Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł badawczy

Dysfunkcja bariery jelitowej pośredniczona przez NEAT1 poprzez wiązanie miR-29b-3p w komórkach Caco-2 uszkodzonych lipopolisacharydem

105 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71021

⸱

14 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Heyuan Street Community Healthcare Center of Heilongjiang Province Daqing City Datong District, 2Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Hebei Medical University, 3Department of Gastroenterology, Shanghai Pudong New Area People's Hospital, 4Department of organ Transplantation, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Third Hospital of Shanxi Medical University, Tongji Shanxi Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym badaniu oceniono NEAT1 jako marker diagnostyczny i regulator dysfunkcji bariery jelitowej w zespole jelita drażliwego z przewagą biegunek. Poziom NEAT1 był podwyższony w surowicy pacjentów, wiązał miR-29b-3p, a jego wyciszenie poprawiło wskaźniki szczelności bariery, apoptozy i stanu zapalnego w komórkach Caco-2 uszkodzonych lipopolisacharydem.

Streszczenie

Patogeneza zespołu jelita drażliwego z biegunką (IBS-D) nie jest jasna, a dostępne terapie pozostają ograniczone. W niniejszym badaniu oceniono wartość diagnostyczną NEAT1 w IBS-D oraz zbadano jego potencjalny mechanizm regulacyjny. Do badania włączono łącznie 116 pacjentów z IBS-D oraz 116 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Poziomy NEAT1 i miR-29b-3p w surowicy oznaczono za pomocą ilościowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR), a do oceny wartości diagnostycznej wykorzystano krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC). W celu przeprowadzenia badań nad mechanizmami opracowano model komórek nabłonka jelitowego Caco-2 traktowanych lipopolisacharydem (LPS). Żywotność komórek oceniono za pomocą testu Cell Counting Kit-8 (CCK-8), apoptozę za pomocą cytometrii przepływowej, integralność bariery za pomocą transepitelialnego oporu elektrycznego (TEER), a poziomy mRNA ZO-1, okludyny i klaudyny-2 za pomocą RT-qPCR. Do weryfikacji relacji wiązania między NEAT1 a miR-29b-3p wykorzystano test podwójnego reportera lucyferazy (DLR) oraz immunoprecypitację RNA (RIP). U pacjentów z IBS-D stwierdzono wysoką ekspresję NEAT1 i niską ekspresję miR-29b-3p, a ich poziomy wykazywały silną ujemną korelację. Wyciszenie NEAT1 zwiększyło poziomy miR-29b-3p, poprawiło żywotność komórek i TEER, zmniejszyło apoptozę, zwiększyło poziomy mRNA ZO-1 i okludyny, obniżyło poziomy mRNA klaudyny-2 oraz złagodziło wskaźniki związane z uszkodzeniem bariery w komórkach Caco-2 traktowanych LPS. Wspólnie wyniki te wskazują, że NEAT1 w surowicy jest potencjalnym biomarkerem IBS-D, a oś NEAT1/miR-29b-3p może być zaangażowana w dysfunkcję bariery jelitowej.

Wprowadzenie

Zespół jelita drażliwego z biegunką (IBS-D) jest powszechnym czynnościowym zaburzeniem żołądkowo-jelitowym charakteryzującym się bólem brzucha, wzdęciami oraz zaburzeniami rytmu wypróżnień1. Obecnie mechanizm patofizjologiczny IBS-D nie został w pełni wyjaśniony2. Metody leczenia opierają się głównie na łagodzeniu objawów, co wiąże się z ograniczoną skutecznością i wysokim wskaźnikiem nawrotów3. Powszechnie uważa się, że w IBS-D zaangażowany jest oddziaływanie wielu czynników, takich jak rozregulowanie osi mózgowo-jelitowej, nadwrażliwość trzewna, niskostopniowy stan zapalny jelit oraz dysfunkcja bariery jelitowej4,5. Chociaż kryteria te w pewnym stopniu ustandaryzowały diagnostykę, mają one charakter subiektywny i mogą prowadzić do opóźnień w diagnozie lub błędnej klasyfikacji, szczególnie gdy objawy pacjenta nakładają się na objawy nieswoistych zapaleń jelit lub innych chorób organicznych. W rutynowej praktyce klinicznej obecnie nie istnieją zwalidowane obiektywne biomarkery IBS-D. W związku z tym poszukiwanie nowego celu molekularnego, który mógłby służyć jako narzędzie diagnostyczne i posiadać potencjalną wartość terapeutyczną, stało się pilną potrzebą w obecnym obszarze badań nad IBS-D.

W ostatnich latach długie niekodujące RNA, będące kluczowymi cząsteczkami w regulacji epigenetycznej, wykazały ogromny potencjał jako markery diagnostyczne i cele terapeutyczne w wielu chorobach6,7. Główną przyczyną IBS-D jest upośledzenie funkcji bariery jelitowej8. Destrukcja białek połączeń ścisłych prowadzi do "przeciekania jelit", co z kolei aktywuje odpowiedź immunologiczną śluzówki9,10. Aktywacja układu odpornościowego uwalnia liczne czynniki prozapalne, które mogą powodować dysfunkcję jelit poprzez aktywację jelitowego układu odpornościowo-nerwowego. Badania wykazały, że niektóre lncRNA mogą regulować barierę nabłonkową jelit11,12. Wykazano, że NEAT1 ulega nadekspresji w tkance śluzówki okrężnicy u pacjentów z zapaleniem jelit13. Hamowanie lncRNA NEAT1 może łagodzić dysfunkcję komórek nabłonka jelitowego (IECs) w wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego14. Jednakże profil ekspresji NEAT1 w IBS-D oraz jego wartość diagnostyczna nie zostały jeszcze zbadane. Ponadto NEAT1 może mieć potencjał jako biomarker diagnostyczny15. Jeśli NEAT1 wykazuje nieprawidłową ekspresję w surowicy pacjentów z IBS-D, mogłoby to uzupełnić obecne kryteria Rome IV poprzez dostarczenie molekularnego narzędzia diagnostycznego. Jednocześnie profil ekspresji miRNA uległ również znacznym zmianom u pacjentów z IBS. Na przykład obniżenie ekspresji miR-29b-3p powiązano z patogenezą IBS16. Jednakże mechanizmy regulacji nadrzędnej sterujące ekspresją miR-29b-3p w IBS-D pozostają całkowicie nieznane. W szczególności rola NEAT1 jako konkurencyjnego endogennego RNA (ceRNA) dla miR-29b-3p w kontekście IBS-D nigdy nie była badana, mimo że mechanizm ten został dobrze opisany w innych chorobach17,18. Ponadto, podczas gdy wcześniejsze badania koncentrowały się głównie na ekspresji na poziomie tkankowym, potencjał krążącego NEAT1 jako nieinwazyjnego biomarkera surowiczego do diagnostyki IBS-D pozostaje całkowicie nieznany.

Stawiamy hipotezę, że lncRNA-NEAT1 może uczestniczyć w regulacji funkcji bariery jelitowej w IBS-D, działając jako ceRNA, który wyłapuje miR-29b-3p. W oparciu o powyższe tło badawcze, celem niniejszej pracy jest: (1) ocena poziomów NEAT1 oraz miR-29b-3p w surowicy pacjentów z IBS-D i ich wartości diagnostycznej; (2) walidacja bezpośredniej interakcji wiążącej między NEAT1 a miR-29b-3p; oraz (3) wyjaśnienie funkcjonalnej roli osi NEAT1/miR-29b-3p w regulacji integralności bariery jelitowej i stanu zapalnego z wykorzystaniem modelu komórek Caco-2 traktowanych LPS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Kryteria włączenia pacjentów

Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną zgodę po pełnym zapoznaniu się z treścią badania. Komitet Etyki Szpitala Ludowego w Nowej Dzielnicy Pudong w Szanghaju przeanalizował i zatwierdził niniejszy protokół badawczy (nr 2024k007). Wielkość próby obliczono za pomocą programu G*Power: wybranym testem był test t, a test statystyczny zaprojektowano w celu wykrycia różnic między dwiema niezależnymi próbkami. Przy wielkości efektu d = 0,5, α = 0,05 i mocy = 0,9, obliczenia wskazały, że do każdej grupy należy włączyć minimum 86 osób. Aby uwzględnić potencjalne nieprzewidziane okoliczności podczas badania, do każdej grupy włączono 116 pacjentów. W badaniu wzięło udział łącznie 116 pacjentów z IBS-D, którzy odwiedzili Szpital Ludowy w Nowej Dzielnicy Pudong w Szanghaju między lipcem 2024 a lipcem 2025 roku, stanowiących grupę eksperymentalną. Kryteria włączenia obejmowały: (1) IBS-D spełniający kryteria diagnostyczne Rzym IV; (2) kolonoskopię niewykazującą zmian organicznych w błonie śluzowej. Kryteria wykluczenia: (1) pacjenci z nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD), rakiem jelita grubego itp.; (2) pacjenci z cukrzycą; (3) pacjenci po niedawnych operacjach jamy brzusznej; oraz (4) pacjenci z ciężką niewydolnością serca, wątroby lub nerek. Jednocześnie do grupy kontrolnej zrekrutowano 116 zdrowych ochotników, których charakterystyka demograficzna, taka jak wiek i płeć, była zgodna z charakterystyką pacjentów. Potwierdzono, że zdrowe osoby kontrolne nie miały w wywiadzie przewlekłych chorób przewodu pokarmowego ani odpowiadających im objawów klinicznych. Od wszystkich badanych pobrano pięć mililitrów krwi z żyły obwodowej. Następnie nadsącz przeniesiono do zamrażarki niskotemperaturowej w temperaturze -80 °C w celu krio konserwacji przed późniejszą ekstrakcją RNA.

Każdy uczestnik wypełnił 10-dniowy kwestionariusz w celu odnotowania następujących objawów klinicznych: (a) ocena nasilenia bólu brzucha przy użyciu 10-stopniowej wizualno-analogowej skali VAS; (b) częstotliwość występowania bólu brzucha w okresie badania (liczba dni z bólem); (c) częstotliwość wypróżnień (maksymalna liczba wypróżnień na dobę); (d) Bristol Faecal Traits Scale w celu oceny konsystencji stolca. Stan emocjonalny badanych oceniono za pomocą Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS).

Hodowla komórkowa i modelowanie

Komórki Caco-2 hodowano rutynowo w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny i streptomycyny, w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂. Linia komórkowa Caco-2 ulega spontanicznemu różnicowaniu w spolaryzowaną monowarstwę komórek z połączeniami ścisłymi i mikrokosmkami, wykazując cechy morfologiczne i funkcjonalne podobne do dojrzałych komórek nabłonka jelitowego. LPS wywołuje odpowiedź zapalną i zaburza połączenia ścisłe w nabłonku jelitowym, zwiększając przepuszczalność jelit — proces ten jest bardzo podobny do cech patologicznych IBS-D. Ponadto, biorąc pod uwagę, że komórki Caco-2 traktowane LPS były szeroko stosowane w poprzednich badaniach19,20,21 do modelowania dysfunkcji bariery i stanu zapalnego związanego z IBS, w niniejszym badaniu wybrano traktowanie komórek Caco-2 lipopolisacharydem (LPS) w celu stworzenia modelu in vitro IBS-D. Po osiągnięciu przez komórki konfluencji na poziomie około 80%, pożywkę hodowlaną zastąpiono pożywką kompletną zawierającą 5 µg/ml LPS22, a komórki stymulowano przez 24 h. Jako grupę kontrolną wykorzystano komórki hodowane konwencjonalnie, bez dodatku LPS.

Transfekcja komórek

W celu zbadania roli NEAT1 oraz miR-29b-3p w komórkach Caco-2 przeprowadzono transfekcję tych komórek. Komórki podzielono na sześć grup w następujący sposób: 1. grupa kontrolna (bez traktowania); 2. grupa LPS; 3. grupa LPS + si-NC; 4. grupa LPS + si-NEAT1; 5. grupa LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC; oraz 6. grupa LPS + si-NEAT1 + inhibitor miR-29b-3p. Zaprojektowano i zsyntetyzowano dwa małe interferujące RNA (si-NEAT1) celujące w NEAT1: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) oraz si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). Jako kontrolę negatywną zastosowano siRNA o niecelującej, losowej sekwencji (si-NC). Jednocześnie zsyntetyzowano inhibitor miR-29b-3p oraz jego kontrolę negatywną. Inhibitor miR-29b-3p: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Kontrola negatywna: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Komórki Caco-2 wysiano na płytki 24-dołkowe i transfekowano zgodnie z protokołem producenta po osiągnięciu przez hodowle 60–70% konfluencji. W skrócie, 1,25 µL siRNA rozcieńczono w 25 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy, aby uzyskać końcowe stężenie siRNA wynoszące 50 nM. W celu inhibicji miRNA, 2 µL inhibitora miR-29b-3p lub kontroli negatywnej rozcieńczono w 25 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy do stężenia końcowego 100 nM. Oddzielnie 1,5 µL odczynnika do transfekcji zmieszano z 25 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy. Następnie rozcieńczone siRNA (lub inhibitor/kontrolę negatywną) zmieszano z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji w celu utworzenia kompleksu transfekcyjnego, który dodawano do komórek kroplami. Sześć godzin po transfekcji mieszaninę transfekcyjną zastąpiono świeżą pożywką kompletną, a komórki inkubowano przez kolejne 48 h przed wykonaniem dalszych testów funkcjonalnych. Efektywność knockdownu lub inhibicji potwierdzono za pomocą RT-qPCR przed przystąpieniem do kolejnych eksperymentów.

Ilościowa polimeraza łańcuchowa w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR)

Całkowite RNA wyizolowano z próbek surowicy oraz komórek Caco-2 poddanych wskazanym zabiegom. W skrócie, każdą próbkę lizowano za pomocą 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA, a następnie połączono z 200 µL chloroformu. Po wirowaniu przy 12 000 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C, górną fazę wodną przeniesiono do nowej probówki, wymieszano z 500 µL izopropanolu i przechowywano w temperaturze −20 °C przez 30 min. Następnie próbki odwirowano przy 12 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Otrzymany osad RNA przemyto dwukrotnie 75% etanolem, wysuszono na powietrzu i zawieszono ponownie w 20 µL wody wolnej od RNaz. Wydajność i czystość RNA zmierzono za pomocą mikrospektrofotometru, a do dalszych analiz wybrano wyłącznie próbki o A260/A280 stosowano wartości od 1,8 do 2,0. RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA zgodnie z protokołem producenta. W celu detekcji NEAT1, ZO-1, okludyna, claudyna-2, i GAPDHDo każdej reakcji odwrotnej transkrypcji o objętości 20 µL wykorzystano 1 µg całkowitego RNA, a mieszanina zawierała 1× bufor RT, 0,5 mM dNTP, 0,5 µM starter oligo(dT), 200 U odwrotnej transkryptazy oraz wodę wolną od RNaz. Reakcję przeprowadzono w temperaturze 37 °C przez 15 min, a następnie inaktywowano enzym w temperaturze 85 °C przez 5 s.

Ilościową reakcję PCR przeprowadzono z użyciem cDNA jako matrycy, wykorzystując system real-time PCR oparty na SYBR Green. Poziomy ekspresji NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludin, oraz claudin-2 zmierzono za pomocą starterów specyficznych dla danych genów. U6 służył jako gen referencyjny dla miR-29b-3p, natomiast GAPDH wykorzystano do normalizacji NEAT1 oraz genów związanych z połączeniami ścisłymi. Względną ekspresję obliczono metodą 2−ΔΔCt. Sekwencje starterów przedstawiono w Tabeli 1.

Test żywotności komórek

Komórki Caco-2 w fazie logarytmicznego wzrostu wysiano do płytek 96-dołkowych w zagęszczeniu 1 × 104 komórek na dołek. Utworzono grupę kontrolną pustą (zawierającą tylko pożywkę hodowlaną), grupę kontrolną (komórki niepoddane działaniu czynników) oraz grupę doświadczalną (komórki Caco-2 w różnych warunkach traktowania), z 5–6 dołkami powtórzonymi w każdej grupie. Komórki przydzielono do czterech punktów czasowych: 0, 24, 48 i 72 h. Dla każdego punktu czasowego przygotowano oddzielną płytkę hodowlaną, aby uniknąć wielokrotnego otwierania inkubatora podczas pomiarów. Po okresie hodowli do każdego dołka dodano 10 µL roztworu CCK-8, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Następnie płytkę hodowlaną przeniesiono do inkubatora w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂ i inkubowano w ciemności przez 2 h. Absorbancję każdego dołka zmierzono natychmiast przy 450 nm za pomocą czytnika płytek mikrodołkowych. Ostatecznie żywotność komórek wyrażono jako wartość procentową.

Analiza apoptozy komórek

Apoptozę ilościowo określono za pomocą cytometrii przepływowej po barwieniu Annexin V-FITC/PI. Komórki Caco-2 z każdej grupy badawczej zebrano i dwukrotnie przemyto lodowatym PBS. Wirowanie przeprowadzono przy 300 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Osad komórkowy resuspendowano w 100 µL 1× buforu wiążącego, a następnie kolejno dodano 5 µL Annexin V-FITC oraz 5 µL PI. Po delikatnym wymieszaniu próbki inkubowano przez 15 min w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie dodano 300 µL 1× buforu wiążącego i zawiesinę ostrożnie wymieszano przed przeniesieniem do probówki do cytometrii przepływowej o pojemności 5 mL. Próbki analizowano metodą cytometrii przepływowej w ciągu 1 h.

Transepitelialna oporność elektryczna (TEER)

Przepuszczalność oceniono poprzez pomiar wartości TEER komórek Caco-223. Komórki Caco-2 zaszczepiono w komorach Transwell i inkubowano przez 21 dni w celu utworzenia gęstej monowarstwy. W każdej z warunków eksperymentalnych przeprowadzono sześć niezależnych powtórzeń biologicznych oraz pięć powtórzeń technicznych. Przed i po zastosowaniu zabiegu eksperymentalnego zmierzono wartości TEER dla każdej grupy za pomocą miernika oporności błonowej, używając elektrod wysterylizowanych etanolem i zrównoważonych w PBS. W skrócie, dłuższy pręt elektrody zanurzono w pożywce hodowlanej po stronie bazolateralnej, a krótszy w pożywce po stronie apikalnej, aby uniknąć kontaktu z membraną filtra. Po stabilizacji odczytano wartość oporności (Ω), a pomiary powtarzano do uzyskania trzech spójnych odczytów. W tych samych warunkach zmierzono oporność pustych filtrów Transwell (bez komórek), a wartość tę odjęto od wszystkich odczytów eksperymentalnych. TEER (Ω·cm2) = (oporność próbki – oporność tła) × efektywna powierzchnia membrany. Dane przedstawiono jako: (grupa eksperymentalna/grupa kontrolna) × 100%.

Test immunoenzymatyczny (ELISA)

Nadbudówki z hodowli komórek Caco-2 z różnych grup badawczych zebrano po 24 h inkubacji. Poziomy cytokin prozapalnych, w tym czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF-α), interleukiny-6 (IL-6), interleukiny-8 (IL-8) oraz interleukiny-1β (IL-1β), zmierzono przy użyciu komercyjnych zestawów ELISA zgodnie z instrukcją producenta. Analizę przeprowadzono ściśle według wytycznych. Próbki i wzorce naniesiono do studzienek uprzednio pokrytych przeciwciałami, następnie inkubowano i przemyto. Następnie dodano biotynilowane przeciwciało detekcyjne. Po kolejnej inkubacji i przemyciu dodano streptawidynę znakowaną peroksydazą chrzanową. Na koniec w celu wywołania zabarwienia dodano substrat TMB, a reakcję przerwano za pomocą roztworu stop. Absorbancję każdej studzienki zmierzono niezwłocznie przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.

Western blot

Białka wyizolowano z komórek Caco-2 po wskazanych traktowaniach, wykorzystując bufor RIPA zawierający inhibitory proteaz. Poziom białek zmierzono za pomocą testu kwasu bicinchononowego (BCA). Dla każdej próbki na każdą ścieżkę naniesiono 30 µg białka, które rozdzielono w 10% żelach SDS-PAGE, a następnie przeniesiono na membrany PVDF. Membrany blokowano w 5% beztłuszczowym mleku przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałami przeciwko ZO-1 (1:1,000), okludynie (1:500), klaudynie-2 (1:1,000) oraz GAPDH (1:5,000). Po przemyciu membrany inkubowano z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP przez 1 h w temperaturze pokojowej. Prążki wykryto za pomocą wzmocnionej chemiluminescencji (ECL), a intensywność prążków przeanalizowano przy użyciu programu ImageJ. GAPDH służyło jako kontrola załadunku.

Test reporterowy z podwójną lucyferazą (DLR)

Potencjalne miejsca wiązania miR-29b-3p z sekwencją NEAT1 przewidziano za pomocą bazy danych ENCORI (https://rnasysu.com/encori/). Następnie fragmenty NEAT1 zawierające miejsca wiązania typu dzikiego (WT) lub zmutowane (MUT) sklonowano do wektora reporterowego pmirGLO. Skonstruowany plazmid rekombinowany ko-transfekowano do komórek wraz z mimetykami miR-29b-3p (Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) lub inhibitorami oraz ich odpowiednimi kontrolami negatywnymi (mimic NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’). Czterdzieści osiem godzin po transfekcji zebrano komórki, a aktywność lucyferazy świetlika oraz lucyferazy renilli określono przy użyciu odczynnika do detekcji podwójnej lucyferazy. Aktywność lucyferazy renilli wykorzystano jako wewnętrzny punkt odniesienia do standaryzacji.

Analiza immunoprecypitacji RNA (RIP)

Do analizy RIP wykorzystano zebrane komórki Caco-2, które przepłukano PBS i inkubowano na lodzie przez 15 min w 200 µL buforu do lizy RIP uzupełnionego o inhibitory proteaz i RNaz. Lizaty komórkowe wirowano przy 16 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C, a 10 µL każdego supernatantu zachowano jako kontrolę wejściową. W celu przeprowadzenia immunoprecypitacji 40 µL magnetycznych kulek Protein A/G rotowano z 5 µg przeciwciała anty-Ago2 lub normalnego IgG w 200 µL buforu do przemywania RIP przez 30 min w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym przemyciu 500 µL buforu do przemywania RIP, 100 µL zawiesiny kulek połączono z 100 µL lizatu, uzupełniono buforem do przemywania RIP do końcowej objętości 1 mL i inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z rotacją. Następnie kulki przemyto pięciokrotnie 500 µL buforu do przemywania RIP i resuspendowano w 150 µL tego samego buforu. Trawienie białek przeprowadzono poprzez dodanie 15 µL proteinazy K (20 mg/mL) i 15 µL 10% SDS, a następnie inkubowano w 55 °C przez 30 min z wstrząsaniem. Zebrano supernatant, a RNA wyizolowano za pomocą odczynnika do ekstrakcji i wytrącono przez noc. Wzbogacenie NEAT1 i miR-29b-3p oceniono następnie za pomocą RT-qPCR.

Analiza lokalizacji subkomórkowej

Komórki Caco-2 rozdzielono na frakcje jądrowe i cytoplazmatyczne przy użyciu wspomnianego, dostępnego komercyjnie odczynnika do separacji jądrowo-cytoplazmatycznej, zgodnie z instrukcjami producenta. Z obu tych komponentów wyekstrahowano całkowite RNA, a rozkład NEAT1 w jądrze i cytoplazmie wykryto za pomocą RT-qPCR. Kalibrację przeprowadzono z wykorzystaniem mRNA U6 (dominującego w jądrze) oraz GAPDH (dominującego w cytoplazmie) jako wskaźników wydajności separacji.

Analiza statystyczna

W przypadku klinicznych próbek surowicy analiza mocy (t-test, d = 0.5, α = 0.05, moc = 0.9) wykazała, że wymagane jest minimum 86 osób w grupie. Aby uwzględnić potencjalne nieprzewidziane okoliczności podczas badania, do każdej grupy włączono 116 pacjentów w celu wykrycia istotnych klinicznie różnic. Normalność rozkładu danych dla zmiennych ciągłych oceniono za pomocą testu Shapiro-Wilka. Ponieważ wszystkie dane ciągłe miały rozkład normalny (P > 0.05), zastosowano analizy parametryczne. Zmienne kategoryczne analizowano za pomocą testu chi-kwadrat. Eksperymenty na komórkach obejmowały sześć niezależnych powtórzeń biologicznych, z pięcioma powtórzeniami technicznymi dla każdego powtórzenia biologicznego. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Porównania między dwiema grupami zmiennych ciągłych przeprowadzono za pomocą testu t Studenta, natomiast porównania między wieloma grupami analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA, a następnie testu post hoc Tukeya. Istotność statystyczną zdefiniowano jako P < 0.05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ekspresja NEAT1 i wartość diagnostyczna

W porównaniu z grupą zdrowej kontroli (HC), poziomy ekspresji NEAT1 u pacjentów z IBS-D były znacznie wyższe (P < 0,0001; Rysunek 1A). Powierzchnia pod krzywą (AUC) dla NEAT1, wyznaczona na podstawie krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), wyniosła 0,867 (95% CI: 0,821–0,913). Specyficzność wyniosła 75,9%, natomiast czułość 84,5% (Rysu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

IBS-D jest powszechnym funkcjonalnym zaburzeniem żołądkowo-jelitowym. Jego mechanizm patologiczny nie został w pełni wyjaśniony. W ostatnich latach lncRNA, jako kluczowe cząsteczki w regulacji epigenetycznej, wykazują duży potencjał w dziedzinie diagnostyki i leczenia chorób. LncRNA NEAT1 badano w kontekście różnych schorzeń, takich jak rak jelita grubego24, glejak25 oraz zawał mięśnia sercowego26. Liczne badania wykazały, że NEAT1 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 24-dołkoweCorningCLS3524Do wysiewania komórek
Płytki 96-dołkoweCorningCLS3599Do wysiewania komórek w testach CCK-8
Zestaw do badania apoptozy Annexin V-FITC/PIInvitrogenV13242Do oznaczania poziomu apoptozy
Przeciwciało monoklonalne przeciwko AGO2Proteintech67934-1-IgDo immunoprecypitacji kompleksów RNA związanych z Ago2
Przeciwciało przeciwko Klaudynie-2Invitrogen32-5600Przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało przeciwko GAPDHCell Signaling Technology5174Przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:5000; kontrola ładowania
Przeciwciało przeciwko ludzkim IgGProteintech10284-1-APStosowane jako kontrola negatywna w analizie RIP
Przeciwciało przeciwko OkludynieAbcamab31721Przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:500
Przeciwciało przeciwko ZO-1Proteintech21773-1-APPrzeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:1000
Komórki Caco-2SUNNCELLSNL-068Do tworzenia modeli bariery nabłonka jelitowego
Zestaw CCK-8SolarbioCA1210Zestaw do analizy proliferacji komórek
ChloroformSigma-AldrichC2432Do rozdziału faz podczas ekstrakcji RNA
Pożywka DMEMGibco11965092Do hodowli komórek
Zestaw do analizy Dual-Luciferase ReporterThermoFisher16186Do oznaczania aktywności lucyferazy
Zestaw ELISA (dla IL-1β)R&D SystemsDY201Do oznaczania białek docelowych w nadsączach hodowli komórkowych
Zestaw ELISA (dla IL-6)R&D SystemsD6050BDo oznaczania białek docelowych w nadsączach hodowli komórkowych
Zestaw ELISA (dla IL-8)R&D SystemsNBP3-28022Do oznaczania białek docelowych w nadsączach hodowli komórkowych
Zestaw ELISA (dla TNF-α)R&D SystemsDTA00DDo oznaczania białek docelowych w nadsączach hodowli komórkowych
Substrat do wzmocnionej chemiluminescencji (ECL)Thermo Fisher32106Do wizualizacji prążków białkowych
Etanol (75%)Sigma-Aldrich459844Do przemywania osadu RNA
FBS (płodowa surowica bydlęca)Gibco10099141Do hodowli komórek
Cytometr przepływowyBeckman CoulterB53002Do oznaczania poziomu apoptozy
Przeciwciała wtórne sprzężone z HRPCell Signaling Technology7074Katalizują generowanie sygnału chemiluminescencyjnego z substratów ECL
IzopropanolSigma-Aldrich1133502500Do precypitacji RNA
Lipofectamine 3000ThermoFisherL3000015Odczynnik do transfekcji
Lipopolisacharyd (LPS)Sigma-AldrichL2880Do indukowania tworzenia modelu komórkowego
Czytnik mikropłytekBioTekEpoch 2Do pomiaru absorbancji próbek w płytkach 96-dołkowych
Mikrospektrofotometr NanodropThermo ScientificND-2000CDo oznaczania stężenia i czystości RNA
Odtłuszczone mleko w proszkuCoolaberCN7861Do blokowania membran (roztwór 5%)
Zestaw PARISThermo FisherAM1921Do frakcjonowania jądrowo-cytoplazmatycznego
Penicylina–StreptomycynaGibco15140122W celu ochrony hodowli komórkowych przed kontaminacją
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Fisher23225Do oznaczania stężeń białek
Wektor Dual-Luciferase pmirGLOPromegaE1330Wektor reporterowy z podwójną lucyferazą
Zestaw odczynników PrimeScript RTTakaraRR047ADo odwrotnej transkrypcji RNA do cDNA
Membrana PVDFMilliporeIPVH00010Do transferu białek po SDS-PAGE
System do ilościowego PCR w czasie rzeczywistym z detekcją fluorescencyjnąApplied Biosystems4365464Do oznaczania genów docelowych
Bufor do lizy RIPA (z inhibitorami proteaz)Thermo Fisher89901Do ekstrakcji białek całkowitych z komórek
Zestaw do immunoprecypitacji białek wiążących RNASigma-Aldrich17-701Analiza immunoprecypitacji białek wiążących RNA (RIP) z użyciem magnetycznych kulek Protein A/G
Odczynniki do SDS-PAGE (żel 10%)TargetMolC0189Do rozdziału białek według masy cząsteczkowej
SYBR Green master mixThermo Fisher4309155Do stosowania w testach PCR
Miernik TEER (woltomierz)MilliporeMERS00002Miernik oporu przezbłonowego, do pomiaru integralności warstwy pojedynczej
Komory TranswellCorning CostarCLS3413Do hodowli monowarstw komórek i pomiaru TEER
Odczynnik TRIzolInvitrogen15596026CNDo ekstrakcji całkowitego RNA

Bibliografia

  1. Ren M, Ma J, Qu M. Network pharmacology integrated with molecular docking and molecular dynamics simulations to explore the mechanism of Shaoyao Gancao Tang in the treatment of asthma and irritable bowel syndrome. Medicine (Baltimore). 2024;103(50).
  2. Zhao C, Zhou X, Shi X. The influence of Nav1.9 channels on intestinal hyperpathia and dysmotility. Channels (Austin). 2023;17(1):2212350.
  3. Jiang J, et al. Effectiveness of Tong-Xie-Yao-Fang combined with Si-Ni-San for irritable bowel syndrome: a protocol for systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2021;100(11).
  4. Lenoir M, Wienke J, Fardao-Beyler F, Roese N. An 8-week course of Bifidobacterium longum 35624 is associated with a reduction in the symptoms of irritable bowel syndrome. Probiotics Antimicrob Proteins. 2025;17(1):315-27.
  5. Tao E, et al. Early life stress induces irritable bowel syndrome from childhood to adulthood in mice. Front Microbiol. 2023;14:1255525.
  6. Biswas S, et al. Expressions of serum lncRNAs in diabetic retinopathy: a potential diagnostic tool. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:851967.
  7. Li W, et al. Functional roles of non-coding RNAs in panvascular diseases. J Vis Exp. 2025;(226).
  8. Shin SY, et al. The effect of phloroglucinol in patients with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J Neurogastroenterol Motil. 2020;26(1):117-27.
  9. Yang S, et al. Ginseng-derived nanoparticles alleviate inflammatory bowel disease via the TLR4/MAPK and p62/Nrf2/Keap1 pathways. J Nanobiotechnology. 2024;22(1):48.
  10. Zhang J, et al. Role of the gut microbiota in complications after ischemic stroke. Front Cell Infect Microbiol. 2024;14:1334581.
  11. Chen S, et al. The role of lncRNAs in regulating the intestinal mucosal mechanical barrier. Biomed Res Int. 2021;2021:2294942.
  12. Lu Q, et al. The role of long noncoding RNAs in intestinal health and diseases: a focus on the intestinal barrier. Biomolecules. 2023;13(11):1674.
  13. Li F, et al. Knockdown of long non-coding RNA NEAT1 relieves inflammation of ulcerative colitis by regulating the miR-603/FGF9 pathway. Exp Ther Med. 2022;23(2):131.
  14. Ni S, Liu Y, Zhong J, Shen Y. Inhibition of lncRNA NEAT1 alleviates intestinal epithelial cells dysfunction in ulcerative colitis by maintaining the homeostasis of the glucose metabolism through the miR-410-3p-LDHA axis. Bioengineered. 2022;13(4):8961-71.
  15. Aparicio P, et al. Serum lncRNAs NEAT1, PVT1 and H19 as novel biomarkers for sarcopenia diagnosis and treatment response. Noncoding RNA Res. 2025;14:166-76.
  16. Martínez C, et al. miR-16 and miR-125b are involved in barrier function dysregulation through the modulation of claudin-2 and cingulin expression in the jejunum in IBS with diarrhoea. Gut. 2017;66(9):1537-8.
  17. Che F, et al. Lnc NEAT1/miR-29b-3p/Sp1 form a positive feedback loop and modulate bortezomib resistance in human multiple myeloma cells. Eur J Pharmacol. 2021;891:173752.
  18. Zhang Y, et al. LncRNA NEAT1/miR-29b-3p/BMP1 axis promotes osteogenic differentiation in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Pathol Res Pract. 2019;215(3):525-31.
  19. Ludidi S, et al. The intestinal barrier in irritable bowel syndrome: subtype-specific effects of the systemic compartment in an in vitro model. PLoS One. 2015;10(5).
  20. Fan Z, et al. Investigation of the biomarkers and mechanism based on endoplasmic reticulum stress in irritable bowel syndrome. Arab J Gastroenterol. 2025;26(4):337-46.
  21. Zhang H, Xiong Z, He Y, Su H, Jiao Y. Cimifugin improves intestinal barrier dysfunction by upregulating SIRT1 to regulate the NRF2/HO-1 signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(3):2897-908.
  22. Zhang Y, et al. Decreased expression of microRNA-510 in intestinal tissue contributes to post-infectious irritable bowel syndrome via targeting PRDX1. Am J Transl Res. 2019;11(12):7385-97.
  23. Li BR, et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. J Vis Exp. 2018;(140).
  24. Zhang M, et al. The lncRNA NEAT1 activates Wnt/β-catenin signaling and promotes colorectal cancer progression via interacting with DDX5. J Hematol Oncol. 2018;11(1):113.
  25. Liang J, Liu C, Xu D, Xie K, Li A. LncRNA NEAT1 facilitates glioma progression via stabilizing PGK1. J Transl Med. 2022;20(1):80.
  26. Yu Q, et al. Silencing of lncRNA NEAT1 alleviates acute myocardial infarction by suppressing miR-450-5p/ACSL4-mediated ferroptosis. Exp Cell Res. 2024;442(2):114217.
  27. Gong Z, Zhang Y, Jiang Y, Chen P, Ji J. LncRNA NEAT1 targets miR-342-3p/CUL4B to inhibit the proliferation of cutaneous squamous cell carcinoma cells. J Oncol. 2022;2022:8145129.
  28. Han M, et al. LncRNA NEAT1 protects uremic toxin-induced intestinal epithelial barrier injury by regulating miR-122-5p/Occludin axis. PLoS One. 2025;20(5).
  29. Cui J, Wang J, Lv Y, Xu D. LncRNA NEAT1 regulates infantile pneumonia by sponging miR-146b. Mol Biotechnol. 2021;63(8):694-701.
  30. Xiao P, et al. LncRNA NEAT1 regulates chondrocyte proliferation and apoptosis via targeting miR-543/PLA2G4A axis. Hum Cell. 2021;34(1):60-75.
  31. Wu X, et al. Aberrant expressions of circulating lncRNA NEAT1 and microRNA-125a are linked with Th2 cells and symptom severity in pediatric allergic rhinitis. J Clin Lab Anal. 2022;36(3).
  32. Wang K, Liu Y, Chai Y. NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 axis regulates macrophage polarization and inflammation in sepsis models. J Vis Exp. 2026;(227).
  33. Tojo González R, et al. Síndrome de intestino irritable: papel de la microbiota y probióticos [Irritable bowel syndrome; gut microbiota and probiotic therapy]. Nutr Hosp. 2015;31(Suppl 1):83-8.
  34. Hwang HJ, et al. Ferulic acid as a protective antioxidant of human intestinal epithelial cells. Antioxidants (Basel). 2022;11(8):1448.
  35. Wu Y, et al. Probiotics (Lactobacillus plantarum HNU082) supplementation relieves ulcerative colitis by affecting intestinal barrier functions, immunity-related gene expression, gut microbiota, and metabolic pathways in mice. Microbiol Spectr. 2022;10(6).
  36. Kuo WT, et al. The tight junction protein ZO-1 is dispensable for barrier function but critical for effective mucosal repair. Gastroenterology. 2021;161(6):1924-39.
  37. Furuse M, et al. Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions. J Cell Biol. 1993;123(6 Pt 2):1777-88.
  38. Wang Z, et al. Binding of Trichinella spiralis C-type lectin with syndecan-1 on intestinal epithelial cells mediates larval invasion of intestinal epithelium. Vet Res. 2023;54(1):86.
  39. Kaya İslamoğlu ZG, Unal M, Küçük A. Atopic dermatitis in adults and irritable bowel syndrome: a cross-sectional study. Indian J Dermatol. 2019;64(5):355-9.
  40. Ma C, et al. LncRNA PTS-1 protects against osteoarthritis through the miR-8085/E2F2 axis. J Inflamm Res. 2025;18:347-66.
  41. Tong Y, Zhou Z, Tang J, Feng Q. miR-29b-3p inhibits the inflammation injury in human umbilical vein endothelial cells by regulating SEC23A. Biochem Genet. 2022;60(6):2000-14.
  42. Li Z, et al. miR-29b-3p protects cardiomyocytes against endotoxin-induced apoptosis and inflammatory response through targeting FOXO3A. Cell Signal. 2020;74:109716.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspresja NEAT1uszkodzenia wywo ane lipopolisacharydembiomarker IBS DRT qPCRywotno kom rekintegralno barierytest apoptozy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.