Zintegrowana metoda modelowania udaru fototrombotycego i in vivo rejestracji optrodem aktywności neuronowej i astrocytów u myszy wykonujących zachowania

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia zintegrowaną metodę, która obejmuje dostarczenie wirusowe, implantację optrodu, indukcję fototrombotyczną, jednoczesne rejestrowanie aktywności astrocytów i neuronów oraz optogenetyczną stymulację astrocytów. Ta zintegrowana metoda ma na celu zapewnienie jednoczesnego badania relacji astrocyt-neuron na wszystkich etapach przewlekłych udaru niedokrwiennego.

Streszczenie

Badanie dynamiki astrocytów i neuronów po udarze niedokrwiennym jest niezbędne do zrozumienia mechanizmów powysiłkowych. Jednak obecne metodologie często nie pozwalają na uchwycenie interakcji w czasie rzeczywistym między neuronami i astrocytami u zwierząt wykonujących określone zadania behawioralne, co ogranicza naszą zdolność do badania ostrej fazy patologii udaru. Ten protokół przedstawia zintegrowaną metodę, która łączy modelowanie udaru fototombotycznego z jednoczesnym rejestrowaniem wielokanałowym elektrofizjologii oraz fotometrią światłowodową u czujnych, zachowujących się myszy z wykorzystaniem niestandardowo wykonanego optrodu. Protokół obejmuje indukcję ogniskowego niedokrwienia poprzez fototombozę, a następnie jednoczesne rejestrowanie impulsów neuronów i przejściowych zmian wapnia w astrocytach. Optrod umożliwia jednoczesne wykonanie fototombozy, rejestrowanie sygnałów wapniowych i manipulację optogenetyczną bez konieczności oddzielnych procedur chirurgicznych. Wyniki reprezentatywne potwierdzają sukces w jednoczesnym rejestrowaniu sygnału wapniowego astrocytów i impulsów neuronów. Optogenetyczna manipulacja astrocytami powoduje mierzalne zmiany w wzorcach wyładowań neuronów (zmniejszenie częstotliwości wyładowań neuronów piramidalnych o 1,55 ± 0,45 Hz i neuronów interneuronowych o 3,64 ± 1,37 Hz w porównaniu z przedstymulacją optogenetyczną, n = 2), co potwierdza, że system jest zdolny do badania interakcji astrocytów i neuronów. To zintegrowane podejście radzi sobie z krytycznymi lukiami w metodologii badań nad udarem, zapewniając rejestrację wielomodalną w czasie rzeczywistym od fazy ostrej do przewlekłej udaru u zwierząt zachowujących się.

Wprowadzenie

Udar mózgu niedokrwienny pozostaje głównym wyzwaniem zdrowia publicznego na świecie, będąc jedną z głównych przyczyn zarówno śmiertelności, jak i długotrwałej niepełnosprawności nabywanej na całym świecie^1,2,3. Wysoki wskaźnik niepełnosprawności związany z udarem niedokrwiennym jest związany z różnorodnymi objawami klinicznymi, od porażenia ruchowego i utraty czucia po upośledzenie poznawcze^4,5,6. Istnieje pilna potrzeba pogłębienia rozumienia mechanizmów patologicznych i odbudowalnych udaru niedokrwiennego podczas fazy naprawy. Oprócz niewydolności neuronów, ostatnio podkreślono katastrofalną niewydolność astrocytów^7,8. Astrocyty, najliczniejsze komórki gleji, są istotnym składnikiem ośrodkowego układu nerwowego, a także trypartytowego synapsu. Na każdym etapie kaskady niedokrwiennej astrocyty odgrywają niezastąpioną rolę i głęboko wpływają na odbudowę neuronów i funkcji^9,10,11. W zdrowym mózgu astrocyty i neurony są funkcjonalnie połączone przez trypartytowy synaps, gdzie procesy astrocytarne pokrywają terminale przed- i postsynaptyczne i aktywnie uczestniczą w transmisji synaptycznej^7,8. Astrocyty regulują stężenie glutaminianu pozakomórkowego poprzez transportery kwasów aminowych, utrzymują homeostazę potasu przez kanały Kir4.1 i modulują siłę synaps poprzez uwalnianie gliotransmiterów poprzez wydzielanie zależne od wapnia^7,8. W tym kontekście, astrocytarne wewnątrzkomórkowe przejścia wapnia reprezentują aktywność astrocytarną i są ściśle związane z wyładowaniem neuronów⁷. Podczas udaru niedokrwiennego ta precyzyjnie sterowana relacja jest szybko zakłócana. Zapadnięcie się gradientów jonowych po niewydolności energetycznej wywołuje masowe uwalnianie glutaminianu i rozprzestrzenianie się depolaryzacji, prowadząc do toksycznego działania na neurony i proliferacji astrocytów reaktywnych¹². Astrocyty w rdzeniu zawału i wokół niego przechodzą kaskadę zmian patologicznych, w tym przeciążenie wapniem, upośledzenie ponownego wychwytu glutaminianu, utrata połączenia synaps i niewydolność uwalniania gliotransmiterów¹³. Jednocześnie aktywność szybkich wyładowań neuronów jest głęboko tłumiona, ponieważ neurony tracą żywotność i integralność potencjału błonowego^14,15. W strefie okołozawałowej, przetrwałe neurony i astrocyty reaktywne angażują się w dynamiczne interakcje, które są uważane za kluczowe dla wyznaczania wyniku powysiłkowej regeneracji; jednakże, elektrofizjologiczne i wapniowe korelaty w czasie rzeczywistym tej interakcji u przetrwałych, aktywnych zwierząt są słabo scharakteryzowane^13,16. W związku z tym, zrozumienie aktywności astrocytarnej w powiązaniu z sygnałami neuronowymi jest uważane za fundament regeneracji funkcji nerwowych po udarze niedokrwiennym.

Fototromboza jest szeroko stosowanym modelem niedokrwienia; wykorzystuje fotoczuły barwnik i skoncentrowane światło do wywołania niedokrzewienia w określonych obszarach docelowych¹⁷. Obecne protokoły modelowania udaru i rejestracji utrudniają badanie interakcji astrocyt-neuron po udar, przez trzy główne techniczne bariery^17,18,19. Segregacja modelowania i rejestracji jest powszechną wadą większości obecnych protokołów, powodując przerwę czasową między ustanowieniem modelu a rejestracją sygnału w czasie rzeczywistym^20,21. Jednakże, od kilku minut do kilku godzin po udar niedokrwienny jest istotnym okresem, w którym zarówno neurony, jak i astrocyty przechodzą drastyczne wahania^12,22. Bez jednoczesnego monitorowania interakcji astrocyt-neuron tuż po wystąpieniu udaru niedokrzewienia, badanie skutecznej wczesnej interwencji w udarze niedokrzewiennym będzie głęboko utrudnione. Kolejnym ograniczeniem obecnych protokołów jest izolacja trybów rejestracji; większość obecnych metodologii jest zoptymalizowana dla jednego rodzaju sygnału. Na przykład, wielokanałowa elektrofizjologia oferuje wykrywanie wyładowań neuronów i lokalnych potencjałów pola (LFP), ale jest ślepa na stany sygnałowe komórek glejowych^15,16. Z kolei monitorowanie dynamiki astrocytarnej poprzez obrazowanie wapnia in vivo uchwytuje wahaniom astrocytarnym, ale nie posiada danych dotyczących wyładowań neuronów. Ostatnia bariera obecnych protokołów wydaje się być stanem rejestracji zwierzęcia; w większości protokołów zwierzę jest unieruchomione lub swobodnie się porusza. Jednakże, dysfunkcja ruchowa jest uważana za jeden z najbardziej kłopotliwych skutków udaru; zrozumienie związku

Protokół

Protokół ten uzyskał zatwierdzenie Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt na Uniwersytecie Medycyny Chińskiej w Guangzhou (00379474) i został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi i regulacjami określonymi w Przewodniku National Institutes of Health dotyczącym opieki i korzystania ze zwierząt laboratoryjnych. Wdrożono wszystkie możliwe środki, aby zminimalizować liczbę zwierząt wykorzystanych w niniejszym badaniu.

1. Dostarczanie wektora wirusowego

UWAGA: Ta sekcja opisuje stereotaktyczne wstrzykiwanie wektorów AAV specyficznych dla astrocytów do kory ruchowej (M1FL). Celem jest uzyskanie stabilnej, specyficznej dla astrocytów ekspresji zarówno wskaźnika wapnia GCaMP6s, jak i optogenetycznego konstruktu opto-vTRAP przed implantacją optrody. Wymagany główny sprzęt: rama stereotaktyczna, cyfrowy system pomiarowy, szklana mikropipeta oraz pompa do mikroinfuzji.

1. Umieścić mysz w komorze indukcyjnej; rozpocząć indukcję znieczulenia 3%–4% izofluranem, przy czym stężenie izofluranu można zwiększyć maksymalnie do 5% w pierwszej minucie, aż mysz przestanie reagować. 
   OSTROŻNIE: Izofluran jest lotnym środkiem znieczulającym. Wszystkie procedury należy wykonywać przy aktywnej wentylacji. Należy unikać przedłużonej ekspozycji personelu.
2. Przenieść mysz do ramion stereotaktycznych wyposażonych w maskę anestezjologiczną i stosować 1–2% izofluranu w celu utrzymania głębokiej płaszczyzny znieczulenia.
3. Kontrolować głębokość znieczulenia co 10 min, badając rytm oddechowy, odruch powiekowy oraz reakcję na ucisk palców stopy. Utrzymywać temperaturę ciała myszy na poziomie 36–37.5 °C za pomocą podkładki grzewczej z systemem sprzężenia zwrotnego.
4. Nanieść maść oftalmiczną na oczy, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki podczas operacji.
5. Zabezpieczyć mysz w ramionach stereotaktycznych za pomocą wsporników usznych i wspornika jamowego. Wyregulować wsporniki uszne tak, aby głowa myszy była unieruchomiona symetrycznie. Upewnić się, że głowa jest stabilna, delikatnie ją badając.
6. Dokładnie usunąć włosy za pomocą kremu depilacyjnego, następnie oczyścić miejsce operacyjne 10% povidone-iodine. Wykonać nacięcie w linii środkowej za pomocą nożyczek chirurgicznych, aby odsłonić czaszkę. Oczyścić okostną przy użyciu soli fizjologicznej i patyczków bawełnianych, aby odsłonić punkty Bregma i Lambda.
7. Obniżyć szklaną mikropipetę, aby kolejno dotknąć punktów Bregma i Lambda; odczytać współrzędną Z na cyfrowym suwmiarzu. Wyregulować wspornik jamowy tak, aby różnica wynosiła <0.04 mm.
8. Obniżyć szklaną mikropipetę, aby dotknąć punktu Bregma i zresetować cyfrowy suwmiarz do zera. Przesunąć mikropipetę kolejno o 2.3 mm w lewo i w prawo od punktu Bregma; odczytać współrzędną Z na cyfrowym suwmiarzu. Wyregulować wsporniki uszne tak, aby różnice bilateralne wynosiły <0.04 mm.
9. Zresetować cyfrowy suwmiarz do zera w punkcie Bregma i wyznaczyć korę ruchową (M1FL; AP: +1.5 mm, ML: +0.74 mm). Za pomocą mikro wiertarki z wiertłami 0.5 mm (końcówka okrągła) wywiercić mały otwór o średnicy około 0.5 mm w zaznaczeniu. Wiercić ostrożnie, aby uniknąć krwawienia i uszkodzenia tkanki mózgowej; aplikować lodowatą sól fizjologiczną, aby zniwelować ciepło generowane podczas wiercenia.
10. Obniżyć szklaną mikropipetę podłączoną do mikropompy infuzyjnej do miejsca docelowego (DV: -0.94 mm od powierzchni mózgu). Przed załadowaniem zmieszać AAV9-GfaABC1D-GCaMP6s i AAV9-GfaABC1D-opto-vTRAP w równych objętościach, aby przygotować mieszaninę wirusową. Wprowadzić 400 nL mieszaniny (po 200 nL każdego wektora) z prędkością 50 nL/min.
    UWAGA: Koktajl wirusowy zawiera: 200 nL specyficznego dla astrocytów wskaźnika wapnia (AAV-GfaABC1D-GCaMP6s, 1.0 × 10¹³ vg/mL) oraz 200 nL specyficznego dla astrocytów optogenetycznego wektora wirusowego (AAV-GfaABC1D-opto-vTrap, 1 × 10¹³vg/mL). Poprawną transdukcję specyficzną dla astrocytów zweryfikowano w podgrupie zwierząt za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na GFAP, co potwierdziło koiloalizację fluorescencyjnego reportera z komórkami GFAP-dodatnimi oraz brak ekspresji w komórkach GFAP-ujemnych.     
    OSTROŻNIE: Wektory AAV są rekombinowanymi czynnikami biologicznymi; wszystkie wektory wirusowe i odpady należy traktować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego danej instytucji.
11. Pozostawić pipetę w miejscu przez 10 min po zakończeniu infuzji, aby umożliwić lepszą dyfuzję wirusa i zapobiec cofaniu się płynu. Powoli wycofać pipetę, zaszyć skórę głowy (4-0, 20 mm, 3/8 okręgu) i umieścić mysz na podkładce grzewczej do czasu pełnego ocucenia.
    UWAGA: Do uzyskania optymalnej ekspresji wirusowej wymagany jest okres 3–4 tygodni. Szczegółowy harmonogram protokołu przedstawiono na Rysunku 1A.

2. Inspekcja i weryfikacja funkcjonalna optrody

UWAGA: Przed implantacją wykonana na zamówienie optroda musi zostać poddana inspekcji fizycznej oraz testom optycznym w celu potwierdzenia, że jest zdolna do dostarczania światła we wszystkich trzech trybach funkcjonalnych (fototrombosis, stymulacja optogenetyczna i fotometria włóknista). Wymagany główny sprzęt: mikroskop, miernik mocy optycznej oraz źródła laserowe o długości fali 532 nm, 488 nm, 470 nm i 405 nm.

1. Inspekcja fizyczna optrody:
   1. Umieść wykonaną optrodę pod mikroskopem, aby sprawdzić rozmieszczenie miejsc rejestracji.
   2. Upewnij się, że 16 wolframowych mikrodrutów jest równomiernie związanych w pęk i otaczają centralne światłowodowe włókno. Sprawdź, czy nie ma zgiętych lub krzyżujących się drutów, które mogłyby spowodować zwarcia elektryczne.
   3. Potwierdź, że końcówka światłowodu jest krótsza od wolframowych mikrodrutów (Ryc. 1B).
      UWAGA: Końcówka światłowodu powinna być cofnięta o 100-200 µm względem końcówek elektrod²³. To przesunięcie, przyjęte na podstawie pracy Lee i wsp.²², zapewnia, że stożek światła wystarczająco pokrywa obszar rejestracji, zapobiegając jednocześnie nadmiernemu szumowi fotoelektrycznemu. Zaleca się, aby badacze empirycznie zweryfikowali odpowiednie przesunięcie dla własnej optrody.
2. Podłącz światłowód do źródła laserowego do modelowania oraz do źródła rejestracyjnego. Użyj miernika mocy optycznej, aby zmierzyć moc wyjściową na końcówce włókna dla następujących trzech trybów funkcjonalnych (Ryc. 1B):
   1. Tryb modelowania fototrombotycznego: Zweryfikuj, czy system może dostarczać światło ciągłe (CW) o wysokiej intensywności (532 nm).
      UWAGA: W tym eksperymencie zastosowano światłowód o NA 0.22. Szacowana średnica plamki oświetlenia na głębokości 100–200 µm poniżej końcówki włókna wynosi około 200–400 µm. Upewnij się, że moc na końcówce osiąga >20 mW, aby zagwarantować skuteczną aktywację błękitu bengalskiego i formowanie skrzepu.
   2. Tryb manipulacji optogenetycznej: Przetestuj impulsową moc wyjściową lasera (np. 488 nm dla opto-vTrap).
      UWAGA: Kalibruj moc do 10 mW na końcówce; wartość ta jest zoptymalizowana dla aktywacji opto-vTRAP na głębokości rejestracji 0,94 mm w korze ruchowej. Dla innych obszarów mózgu zaleca się weryfikację behawioralną lub elektrofizjologiczną.
   3. Tryb fotometrii światłowodowej (rejestracja wapnia): Przetestuj światło wzbudzenia o niskiej mocy (np. 470 nm i 405 nm).
      UWAGA: Upewnij się, że moc wyjściowa jest stabilna i utrzymywana na bardzo niskim poziomie (<50 µW), aby zminimalizować fototoksyczność i fotoblaknięcie wskaźnika wapnia (np. GCaMP6s) podczas długoterminowej rejestracji.

3. Przewlekła implantacja optrody

UWAGA: Ta sekcja opisuje procedurę chirurgiczną przewlekłego implantowania optrody w miejscu iniekcji wirusa. Precyzyjne wyznaczenie współrzędnych iniekcji jest kluczowe, aby zapewnić, że elektrody rejestrujące i światłowód obejmą obszar ekspresji GCaMP6s i opto-vTRAP. Wymagany główny sprzęt: rama stereotaktyczna, mikrowiertarka, pęseta, śruby do kranioplastyki, żel agarozowy i cement dentystyczny.

1. W celu przeprowadzenia znieczulenia, unieruchomienia stereotaktycznego, przygotowania czaszki i balansowania, należy postępować zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 1, z wyjątkiem nacięcia skóry głowy, podczas którego należy usunąć fragment o wymiarach 1,5 cm × 1,5 cm, upewniając się, że wokół oczu pozostało wystarczająco dużo skóry.
2. Oczyścić czaszkę wodą utlenioną oraz 0,9% solą fizjologiczną. Zidentyfikować Bregma i wyzerować cyfrowy suwak noniuszowy.
3. Użyć wiertła (0,8 mm, końcówka okrągła), aby lekko zmatowić powierzchnię czaszki w celu zapewnienia lepszej adhezji cementu dentystycznego.
4. Zaznaczyć korę ruchową za pomocą markera (M1FL; AP: 1,5 mm, ML: 0,74 mm), a następnie wykorzystać ten punkt jako środek do narysowania kwadratu o wymiarach 5 mm × 5 mm (Rycina 1C).
   1. Użyć mikrowiertarki z odpowiednią prędkością (około 10000 rpm) i wyciąć wzdłuż narysowanego kwadratu. Podczas wiercenia nieustannie wkraplać lodowatą sól fizjologiczną na ścieżkę wiertła, aby odprowadzić ciepło powstające podczas wiercenia z wysoką prędkością i zapobiec uszkodzeniu tkanki mózgowej. Natychmiast przerwać pracę, gdy płatek kostny zacznie się poluzować (Rycina 1C).
5. Wywiercić trzy małe otwory (średnica 0,5 mm) nad półkulą przeciwległą i móżdżkiem, a następnie wkręcić w otwory śruby do kranioplastyki. Należy upewnić się, że każda śruba dosięga opony twardej, unikając jednak dalszej penetracji i dodatkowego uszkodzenia tkanki mózgowej (Rycina 1C).
6. Za pomocą pęsety usunąć wcześniej poluzowany płatek kostny. Należy unikać wywierania dodatkowej siły nacisku w dół podczas usuwania, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki mózgowej i zachować nienaruszoną oponę twardą.
   UWAGA: W przypadku wystąpienia krwawienia można zastosować gąbkę hemostatyczną, aby szybko je zatrzymać.
7. Użyć pęsety z ultraprecyzyjną końcówką (<0,03 mm × 0,01 mm), aby usunąć oponę twardą w obszarze okna czaszkowego. Należy zapobiec bezpośredniemu uchwyceniu tkanki mózgowej końcówką pęsety podczas tego procesu.
   UWAGA: Po usunięciu kości bardzo ważne jest utrzymanie wilgotności tkanki mózgowej. Zaleca się stosowanie sterylnych kulek waty nasączonych solą fizjologiczną do przykrycia okna w czasie, gdy nie odbywa się żadna procedura, aby uniknąć obrzęku i uszkodzeń neuronalnych spowodowanych wysychaniem.
8. Zamocować optrodę do ramienia mikromanipulatora ramy stereotaktycznej i przesunąć ją nad okno czaszkowe. Mocno splotować srebrne przewody uziemiające i referencyjne optrody z trzema śrubami do kranioplastyki (Rycina 1C).
9. Oczyścić powierzchnię okna czaszkowego sterylną solą fizjologiczną, aby upewnić się, że nie ma krwawienia ani skrzepów krwi, które mogłyby utrudnić wprowadzenie elektrody. Powoli obniżać optrodę do pożądanej głębokości (DV: -0,94 mm) z prędkością 1 µm/s.
   UWAGA: Eksponowana tkanka korowa powinna być nawilżana sterylną solą fizjologiczną podczas implantacji.
10. Po implantacji nałożyć warstwę agarozy na okno czaszkowe, aby chronić tkankę korową przed cementem dentystycznym.
11. Nałożyć 3–4 warstwy cementu dentystycznego, aby pokryć odsłoniętą czaszkę, zapewniając stabilne zakotwiczenie całej optrody. Wyjąć mysz z ramy stereotaktycznej po stwardnieniu cementu dentystycznego (Rycina 1C).
12. Zastosować leki przeciwbólowe przez 3–5 dni i pozwolić myszy na rekonwalescencję przez 1–2 tygodnie przed rozpoczęciem rejestracji i modelowania.

4. Modelowanie fototromboticzne i jednoczesny zapis

UWAGA: Ta sekcja opisuje procedury habituacji behawioralnej, rejestracji linii bazowej, indukcji udaru za pomocą fototrombocji oraz podłużnej rejestracji po udarze. Fototrombocja jest przeprowadzana poprzez wszczepioną optrodę, podczas gdy jednocześnie utrzymywana jest rejestracja elektrofizjologiczna i fotometria światłowodowa. Wymagany główny sprzęt: aparat rotarod, miernik siły chwytu, system fotometrii światłowodowej, wielokanałowy system rejestracji aktywności neuronalnej, barwnik bengała różowego (Rose Bengal) oraz źródło laserowe o długości fali 530 nm.

1. Posiadać Myszy przechodzą trening behawioralny przed stworzeniem modelu.
   UWAGA: Wszystkie zwierzęta były utrzymywane i badane w ustandaryzowanych warunkach laboratoryjnych. Warunki utrzymania: temperatura w pomieszczeniu 20–25 °C, wilgotność względna 50%–60%, cykl światła/ciemności 12 h (włączenie światła o godzinie 07:00). Zwierzęta miały stały dostęp do pokarmu i wody przez cały okres trwania badania. Wszystkie testy i procedury chirurgiczne przeprowadzano w fazie jasnej. Sesje rejestracji zachowań odbywały się w fazie jasnej o stałej porze każdego dnia, aby zminimalizować dobowe różnice w aktywności neuronalnej i dynamice wapniowej astrocytów. W komorze rejestracyjnej utrzymywano również temperaturę otoczenia na poziomie 20–25 °C.
   1. W teście rotarod mysz powinna biegać w sposób ciągły na obracającym się pręcie przez 5 min w ciągu 3 kolejnych prób, przy czym prędkość rotacji pręta powinna wzrastać od 4 do 40 obr./min w ciągu 5 min.
   2. W teście siły chwytu należy nauczyć mysz przeciągania pręta testowego przednimi łapami, a następnie przeprowadzić trzy kolejne próby, w których wyniki będą wahać się w granicach mniej niż 10%.
2. Skonfiguruj parametry akwizycji danych dla fotometrii światłowodowej.
   1. Należy użyć systemu fotometrii światłowodowej o dwóch lub trzech długościach fali w celu wzbudzenia wskaźnika wapnia (np. GCaMP6s). W przypadku GCaMP6s należy ustawić kanał sygnałowy na 470 nm, a kanał kontrolny na 405 nm, aby skorygować artefakty ruchowe oraz autofluorescencję.
      UWAGA: Bardzo ważne jest ponowne sprawdzenie mocy lasera rejestrującego, aby upewnić się, że moc na końcówce włókna wynosi od 20 do 40 µW, co pozwoli uniknąć fotoblaknięcia i fototoksyczności.
   2. Ustaw częstotliwość próbkowania akwizycji danych na 60–100 Hz, co będzie wystarczające do zarejestrowania astrocytarnych przejściowych zmian poziomu wapnia.
3. Ustaw parametry akwizycji danych dla wielokanałowej elektrofizjologii.
   1. Należy upewnić się, że wszystkie komponenty systemu rejestracyjnego (w tym urządzenie do testu siły chwytu oraz klatka) są odpowiednio uziemione w celu zredukowania szumów. Podczas rejestracji należy zastosować wspólną referencję medianową (CMR), aby wyeliminować artefakty globalne.
      UWAGA: Bardzo ważne jest sprawdzenie widoku spektrogramu sygnału w systemie rejestracyjnym, aby upewnić się, że nie występują zakłócenia z sieci energetycznej, a szum spowodowany artefaktami ruchowymi jest zminimalizowany. Duże artefakty ruchowe mogą wskazywać na niewłaściwe zamocowanie śrub i przewodu uziemiającego podczas operacji implantacji.
   2. Należy upewnić się, że w oprogramowaniu do rejestracji wybrano sygnały szerokopasmowe (wide-band) oraz LFP, a następnie monitorować obecność wszelkich zakłóceń występujących podczas całej sesji pomiarowej.
4. Wykonaj pomiar bazowy.
   1. Krótko znieczulić izofluranem (w czasie do 60 s); podłączyć optrodę do linii rejestrującej za pomocą adaptera.
   2. Umieść mysz w środowisku przypominającym klatkę domową w celu przeprowadzenia rejestracji i zapewnij 10 minut aklimatyzacji po przebudzeniu.
   3. Nagrywanie należy przeprowadzić równolegle z testem siły chwytu; mysz musi pociągać za pasek testowy raz na minutę przez 5 min.
   4. Należy zapewnić precyzyjne oznaczenie znacznikami czasu testów behawioralnych zarówno w wielokanałowych, jak i światłowodowych systemach fotometrii, aby umożliwić synchronizację danych (Rycina 1D).
5. Ustanowienie modelu fototromboticznego.
   1. Podaj domięśniowo (i.p.) 1,5% roztwór barwnika bengały różowy w dawce 10–20 mg/kg, a następnie odczekaj 5 min, aż barwnik rozprzestrzeni się w naczyniach korowych.
      OSTRZEŻENIE: Bengala różowa jest barwnikiem fotouczulającym. Należy chronić odczynnik przed silnym światłem otoczenia. Podczas pracy z odczynnikiem należy stosować rękawice i ochronę oczu.
   2. Zanurzyć mysz w narkozie izofluranem, stosując te same parametry indukcji i utrzymania znieczulenia, które opisano wcześniej.
   3. Gdy mysz znajdzie się w głębokim stopniu znieczulenia i będzie utrzymywana w tym stanie za pomocą maski anestezjologicznej, należy podłączyć sondę optyczną optrody do źródła laserowego.
   4. Wywołaj niedokrwienie ogniskowe, dostarczając wiązkę lasera o długości fali 530 nm i mocy 15 mW poprzez implantowaną optrodę przez okres od 5 do 8 min.
      OSTRZEŻENIE: Laser o długości fali 530 nm i mocy 15 mW jest niebezpieczny. Wszyscy badacze muszą stosować ochronne okulary laserowe. Nigdy nie należy patrzeć bezpośrednio w końcówkę światłowodu podczas fototrombozy.
6. Wykonaj pomiar po udarze.
   1. Umieść mysz na podgrzewanej podkładce w celu rekonwalescencji. Gdy mysz całkowicie się obudzi (zazwyczaj w ciągu 10 min), rozpocznij pierwszy ostry pomiar po udarze.
   2. Powtarzać pomiary każdego dnia w celu ścisłego monitorowania postępu choroby.
7. Przeprowadź manipulację optogenetyczną.
   1. Oprócz rejestracji sygnałów wapniowych i emisji wiązki lasera w celu indukcji niedokrwienia, optroda umożliwia również dostarczanie stymulacji optogenetycznej, co przedstawiono na reprezentatywnych wynikach (Rysunek 4).
   2. Podłącz optrodę do stymulatora laserowego do optogenetyki o odpowiedniej długości fali i mocy lasera (w tym przypadku 488 nm, 10 mW, 5 min dla opto-vTrap), a następnie włącz stymulator, aby przeprowadzić manipulację optogenetyczną.

5. Potok analizy danych multimodalnych

UWAGA: Ta sekcja przedstawia schemat analizy dla przetwarzania wielokanałowych danych elektrofizjologicznych (sortowanie impulsów), sygnałów wapniowych astrocytów (obliczanie ΔF/F) oraz wyrównania między-modalnego dwóch strumieni danych. Wymagane oprogramowanie: Plexon Offline Sorter (oprogramowanie do offline'owego sortowania impulsów), NeuroExplorer (oprogramowanie do analizy danych neuronalnych) oraz oprogramowanie do analizy RWD OFRs (fotometrii światłowodowej).

1. Sortowanie impulsów neuronalnych (system Plexon):
   1. Zaimportuj surowe pliki .pl2 do oprogramowania do offline'owego sortowania impulsów. Zastosuj cyfrowy filtr pasmowo-wysokoprzepustowy (<300 Hz), aby wyizolować wysokoczęstotliwościową aktywność impulsową.
   2. Ustaw próg napięcia (zazwyczaj -5 odchyleń standardowych szumu), aby wykryć potencjalne impulsy.
   3. Po ręcznej weryfikacji i odrzuceniu przebiegów szumu, użyj funkcji skanowania w oprogramowaniu do offline'owego sortowania impulsów, aby przeprowadzić analizę głównych składowych (PCA) w celu pogrupowania przebiegów i wyszukania różnych klastrów neuronów²⁴.
   4. Przeanalizuj histogramy odstępów międzyimpulsowych (ISI). Upewnij się, że każda „jednostka pojedyncza” (Single Unit) ma wskaźnik naruszeń ISI <1% (co odzwierciedla okres refrakcji). Wskaźnik naruszeń ISI jest wyświetlany w lewym górnym rogu każdej jednostki w oprogramowaniu do offline'owego sortowania impulsów.
   5. Wyeksportuj posortowane znaczniki czasu do oprogramowania do analizy danych neuronalnych. Wykorzystaj funkcje histogramu częstotliwości oraz histogramów peri-zdarzeniowych w funkcji czasu w oprogramowaniu do analizy danych neuronalnych, aby wygenerować histogramy częstotliwości i peri-stymulacyjne histogramy czasu (PSTH).
   6. Z sekcji statystyk w oprogramowaniu do analizy danych neuronalnych wygeneruj średnią długość przebiegu oraz średnią częstotliwość wyładowań dla każdej jednostki do dalszej analizy.
2. Przetwarzanie sygnałów wapniowych astrocytów (oprogramowanie do analizy fotometrii światłowodowej)
   1. Otwórz surowe dane fluorescencyjne (kanał 470 nm dla sygnału i kanał 410 nm dla kontroli ruchu) w oprogramowaniu analitycznym.
   2. W sekcji pre-processing systemu fotometrii światłowodowej wykorzystaj kanał 410 nm jako kontrolę do korekcji ruchu, ustaw smoothing coefficient na 8 i wybierz PLS Fit jako metodę korekcji linii bazowej.
   3. Oblicz zmianę fluorescencji(ΔF/F) korzystając ze wzoru²⁵:
      
   4. Przeprowadź analizę sygnału wapniowego astrocytów w oparciu o znaczniki czasu zdarzeń, wyekstrahuj dane peri-zdarzeniowe do wizualizacji (np. mapy ciepła i średnie ślady) oraz oblicz pole pod krzywą (AUC).
3. Zsynchronizowana korelacja astrocyt-neuron
   1. Dopasuj impulsy neuronalne i sygnały wapniowe astrocytów, przyjmując wspólny znacznik czasu zdarzenia behawioralnego jako czas zero.
   2. Po wyekstrahowaniu danych peri-zdarzeniowych, wyrównaj oba strumienie danych do wspólnego czasu zero i zwizualizuj korelację astrocyt-neuron (Rysunek 3).

Wyniki

Harmonogram doświadczenia

Rysunek 1 przedstawia harmonogram eksperymentu oraz kluczowe punkty orientacyjne operacji. Trzytygodniowy odstęp między iniekcją wirusa a implantacją optrody jest krytyczny dla uzyskania odpowiedniej ekspresji GCaMP6s; silne sygnały wapniowe astrocytów należy potwierdzić, analizując ślady fotometrii włókienkowej podczas okresu rejestracji bazowej przed indukcją udaru.

Wielowymiarowa wer...

Dyskusja

Opisany tutaj zintegrowany protokół stanowi znaczącą nowość w badaniach nad interakcjami astrocytów i neuronów w trakcie progresji udaru niedokrwiennego. Łącząc indukcję fototrombotyczną z monitorowaniem opto-elektrofizjologicznym w czasie rzeczywistym i manipulacją optogenetyczną, ta metoda skutecznie łączy moment wystąpienia udaru z obserwacją reorganizacji układów neuronów i astrocytów na poziomie obwodów. Niedawny wkład zespołu Boyce i wsp. potwierdził wykonalność łączenia pomiaru fotometrii włókienniczej i rejestrac...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2% TTC Staining Solution	Solarbio	G3005
Agorose	Biosharp	BS081
Body Temperature Maintenance System / Homeothermic Monitor	RWD life Science	69002
Cranial Screws	Zhongke Huida	23092007
Data Acquisition and Analysis Software(Fiber photometry)	RWD life Science	ORFs
Data Acquisition and Analysis Software(Multi-channel electrophysiology)	Plexon	PlexControl, Offline Sorter, Neuroexplorer
Digital laboratory stereotactic frame	RWD life Science	68804
Forcep	FST	11252-00	Forcep diameter 0.005 mm ´ 0.025 mm
Laser power meter	Sanwa	LP10
Laser Speckle Blood Flow Imaging System	Pericam AB	Pericam PSI NR
Mice	Risemice	C57BL/6J
Miniature handheld cranial drill	RWD life Science	78001
Mouse Viral Micro-injector	RWD life Science	68025
Optrode	Customized	Kedou	Customized with 16 tungsten electrode surrounding 1 optical fiber
Prism	GraphPad	5.01 version
R studio	Posit	version 4.4.1
rAAV-GfaABC1D-GCaMP6s	BrainVTA	PT-2560	Astrocyte-specific calcium indicator
rAAV-GfaABC1D-opto-vTrap	BrainCase	BC-2446	Astrocyte-specific optogenetic viral vector
Rose Bengal Dye	Sigma-Aldrich	198250	Photosensitive dye for thrombus induction/Sigma-Aldrich
Trolley-mounted anesthesia workstation	RWD life Science	R520	Anesthesia machine for controllable inhalation anesthesia for mice