesuń wątrobę w stronę przepony, żołądek w lewo, a jelito cienkie w dół.
6. Utrzymuj organy w odsunięciu za pomocą gazy nasączonej solą fizjologiczną. Miejsce nacięcia i ułożenie organów przedstawiono na Rysunku 4C.
7. Zidentyfikuj przewód limfatyczny wątrobowy (średnica ~0,6 mm), korzystając z ustalonych punktów orientacyjnych anatomicznych. Przewód biegnie równolegle i nieco ku strony ogonowej w stosunku do tętnicy wątrobowej, położony przyśrodkowo względem prawej nerki i sąsiadujący z żyłą główną dolną.
8. Zaobserwuj wygląd przewodu limfatycznego wątrobowego. Zazwyczaj jest on przezroczysty i wąski.
9. Odróżnij przewód limfatyczny wątrobowy od przewodu limfatycznego krezkowego, który jest większy i zazwyczaj wydaje się nieprzezroczysty lub biały ze względu na zawartość chylomikronów. Przewód limfatyczny krezkowy może zatem służyć jako punkt orientacyjny ułatwiający identyfikację położonego powyżej przewodu limfatycznego wątrobowego.
10. Usuń tkankę łączną pokrywającą przewód limfatyczny i żyłę główną za pomocą prostych pęset Graefe.
11. Utwórz przejście pod żyłą główną, wprowadzając proste pęsety Graefe przez tkankę tłuszczową pod prawą nerką. Przesuwaj pęsetę, aż końcówki wyłonią się po przeciwnej stronie pod żyłą główną, równolegle do przewodu limfatycznego wątrobowego.
12. Chwyć zewnętrzny koniec przygotowanej kaniuli prostymi pęsetami Graefe i przeciągnij ją przez tunel utworzony pod żyłą główną, aż końcówka pojawi się po przeciwnej stronie.
13. Za pomocą zacisku Halsted-Mosquito zagnij końcówkę igły 25G pod kątem około 90°. Używając zgiętej igły, nakłuj przewód limfatyczny wątrobowy po prawej stronie (najbliżej operatora).
    OSTROŻNIE: Zachowaj ostrożność podczas operowania ostrymi igłami podczas nakłuwania przewodu limfatycznego, aby uniknąć przypadkowych obrażeń.
14. Upewnij się, że kaniula jest wypełniona roztworem przeciwkrzepliwym i nie zawiera pęcherzyków powietrza. Wprowadź ścięty koniec kaniuli na około 2 mm do wnętrza przewodu.
15. Obserwuj zewnętrzny koniec kaniuli pod kątem przepływu limfy (~ 100 µL/h). Jeśli nie zaobserwowano przepływu, skoryguj położenie lub ponownie wprowadź kaniulę.
16. Po potwierdzeniu przepływu limfy zatkaj kaniulę, a następnie nałóż małą kroplę weterynaryjnego kleju, aby zabezpieczyć miejsce wprowadzenia. Po wyschnięciu potwierdź przepływ limfy przez rurkę.
17. Usuń gazę i przywróć organy na ich pierwotne miejsca.
18. Umieść probówkę do zbierania zawierającą roztwór przeciwkrzepliwy pod wylotem kaniuli. Potwierdź, że limfa ścieka do probówki kropla po kropli.
19. Zamknij ścianę brzucha, szyjąc kolejno warstwy mięśnia skośnego wewnętrznego, skośnego zewnętrznego oraz skórę. Identyfikację i pomyślną kaniulację przewodu limfatycznego wątrobowego pokazano na Rysunku 5.
    UWAGA: Po pomyślnej kaniulacji przewodu limfatycznego wątrobowego procedurę można na krótko przerwać, utrzymując znieczulenie i nawodnienie, przed rozpoczęciem zbierania limfy.

Rysunek 4: Odsłonięcie przewodu limfatycznego wątroby. (A) Punkt orientacyjny wskazujący miejsce nacięcia 1,5–2 cm poniżej prawej klatki piersiowej. (B) Nacięcie skóry i mięśni brzucha, odsłaniające narządy wewnętrzne. (C) Repozycja narządów w celu odsłonięcia przewodu limfatycznego wątroby. Wątroba jest przesunięta w stronę przepony, żołądek na lewą stronę zwierzęcia, a jelito cienkie jest odsunięte ku dołowi. Przewód limfatyczny wątroby znajduje się pomiędzy tętnicą wątrobową (zielona strzałka) a tętnicą krezkową (niebieska strzałka). L: wątroba; SI: jelito cienkie; IVC: żyła główna dolna; RK: prawa nerka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 5: Identyfikacja i kaniulacja przewodu limfatycznego wątroby. (A) Struktury limfatyczne i tętnicze można zaobserwować po repozycjonowaniu organów i przed usunięciem otaczającej tkanki łącznej. Tętnica wątrobowa (zielone strzałki) znajduje się głową w stosunku do sąsiedniego przewodu limfatycznego wątroby (żółte strzałki). Przewód limfatyczny krezkowy (fioletowe strzałki) znajduje się powyżej tętnicy krezkowej (czarny przerywany obrys). Struktury te przebiegają prostopadle do żyły głównej dolnej. IVC: żyła główna dolna; RK: prawa nerka. (B) Przewód limfatyczny wątroby (żółte strzałki) można wyraźnie zwizualizować po usunięciu otaczającej tkanki łącznej. Przewód limfatyczny wątroby przebiega równolegle do tętnicy wątrobowej (zielony przerywany obrys) i głową w stosunku do przewodu limfatycznego krezkowego (fioletowe strzałki) oraz tętnicy krezkowej (czarny przerywany obrys). (C) Kaniulę (białe strzałki) wprowadza się do przewodu limfatycznego wątroby (żółte strzałki) poprzez małą punkcję wykonaną w przewodzie limfatycznym (pomarańczowe strzałki). Można zwizualizować przewód limfatyczny krezkowy (niebieskie strzałki). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

6. Okres pooperacyjny

1. Niezwłocznie po pomyślnym wprowadzeniu kaniuli do naczyń chłonnych wątroby należy rozpocząć rehydratację, podając sterylną sól fizjologiczną z prędkością 1,0–2,0 ml/h przez kaniulę w żyle szyjnej.
2. Należy kontynuować infuzję przez cały czas trwania pobierania limfy. Alternatywnie można przeprowadzić rehydratację. poprzez kaniulę żołądkową lub dwunastniczą, co pozwala na zarezerwowanie kaniuli żyły szyjnej do pobierania krwi żylnej w razie potrzeby.
3. Przez cały okres pobierania próbek należy utrzymywać zwierzę w znieczuleniu na podgrzewanej macie chirurgicznej (37°C).
4. Monitorować częstość oddechów oraz głębokość znieczulenia przez cały czas trwania eksperymentu, obserwując wzorce oddychania i odpowiedzi odruchowe, przy jednoczesnym utrzymywaniu znieczulenia izofluranem poprzez stożek dziobowy.
5. Nawodnienie utrzymywano poprzez ciągłą infuzję soli fizjologicznej (1,0–2,0 ml/h) poprzez kaniula żyły szyjnej.
6. Aby zminimalizować zaburzenia fizjologiczne, całkowitą objętość krwi pobranej przed pobraniem próbek końcowych ograniczono do <10% szacowanej objętości krwi krążącej, zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi etyki badań na zwierzętach.
7. Należy stale zbierać limfę wątrobową do probówek zawierających przeciwkrzepliwy środek. Probówki do zbierania należy wymieniać co godzinę lub w razie potrzeby.
8. Pobierać próbki krwi tętniczej w wyznaczonych punktach czasowych:
   1. Tymczasowo zablokuj zewnętrzną rurkę i podłącz pustą strzykawkę.
   2. Pobierać krew, aż dreny zostaną całkowicie wypełnione.
   3. Wymień strzykawkę na nową w celu pobrania próbki i pobierz około 100–200 µL krwi tętniczej w każdym wyznaczonym punkcie czasowym pobierania próbek.
   4. Po każdym pobraniu należy przepłukać kaniulę roztworem przeciwkrzepliwym.
   5. Zamknąć kaniulę za pomocą zatyczki.
9. Po zakończeniu pobierania próbek należy przystąpić do pobrania końcowego z tętnicy wątrobowej i żyły wrotnej lub uśmiercić szczura w sposób humanitarny za pomocą pentobarbitonu sodu (>100 mg/kg) poprzez kaniulę tętnicy szyjnej lub żyły szyjnej.

7. Pobieranie próbek końcowych z tętnicy wątrobowej i żyły wrotnej

1. Po zakończeniu pobierania limfy i krwi należy utrzymać głęboką anestezję i zapewnić stabilne oddychanie przed przystąpieniem do końcowego poboru próbek z naczyń krwionośnych.
2. Należy ostrożnie ponownie otworzyć nacięcie brzuszne, aby odsłonić górną jamę brzusną.
3. Za pomocą zwilżonej solą fizjologiczną gazy należy delikatnie odsunąć wątrobę w stronę przepony, żołądek w lewo, a jelito cienkie w dół, aby odsłonić kaniulowany przewód limfatyczny wątroby.
4. Należy zidentyfikować tętnicę wątrobową, która biegnie równolegle i bardziej ku strony ogonowej w stosunku do przewodu limfatycznego wątroby.
   UWAGA: Tętnica wydaje się mniejsza i bledsza niż żyła wrotna i wykazuje bardziej pulsujący przepływ.
5. Należy przygotować kaniulę z polichlorku winylu o średnicy zewnętrznej 0,61 mm i średnicy wewnętrznej 0,28 mm, uprzednio napełnioną roztworem przeciwzakrzepowym i pozbawioną pęcherzyków powietrza.
6. Używając zakrzywionej pęsety irysowej, należy wyizolować krótki odcinek tętnicy wątrobowej i umieścić pod nią szew z jedwabiu 4-0.
7. Należy delikatnie unieść tętnicę i umieścić drugi szew dystalnie względem pierwszego. Szew dystalny należy zawiązać, aby kontrolować cofanie się krwi, pozostawiając szew proksymalny niezwiązany do późniejszego zamknięcia.
8. Za pomocą mikro-nożyczek o ostrym czubku należy wykonać małe nacięcie poprzeczne (około 0,5 mm) w ścianie tętnicy pomiędzy szwami.
9. Należy delikatnie unieść płatek naczynia końcem pęsety Dumont, aby ustabilizować światło naczynia przed wprowadzeniem kaniuli.
10. Należy wprowadzić ścięty koniec kaniuli z polichlorku winylu do otworu i przesunąć ją o około 2–3 mm.
11. Kaniulę należy zabezpieczyć, wiążąc szew proksymalny wokół naczynia i kaniuli.
12. Poprawność umiejscowienia należy potwierdzić, obserwując pulsujący przepływ krwi do kaniuli lub delikatnie aspirując niewielką ilość jasnoczerwonej krwi tętniczej.
13. Należy pobrać 0,5–1 mL krwi do wcześniej oznakowanej probówki zawierającej przeciwzakrzep.
14. Po pobraniu należy wycofać kaniulę i uzyskać hemostazę poprzez zaciśnięcie obu szwów. Procedurę odsłaniania i kaniulacji tętnicy wątrobowej przedstawiono na Rysunku 6.
15. Należy zidentyfikować żyłę wrotną, która biegnie przyśrodkowo i prostopadle do tętnicy wątrobowej. Żyła wrotna ma większą średnicę i ciemniejszą barwę w porównaniu z tętnicą wątrobową.
16. Do strzykawki 1 mL, uprzednio przepłukanej roztworem przeciwzakrzepowym, należy założyć igłę 23G lub 25G.
17. Igłę należy wprowadzić ścięciem do góry do żyły wrotnej pod niewielkim kątem (około 20°–30°), aby uniknąć zapadnięcia się lub przerwania naczynia.
18. Należy delikatnie aspirować wymaganą objętość krwi.
19. Ponieważ nakłucie żyły wrotnej jest procedurą końcową, zwierzę należy humanitarnie uśmiercić natychmiast po pobraniu próbek poprzez podanie >100 mg/kg pentobarbionu sodowego przez kaniulę tętnicy szyjnej lub żyły szyjnej, podczas gdy zwierzę pozostaje pod głęboką anestezją. Lokalizacja żyły wrotnej oraz metoda końcowego pobierania próbek są pokazane na Rysunku 7.
    OSTRZEŻENIE: Pentobarbion sodowy jest substancją kontrolowaną i powinien być obchodzony oraz podawany zgodnie z regulacjami instytucjonalnymi i odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa.
20. Śmierć należy potwierdzić poprzez ustanie oddychania i aktywności serca przed utylizacją truchła, zgodnie z Australian Code for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes (NHMRC )¹⁵ oraz wytycznymi ANZCCART.

Rysunek 6: Identyfikacja i kanulacja tętnicy wątrobowej. (A) Odsłonięcie tętnicy wątrobowej (zielone strzałki). Tętnica wątrobowa znajduje się obok przewodu limfatycznego krezkowego (czarna przerywana linia) i prostopadle do żyły głównej dolnej. IVC: żyła główna dolna; L: wątroba. (B) Izolacja tętnicy wątrobowej za pomocą kleszczyków zakrzywionych. (C) Prawidłowe wprowadzenie (fioletowe strzałki) polwinylowej kaniuli o wymiarach 0.61 mm × 0.28 mm (pomarańczowe strzałki) do tętnicy wątrobowej (zielone strzałki), zabezpieczonej szwami jedwabnymi 4-0 w celu poboru krwi tętniczej końcowej. Przewód limfatyczny krezkowy (czarna przerywana linia) jest widoczny. PV: żyła wrotna. (D) Po zabezpieczeniu kaniuli potwierdzono jej drożność poprzez zassanie krwi do wnętrza kaniuli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 7: Identyfikacja żyły wrotnej i pobieranie próbek końcowych. (A) Żyła wrotna (wskazana igłą 25G) znajduje się pomiędzy tętnicą wątrobową (biała przerywana linia) a przewodem żółciowym (czarna przerywana linia). Żyła wrotna wydaje się większa i ciemniejsza od tętnicy wątrobowej; dostęp do niej uzyskuje się w głębokiej anestezji w celu końcowego pobrania krwi. PV: żyła wrotna; IVC: żyła główna dolna; L: wątroba; SI: jelito cienkie; RK: prawa nerka. (B) Prawidłowe wprowadzenie igły 25G do żyły wrotnej (czarna przerywana linia) w celu końcowego pobrania krwi żylnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Opisane w sekcji Protokół podejście chirurgiczne umożliwia wyraźną identyfikację przewodu limfatycznego wątroby, znajdującego się przyśrodkowo od prawej nerki i przebiegającego równolegle do tętnicy trzewnej oraz tętnicy wątrobowej, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami⁴. Reprezentacyjna anatomia oraz kanulacja przedstawione są na Rysunku 5. Prawidłową kanulację potwierdza natychmiastowe pojawienie się przejrzystej lub lekko mętnej limfy, pozbawionej mlecznego zanieczyszczenia chylomikronami, co sugeruje minimalne mieszanie z limfą krezkową. Obserwacja ta jest zgodna z opisaną charakterystyką limfy wątrobowej³. Identyfikacja limfy wątrobowej opierała się na jej położeniu anatomicznym względem tętnicy wątrobowej i żyły głównej dolnej, a także na charakterystycznym przejrzystym wyglądzie, w przeciwieństwie do typowo mętnego lub mlecznego wyglądu limfy krezkowej.

Przepływ limfy wątrobowej powinien pozostać stabilny przez cały okres pobierania, przy średnim tempie wynoszącym około 0,1 mL/h^3,4,11. Przepływ limfy wątrobowej zazwyczaj pozostaje najbardziej stabilny przez około 2–3 h po kaniulacji w warunkach znieczulenia, choć w optymalnych warunkach eksperymentalnych możliwe jest uzyskanie dłuższych okresów pobierania (do ~6–8 h). Reprezentatywne wartości przepływu limfy zgłoszone w poprzednich badaniach⁴ podsumowano w Tabeli 1. Przepływ limfy wątrobowej jest zazwyczaj niższy niż wartości raportowane dla prędkości przepływu w przewodach limfatycznych krezkowych i piersiowych u znieczulonych szczurów.

Miejsca poboru chłonki (stan świadomości)	Średni przepływ chłonki (mL/h)
Chłonka piersiowa (budząca się/przytomna)	1.74 ± 0.33
Chłonka piersiowa (znieczulona)	0.65 ± 0.10
Chłonka krezkowa (znieczulona)	0.45 ± 0.11
Chłonka wątrobowa (znieczulona)	0.12 ± 0.02

Tabela 1: Średnie prędkości przepływu chłonki (mL/h) przez kanulacje przewodu piersiowego, krezkowego i wątrobowego u szczurów świadomych i znieczulonych. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM dla n = 3–5 szczurów. Dostosowano na podstawie Tabeli 3 w pracy Yadav i wsp. (2018)⁴.

Reprezentatywne wyniki ilustrujące transport limfatyczny makrocząsteczek przedstawiono na Rysunku 8. Przykłady te pokazują, w jaki sposób model może być wykorzystany do oceny regeneracji układu limfatycznego po dożylnym podaniu terapeutycznych makrocząsteczek, w tym pegylowanego interferonu α2a o masie około 60 kDa (IFN-PEG40), pegylowanego interferonu α2b o masie około 31 kDa (IFN-PEG12) oraz przeciwciała monoklonalnego trastuzumabu, co sugeruje, że wątroba jest głównym miejscem ekstrawazacji i dostępu limfatycznego dla terapeutycznych makrocząsteczek⁴.

Rysunek 8: Odzysk limfatyczny dożylnie podanych terapeutyków makromolekularnych w limfie klatki piersiowej, krezki i wątroby.Całkowity procent dawki odzyskanej w limfie klatki piersiowej, krezki i wątroby po dożylnym podaniu pegylowanych interferonów o różnej wielkości cząsteczkowej (IFN-PEG12 i IFN-PEG40) oraz przeciwciała monoklonalnego (trastuzumab). Dane przedstawiają średnią ± SEM odzysku dawki w ciągu 8 godzin. Adaptowano z Yadav et al. (2018)⁴. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Model ten umożliwia również szczegółowe profilowanie lipoprotein chłonki wątrobowej³. Reprezentatywne analizy składu lipidowego chłonki przedstawiono na Rysunku 9. W porównaniu z chłonką klatki piersiowej i krezową, chłonka wątrobowa wykazuje wyraźnie niższą całkowitą zawartość lipidów, lecz stężenia białek porównywalne z innymi źródłami chłonki. Analiza lipoprotein chłonki wątrobowej podkreśla wyjątkową rolę wątroby w transporcie lipidów i odwrotnym transporcie cholesterolu. Reprezentatywne dane dotyczące składu lipidowego podsumowano w Tabeli 2. HDL chłonki wątrobowej jest wzbogacony w estry cholesterolu, HDL chłonki krezowej jest w przeważającej mierze bogaty w trójglicerydy, a HDL chłonki klatki piersiowej zawiera względnie wyższą zawartość fosfolipidów. Te różnice w składzie wskazują na odmienne role każdego źródła limfatycznego w metabolizmie i transporcie lipidów.

	% w/w
Frakcje	Fosfolipid	Wolny cholesterol	Ester cholesterylu	Trigliceryd
Chłopka krezkowa
D-HDL	20 ± 3	1 ± 0	5 ± 1	16 ± 1
L-HDL	21 ± 4	2 ± 0	8 ± 2	23 ± 5
Chłopka wątrobowa
D-HDL	24 ± 1	3 ± 0	12 ± 3	8 ± 1
L-HDL	23 ± 1	6 ± 1	13 ± 2	14 ± 2
Chłopka piersiowa
D-HDL	25 ± 1	1 ± 0	7 ± 0	11 ± 3
L-HDL	29 ± 1	2 ± 0	11 ± 1	11 ± 0
Osocze
D-HDL	29 ± 2	2 ± 0	20 ± 3	2 ± 0
L-HDL	36 ± 6	2 ± 0	18 ± 3	4 ± 1

Tabela 2: Skład lipidowy frakcji lipoprotein o wysokiej gęstości gęstych (D-HDL) i lekkich (L-HDL) wyizolowanych z limfy krezkowej, wątrobowej i klatki piersiowej oraz z osocza. Wartości przedstawiają procentową zawagę (% wt/wt) fosfolipidów, wolnego cholesterolu, estrów cholesterolu i triglicerydów w stosunku do całkowitej frakcji lipidowej. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Adaptacja z Tabeli 1 w Gracia et al. (2020)³.

Rysunek 9: Skład białkowy i lipidowy limfy krezkowej, wątrobowej i piersiowej. Proporcje zawartości białka i całkowitego lipidu w limfie krezkowej, wątrobowej i piersiowej. Zawartość lipidów obejmuje fosfolipidy (PL), triglicerydy (TG), estry cholesterolu (CE) i wolny cholesterol (FC), wyrażone jako procent masy lipidów w stosunku do całkowitej masy białek i lipidów. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Adaptacja z Gracia et al. (2020)³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Kanulowanie przewodu limfatycznego wątroby jest zabiegiem technicznie trudnym, nawet dla doświadczonych mikochiruргów. Kilka kluczowych kroków może poprawić prawdopodobieństwo zachowania integralności przewodu limfatycznego i osiągnięcia stabilnego przepływu limfy. Podczas identyfikacji i izolowania przewodu limfatycznego wątroby (kroki protokołu 5.7-5.10), początkowym krokiem jest usunięcie tkanki łącznej i tłuszczu pokrywającego przewód limfatyczny trzewny i żyłę główną dolną w pobliżu przewodu limfatycznego wątroby. Przewód limfatyczny wątroby jest przezroczysty i kruchy w porównaniu z grubszym i mniej przejrzystym przewodem limfatycznym trzewnym i może łatwo pęknąć, jeśli jest bezpośrednio manipulowany. Przewód limfatyczny trzewny służy jako użyteczny punkt odniesienia anatomicznego, ponieważ oczyszczenie jego pokrywającej tkanki ujawnia przewód limfatyczny wątroby zlokalizowany powyżej. Ponieważ przewód limfatyczny wątroby często wykazuje zginanie lub krzywiznę, operator powinien wybrać punkt kanulacji wzdłuż prostego odcinka i ustawiać kanilę równolegle do naturalnego przebiegu przewodu, aby zminimalizować ryzyko zablokowania lub rozerwania (kroki 5.11-5.14).

Kanulowanie same w sobie jest najważniejszym czynnikiem decydującym o sukcesie. Po przebiciu przewodu (krok 5.13), dostęp intraluminalny można potwierdzić wizualnie wprowadzając końcówkę kleszczy do otworu i upewniając się, że tylko jedna ściana naczynia pokrywa instrument. Pojawienie się dwóch przeciwnych ścian wskazuje na przebicie przez cały przewód. Po potwierdzeniu dostępu intraluminalnego, kanilę można płynnie przesuwać wzdłuż przewodu pod tym samym kątem. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić sąsiednich naczyń krwionośnych, ponieważ krwotok na pole może wprowadzić krew do kanili zbierającej limfę, zanieczyszczając próbkę i znacznie zwiększając ryzyko powstawania skrzepów. Po ustanowieniu przepływu limfy (krok 5.15), końcówka zbierająca kanili powinna być zamknięta, a należy ostrożnie nałożyć klej weterynaryjny, aby zapobiec jej wejściu do światła. Kanilę należy również sprawdzić pod kątem pęcherzyków powietrza, ponieważ uwięzione powietrze zwiększa ciśnienie zwrotne i może utrudniać przepływ limfy. Ponieważ limfa wątrobowa jest generowana pod niskim ciśnieniem napędzającym, końcówka zbierająca kanili powinna być zawsze umieszczona poniżej poziomu miejsca zabiegu, aby ułatwić drenaż siłą grawitacji.

Udanej kanulacji przewodu limfatycznego wątroby towarzyszy natychmiastowe rozpoczęcie przepływu limfy. Po ustanowieniu, limfa wątrobowa zazwyczaj płynie z prędkością około 0,1 mL/h, z stabilnym wyjściem przez kilka godzin. Szybkość przepływu może się różnić w zależności od anatomii zwierzęcia, fizjologii i warunków eksperymentalnych. Na przykład, limfa była zbierana w znieczuleniu izofluanem w tym protokole. Znieczulenie izofluanem może wpływać na parametry fizjologiczne istotne dla funkcji układu limfatycznego, dlatego warunki eksperymentalne z użyciem znieczulenia powinny być brane pod uwagę przy interpretacji szybkości tworzenia limfy¹⁶. Kanulacja przewodu limfatycznego wątroby wymaga laparotomii i delikatnej manipulacji mikrochirurgicznej naczyń limfatycznych brzucha, dlatego pobieranie limfy od świadomych szczurów nie jest możliwe w tym modelu. Poprzednie badania porównujące transport limfy w warunkach znieczulenia i świadomości lub stosujące różne schematy znieczulenia wykazały, że znieczulenie może umiarkowanie wpływać na bezwzględne szybkości przepływu limfy, ale nie znacząco zmienia ogólne wzorce transportu limfatycznego⁴. Dlatego wartości przepływu limfy uzyskane w tym modelu powinny być interpretowane w kontekście warunków eksperymentalnych znieczulenia.

Stopniowe zmniejszenie lub zaprzestanie przepływu podczas pobierania jest najczęściej spowodowane tworzeniem skrzepu w kanili, wynikającym z zanieczyszczenia krwią lub osadzenia fibryny. Przepływ można czasem przywrócić, lokalizaując i delikatnie ściskając kanilę za pomocą drobnych kleszczy, aby mechanicznie złamać skrzep, lub delikatnie aspirując przez końcówkę zbierającą kanili, aby usunąć przeszkodę. Jeśli blokada jest ograniczona do zewnętrznej części, kanila może być przecięta powyżej skrzepu i ponownie połączona ze świeżą rurką za pomocą sterylnego złącza silikonowego. Jeśli skrzep powstaje w miejscu kanulacji, zwykle wymagana jest ponowna kanulacja. W takich przypadkach, usunięcie kleju można spróbować z dużą ostrożnością, aby uniknąć pęknięcia przewodu lub sąsiednich naczyń krwionośnych. Przed ponowną próbą kanulacji należy osiągnąć hemostazę, ponieważ nawet niewielkie wycieki krwi do kanili znacząco wspierają krzepnięcie w układzie limfatycznym wątroby o niskim ciśnieniu.

Czynniki fizjologiczne również wpływają na przepływ limfy i przepuszczalność. Przepływ limfy wątrobowej u szczurów jest z natury wolniejszy niż przepływ limfy trzewnej lub prze

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Anticoagulant solution (EDTA 0.1%)	Invitrogen	AM9261	Zapobiega tworzeniu się skrzeplin w kaniulach i pobranej próbce
Anticoagulant solution (Heparin 20 IU/mL)	Pfizer	00409-2723-01	Zapobiega tworzeniu się skrzeplin w kaniulach i pobranej próbce
Chlorhexidine (0.5%)	McFarlane Medical	12120-OR	Stosowany do dezynfekcji miejsca operacji
Collection tubes (microcentrifuge)	Greiner Bio-One	616201	Stosowany do pobierania limfy i krwi
Cotton gauze	Winc Australia	18874125	Stosowany do manipulacji narządami i utrzymania wilgotności
Cotton swabs	Pacific Laboratory	1005199	Stosowany do przemieszczania narządów podczas operacji
Curved iris forceps	Macquarie Medical Systems	TTP5002-5	Stosowany do izolowywania naczyń i manipulacji tkankami
Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-35	Stosowany do otwierania i stabilizowania światła światła tętnicy wątrobowej do włożenia kaniulek
Ethanol (70%)	Ajax	AJA214-2.5PL	Stosowany do dezynfekcji miejsca operacji
Halsted-Mosquito hemostat forceps	Fine Science Tools	13009-12	Stosowany do wygięcia igły 25G do punkcji wątrobowego przewodu limfatycznego
Heated surgical pad (37 °C)	Ratek	IC-WT1	Utrzymuje temperaturę ciała podczas operacji
Induction chamber	Darvall	1859	Stosowany do początkowego znieczulenia
Infusion pump	Adelab Scientific	NE-300	Dostarcza kontrolowanego wlewu soli fizjologicznej przez kaniulek
Iris scissors	Stark Medical	E-AC985-11	Stosowany do nacięć skóry i mięśni
Isoflurane	Provet Pty Ltd	ISOF07	Anestezja inhalacyjna stosowana do indukcji i podtrzymania znieczulenia
Kelman-McPherson lens forceps	ProSciTech	TY-1301	Stosowany do otwierania i stabilizowania światła światła żyły szyjnej i tętnicy szyjnej do włożenia kaniulek
Needle (23G × 1")	Livingstone	DN23GX1.0LV	Stosowany do punkcji żyły wrotnej i pobierania krwi
Needle (25G × 1")	Livingstone	DN25GX1.0LV	Stosowany do płukania kaniulek i punkcji wątrobowego przewodu limfatycznego
Nose cone anesthesia system	Darvall	7885	Utrzymuje znieczulenie podczas operacji
Oxygen supply with flowmeter	BOC	400NE	Gaz nośny do znieczulenia izofluranem
Polyethylene cannula (0.8 mm O.D., 0.5 mm I.D.)	Microtube Extrusions	PE8050	Stosowany do kanulacji tętnicy szyjnej, żyły szyjnej i przewodu limfatycznego wątroby
Polyvinyl cannula (0.61 mm O.D., 0.28 mm I.D.)	Microtube Extrusions	PIV6128	Stosowany do kanulacji tętnicy wątrobowej
Silk sutures (4-0)	SMI AG	SM8015	Stosowany do mocowania naczyń i kaniulek
Sodium pentobarbitone	Lyppard Australia Pty Ltd	LETH250	Stosowany do eutanazji (>100 mg/kg)
Sterile saline (0.9% NaCl)	FreeFlex	K690531	Stosowany do nawadniania i płukania
Straight Graefe forceps	Fine Science Tools	11150-10	Stosowany do delikatnego izolowywania naczyń
Surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000-CS	Stosowany do wizualizacji podczas kanulacji wątrobowego przewodu limfatycznego
Surgical sterile blades (for scalpel use)	Livingstone	SBLDCL15	Stosowany do stoczania końcówek kaniulek podczas przygotowania
Syringe (1 mL)	Terumo	19032-TE	Stosowany do płukania kaniulek
Syringe (3 mL)	Terumo	19048-TE	Stosowany do pobierania krwi
Syringe (30 mL)	Terumo	19034-TE	Stosowany do wlewu soli fizjologicznej
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09	Stosowany do nacięć naczyń
Veterinary tissue adhesive	3M	1469SB	Stosowany do mocowania kaniulek przewodu limfatycznego wątroby