Zintegrowane Badanie Asocjacyjne Transkryptomu i Randomizacja Mendelowska identyfikuje LYNX1 i MS4A14 jako Cel Terapeutyczny w Osteomyelitis

Summary

To badanie integruje analizę skojarzeń w zakresie transkryptomu i randomizację Mendela, aby systematycznie zidentyfikować cele lekowe w osteomyelitis. Wykorzystując bazy danych genetycznych, autorzy zidentyfikowali LYNX1 i MS4A14 jako kluczowe geny kandydackie, podkreślając kluczowe szlaki molekularne i informując o precyzyjnych strategiach terapeutycznych w leczeniu infekcji kości.

Abstract

Osteomyelitis to poważna choroba zakaźna charakteryzująca się głęboką stanem zapalnym kości i rdzenia kostnego, wywoływana głównie przez patogeny bakteryjne takie jak Staphylococcus aureus (S. aureus). Jednak obecne schematy leczenia są znacznie utrudnione przez pojawienie się oporności na antybiotyki i nawracające infekcje, napędzane przez silne tworzenie biofilmu i trwałość bakterii wewnątrzkomórkowych. Dlatego istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania nowych docelowych celów terapeutycznych poza konwencjonalnymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi. Zastosowano zintegrowane podejście obliczeniowe łączące badanie stosunku transkryptomu i skojarzeń genomowych (TWAS) z analizą losowego przypisywania Mendela opartą na sumarycznych danych (SMR), aby systematycznie zidentyfikować geny podatności przyczyniające się do osteomyelitis. Duże skala wariantów genetycznych została wykorzystana jako instrument do przewidywania ekspresji genów w różnych tkankach, umożliwiając analizę przyczynowych powiązań między tymi celami a ryzykiem choroby. Zintegrowana struktura zidentyfikowała LYNX1 i MS4A14 jako kluczowe geny kandydackie i potencjalne cele terapeutyczne. W szczególności LYNX1 był związany ze zwiększoną podatnością na osteomyelitis, podczas gdy MS4A14 wykazywał potencjalne właściwości ochronne. Te odkrycia podkreślają regulacyjne role tych genów w odpowiedzi immunologicznej żywiciela i modulacja stanu zapalnego podczas infekcji kości. To badanie łączy lukę między wynikami badań stosunku genów i genomów a interpretacją biologiczną, poprawiając rozumienie genetycznej podstawy osteomyelitis i wspierając rozwój ukierunkowanych strategii medycyny precyzyjnej w celu wzmocnienia obrony żywiciela i pokonania oporności terapeutycznej.

Introduction

Osteomyelitis to poważna choroba zakaźna charakteryzująca się głęboką zapaleniem kości i szpiku kostnego. Często jest wywoływana przez najazd bakterii, przy czym Staphylococcus aureus (S. aureus) jest częstym patogenem w przypadku ostrego i przewlekłego uogólnione przewlekłe przebiegi^1,2. Chociaż S. aureus jest prominentny, osteomyelitis jest często polimikrobialna, a eradykacja S. aureus sama w sobie nie zawsze rozwiązuje infekcję ze względu na utrzymywanie się drobnoustrojów niemożliwych do hodowli oraz dynamiczne interakcje biofilmu^3,4. W przypadku podatnych gospodarzy patogeny wykorzystują złożone strategie ucieczki, w tym utrzymywanie się wewnątrz makrofagów i tworzenie gęstych biofilmów. Te biofilmy, składające się z pozakomórkowego DNA, polisacharydów i specjalistycznych białek, tworzą formidabilne fizyczne bariery, które odpornością na działanie obrony odpornościowej gospodarza i ograniczają penetrację konwencjonalnych środków przeciwdrobnoustrojowych^5,6. W rezultacie, chociaż kliniczne leczenie zazwyczaj obejmuje agresywne odbłonniki chirurgiczne i przedłużoną terapię antybiotykową, obecność odpornych biofilmów i polimikrobialnych społeczności znacznie zmniejsza skuteczność leczenia, prowadząc do przedłużającej się morbidytetu i nawracających infekcji^7,8. Wyjaśnienie struktury molekularnej leżącej u podstaw interakcji gospodarz-patogen pozostaje kluczowe dla identyfikacji nowych docelowych terapii⁹.

Badania skojarzeń genomowych (GWAS) poszerzyły rozumienie osteomyelitis poprzez zidentyfikowanie wielu lokusa genetycznych związanych z podatnością na chorobę¹⁰. Jednak ze względu na surowe progi wielokrotnego testowania oraz ograniczenia mocy statystycznej i wielkości próby, wiele kluczowych lokusa wpływających na podatność na osteomyelitis prawdopodobnie pozostanie niewykrytych⁷. Ponadto, interpretacja wyników GWAS nadal jest wyzwaniem, ponieważ większość zidentyfikowanych wariantów znajduje się w regionach niekodujących lub międzygenowych, co sugeruje efekty regulacyjne na ekspresję genów, a nie bezpośrednie zmiany w strukturze białka¹¹. Ponadto, pierwotne dane GWAS nie mają bezpośredniej specyficzności tkankowej, co wymaga uzupełniających analiz w dalszym ciągu, aby określić konteksty komórkowe, w których te warianty wywierają swoje działanie. Badania skojarzeń transkryptomu (TWAS) radzą sobie z tymi ograniczeniami, integrując genetycznie przewidywaną ekspresję genów z paneli referencyjnych do istniejących zestawów danych GWAS, umożliwiając systematyczną identyfikację funkcjonalnie istotnych genów związanych z chorobą w wielu tkankach¹².

Aby wzmocnić wnioski przyczynowe, randomizacja mendelowska (MR) wykorzystuje warianty genetyczne jako zmienne instrumentalne, korzystając z losowego przydziału alleli przy poczęciu, aby zmniejszyć zaburzenia i odwrotne przyczyny^13,14. Analizy loci cech ilościowych ekspresji (eQTL) dalej łączą warianty GWAS z transkrypcją genów¹⁵, podczas gdy randomizacja mendelowska oparta na podsumowaniach (SMR) integruje zestawy danych GWAS i QTL, aby priorytetyzować geny przyczynowe i odróżnić je od asocjacji napędzanych przez dysrównowagę łączenia poprzez testowanie heterogeniczności¹⁶.

To badanie reprezentuje pierwsze zastosowanie integracyjnego frameworku TWAS i MR specyficznie skupionych na osteomyelitis, rozwiązując lukę między wynikami GWAS a klinicznie działającymi wskazówkami. Łącząc eksperymentalne dane transkryptomowe z danymi genetycznymi populacyjnymi w dużej skali, geny podatności na choroby były systematycznie mapowane i wnioski przyczynowe były wywnioskowane. Ta integracyjna strategia ma na celu odkrycie nierozpoznanych wcześniej ścieżek molekularnych zaangażowanych w odporność gospodarza na osteomyelitis i identyfikację kandydatów do precyzyjnego rozwoju terapii.

Protocol

Wszystkie statystyki sumaryczne wykorzystane w analizach Randomizacji Mendelowskiej (MR) i Badania Asocjacji Transkryptomu (TWAS) zostały pobrane ściśle z wcześniej opublikowanych, anonimowych zestawów danych. Zatwierdzenie etyczne i indywidualna zgoda na oryginalne badania są udokumentowane w ich odpowiednich publikacjach. W związku z tym, dodatkowa zgoda etyczna na to badanie górnicze danych została uchylona przez Radę Recenzji Instytucjonalnej Szpitala Tongde w Prowincji Zhejiang (Zhe Tongde Lunshen 2024 [Yan] No. 028-JY). Narzędzia użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Nabywanie i przetwarzanie danych RNA-seq

Dane transkryptomowe zostały uzyskane z bazy danych Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE272198) w celu oceny zachowania ścieżek odporności wrodzonej w różnych gatunkach ssaków dla początkowej walidacji¹⁷. Makrofagi pochodzące z szpiku kostnego (BMDM) zostały zarażone S. aureus (wielokrotność zakażenia, MOI = 10) przez 1 godzinę, po czym poddano je leczeniu lizostatiną (20 µg/mL) i gentamycyną (50 µg/mL) w celu usunięcia bakterii pozakomórkowych. Po trzech płukaniach buforem fosforanowym (PBS), BMDM były kultywowane przez 24 godziny, lizowano w środku reagentu ekstrakcyjnego RNA, a następnie sekwencjonowano.

Jakość RNA została oceniona za pomocą zautomatyzowanego systemu elektroforetycznego, aby zapewnić integralność. Biblioteki zostały przygotowane z trzech niezależnych eksperymentów i sekwencjonowano na platformie sekwencjonowania wysoko-przepustowości. Surowe odczyty zostały dopasowane do genomu myszy (GRCm38, mm10) za pomocą STAR (v2.7.10a). Różnicowo eksponowane geny (DEG) zostały zidentyfikowane za pomocą DESeq2 (v1.38.0). Aby zmniejszyć liczbę fałszywych dodatnich wyników, statystyczna istotność została zdefiniowana jako skorygowany p-wartość (FDR) < 0.05 i |log2 zmiany skali| > 1. Analiza Gene Ontology (GO) została przeprowadzona za pomocą clusterProfiler (v4.6.0), a Analiza Obogacenia Zbiorów Genów (GSEA) przeprowadzono za pomocą GseaVis (v0.0.5). Mapa ciepła została wygenerowana za pomocą pakietu pheatmap (v1.0.12) w R (v4.2.0).

Analiza TWAS

Dane sekwencjonowania RNA z pełnej krwi i sekwencjonowania pełnego genomu (WGS) zostały uzyskane z projektu Genotype-Tissue Expression (GTEx) (V8)¹⁸. Wykorzystano wstępnie wytrenowanie modeli ekspresji genów z publicznego repozytorium (https://doi.org/10.5281/zenodo.3842289). Statystyki sumaryczne osteomielitis dla TWAS zostały pobrane z konsorcjum FinnGen, obejmujące 2336 przypadków i 473264 kontroli¹².

TWAS przeprowadzono za pomocą trzech algorytmów: wspólne wdrożenie tkankowe (JTI), PrediXcan¹⁹ i UTMOST^12,20. JTI szacuje podobieństwo ekspresji genów i dostępność epigenetycznego chromatyny w celu optymalizacji dokładności predykcji. PrediXcan stosuje regresję sprężystą z pięciokrotną walidacją krzyżową, podczas gdy UTMOST poprawia dokładność poprzez wykorzystanie danych ekspresji wielotkankowych za pomocą gęstego LASSO. Zaktualizowany framework UTMOST opisany przez Zhou et al.¹² standaryzuje hiperparametry dla nieuprzednionej estymacji. Geny o stabilnych wynikach walidacji krzyżowej - zdefiniowane jako współczynnik korelacji r > 0.1 i istotność predykcyjna p < 0.05²¹ - zostały zachowane jako imputowalne. Modele transkryptomowe pełnej krwi zostały ustanowione za pomocą macierzy kowariancji SNP z referencyjnego zestawu danych 1000 Genomes.

Następnie przeanalizowano skojarzenia między przewidywaną ekspresją genów a ryzykiem osteomielitis. Aby uwzględnić wielokrotne testowanie, statystyczna istotność dla TWAS została pierwotnie zdefiniowana za pomocą progu False Discovery Rate (FDR) < 0.05. Biorąc pod uwagę hipotetyczny charakter tego wieloetapowego badania, loki spełniające sugestywny (nominalny) próg p < 0.05 zostały również priorytetowe dla analizy randomizacji mendelowskiej (SMR) i kolokalizacji. Ta integracyjna strategia ma na celu maksymalizację uchwycenia potencjalnych czynników regulacyjnych, opierając się na wielo-omicznej walidacji krzyżowej (TWAS + SMR) w celu zapewnienia solidności priorytetowych kandydatów.

Analiza SMR

To badanie przestrzegało wytycznych dla wzmacniania raportowania obserwacyjnych badań w epidemiologii (STROBE)²². Aby obliczyć fenotyp reprezentujący predyspozycję genetyczną do dysfunkcji mitochondrialnej (zwanej dalej “mitodys” w celach analitycznych), transkrypty odpowiadające wszystkim znanym genem związanym z mitochondriami zostały wyodrębnione z bazy danych MitoCarta3.0²³. Ten zestaw genów służył jako predefiniowana, biologicznie poinformowana podstawa dla późniejszego predykcji ryzyka poligenicznego. Wszystkie późniejsze interpretacje funkc

Results

Characterization of bulk RNA-sequencing and functional enrichments

Following the methodology used to isolate uninfected (control) versus S. aureus-infected BMDMs, 3,775 DEGs were identified in the experimental group, comprising 1,686 upregulated and 2,089 downregulated genes. GO analysis revealed a network strongly enriched for innate immune activation, including positive regulation (GO:0045089) and activation (GO:0002218) of the innate immune response, reflecting can...

Discussion

Poprzez integrację analiz TWAS i SMR w całym tłumaczeniu zbiorów danych, badanie to zidentyfikowało podstawową sieć lokusa genetycznych związanych z fenotypami osteomielitis. Identyfikacja LYNX1 i MS4A14 jako potencjalnych genów kandydatów reprezentuje kluczowy wkład, zapewniając mechaniczne wgląd poza konwencjonalnymi wynikami GWAS poprzez uwzględnienie kontekstu transkryptomu. To podejście integracyjne podkreśla potencjał strategii medycyny precyzyjnej w rozwijaniu klinicznego zarządzania poważnymi infekcjami kości.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
clusterProfiler	Guangchuang Yu's Team (Sun Yat-sen University)	NA	Stosowane do analizy wzbogacania funkcjonalnego Gene Ontology (GO) genów o zróżnicowanej ekspresji.
DESeq2	Bioconductor Project (Open Source)	NA	Stosowane do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji (DEGs)
GSEA / GseaVis	Broad Institute / Open Source Community	NA	Stosowane do analizy wzbogacania zestawów genów (GSEA) w celu zidentyfikowania koordynacyjnie ekspresowanych zestawów genów. GseaVis jest prawdopodobnie stosowany do wizualizacji.
HEIDI (Heterogeneity in Dependent Instruments) test	Zintegrowana funkcja w oprogramowaniu SMR	NA	Stosowane do testowania, czy obserwowana w SMR asocjacja jest spowodowana dysekwilibryem łączeniowym, a nie wspólną przyczynową wariantą. P_HEIDI > 0,05 wskazuje na brak większej niejednorodności
JTI (Joint-Tissue Imputation)	Zhou et al. (Open Source Model)	NA	Algorytm TWAS, który szacuje podobieństwo ekspresji genów i dostępność epigenetycznego chromatyny w celu optymalizacji dokładności predykcji.
pheatmap	Raivo Kolde (R package)	NA	Stosowane do generowania map ciepła genów o zróżnicowanej ekspresji w celu wizualizacji danych.
PrediXcan	Gamazon et al. (Open Source Model)	NA	Algorytm TWAS, który stosuje regresję z ściągnięciem sprężystym z pięciokrotną walidacją krzyżową do uzupełnienia ekspresji genów i testowania asocjacji z ryzykiem choroby.
SMR (Summary-data-based Mendelian Randomization)	Opracowane przez zespół na Uniwersytecie Fudan (Open Source Software)	NA	Stosowane do przeprowadzania analizy losowych randomizowanych badań na podstawie danych podsumowanych w celu zbadania przyczynowych asocjacji między ekspresją genów a ryzykiem osteomielitis. Stosowano wersję 1.0.3.
STAR	Alexander Dobin (Cold Spring Harbor Laboratory)	NA	Stosowane do dostosowywania odczytów RNA-seq do genomu odniesienia (genom myszy GRCm38/mm10).
UTMOST	Hu et al. (Open Source Model)	NA	Algorytm TWAS, który poprawia dokładność predykcji poprzez wykorzystanie danych ekspresji wielotkankowych przy użyciu ramówki sparse group LASSO.