Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Badanie to potwierdziło terapeutyczny wpływ wywaru Shengxian Quyu na niewydolność serca poprzez eksperymenty na zwierzętach. Ultrawydajna chromatografia cieczowa – spektrometria mas oraz analizy farmakologii sieciowej zidentyfikowały potencjalne cele i mechanizmy terapeutyczne.
Dekoktura Shengxian Quyu (SXQY) była sugerowana jako potencjalna strategia terapeutyczna niewydolności serca (HF), jednak jej mechanizmy terapeutyczne pozostają niejasne. Badanie to analizowało efekty terapeutyczne oraz mechanizmy leżące u podstaw SXQY w HF. Model HF na szczurze został wywołany przez poprzeczne zwężenie aorty (TAC) i leczony metodą SXQY. Funkcję serca oceniono za pomocą echokardiografii przezklatkowej, a strukturę mięśnia sercowego i włóknienie oceniono za pomocą hematoksyliny i eozyny oraz barwienia trójchromowego Massona. Próbki surowicy analizowano za pomocą metabolomiki nieukierunkowanej za pomocą ultrawydajnej chromatografii cieczowej – tandemowej spektrometrii mas. Składniki wchodzące do krwi zostały mapowane na cele, a przecinające się cele związane z HF analizowano za pomocą analizy sieci interakcji białko-białko (PPI), a następnie analizy Gene Ontology oraz Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). SXQY istotnie poprawiło funkcję serca u szczurów TAC, co potwierdza zmniejszenie wewnętrznej średnicy lewej komory w rozgorzeniu oraz grubość tylnej ściany lewej komory w rozgorzeniu oraz zwiększenie frakcji wyrzutowej lewej komory, a także złagodziło przerost mięśnia sercowego, stan zapalny i włóknienie. Zidentyfikowano łącznie 563 związki wprowadzające do krwi (367 prototypów i 196 metabolitów), z czego 5 kluczowych związków aktywnych w bazie danych Traditional Chinese Systems Pharmacology odpowiada 63 celom. Analiza sieci wykazała 44 nakładające się geny, z Formononetiną, Timosaponiną BII i Sinensetyną jako kluczowymi składnikami, a PTGS2, PPARG i HSP90AA1 jako głównymi celami. Analiza inhibitorów protonowych (PPI) dodatkowo zidentyfikowała kluczowe geny, w tym ESR1, PTGS2, PPARG, HSP90AA1, JUN oraz 15 dodatkowych genów. Analiza KEGG wykazała, że SXQY działa głównie poprzez Ca2+, fosforydylinozytol 3-kinazowo-białkowo-kinazę B, cykliczną adenozynomonofosforan oraz szlaki zapalne i hormonalne. Podsumowując, SXQY wywiera efekty ochronne przeciwko HF poprzez poprawę funkcji serca oraz osłabienie remodelacji mięśnia sercowego poprzez mechanizmy wieloskładnikowe, wielocelowe i wieloszlakowe.
Niewydolność serca (HF) to zespół kliniczny charakteryzujący się upośledzeniem wypełniania i zdolności wypłnięcia komory spowodowanymi nieprawidłowościami strukturalnymi lub funkcjonalnymi serca, co skutkuje zbiorem objawów klinicznych1. Jako stadium terminalne różnych chorób serca, HF znacząco obniża jakość życia pacjentów i prowadzi do wysokiej śmiertelności oraz częstych ponownych hospitalizacji, co nakłada znaczne obciążenie chorobowe zarówno rodzinom, jak i społeczeństwu 2,3. W leczeniu klinicznym farmakoterapia HF stanowi fundament i fundament leczenia, obejmując głównie kluczowe klasy leków, takie jak diuretyki, inhibitory układu renina–angiotensyna, beta-blokery, antagoniści receptorów mineralokortykoidowych oraz inhibitory kotransportera sodowo-glukozowego 2 3,4,5,6 . Chociaż leki te częściowo poprawiły rokowanie pacjentów z HF, każdy z nich niesie ze sobą pewne ograniczenia i skutki niepożądane, takie jak zaburzenia elektrolitowe, bradykardia czy infekcje dróg moczowych7. Dlatego terapie farmakologiczne dla HF wciąż wymagają dalszych badań.
Tradycyjna Medycyna Chińska (TCM) zgromadziła bogate doświadczenie kliniczne w długoterminowym leczeniu HF. Kładąc nacisk na holistyczną regulację i interwencję wielocelową, oferuje unikalne podejście do leczenia8. W ostatnich latach szereg randomizowanych badań kontrolowanych (RCT) wykazało skuteczność terapeutyczną chińskich formuł ziołowych dla HF 9,10,11,12,13,14,15. Dekoktura Shengxian Quyu (SXQY) już rozpoczęła rygorystyczne badania RCT mające potwierdzić skuteczność terapeutyczną, jednak jej specyficzne mechanizmy terapeutyczne wymagają dalszych i bardziej kompleksowych badań16. Farmakologia sieci, jako rozwijająca się dziedzina integrująca biologię systemową, polifarmakologię i analizę obliczeniową, oferuje potężne narzędzie do wyjaśniania holistycznych mechanizmów działania chińskich ziołowych formuł 17,18,19. Dlatego badanie to wykorzystuje zintegrowaną strategię łączącą metabolomikę nieukierunkowaną z farmakologią sieciową do identyfikacji składników SXQY wchłanianych przez krew oraz wyjaśnienia jego potencjalnych mechanizmów terapeutycznych. Prace te mają na celu stworzenie podstaw do dalszego klinicznego zastosowania SXQY.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zbadane i zatwierdzone przez Komitet Etyki i Dobrostanu Zwierząt Szpitala Przyjaźni Chińsko-Japońskiej (zatwierdzenie nr zryhyy21-23-01-09) i przeprowadzono zgodnie z zasadami zastępowania, redukcji i udoskonalenia, aby zminimalizować wykorzystywanie i cierpienie zwierząt. Badacze zajmujący się pozyskiwaniem i analizą danych (w tym pomiarami echokardiografii i oceną histologiczną) byli zaslepieni na przydział grup.
Przygotowanie próbki SXQY
SXQY składa się z następujących składników ziołowych: Astragalus membranaceus (Huangqi) (30 g), Codonopsis pilosula (Dangshen; 20 g), Cornus officinalis (Shanyurou; 15 g), Sparganium stoloniferum (Sanleng; 12 g), Curcuma zedoaria (Erzhu; 15 g), Cimicifuga heracleifolia (Shengma; 10 g), Bupleurum chinense (Chaihu; 10 g), Platycodon grandiflorus (Jiegeng; 10 g), Anemarrhena asphodeloides (Zhimu; 15 g) oraz Leonurus japonicus (Yimu; 15 g), z całkowitą masą ziół 152 g na receptę. Wszystkie materiały ziołowe zostały zakupione w Departamencie Farmacji Szpitala Przyjaźni Chin i Japonii i uwierzytelnione przez głównego farmaceutę zgodnie ze standardowymi metodami identyfikacji farmakognostycznej. Klinicznie SXQY podaje się w dawce jednej recepty (152 g) dziennie. Zakładając średnią masę ciała dorosłego na poziomie 70 kg, odpowiednia dawka dla ludzi wynosi 2,17 g (zioło surowe)/kg. Na podstawie normalizacji powierzchni ciała między ludźmi a szczurami, równoważną dawkę dla szczurów obliczono na 13,67 g (zioło surowe)/kg. Do przygotowania wywaru jedną receptę SXQY moczono w wodzie destylowanej w stosunku 10 mL na gram surowych ziół (w/v, na podstawie początkowej objętości rozpuszczalnika bez regulacji po moczeniu) przez 1 godzinę, następnie gotowano przy użyciu elektrycznego płaszcza grzewczego i utrzymywano w temperaturze 100°C przy ciągłym gotowaniu przez 1 godzinę. Ekstrakt był następnie filtrowany przez gazę (o rozmiarze porów 200–300 μm). Pozostałości zostały następnie wyekstrahowane jeszcze dwukrotnie w identycznych warunkach. Zebrane filtraty były koncentrowane pod obniżonym ciśnieniem za pomocą parownika obrotowego w temperaturze 60°C, do końcowej objętości 111 mL, co dało stężenie 1,37 g (surowego leku)/mL. Skoncentrowany wywar był ponownie filtrowany przez gazę (por o wielkości 200–300 μm) i przechowywany w temperaturze 4°C, a następnie używany w ciągu 24–48 godzin. Do podawania roztwór był stosowany bezpośrednio, a objętość gavage obliczono na podstawie stężenia 1,37 g/mL, co dało objętość podawania około 10 mL/kg, aby osiągnąć docelową dawkę 13,67 g/kg.
Model zwierzęcy
Osiemnaście 8-tygodniowych samców szczurów Sprague–Dawley (SD) było trzymanych w standardowym, warunkowanym środowisku (23°C ± 2°C, wilgotność względna 50 ± 5% oraz 12-godzinny cykl światła/ciemności) z bezpłatnym dostępem do jedzenia i wody. Zwierzęta zostały losowo przydzielone do trzech grup (n = 6 na grupę) za pomocą losowej tabeli liczbowej: grupy obsługiwanej przez sham (Sham), grupy poprzecznej zwężenia aorty (TAC) oraz grupy leczonej SXQY (SXQY). Szczury z grup TAC i SXQY zostały znieczulone przez wdychanie izofluranu (indukcja 4%, utrzymanie 2%) i umieszczone w pozycji leżącej na termostatycznie kontrolowanej poduszce grzewczej utrzymywanej w temperaturze 37°C. Odpowiednią znieczulenie potwierdzono przez brak odruchowych reakcji na szczypanie łapy, stabilne tempo oddechu i brak spontanicznych ruchów. Maść okulistyczna została nałożona na oba oczy, aby zapobiec przesuszeniu rogówki. Po intubacji endotchawicowej zwierzęta były podłączone do respiratora dla małych zwierząt o objętości pływowej 4–6 mL na 200 g masy ciała, oddechu 70 oddechów na minutę oraz stosunku wdechu do wydechu 1:1.
Wszystkie zabiegi chirurgiczne wykonywano w warunkach aseptycznych. Narzędzia chirurgiczne zostały sterylizowane przez autoklawowanie, a obszar operacyjny przygotowano przez golenie i dezynfekcję povidonem z jodem, a następnie 70% etanolem. Po przygotowaniu miejsca operacji wykonano nacięcie skóry lewej części klatki piersiowej, a mięśnie piersiowe duże i małe zostały tępo rozcięte w celu odsłonięcia żeber. W drugiej do trzeciej przestrzeni międzyżebrowej, przylegającej do lewej krawędzi mostka, powstało poziome nacięcie o długości około 1,0 cm. Naczynia krwionośne i powięzi zostały tępo oddzielone, a grasica delikatnie cofnięta, aby całkowicie odsłonić łuk aorty.
Łuk aorty został ostrożnie uniesiony pomiędzy prawą tętnicą innominalną a lewą wspólną tętnicą szyjną za pomocą sterylnych, zakrzywionych kleszczy, a pod spodem przeprowadzono szew 2-0 z jedwabiu. Tępa, zakrzywiona igła 16 gauge (średnica zewnętrzna 1,6 mm) była ręcznie modyfikowana przez stępienie końcówki i wygięcie jej do odpowiedniej krzywizny przed użyciem, a następnie sterylizację autoklawem. Przygotowana zakrzywiona igła z tępym końcem była następnie ustawiana równolegle do łuku aorty, po czym szew był ciasno wiązany wokół aorty i igły. Igła została natychmiast usunięta, aby uzyskać ustandaryzowane zwężenie, a grasica została przesunięta. Po potwierdzeniu braku aktywnego krwawienia, ściana klatki piersiowej i skóra zostały zamknięte warstwami. Po operacji wentylacja mechaniczna była kontynuowana przez około 10 minut, aż do przywrócenia samoistnego oddychania, co potwierdza stabilna i regularna częstość oddychania oraz możliwość utrzymania spontanicznego oddychania bez wsparcia wentylacyjnego. W tym momencie usunięto rurkę tchawicową. Zwierzęta operowane na fikcję przechodziły te same zabiegi chirurgiczne, z tą różnicą, że łuk aorty nie był podwiązany.
Po operacji miejsce nacięcia zostało zdezynfekowane, a zwierzęta umieszczano w czystych klatkach do regeneracji, aby zmniejszyć ryzyko infekcji. Szczury były następnie oddawane do ośrodka dla zwierząt na rekonwalescencję i rutynowe zakwaterowanie. Anegezję podawano przy użyciu buprenorfiny (0,05 mg/kg, podskórnie). Szczury obserwowano co 12 godzin w ciągu pierwszych 72 godzin pod kątem objawów bólu, niepokoju lub powikłań chirurgicznych, w tym zmniejszonej ruchomości, piloerekcji, nieprawidłowej postawy, ciężkiego oddychania lub rozchodzenia rany.
Trzy dni po operacji szczury z grupy leczonej SXQY były doustnie podawane 1 mL/100 g masy ciała wywaru SXQY przez 9 tygodni. Tymczasem szczury z grup sfałszowanych i TAC otrzymywały równą ilość (1 mL/100 g masy ciała) wody destylowanej przez gavage.
Echokardiografia przezklatkowa
Pod koniec okresu leczenia wykonano echokardiografię przeztorakalną we wszystkich grupach. Szczury były znieczulone przez wdychanie izofluranu i umieszczane w pozycji leżącej na dedykowanej platformie obrazowania. Przednia część klatki piersiowej została starannie ogolona i pokryta obfitą warstwą żelu ultrasonografialnego. Obrazowanie ultradźwiękowe przeprowadzono za pomocą wysokorozdzielczego systemu ultradźwiękowego dla małych zwierząt wyposażonego w przetwornik wysokiej częstotliwości (18–40 MHz) w trybie B i M. Przetwornik został umieszczony delikatnie na obszarze pokrytym żelem, z ustawieniem głębokości 12,29 mm i wzmocnieniem 22 dB; ostrość była dostosowana, aby zoptymalizować jakość obrazu. Pobierano obrazy i pętle wideo do późniejszej analizy ilościowej. Zmierzono średnicę wewnętrzną na końcu i rozkurczowym lewej komory (LVIDd) oraz grubość tylnej ściany lewej komory przy roztopie końcowym (LVPWd), a frakcję wyrzutową lewej komory (LVEF) obliczono wzorem Teichholza na podstawie pomiarów trybu M. Dla każdego parametru pomiary były uśredniane przez 3–5 kolejnych cykli serca. Wszystkie akwizycje i analizy echokardiograficzne były wykonywane przez certyfikowanego operatora z formalnym przeszkoleniem w zakresie echokardiografii, zgodnie ze standaryzowanymi protokołami echokardiograficznymi.
Pobieranie próbek i przetwarzanie
Po zabiegu USG szczury były znieczulone izofluranem. Zwierzęta umieszczano w pozycji leżącej na plecach, a jama piersiowa była otwierana, odsłaniając serce. Serca były szybko usuwane, płukane w zimnej soli fizjologicznej z buforem fosforanowym i przecinane wzdłuż płaszczyzny strzałkowej. Tkanki sercowe natychmiast utrwalono w 4% paradehydzie w temperaturze 4°C przez 24 godziny, po czym nastąpiło odwodnienie poprzez stopniową serię etanolową (70%, 80%, 90%, 95% i 100%) przez 1 godzinę na każdym etapie, podczas której tkanki stopniowo stawały się przezroczyste bez zauważalnego kurczenia się. Próbki były usuwane w ksylenie, infiltrowane stopioną parafiną w temperaturze 60°C przez 3 godziny i pozostawiane do zastygnięcia w temperaturze pokojowej (RT; 20°C–25°C). Bloki tkanki serca osadzone w parafinie zostały przycięte i przekrojone na grubość 4–6 μm przy użyciu mikrotomu. Fragmenty były uwodzione w kąpieli wodnej utrzymywanej w temperaturze 45°C, montowane na szklanych ślizgawkach i suszone w temperaturze 37°C–40°C przez noc. Preparaty przechowywano w RT w warunkach niskiej wilgotności i wykorzystywano w ciągu tygodnia do barwienia histologicznego.
Barwienie hematoksyliny i eozyny (HE)
Sekcje z osadzeniem w parafinę były przetwarzane w następujący sposób. Fragmenty najpierw deparafinizowano przez zanurzenie w ksylenie I, II i III na 5 minut każda, następnie nawadniano za pomocą serii bezwodnych etanolu I i II oraz roztworów ethanolu stopniowego (95%, 90%, 80%, 70% i 50%) przez 5 minut każda, a następnie płukano w wodzie destylowanej, bez widocznych pozostałości wosku. Następnie przekroje były barwione hematoksyliną Harrisa przez 5 minut i płukane pod bieżącą wodą z kranu przez 1–2 minuty. Różnicowanie przeprowadzono w roztworze alkoholu kwasowego przez około 1–2 sekundy, a punkt końcowy określano na podstawie wizualnej inspekcji, gdy tło wydawało się blade, a barwienie jądrowe pozostawało wyraźnie określone. Następnie nastąpiło niebiesko w wodzie w temperaturze 37°C–45°C i płukanie wodą destylowaną. Następnie sekcje były barwione eozyną rozpuszczalną w alkoholu przez 40 sekund, myte wodą destylowaną, odwodnione przez oklasyfikowany etanol, oczyszczone ksylenem i ostatecznie osadzone żywicą neutralną.
Barwienie Massona
Sekcje z parafiną były deparafinizowane sekwencyjnie w ksylenie I, II i III przez 5 minut każda, następnie nawadniano przez bezwodny etanol I i II oraz roztwory etruzowane (95%, 90%, 80%, 70% i 50%) przez 5 minut każda, a na końcu płukano w wodzie destylowanej. Sekcje zanurzano w kwasie octowym 0,5% (wstępnie schładzono do 4°C) przez 1 sekundę, następnie barwiliśmy roztworem fuchsyny z komercyjnego zestawu do barwienia trichromowego Masson's przez 10 minut, a następnie różnicowanie kwasem fosforolibdowym przez 5 minut i barwienie błękitem anilinowym przez 3 minuty. Wszystkie odczynniki były częścią tego samego komercyjnego zestawu i były używane zgodnie z instrukcjami producenta. Po barwieniu sekcje były trzykrotnie płukane kwasem octowym, wstępnie schładzonym do 4°C (około 30 sekund na płukanie), suszone przez etanol klasyfikowany, oczyszczone ksylenem i zamocowane żywicą neutralną.
Pobieranie próbek surowicy do analizy metabolomiki
Sześć 8-tygodniowych samców szczurów SD było trzymanych w takich samych warunkach jak te w powyższym eksperymencie in vivo. Zwierzęta zostały losowo przypisane do grupy objętej SXQY oraz grupy kontrolnej pojazdu (woda destylowana; n = 3 na grupę) za pomocą komputerowej metody losowania. Szczury z grupy SXQY były podawane doustnie SXQY w dawce 1 mL/100 g masy ciała, podczas gdy grupa kontrolna otrzymała równą ilość wody destylowanej. Po siedmiu dniach codziennego gavage, ostatnia dawka siódmego dnia została podwojona. Po ostatniej administracji zwierzęta były głodzone przez 12 godzin. Szczury były znieczulone izofluranem, aż do potwierdzenia utraty odruchu cofania się pedałów jako wskaźnika odpowiedniego znieczulenia. Próbki krwi pobrano z splotu żylnego retrooczodołowego za pomocą sterylnych kapilar i natychmiast przenoszono do mikrowirówek o pojemności 1,5 mL bez antykoagulantu. Cała krew została następnie pozostawiona w stanie RT przez 1 godzinę i wirowana w 1000 × g przez 15 minut w temperaturze 4°C, aby uzyskać surowicę. Gdy pojawiała się wyraźna separacja między górną przezroczystą warstwą surowicy a skrzepem, surowica supernatantowa była ostrożnie wdychana i przenoszona do czystych rurek mikrowirówki. Próbki surowicy przechowywano w temperaturze −80°C do czasu analizy składników wchodzących do krwi.
Próbka wstępnego przetwarzania do analizy metabolomiki
Próbki serum były rozmrażane na lodzie po wyjęciu z magazynu −80°C i krótko mieszane w wirach (10 s), aby zapewnić jednorodność. Aliquot surowicy 100 μL został przeniesiony do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, a następnie dodano 500 μL rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (20% acetonitrylu–metanolu zawierającego 2-chloro-L-fenylalaninę jako wewnętrzny standard przy końcowym stężeniu 1 μg/mL) w celu wytrącenia białek. Mieszanka była intensywnie wirowana przez 3 minuty, a następnie wirowana w 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Część powstałego supernatantu o pojemności 470 μL została przeniesiona do nowej rurki i odparowana do wyschnięcia za pomocą parownika azotu przy niskim, kontrolowanym przepływie azotu. Po rekonstrukcji w 200 μL 70% metanolu i wody oraz wirowaniu przez 1 minutę, próbki zostały odwirowane w 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4°C, a 180 μL klarownego supernatantu przelano do fiolek z autopróbkowaniem do analizy chromatografii cieczowej – spektrometrii mas tandemowej (LC-MS/MS).
Aliquot 200 μL próbki SXQY był następnie przenoszony do wcześniej oznakowanej probówki wirówki o pojemności 1,5 mL. Do każdej próbki dodawano wewnętrzny roztwór ekstrakcyjny w proporcji objętościowej 1:1 (v/v). Mieszanka była mieszana wirowo przez 15 minut i wirowana w temperaturze 12 000 × g przez 3 minuty w temperaturze 4°C. Powstały supernatant był starannie zbierany i filtrowany przez mikroporowatą membranę o średnicy 0,22 μm, co dało przezroczysty filtrat bez widocznych cząstek. Filtrat był przenoszony do fiolek z automatycznym próbkowaniem i przechowywany w temperaturze 4°C przed ultrawydajną analizą LC-MS/MS (UPLC–MS/MS).
Przygotowanie rozwiązań standardów wewnętrznych
Roztwór wewnętrzny standardu (2-chloro-L-fenylolanina) przygotowano przez rozpuszczenie 1 mg standardu referencyjnego w 1 mL 70% (v/v) metanolu w wodzie, co dało stężenie 1 000 μg/mL. Roztwór ten był dalej rozcieńczany tym samym rozpuszczalnikiem, aby uzyskać działający wewnętrzny roztwór standardowy o końcowym stężeniu 1 ppm, który był świeżo przygotowany, przechowywany w temperaturze 4°C i używany w ciągu 48–72 godzin.
Warunki UPLC–MS/MS
Separacja chromatograficzna była wykonywana za pomocą systemu UPLC sprzężonego z tandemometrem mas. Separację osiągnięto na kolumnie C18 utrzymywanej w temperaturze 40°C, o przepływie 0,35 mL/min i objętości wtrysku 4 μL. Faza komórkowa składała się z ultraczystej wody zawierającej 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego (A) oraz acetonitrylu zawierającego 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego (B). Gradient elucia została zastosowana w następujący sposób: 5% B po 0,0 min; liniowo wzrosło do 25% B przy 2,0 min, 35% B po 3,0 min, 60% B po 5,0 min, a 99% B po 6,0 min; utrzymywana na 99% B przez 1,5 min; powrócił do 5% B po 7,6 min; i wyrównywał się na poziomie 5% B do 10,0 min.
Detekcja spektrometryczna mas była przeprowadzana za pomocą spektrometru masowego o wysokiej rozdzielczości wyposażonego w źródło jonizacji elektrosprayowej pracujące w trybach dodatnim i ujemnym. Napięcia natrysku ustawiono na 3500 V w trybie dodatnim i 3200 V w trybie ujemnym. Gaz osłonowy i gaz pomocniczy zostały ustawione odpowiednio na 30 i 5 jednostek (określonych przez instrument). Temperatura rurki jonowej i temperatury parownika utrzymywano odpowiednio na poziomie 320°C i 300°C. Pełne skany MS wykonywano w zakresie m/z 84–1250 z rozdzielczością 35 000 z celem automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) 1,0 × 106, a następnie zależne od danych akwizycje MS/MS (top 10) z rozdzielczością 17 500 z celem AGC 2,0 × 105 i oknem izolacji 1,0–1,5 m/z. Zastosowano stopniowe znormalizowane energie kolizji 30, 40 i 50. Do fragmentacji wybrano 10 najintensywniejszych jonów prekursorowych z dynamicznym czasem wykluczenia wynoszącym 3 s.
Przetwarzanie surowych danych
Surowe dane ze spektrometrii mas zostały przekonwertowane do formatu mzML za pomocą ProteoWizard. Aby zapewnić niezawodność analityczną, przygotowano próbki kontroli jakości (QC) w grupie poprzez wymieszanie równych objętości wszystkich próbek surowic. Próbki QC były wstrzykiwane w regularnych odstępach czasu (jedna iniekcja QC co 5–10 próbek analitycznych) podczas analizy UPLC–MS/MS, aby monitorować stabilność instrumentu, spójność czasu retencji oraz powtarzalność sygnału. Powtarzalność oceniano na podstawie względnego odchylenia standardowego szczytowych intensywności w próbkach QC.
Wykrywanie szczytów, korekcja czasu retencji oraz wyrównanie szczytów były wykonywane za pomocą pakietu XCMS. Cechy z wskaźnikiem braków powyżej 50% w jakiejkolwiek grupie zostały wykluczone z dalszej analizy. Korekcja dryfu sygnału została następnie zastosowana do obszarów szczytowych za pomocą metody normalizacji opartej na regresji wektorowej (SVR), zaimplementowanej w oprogramowaniu statystycznym R, wykorzystującej modelowanie QC do korygowania dryfu sygnału w trakcie analizy analizy.
Identyfikacja metabolitów została przeprowadzona poprzez dopasowanie skorygowanych cech z wewnętrzną biblioteką standardów referencyjnych (zawierającą około 5 000 związków z danymi spektralnymi MS1 i MS2; własnościową i niepublicznie dostępną), a także publicznie dostępnymi bazami danych spektralnych, w tym Human Metabolome Database (HMDB), Metabolite and Tandem Mass Spectrometry Database (METLIN), MassBank oraz Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS), oparte na dokładnym dopasowaniu mas, wyrównaniu czasu retencji oraz podobieństwie widmowym MS/MS. Dopasowanie masy wykonano przy użyciu tolerancji ±25 ppm dla jonów prekursorowych (MS1) i fragmentów (MS2), z tolerancją czasu retencji ±6 s. Do wyszukiwania bibliotecznego zastosowano tolerancję ±25 ppm dla jonów prekursorowych (Q1) oraz ±50 ppm dla fragmentów MS/MS, z minimalnym wynikiem dopasowania MS/MS 0,3. Do identyfikacji niecelowanej zachowano tylko metabolity z kompleksowym wynikiem identyfikacyjnym powyżej 0,5. Ostateczny wynik był obliczany jako ważona suma wyników fragmentów (0,1), do przodu (0,3) i do tyłu (0,6). Dane uzyskane w dodatnim i ujemnym trybie jonizacji zostały połączone na poziomie związków. Dla zdublowanych adnotacji wybierano wpis o najwyższej pewności identyfikacji i najwyższym wyniku. Sfinalizowane adnotacje zostały zebrane w plik adnotacji metabolitów.
Kryteria identyfikacji związków wchłoniętych
Absorbowane składniki prototypowe zostały zdefiniowane jako związki wykryte w ekstrale SXQY oraz w grupie poddany SXQY z odpowiadającymi czasami retencji w tolerancji ±0,1 min. Ponadto związki te musiały wykazywać szczytową powierzchnię w grupie traktowanej SXQY, która była co najmniej dwukrotnie większa niż w grupie kontrolnej pojazdu lub nie występować w próbkach kontrolnych pojazdu.
Wchłonięte metabolity zostały zidentyfikowane według innego zestawu kryteriów. Związki te nie zostały wykryte w ekstrakcie SXQY, ale występowały w grupie leczonej SXQY. Ich cechy spektrometryczne mas musiały być zgodne z charakterystycznymi transformacjami metabolicznymi, w tym hydroksylacją (Δm/z = +15,9949 Da) oraz demetylacją (Δm/z = −14,0157 Da). Ponadto obszar szczytu w grupie objętej SXQY musiał być co najmniej dwukrotnie wyższy niż w grupie kontrolnej pojazdu na podstawie znormalizowanych obszarów szczytowych po korekcie dryfu sygnału, w przeciwnym razie odpowiadający sygnał musiał być niewykrywalny w próbkach kontrolnych pojazdu.
Odzyskanie wchłoniętych genów powiązanych ze związkami
Składniki wprowadzające do krwi zostały przeanalizowane w Platformie Bazy Danych i Analiz Systemów Medycyny Chińskiej (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.ph; dostęp w styczniu 2026)20. Związki udokumentowane w TCMSP zostały przesiewowane jako kandydaty na bioaktywne składniki na podstawie ustalonych progów farmakokinetycznych biodostępności doustnej ≥ 30% oraz podobieństwa do leku ≥ 0,1821. Później odzyskano potencjalne cele odpowiadające zachowanym związkom, a wszystkie identyfikatory celów zostały ustandaryzowane do oficjalnych symboli genów na podstawie bazy UniProt22.
Odzyskanie celów związanych z chorobą oraz genów przecięć
Geny związane z HF zostały zebrane z bazy danych GeneCards (https://www.genecards.org/; dostęp w styczniu 2026) przy użyciu terminu "niewydolność serca" jako terminu wyszukiwania, a geny o wskaźniku trafności ≥ 10 zostały wybrane do dalszej analizy. Cele związane z HF zostały następnie skrzyżowane z celami powiązanymi ze związkami zidentyfikowanymi w TCMSP za pomocą platformy Weishengxin (https://www.bioinformatics.com.cn; dostęp w styczniu 2026). Nakładające się geny zostały zdefiniowane jako cele przecięcia i wykorzystane do późniejszych analiz budowy sieci (PPI) oraz wzbogacania funkcjonalnego.
Konstrukcja sieci i analizy wzbogacania funkcjonalnego
Analiza PPI zidentyfikowanych celów została przeprowadzona przy użyciu bazy danych STRING (http://cn.string-db.org/; dostęp w styczniu 2026)23, z gatunkiem ustawionym na Homo sapiens i progiem poziomu ufności ≥0,7. Dane interakcji zostały zaimportowane do narzędzia wizualizacyjnego Cytoscape do wizualizacji sieci. Analizę topologiczną przeprowadzono za pomocą wtyczki NetworkAnalyzer w narzędziu wizualizacyjnym, a geny hubów zidentyfikowano za pomocą wtyczki CytoHubba24,25. Analiza wzbogacenia ontologii genów (GO) została przeprowadzona na celach przecięcia, w tym na kategoriach procesów biologicznych (BP), komponentu komórkowego (CC) oraz funkcji molekularnej (MF). Terminy GO o wartości P < 0,05 uznano za istotne, a do wizualizacji26 wybrano 10 wzbogaconych wyrazów z każdej kategorii. Cele przecięć zostały następnie poddane analizie wzbogacenia szlaków w Encyklopedii Genów i Genomów w Kioto (KEGG) z wykorzystaniem pakietu clusterProfiler w oprogramowaniu statystycznym. Szlaki o wartości P < 0,05 uznano za statystycznie istotne, a 20 najlepiej wzbogaconych szlaków wybrano do wizualizacji. Te ścieżki zostały następnie wykorzystane do stworzenia sieci interakcji cel–ścieżka27.
Analiza statystyczna
Dane prezentowane są jako średnia ± SD. Normalność rozkładu danych oceniono za pomocą testu Shapiro–Wilka, a jednorodność wariancji oceniono za pomocą testu Levene'a lub testu Brown-Forsythe'a przed analizą. Porównania statystyczne między grupami przeprowadzono za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji, a następnie testu post hoc Tukeya z użyciem GraphPad Prism. P < 0,05 uznano za istotne statystycznie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Echokardiografia przezklatkowa
Analiza echokardiograficzna wykazała wyraźną remodelację i dysfunkcję serca u szczurów TAC (Rysunek 1). W porównaniu z grupą kontrolną Sham, TAC istotnie zwiększył LVIDd i LVPWd, podczas gdy LVEF był wyraźnie obniżony. Warto zauważyć, że podawanie SXQY częściowo odwróciło te zmiany patologiczne, co odzwierciedla istotne zmniejszenie LVIDd i LVPWd oraz równoczesna poprawa LVEF w porównaniu z grupą TAC.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
SXQY jest szeroko stosowany w praktyce klinicznej od ponad dwóch dekad, wykazując skuteczność w leczeniu różnych schorzeń sercowo-naczyniowych. Ostatnio jego zastosowanie rozszerzono na pacjentów z niewydolnością serca o zmniejszonej frakcji wyrzutowej i nieznacznie obniżonej frakcji wyrzutowej16. W niniejszym badaniu opracowano model szczura za pomocą operacji TAC, aby naśladować zmiany patologiczne HF, a w międzyczasie niektóre szczury były leczone lekiem SXQY w celu oceny jego skuteczności. Do ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie zgłaszają konfliktów interesów w tej pracy.
Dziękujemy Centrum Eksperymentów Zwierzęcych Szpitala Przyjaźni Chińsko-Japońskiej za pomoc w opiece nad zwierzętami i procedurach chirurgicznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2-chloro-L-fenyloalanina | Aladyn | C105993-1g | Standard wewnętrzny; ≥ 98% |
| Acetonitryl (klasa LC-MS) | Aladyn | A120771-1L | Rozpuszczalnik ekstrakcyjny |
| Kwas octowy | Solarbio | G1340 | Bejcowanie Masson; wstępnie schłodzony do 4 i stopnie; C |
| Fiolki z autosamplerem | Agilent | 5190-9590 | Dla ładowania próbek LC-MS/MS |
| Buprenorfina | Cerilliant | B-044S | Środek analgetyczny |
| Kolumna C18 (1,8 μ m, 2,1 mm & razy; 100 mm) | Wody | 176001125 | Kolumna ACQUITY Premier HSS T3 |
| Rurki kapilarne, sterylne | Fisherbrand | 22-362-566 | Pobieranie krwi retrooczodołowej |
| Wirówka (chłodzona) | KUBOTA | N61196-F000 | Do surowicy i przetwarzania próbek |
| clusterProfiler package | Bioconductor | — | Pakiet R do analizy wzbogacania KEGG; v4.0.2 |
| Zakrzywione kleszcze, sterylne | HL-SQX | HL-JP | Manipulacja łuku aorty |
| Oprogramowanie Cytoscape | NHGRI | NIH NHGRI U24 HG012107 | Wersja 6.4.1 |
| Dedykowana platforma obrazowania | Fujifilm VisualSonics | System obrazowania ultradźwiękowego VisualSonics Vevo 1100 | Pozycjonowanie zwierząt podczas echokardiografii |
| Woda destylowana | Nie ma | Nie ma | Przygotowanie dekokcji i kontrola pojazdu |
| Płaszcz grzewczy elektryczny | Midea | WK2102 | Gotowanie wywaru |
| Rurka tchawicowa | CWE Inc., USA | SAR-1000 | Intubacja tchawiczna; Rurka tchawicowa użyta w tym badaniu została zintegrowana z konfiguracją respiratora i nie była oddzielnym ani samodzielnym urządzeniem |
| Etanol (absolut) | Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd. | 64-17-5 | Odwodnienie i sterylizacja |
| Kwas mrówkowy | Aladyn | O930702 | Addytywność fazy ruchomej |
| Gaza | Solarbio | YA0720 | Filtracja dekokcyjna; 200– 300 i mu; Rozmiar porów m |
| Baza danych GeneCards | GeneCards | — | Pozyskiwanie celów związanych z chorobą; dostęp styczeń 2026 |
| Baza danych GNPS | Uniwersytet Kalifornijski w San Diego | — | Spektralna baza danych; wersja 1.3.16, dane zarchiwizowane w grudniu 2025 |
| Oprogramowanie GraphPad Prism | Oprogramowanie GraphPad | — | Wersja 10.1.2; SCR_002798 |
| Poduszka grzewcza (termostatyczna) | Physitemp | HP-4M | Utrzymywane na 37 stopni; C |
| Hematoksylina i eozyna (H& E) Zestaw do bejcowania | Solarbio | G1120 | Barwienie histologiczne |
| Przetwornik wysokiej częstotliwości | VisualSonics | Vevo F2 | 18– 40 MHz |
| Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive | Q Exactive HF-X |
| System ultrasonografii o wysokiej rozdzielczości dla małych zwierząt | Fujifilm VisualSonics | System obrazowania ultradźwiękowego VisualSonics Vevo 1100 | Vevo 2100 |
| Baza danych HMDB | Grupa Badawcza Wishart / Centrum Innowacji Metabolomiki, Uniwersytet Alberty | — | Spektralna baza danych; HMDB aktualna wersja 5.0; wydanie 5.0; Styczeń 2022 |
| Wewnętrzna biblioteka standardów referencyjnych | METWARE | — | Skład wewnętrznej biblioteki referencyjnej standardów: Biblioteka zawiera łącznie 5 000 związków i zawiera zarówno dane spektralne MS1 (prekursor), jak i MS2 (fragmentacyjne). Oświadczenie o dostępności: Format danych bibliotecznych to .txt. Stan przechowywania: Baza danych jest przechowywana na wewnętrznym serwerze firmy. Uprawnienia dostępu: Ta samodzielnie zbudowana biblioteka standardów to własna, własna biblioteka spektralna firmy. Jest wykorzystywany wyłącznie do identyfikacji metabolitów, weryfikacji wyników oraz śledzenia jakości w kontrolowanych procesach analitycznych firmy. Biblioteka nie jest publicznie dostępna do pobrania. Klienci mogą uzyskać wyniki adnotacji, informacje o trafieniach oraz niezbędne opisy pól generowane na podstawie tej biblioteki. |
| Izofluran | Sigma-Aldrich | 792632 | Znieczulenie wziewne |
| System chromatografii cieczowej (UPLC) | SCIEX | ExionLC AD | ExionLC AD |
| Baza danych MassBank | konsorcjum MassBank; Towarzystwo Spektrometrii Mas Japonii / MassBank Europe | — | Spektralna baza danych; wersja 2024.06; dane zarchiwizowane w grudniu 2025 |
| Masson' Zestaw Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | Barwienie histologiczne |
| Filtr membranowy (0,22 μ m) | Beyotime | FF362 | Polietersulfon (PES) |
| Baza danych METLIN | Instytut Badawczy Scripps / Laboratorium Siuzdaka | RRID: SCR_010500 | Spektralna baza danych; Ta baza danych nie podaje stałego rocznego numeru wersji; Dane pobrane w 2023 roku |
| Metanol (klasa LC-MS) | Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd. | 67-56-1 | Rozpuszczalnik ekstrakcyjny |
| Rurki mikrowirówki (1,5 mL) | Corning Life Sciences (Wujiang) Co., Ltd. | MCT-150-C | Przetwarzanie próbek |
| Mikrotom | Leica | DSC1 | Sekcjonowanie tkanek |
| Żywica neutralna | Solarbio | G8590 | Montaż zamka |
| Evaporator/źródło gazu | Organomacja | N-EVAP | Suszenie próbki |
| Maść okulistyczna | Aladyn | 08-03-8009 | Ochrona oczu podczas znieczulenia |
| Parafina | Solarbio | YA0010 | Osadzanie tkanek |
| Paraformaldehyd (4%) | Solarbio | P1110 | Utrwalanie tkanek |
| Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym | TY | DYP1021 | Mycie tkanek |
| Kwas fosfolibdowy | Solarbio | G1340 | Barwienie Masona |
| Povidone– jod | Solarbio | IP3800 | Dezynfekcja chirurgiczna |
| Oprogramowanie ProteoWizard | Fundacja ProteoWizard | — | Wersja 3.0.19254 |
| Oprogramowanie R | Fundacja R | — | Wersja 4.2.2 |
| Rotacyjny parownik | QINGDAO JINGCHENG INSTRUMENT CO., LTD | JC-2LZF | Stężenie delokcji przy obniżonym ciśnieniu |
| Szew jedwabny (2-0) | FULAN | NL30RH26A-76 | Zwężenie aorty |
| Respirator dla małych zwierząt | CWE Inc., USA | SAR-1000 | Wentylacja mechaniczna |
| Sprague– Szczury Dawley (samiec, 8 tygodni) | SPF Bio Co., Ltd. | — | RGD_70508; Numer licencji SCXK(jing)2024-0001 |
| Baza danych STRING | Konsorcjum STRING | — | Analiza interakcji białkowych; dostęp styczeń 2026 |
| Pakiet/skrypt wspierający normalizację regresji wektorowej | MetNormalizer | — | Korekcja dryfu sygnału; v1.3.02 |
| Baza danych TCMSP | TCMSP | — | Pozyskiwanie obiektów złożonych i celów; dostęp styczeń 2026 |
| Baza danych UniProt | Konsorcjum UniProt | — | Standardyzacja symboli genowych |
| Żel ultradźwiękowy | MAGNAFLUX | 25-912 | Echokardiografia |
| Woda ultraczysta | Przygotowane laboratoryjnie | — | Rozpuszczalnik fazy komórkowej |
| Mieszacz wirowy | Yalin | VM-ST | Miksowanie próbek |
| Kąpiel wodna | Julabo | PURA22 | Sekcja unosząca się na 45 stopni; C |
| Peron Weishengxin | Weishengxin | — | Analiza przecięć celów; dostęp styczeń 2026 |
| Oprogramowanie XCMS | Fundacja R | — | Wersja 3.16.1 |
| Ksylen | Aladyn | X775162 | Deparafinizacja |