Model myszy pojedynczego i wielokrotnego obrotowego zamkniętego urazu mózgu z wstrząsieniem mózgu

Podsumowanie

Opisano jest odtwarzalne mysie modele obrażeń mózgu z obrotowego uderzenia, co zapewnia wszechstronny sposób badania subtelnych funkcjonalnych i biologicznych podstaw - w tym zmian neurovaskularnych, zapalnych i behawioralnych - po pojedynczym lub powtarzanym uderzeniu bez wyraźnych strukturalnych uszkodzeń mózgu.

Streszczenie

Wstrząśnienie mózgu (CBI), podłoże patofizjologiczne leżące u podstaw klinicznego wstrząśnienia mózgu, jest częstym, ale jeszcze niedostatecznie zrozumiałym stanem, który może prowadzić do długotrwałego upośledzenia neurologicznego u niektórych pacjentów. Szczególnie wielokrotne Wstrząśnienie mózgu, tj. w sporcie kontaktowym, jest związane z trwałymi deficytami poznawczymi i postępującą neurodegeneracją (np. przewlekła urazowa encefalopatia, CTE). Aby wypełnić tę lukę w wiedzy, stworzono model myszy z powtarzalnym zamkniętym obrażeniem mózgu, które odtwarza kluczowe cechy biomechaniczne i patologiczne Wstrząśnienia mózgu. Użyto stereotaktycznie kierowanego elektromagnetycznego uderzenia dostarczającego standaryzowane uderzenie w nietkniętą czaszkę. Aby zmniejszyć lokalne naprężenie na czaszce i sąsiednich tkankach mózgowych, końcówka uderzeniowa została wyposażona w niestandardową szybkę silikonową. Ta konfiguracja niezawodnie indukowała rotację głowy o niskiej zmienności między zwierzętami, zapobiegając jednocześnie ułamaniom czaszki lub mikroskopijnemu uszkodzeniu tkanki. Aby zachować fizjologiczne aktywności neuronów i naczyń krwionośnych oraz uniknąć potencjalnie neuromodulacyjnych efektów głębokiej anestezy, uraz mózgu został wywołany u świadomych myszy pod lekką sedacja za pomocą agonisty α2 medetomidin. Wywołane uderzenia powodowały powtarzalne rotacyjne ruchy głowy z niewielką zmiennością przypisaną do pozycji głowy. Integralność strukturalna mózgu została oceniona za pomocą in vivo obrazowania magnetycznego T2-zważonego i potwierdzona przez ex vivo analizy histologiczne, które nie wykazały dowodów na uszkodzenie tkanki, stłuczenie lub mikrokrwotoki, ale wykazały łagodne, rozległe zaburzenie interfejsu mikrokrążenia. Ten nowy model obrażeń mózgu z zamkniętą czaszką zapewnia solidną platformę eksperymentalną do przeprowadzania długotrwałych badań subtelnych zmian neuronaczyniowych, zapalnych i bariery krew-mózg, które występują bez wyraźnej patologii strukturalnej. Jego zastosowanie umożliwia uzyskanie mechanistycznych wnikliwości w patofizjologię klinicznego wstrząśnienia mózgu i potencjalne skutki neurodegeneracyjne wielokrotnych urazów, ułatwiając w ten sposób opracowanie pilnie potrzebnych biomarkerów klinicznych.

Wprowadzenie

Uraz mózgu (TBI) pozostaje istotną przyczyną długotrwałej niepełnosprawności we wszystkich grupach wiekowych, przy czym nastolatkowie i dorośli w młodym wieku są dotknięci w nieproporcjonalnie większym stopniu^1,2,3. Zdecydowana większość TBI jest klasyfikowana jako łagodna (mTBI), powszechnie nazywana na poziomie klinicznym stłuczeniem mózgu. Chociaż stłuczenie mózgu z definicji nie jest związane z wyraźnymi strukturalnymi uszkodzeniami mózgu wykrywalnymi w konwencjonalnych badaniach obrazowych, rosnące dowody sugerują, że podstawowy mechanizm obrażeń – tutaj określany jako uderzeniowy uraz mózgu (CBI) – reprezentuje odrębną i klinicznie istotną jednostkę patofizjologiczną.

W szczególności, powtarzające się CBI, zwłaszcza gdy występują w krótkim czasie, jak często spotyka się w sporcie kontaktowym i środowiskach wojskowych, zostało powiązane z trwałym spadkiem funkcji poznawczych, objawami neuropsychiatrycznymi i rozwojem przewlekłej encefalopatii pourazowej (CTE)^1,2,3. Ta pozorna sprzeczność między łagodnym charakterem początkowego urazu a potencjalnymi długotrwałymi następstwami neurologicznymi stanowi główne wyzwanie zarówno dla diagnostyki klinicznej, jak i badań mechanizmu choroby.

Pojawiające się dowody wskazują, że subtelne, ale trwałe zmiany na styku neurovaskularnym i neuroglialnym stanowią istotny mechanizm chorobowy⁴. Te zmiany obejmują integralność bariery krew-mózg (BBB), strukturę mikrokrążenia, aktywację gleju, pobudliwość neuronów i procesy naprawcze endogenne, potencjalnie łącząc patofizjologię na poziomie komórkowym z długotrwałymi funkcjonalnymi i behawioralnymi deficytami obserwowanymi po, zwłaszcza powtarzanym, CBI^5,6,7,8. Łącznie, takie zmiany są coraz częściej rozpoznawane jako potencjalne czynniki przyczyniające się do opóźnionych deficytów funkcjonalnych i behawioralnych po CBI. Jednakże, rozproszony i wielowymiarowy charakter komplikuje zrozumienie mechanizmu choroby i do tej pory utrudnia opracowanie ukierunkowanych interwencji terapeutycznych.

Modele przedkliniczne, które naśladują kluczowe aspekty kaskady patofizjologicznej, są kluczowymi narzędziami do analizy tych mechanizmów i identyfikacji nowych dróg terapeutycznych. Chociaż istnieje szeroka gama eksperymentalnych modeli TBI, większość z nich została zaprojektowana do naśladowania umiarkowanych do ciężkich obrażeń lub opiera się na skupisku strukturalnym uszkodzeniu^9,10,11. W przeciwieństwie do tego, zaskakująco brakuje modeli zwierzęcych charakterystycznego mechanizmu obrażeń CBI⁵. Zazwyczaj uraz mózgu określany jako "łagodny" jest wywoływany przez skupisku uderzenie w sztywno unieruchomiony pysk lub nawet przez bezpośrednie uderzenie kory po kraniotomi, co fundamentalnie jest sprzeczne z rozproszonym mechanizmem obrażeń, napędzanym przyspieszeniem-zwalnianiem, który definiuje stłuczenie mózgu u ludzi^6,7. Chociaż takie podejścia pozwalają na precyzyjną kontrolę parametrów urazu, ich ograniczona zdolność do naśladowania dynamiki prawdziwych stłuczeń mózgu zmniejsza ich istotność translacyjną.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, istnieje kilka metod wywoływania powtarzalnego i rozproszonego zamkniętego urazu mózgu^12,13,14. W oparciu o te koncepcje i mając na celu zminimalizowanie złożoności technicznej, opracowano kontrolowany model obrażeń rotacyjnych u myszy z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego elektromagnetycznego urządzenia uderzeniowego, często stosowanego w innych eksperymentalnych modelach traumy (tj. kontrolowane uderzenie kortykalne, CCI). Przez dostarczenie powtarzalnego uderzenia w swobodnie poruszającą się głowę, to podejście zachowuje integralność strukturalną, umożliwiając jednocześnie przeprowadzenie badań podłużnych nad zmianami neurowaskularnymi, neuroglialnymi i funkcjonalnymi po pojedynczych i powtarzalnych uderzeniach CBI w warunkach, które bliskie są biomechanicznym cechom ludzkiego stłuczenia mózgu.

W połączeniu z podłużną oceną behawioralną, obrazowaniem in vivo i histologią ex vivo, ten model zapewnia wszechstronną i dostępną platformę do badania zmian neurowaskularnych, glialnych i behawioralnych po pojedynczych lub powtarzalnych uderzeniach. Jako taki, jest dobrze przystosowany do badania subtelnych wtórnych mechanizmów chorobowych CBI, identyfikacji parametrów surogatowych translacyjnych i oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych w klinicznie istotnym eksperymentalnym otoczeniu.

Protokół

Wszystkie procedury zwierzęce spełniały wymagania niemieckiej Ustawy o Ochronie Zwierząt i zostały zatwierdzone przez instytucjonalne i rządowe władze (LANUV Nordrhein-Westfalen; AZ 81-02.04.2020.A058). Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z wytycznymi ARRIVE. Schematyczny przebieg badania szczegółowo opisano w Rysunku 1. Ten protokół niezawodnie wywołuje stłuczeniowe uszkodzenie mózgu, co potwierdza zdefiniowany zestaw wyników walidacji strukturalnej, behawioralnej i neuronaczyniowej (Rysunek 2). Wszystkie materiały użyte w tym badaniu są szczegółowo opisane w Tabeli Materiałów.

1. Ogólne zasady

UWAGA: Myszy były trzymane w warunkach standaryzowanych (cykl 12 h światło/ciemność) z dostępem do jedzenia i wody ad libitum. Myszy przystosowały się do warunków eksperymentalnych przez co najmniej 7 dni przed operacją. W tym badaniu pilotażowym użyto łącznie 40 myszy, przydzielając 10 zwierząt do każdej grupy eksperymentalnej (grupa kontrolna sham, grupa pojedynczego CBI, powtarzające CBI z wysoką częstotliwością i powtarzające CBI z niską częstotliwością). Skonfiguruj system kamer wysokiej prędkości na wysokości oczu myszy, z głową myszy w ustalonej pozycji przed nią (np. 10 cm). Aby zapewnić spójność między próbami, utrzymuj stałą pozycję i orientację kamery. W tym badaniu użyto GoPRO Hero6 z częstotliwością 240 klatek na sekundę (fps) z rozdzielczością 1080px. Do analizy kinematycznej opisanej w protokołach użyto oprogramowania do analizy ruchu o otwartym kodzie źródłowym Kinovea (wersja 2025.2.0).

2. Wprowadzenie do analgezji i znieczulenia

1. Przygotuj zestaw, w tym ramę stereotaktyczną i mocowanie do elektromagnetycznego uderzeniowca.
2. Podawaj tramadol (1 mg/mL) przez wodę pitną dwa dni przed indukcją urazu i kontynuuj przez trzy dni po (ostatniej) operacji.
3. Wprowadź znieczulenie za pomocą izofluranu w mieszaninie tlenu z prototlenkiem azotu (O₂ 30%, N₂O 70%), z 4–4,5% izofluranu w komorze indukcyjnej.
4. Oceń tolerancję chirurgiczną za pomocą odruchu wycofania łapy. Kontynuuj po ustaniu reakcji wycofania.
5. Wyjmij mysz z komory indukcyjnej i umieść ją na podgrzewanym podkładzie wewnątrz ramy stereotaktycznej. Utrzymuj temperaturę rdzeniową na poziomie 37 ± 1,0 °C za pomocą światłowodowej sondy prostokątnej.
6. Utrzymuj znieczulenie poprzez podawanie izofluranu w stężeniu 2,0–2,5% przez rurkę nosową podłączoną do zestawu stereotaktycznego.

3. Przygotowanie czaszki

1. Umocuj mysz wewnątrz ramy stereotaktycznej za pomocą specyficznych uchwytów usznych.
2. Ogolić skórę głowy i dokładnie wydezynfekuj obszar operacyjny za pomocą środka dezynfekującego na bazie alkoholu.
3. Zastosuj znieczulenie miejscowe poprzez podawanie podskórne bupiwakainy (0,1 mg/kg).
4. Ponownie oceń odruch wycofania łapy przed nacięciem skóry. Kontynuuj tylko w przypadku braku reakcji wycofania, aby zapewnić jednolitą głębokość znieczulenia.
5. Wykonaj nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej o długości około 7 mm, aby odsłonić czaszkę.
6. Ostrożnie odsłoń czaszkę nad kością cieńską prawą między punktem Bregma a Lambda.
7. Upewnij się, że rama stereotaktyczna jest ustawiona prostopadle do czaszki, z osią pionową ustawioną pod kątem 90° względem powierzchni głowy.
8. Wstaw igłę wskaźnikową do uchwytu stereotaktycznego i ustawiaj ją centralnie na punkcie Bregma.
9. Wyzeruj wszystkie współrzędne stereotaktyczne i przesuń igłę wskaźnikową do wstępnie zdefiniowanych współrzędnych przednio-tylnych (AP) i boczno-środkowych (ML) (w naszym modelu na AP 0,5, ML –2,5). Oznacz punkt docelowy wodoszczelnym długopisem.

4. Regulacja analgezji

1. Uwolnij mysz z uchwytów usznych.
2. Podaj medetomidynę podskórnie (0,5 mg/kg) i stopniowo zmniejszaj izofluran do <0,5 %.
3. Utrzymuj znieczulenie na poziomie <0,5% izofluranu, ciągle monitorując oddech i temperaturę ciała.
4. Pozwól na równowagę w tych warunkach przez 10 min, aby osiągnąć stały stan znieczulenia, zachowując aktywność sieci neuronowych. Współczynnik oddechu, brak odpowiedzi odruchowych i stabilna temperatura ciała (37 ± 1,0 °C) były używane jako standaryzowane wskaźniki, aby zapewnić porównywalną głębokość znieczulenia dla wszystkich zwierząt.

5. Wprowadzenie uderzenia

UWAGA: Przed eksperymentem wykonaj

Wyniki

Ogólne założenia:

Zastosowanie tego protokołu powtarzalnie indukuje stłuczeniowe uszkodzenie mózgu, co wykazano na podstawie zdefiniowanego zestawu wskaźników walidacji strukturalnej, behawioralnej i neuronaczyniowej (patrz Rycina 2). Integralność strukturalna została zachowana po urazie. Nie wykryto żadnego rzucającego się w oczy makroskopowego uszkodzenia tkanki ani krwotoku, co wskazuje, że protokół indukuje stłuczeniowe, a nie roztrzepane usz...

Dyskusja

Nowy model myszy z zamkniętym uderzeniem mózgu (CBI) oparty na obrażeniu przyspieszeniowo-oporowy charakteryzuje się łagodnym, ale rozpowszechnionym upośledzeniem bariery krew-mózg oraz wyraźnym fenotypem neuropsychiatrycznym przypominającym kliniczne wstrząsienie mózgu. Poprzez reprodukowanie kluczowych cech CBI w kontrolowany i spójny sposób przy zachowaniu integralności strukturalnej, model zapewnia użyteczny i dobrze scharakteryzowany eksperymentalny rama dla badania mechanizmów leżących u podstaw CBI oraz jego neuro...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lek
Antipamezole	Vetoquinol	VM 06043/4004	Antagonista medetomidyny (antagonista receptora α2-adrenergicznego), podskórnie (0,5 mg/kg)
Bepanthen Ophthalmic Ointment	Bayer	11809917	Ochrona oczu podczas znieczulenia, miejscowo
Bupiwakaina	Sigma-Aldrich	B1160000	Znieczulenie miejscowe, podskórnie (0,1 mg/kg)
Izofluran	CP pharma	1214CN	Znieczulenie, inhalacyjne (indukcja i utrzymanie)
Medetomidyna	Vetoquinol	VM 06043/4003	Sedatyw/znieczulający uzupełniający (agonista receptora α2-adrenergicznego), podskórnie (0,5 mg/kg)
Tramadol hydrochloride (100 mg/mL)	Grünenthal	6867645	Analgezja podawany przez wodę pitną, 1 mg/mL końcowe stężenie dla myszy, od 2 dni przed do 3 dni po operacji
Wyposażenie
Polietylenowa poduszka na szyję	Na zamówienie		Podpora dla pozycji leżącej na brzuchu podczas uderzenia
Sterotaksyczna osłona Impactor Silupran	Na zamówienie		Rozprowadza obciążenie mechaniczne, zapobiega ogniskowemu uszkodzeniu czaszki, przymocowany do końcówki uderzeniowej, 830 kPa
Sterotaksyczny Impactor	Leica Biosystems	39463923/IM10131	Elektromagnetyczne urządzenie uderzeniowe do kontrolowanego dostarczania uderzenia
Narzędzia
GoPro Hero6	GoPro Inc., San Mateo, CA, USA
Kinovea		(wersja 2025.2.0)
MATLAB	MathWorks, Natick, MA, USA	NA