Dysfunkcja bariery jelitowej pośredniczona przez NEAT1 poprzez wiązanie miR-29b-3p w komórkach Caco-2 uszkodzonych lipopolisacharydem

Podsumowanie

W niniejszym badaniu oceniono NEAT1 jako marker diagnostyczny i regulator dysfunkcji bariery jelitowej w zespole jelita drażliwego z przewagą biegunek. Poziom NEAT1 był podwyższony w surowicy pacjentów, wiązał miR-29b-3p, a jego wyciszenie poprawiło wskaźniki szczelności bariery, apoptozy i stanu zapalnego w komórkach Caco-2 uszkodzonych lipopolisacharydem.

Streszczenie

Patogeneza zespołu jelita drażliwego z biegunką (IBS-D) nie jest jasna, a dostępne terapie pozostają ograniczone. W niniejszym badaniu oceniono wartość diagnostyczną NEAT1 w IBS-D oraz zbadano jego potencjalny mechanizm regulacyjny. Do badania włączono łącznie 116 pacjentów z IBS-D oraz 116 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Poziomy NEAT1 i miR-29b-3p w surowicy oznaczono za pomocą ilościowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR), a do oceny wartości diagnostycznej wykorzystano krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC). W celu przeprowadzenia badań nad mechanizmami opracowano model komórek nabłonka jelitowego Caco-2 traktowanych lipopolisacharydem (LPS). Żywotność komórek oceniono za pomocą testu Cell Counting Kit-8 (CCK-8), apoptozę za pomocą cytometrii przepływowej, integralność bariery za pomocą transepitelialnego oporu elektrycznego (TEER), a poziomy mRNA ZO-1, okludyny i klaudyny-2 za pomocą RT-qPCR. Do weryfikacji relacji wiązania między NEAT1 a miR-29b-3p wykorzystano test podwójnego reportera lucyferazy (DLR) oraz immunoprecypitację RNA (RIP). U pacjentów z IBS-D stwierdzono wysoką ekspresję NEAT1 i niską ekspresję miR-29b-3p, a ich poziomy wykazywały silną ujemną korelację. Wyciszenie NEAT1 zwiększyło poziomy miR-29b-3p, poprawiło żywotność komórek i TEER, zmniejszyło apoptozę, zwiększyło poziomy mRNA ZO-1 i okludyny, obniżyło poziomy mRNA klaudyny-2 oraz złagodziło wskaźniki związane z uszkodzeniem bariery w komórkach Caco-2 traktowanych LPS. Wspólnie wyniki te wskazują, że NEAT1 w surowicy jest potencjalnym biomarkerem IBS-D, a oś NEAT1/miR-29b-3p może być zaangażowana w dysfunkcję bariery jelitowej.

Wprowadzenie

Zespół jelita drażliwego z biegunką (IBS-D) jest powszechnym czynnościowym zaburzeniem żołądkowo-jelitowym charakteryzującym się bólem brzucha, wzdęciami oraz zaburzeniami rytmu wypróżnień¹. Obecnie mechanizm patofizjologiczny IBS-D nie został w pełni wyjaśniony². Metody leczenia opierają się głównie na łagodzeniu objawów, co wiąże się z ograniczoną skutecznością i wysokim wskaźnikiem nawrotów³. Powszechnie uważa się, że w IBS-D zaangażowany jest oddziaływanie wielu czynników, takich jak rozregulowanie osi mózgowo-jelitowej, nadwrażliwość trzewna, niskostopniowy stan zapalny jelit oraz dysfunkcja bariery jelitowej^4,5. Chociaż kryteria te w pewnym stopniu ustandaryzowały diagnostykę, mają one charakter subiektywny i mogą prowadzić do opóźnień w diagnozie lub błędnej klasyfikacji, szczególnie gdy objawy pacjenta nakładają się na objawy nieswoistych zapaleń jelit lub innych chorób organicznych. W rutynowej praktyce klinicznej obecnie nie istnieją zwalidowane obiektywne biomarkery IBS-D. W związku z tym poszukiwanie nowego celu molekularnego, który mógłby służyć jako narzędzie diagnostyczne i posiadać potencjalną wartość terapeutyczną, stało się pilną potrzebą w obecnym obszarze badań nad IBS-D.

W ostatnich latach długie niekodujące RNA, będące kluczowymi cząsteczkami w regulacji epigenetycznej, wykazały ogromny potencjał jako markery diagnostyczne i cele terapeutyczne w wielu chorobach^6,7. Główną przyczyną IBS-D jest upośledzenie funkcji bariery jelitowej⁸. Destrukcja białek połączeń ścisłych prowadzi do "przeciekania jelit", co z kolei aktywuje odpowiedź immunologiczną śluzówki^9,10. Aktywacja układu odpornościowego uwalnia liczne czynniki prozapalne, które mogą powodować dysfunkcję jelit poprzez aktywację jelitowego układu odpornościowo-nerwowego. Badania wykazały, że niektóre lncRNA mogą regulować barierę nabłonkową jelit^11,12. Wykazano, że NEAT1 ulega nadekspresji w tkance śluzówki okrężnicy u pacjentów z zapaleniem jelit¹³. Hamowanie lncRNA NEAT1 może łagodzić dysfunkcję komórek nabłonka jelitowego (IECs) w wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego¹⁴. Jednakże profil ekspresji NEAT1 w IBS-D oraz jego wartość diagnostyczna nie zostały jeszcze zbadane. Ponadto NEAT1 może mieć potencjał jako biomarker diagnostyczny¹⁵. Jeśli NEAT1 wykazuje nieprawidłową ekspresję w surowicy pacjentów z IBS-D, mogłoby to uzupełnić obecne kryteria Rome IV poprzez dostarczenie molekularnego narzędzia diagnostycznego. Jednocześnie profil ekspresji miRNA uległ również znacznym zmianom u pacjentów z IBS. Na przykład obniżenie ekspresji miR-29b-3p powiązano z patogenezą IBS¹⁶. Jednakże mechanizmy regulacji nadrzędnej sterujące ekspresją miR-29b-3p w IBS-D pozostają całkowicie nieznane. W szczególności rola NEAT1 jako konkurencyjnego endogennego RNA (ceRNA) dla miR-29b-3p w kontekście IBS-D nigdy nie była badana, mimo że mechanizm ten został dobrze opisany w innych chorobach^17,18. Ponadto, podczas gdy wcześniejsze badania koncentrowały się głównie na ekspresji na poziomie tkankowym, potencjał krążącego NEAT1 jako nieinwazyjnego biomarkera surowiczego do diagnostyki IBS-D pozostaje całkowicie nieznany.

Stawiamy hipotezę, że lncRNA-NEAT1 może uczestniczyć w regulacji funkcji bariery jelitowej w IBS-D, działając jako ceRNA, który wyłapuje miR-29b-3p. W oparciu o powyższe tło badawcze, celem niniejszej pracy jest: (1) ocena poziomów NEAT1 oraz miR-29b-3p w surowicy pacjentów z IBS-D i ich wartości diagnostycznej; (2) walidacja bezpośredniej interakcji wiążącej między NEAT1 a miR-29b-3p; oraz (3) wyjaśnienie funkcjonalnej roli osi NEAT1/miR-29b-3p w regulacji integralności bariery jelitowej i stanu zapalnego z wykorzystaniem modelu komórek Caco-2 traktowanych LPS.

Protokół

Kryteria włączenia pacjentów

Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną zgodę po pełnym zapoznaniu się z treścią badania. Komitet Etyki Szpitala Ludowego w Nowej Dzielnicy Pudong w Szanghaju przeanalizował i zatwierdził niniejszy protokół badawczy (nr 2024k007). Wielkość próby obliczono za pomocą programu G*Power: wybranym testem był test t, a test statystyczny zaprojektowano w celu wykrycia różnic między dwiema niezależnymi próbkami. Przy wielkości efektu d = 0,5, α = 0,05 i mocy = 0,9, obliczenia wskazały, że do każdej grupy należy włączyć minimum 86 osób. Aby uwzględnić potencjalne nieprzewidziane okoliczności podczas badania, do każdej grupy włączono 116 pacjentów. W badaniu wzięło udział łącznie 116 pacjentów z IBS-D, którzy odwiedzili Szpital Ludowy w Nowej Dzielnicy Pudong w Szanghaju między lipcem 2024 a lipcem 2025 roku, stanowiących grupę eksperymentalną. Kryteria włączenia obejmowały: (1) IBS-D spełniający kryteria diagnostyczne Rzym IV; (2) kolonoskopię niewykazującą zmian organicznych w błonie śluzowej. Kryteria wykluczenia: (1) pacjenci z nieswoistymi zapaleniami jelit (IBD), rakiem jelita grubego itp.; (2) pacjenci z cukrzycą; (3) pacjenci po niedawnych operacjach jamy brzusznej; oraz (4) pacjenci z ciężką niewydolnością serca, wątroby lub nerek. Jednocześnie do grupy kontrolnej zrekrutowano 116 zdrowych ochotników, których charakterystyka demograficzna, taka jak wiek i płeć, była zgodna z charakterystyką pacjentów. Potwierdzono, że zdrowe osoby kontrolne nie miały w wywiadzie przewlekłych chorób przewodu pokarmowego ani odpowiadających im objawów klinicznych. Od wszystkich badanych pobrano pięć mililitrów krwi z żyły obwodowej. Następnie nadsącz przeniesiono do zamrażarki niskotemperaturowej w temperaturze -80 °C w celu krio konserwacji przed późniejszą ekstrakcją RNA.

Każdy uczestnik wypełnił 10-dniowy kwestionariusz w celu odnotowania następujących objawów klinicznych: (a) ocena nasilenia bólu brzucha przy użyciu 10-stopniowej wizualno-analogowej skali VAS; (b) częstotliwość występowania bólu brzucha w okresie badania (liczba dni z bólem); (c) częstotliwość wypróżnień (maksymalna liczba wypróżnień na dobę); (d) Bristol Faecal Traits Scale w celu oceny konsystencji stolca. Stan emocjonalny badanych oceniono za pomocą Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS).

Hodowla komórkowa i modelowanie

Komórki Caco-2 hodowano rutynowo w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny i streptomycyny, w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂. Linia komórkowa Caco-2 ulega spontanicznemu różnicowaniu w spolaryzowaną monowarstwę komórek z połączeniami ścisłymi i mikrokosmkami, wykazując cechy morfologiczne i funkcjonalne podobne do dojrzałych komórek nabłonka jelitowego. LPS wywołuje odpowiedź zapalną i zaburza połączenia ścisłe w nabłonku jelitowym, zwiększając przepuszczalność jelit — proces ten jest bardzo podobny do cech patologicznych IBS-D. Ponadto, biorąc pod uwagę, że komórki Caco-2 traktowane LPS były szeroko stosowane w poprzednich badaniach^19,20,21 do modelowania dysfunkcji bariery i stanu zapalnego związanego z IBS, w niniejszym badaniu wybrano traktowanie komórek Caco-2 lipopolisacharydem (LPS) w celu stworzenia modelu in vitro IBS-D. Po osiągnięciu przez komórki konfluencji na poziomie około 80%, pożywkę hodowlaną zastąpiono pożywką kompletną zawierającą 5 µg/ml LPS²², a komórki stymulowano przez 24 h. Jako grupę kontrolną wykorzystano komórki hodowane konwencjonalnie, bez dodatku LPS.

Transfekcja komórek

W celu zbadania roli NEAT1 oraz miR-29b-3p w komórkach Caco-2 przeprowadzono transfekcję tych komórek. Komórki podzielono na sześć grup w następujący sposób: 1. grupa kontrolna (bez traktowania); 2. grupa LPS; 3. grupa LPS + si-NC; 4. grupa LPS + si-NEAT1; 5. grupa LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC; oraz 6. grupa LPS + si-NEAT1 + inhibitor miR-29b-3p. Zaprojektowano i zsyntetyzowano dwa małe interferujące RNA (si-NEAT1) celujące w NEAT1: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) oraz si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). Jako kontrolę negatywną zastosowano siRNA o niecelującej, losowej sekwencji (si-NC). Jednocześnie zsyntetyzowano inhibitor miR-29b-3p oraz jego kontrolę negatywną. Inhibitor miR-29b-3p: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Kontrola negatywna: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Komórki Caco-2 wysiano na płytki 24-dołkowe i transfekowano zgodnie z protokołem producenta po osiągnięciu przez hodowle 60–70% konfluencji. W skrócie, 1,25 µL siRNA rozcieńczono w 25 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy, aby uzyskać końcowe stężenie siRNA wynoszące 50 nM. W celu inhibicji miRNA, 2 µL inhibitora miR-29b-3p lub kontroli negatywnej rozcieńczono w 25 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy do stężenia końcowego 100 nM. Oddzielnie 1,5 µL odczynnika do transfekcji zmieszano z 25 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy. Następnie rozcieńczone siRNA (lub inhibitor/kontrolę negatywną) zmieszano z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji w celu utworzenia kompleksu transfekcyjnego, który dodawano do komórek kroplami. Sześć godzin po transfekcji mieszaninę transfekcyjną zastąpiono świeżą pożywką kompletną, a komórki inkubowano przez kolejne 48 h przed wykonaniem dalszych testów funkcjonalnych. Efektywność knockdownu lub inhibicji potwierdzono za pomocą RT-qPCR przed przystąpieniem do kolejnych eksperymentów.

Ilościowa polimeraza łańcuchowa w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR)

Całkowite RNA wyizolowano z próbek surowicy oraz komórek Caco-2 poddanych wskazanym zabiegom. W skrócie, każdą próbkę lizowano za pomocą 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA, a następnie połączono z 200 µL chloroformu. Po wirowaniu przy 12 000 × g przez 15 min w temperaturze 4 °C, górną fazę wodną przeniesiono do nowej probówki, wymieszano z 500 µL izopropanolu i przechowywano w temperaturze −20 °C przez 30 min. Następnie próbki odwirowano przy 12 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Otrzymany osad RNA przemyto dwukrotnie 75% etanolem, wysuszono na powietrzu i zawieszono ponownie w 20 µL wody wolnej od RNaz. Wydajność i czystość RNA zmierzono za pomocą mikrospektrofotometru, a do dalszych analiz wybrano wyłącznie próbki o A₂₆₀/A₂₈₀ stosowano wartości od 1,8 do 2,0. RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA zgodnie z protokołem producenta. W celu detekcji NEAT1, ZO-1, okludyna, claudyna-2, i GAPDHDo każdej reakcji odwrotnej transkrypcji o objętości 20 µL wykorzystano 1 µg całkowitego RNA, a mieszanina zawierała 1× bufor RT, 0,5 mM dNTP, 0,5 µM starter oligo(dT), 200 U odwrotnej transkryptazy oraz wodę wolną od RNaz. Reakcję przeprowadzono w temperaturze 37 °C przez 15 min, a następnie inaktywowano enzym w temperaturze 85 °C przez 5 s.

Ilościową reakcję PCR przeprowadzono z użyciem cDNA jako matrycy, wykorzystując system real-time PCR oparty na SYBR Green. Poziomy ekspresji NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludin, oraz claudin-2 zmierzono za pomocą starterów specyficznych dla danych genów. U6 służył jako gen referencyjny dla miR-29b-3p, natomiast GAPDH wykorzystano do normalizacji NEAT1 oraz genów związanych z połączeniami ścisłymi. Względną ekspresję obliczono metodą 2−ΔΔCt. Sekwencje starterów przedstawiono w Tabeli 1.

Test żywotności komórek

Komórki Caco-2 w fazie logarytmicznego wzrostu wysiano do płytek 96-dołkowych w zagęszczeniu 1 × 10⁴ komórek na dołek. Utworzono grupę kontrolną pustą (zawierającą tylko pożywkę hodowlaną), grupę kontrolną (komórki niepoddane działaniu czynników) oraz grupę doświadczalną (komórki Caco-2 w różnych warunkach traktowania), z 5–6 dołkami powtórzonymi w każdej grupie. Komórki przydzielono do czterech punktów czasowych: 0, 24, 48 i 72 h. Dla każdego punktu czasowego przygotowano oddzielną płytkę hodowlaną, aby uniknąć wielokrotnego otwierania inkubatora podczas pomiarów. Po okresie hodowli do każdego dołka dodano 10 µL roztworu CCK-8, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Następnie płytkę hodowlaną przeniesiono do inkubatora w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂ i inkubowano w ciemności przez 2 h. Absorbancję każdego dołka zmierzono natychmiast przy 450 nm za pomocą czytnika płytek mikrodołkowych. Ostatecznie żywotność komórek wyrażono jako wartość procentową.

Analiza apoptozy komórek

Apoptozę ilościowo określono za pomocą cytometrii przepływowej po barwieniu Annexin V-FITC/PI. Komórki Caco-2 z każdej grupy badawczej zebrano i dwukrotnie przemyto lodowatym PBS. Wirowanie przeprowadzono przy 300 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Osad komórkowy resuspendowano w 100 µL 1× buforu wiążącego, a następnie kolejno dodano 5 µL Annexin V-FITC oraz 5 µL PI. Po delikatnym wymieszaniu próbki inkubowano przez 15 min w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie dodano 300 µL 1× buforu wiążącego i zawiesinę ostrożnie wymieszano przed przeniesieniem do probówki do cytometrii przepływowej o pojemności 5 mL. Próbki analizowano metodą cytometrii przepływowej w ciągu 1 h.

Transepitelialna oporność elektryczna (TEER)

Przepuszczalność oceniono poprzez pomiar wartości TEER komórek Caco-2²³. Komórki Caco-2 zaszczepiono w komorach Transwell i inkubowano przez 21 dni w celu utworzenia gęstej monowarstwy. W każdej z warunków eksperymentalnych przeprowadzono sześć niezależnych powtórzeń biologicznych oraz pięć powtórzeń technicznych. Przed i po zastosowaniu zabiegu eksperymentalnego zmierzono wartości TEER dla każdej grupy za pomocą miernika oporności błonowej, używając elektrod wysterylizowanych etanolem i zrównoważonych w PBS. W skrócie, dłuższy pręt elektrody zanurzono w pożywce hodowlanej po stronie bazolateralnej, a krótszy w pożywce po stronie apikalnej, aby uniknąć kontaktu z membraną filtra. Po stabilizacji odczytano wartość oporności (Ω), a pomiary powtarzano do uzyskania trzech spójnych odczytów. W tych samych warunkach zmierzono oporność pustych filtrów Transwell (bez komórek), a wartość tę odjęto od wszystkich odczytów eksperymentalnych. TEER (Ω·cm²) = (oporność próbki – oporność tła) × efektywna powierzchnia membrany. Dane przedstawiono jako: (grupa eksperymentalna/grupa kontrolna) × 100%.

Test immunoenzymatyczny (ELISA)

Nadbudówki z hodowli komórek Caco-2 z różnych grup badawczych zebrano po 24 h inkubacji. Poziomy cytokin prozapalnych, w tym czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF-α), interleukiny-6 (IL-6), interleukiny-8 (IL-8) oraz interleukiny-1β (IL-1β), zmierzono przy użyciu komercyjnych zestawów ELISA zgodnie z instrukcją producenta. Analizę przeprowadzono ściśle według wytycznych. Próbki i wzorce naniesiono do studzienek uprzednio pokrytych przeciwciałami, następnie inkubowano i przemyto. Następnie dodano biotynilowane przeciwciało detekcyjne. Po kolejnej inkubacji i przemyciu dodano streptawidynę znakowaną peroksydazą chrzanową. Na koniec w celu wywołania zabarwienia dodano substrat TMB, a reakcję przerwano za pomocą roztworu stop. Absorbancję każdej studzienki zmierzono niezwłocznie przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.

Western blot

Białka wyizolowano z komórek Caco-2 po wskazanych traktowaniach, wykorzystując bufor RIPA zawierający inhibitory proteaz. Poziom białek zmierzono za pomocą testu kwasu bicinchononowego (BCA). Dla każdej próbki na każdą ścieżkę naniesiono 30 µg białka, które rozdzielono w 10% żelach SDS-PAGE, a następnie przeniesiono na membrany PVDF. Membrany blokowano w 5% beztłuszczowym mleku przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałami przeciwko ZO-1 (1:1,000), okludynie (1:500), klaudynie-2 (1:1,000) oraz GAPDH (1:5,000). Po przemyciu membrany inkubowano z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP przez 1 h w temperaturze pokojowej. Prążki wykryto za pomocą wzmocnionej chemiluminescencji (ECL), a intensywność prążków przeanalizowano przy użyciu programu ImageJ. GAPDH służyło jako kontrola załadunku.

Test reporterowy z podwójną lucyferazą (DLR)

Potencjalne miejsca wiązania miR-29b-3p z sekwencją NEAT1 przewidziano za pomocą bazy danych ENCORI (https://rnasysu.com/encori/). Następnie fragmenty NEAT1 zawierające miejsca wiązania typu dzikiego (WT) lub zmutowane (MUT) sklonowano do wektora reporterowego pmirGLO. Skonstruowany plazmid rekombinowany ko-transfekowano do komórek wraz z mimetykami miR-29b-3p (Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) lub inhibitorami oraz ich odpowiednimi kontrolami negatywnymi (mimic NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’). Czterdzieści osiem godzin po transfekcji zebrano komórki, a aktywność lucyferazy świetlika oraz lucyferazy renilli określono przy użyciu odczynnika do detekcji podwójnej lucyferazy. Aktywność lucyferazy renilli wykorzystano jako wewnętrzny punkt odniesienia do standaryzacji.

Analiza immunoprecypitacji RNA (RIP)

Do analizy RIP wykorzystano zebrane komórki Caco-2, które przepłukano PBS i inkubowano na lodzie przez 15 min w 200 µL buforu do lizy RIP uzupełnionego o inhibitory proteaz i RNaz. Lizaty komórkowe wirowano przy 16 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C, a 10 µL każdego supernatantu zachowano jako kontrolę wejściową. W celu przeprowadzenia immunoprecypitacji 40 µL magnetycznych kulek Protein A/G rotowano z 5 µg przeciwciała anty-Ago2 lub normalnego IgG w 200 µL buforu do przemywania RIP przez 30 min w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym przemyciu 500 µL buforu do przemywania RIP, 100 µL zawiesiny kulek połączono z 100 µL lizatu, uzupełniono buforem do przemywania RIP do końcowej objętości 1 mL i inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z rotacją. Następnie kulki przemyto pięciokrotnie 500 µL buforu do przemywania RIP i resuspendowano w 150 µL tego samego buforu. Trawienie białek przeprowadzono poprzez dodanie 15 µL proteinazy K (20 mg/mL) i 15 µL 10% SDS, a następnie inkubowano w 55 °C przez 30 min z wstrząsaniem. Zebrano supernatant, a RNA wyizolowano za pomocą odczynnika do ekstrakcji i wytrącono przez noc. Wzbogacenie NEAT1 i miR-29b-3p oceniono następnie za pomocą RT-qPCR.

Analiza lokalizacji subkomórkowej

Komórki Caco-2 rozdzielono na frakcje jądrowe i cytoplazmatyczne przy użyciu wspomnianego, dostępnego komercyjnie odczynnika do separacji jądrowo-cytoplazmatycznej, zgodnie z instrukcjami producenta. Z obu tych komponentów wyekstrahowano całkowite RNA, a rozkład NEAT1 w jądrze i cytoplazmie wykryto za pomocą RT-qPCR. Kalibrację przeprowadzono z wykorzystaniem mRNA U6 (dominującego w jądrze) oraz GAPDH (dominującego w cytoplazmie) jako wskaźników wydajności separacji.

Analiza statystyczna

W przypadku klinicznych próbek surowicy analiza mocy (t-test, d = 0.5, α = 0.05, moc = 0.9) wykazała, że wymagane jest minimum 86 osób w grupie. Aby uwzględnić potencjalne nieprzewidziane okoliczności podczas badania, do każdej grupy włączono 116 pacjentów w celu wykrycia istotnych klinicznie różnic. Normalność rozkładu danych dla zmiennych ciągłych oceniono za pomocą testu Shapiro-Wilka. Ponieważ wszystkie dane ciągłe miały rozkład normalny (P > 0.05), zastosowano analizy parametryczne. Zmienne kategoryczne analizowano za pomocą testu chi-kwadrat. Eksperymenty na komórkach obejmowały sześć niezależnych powtórzeń biologicznych, z pięcioma powtórzeniami technicznymi dla każdego powtórzenia biologicznego. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Porównania między dwiema grupami zmiennych ciągłych przeprowadzono za pomocą testu t Studenta, natomiast porównania między wieloma grupami analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA, a następnie testu post hoc Tukeya. Istotność statystyczną zdefiniowano jako P < 0.05.

Wyniki

Ekspresja NEAT1 i wartość diagnostyczna

W porównaniu z grupą zdrowej kontroli (HC), poziomy ekspresji NEAT1 u pacjentów z IBS-D były wyraźnie wyższe (P < 0.0001; Rycina 1A). Pole pod krzywą (AUC) dla NEAT1, wyznaczone na podstawie charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC), wyniosło 0.867 (95% CI: 0.821–0.913). Specyficzność wyniosła 75.9%, natomiast czułość 84.5% (Rycina 1B). Sugeruje to, że nieprawidłowa ekspresja NEAT1 w surowicy pacjentów z IBS-D może służyć jako nowy biomarker diagnostyczny dla tego schorzenia.

Dodatkowo porównano dane kliniczne pacjentów z grupy zdrowej oraz grupy z IBS-D. Wyniki nie wykazały istotnych różnic między obiema grupami pod względem wieku, płci ani innych charakterystyk (P > 0.05). Odnotowano jednak istotne różnice w wynikach HADS, częstotliwości wypróżnień oraz konsystencji stolca (P < 0.0001, Tabela 2). W odniesieniu do częstotliwości występowania bólu brzucha, 69 pacjentów odczuwało objawy przez ≥ 5 dni, co stanowiło 59,48% przypadków. W kwestii nasilenia bólu brzucha, 72 pacjentów uzyskało wynik ≥ 5, co stanowiło 62,07% (Tabela 2). Oznacza to, że pacjenci z IBS-D są wyraźnie odróżnialni od grupy kontrolnej na podstawie ich objawów. Biorąc pod uwagę kliniczny związek między podwyższonym poziomem NEAT1 a objawami IBS-D, następnie zbadano wpływ funkcjonalny NEAT1 na integralność bariery jelitowej z wykorzystaniem modelu komórek Caco-2 traktowanych LPS.

Wpływ niskich poziomów NEAT1 na uszkodzenie bariery jelitowej i odpowiedzi zapalne w komórkach Caco-2 traktowanych LPS

Aby zamodelować dysfunkcję bariery jelitowej i stan zapalny o niskim nasileniu obserwowany w IBS-D, potraktowano komórki Caco-2 LPS. Po dodaniu LPS do komórek odnotowano zwiększenie poziomu NEAT1 w porównaniu z grupą kontrolną. Po transfekcji si-NEAT1 poziom NEAT1 wyraźnie spadł w porównaniu z grupą LPS + si-NC (P < 0.0001, Rycina 2A). Leczenie LPS zmniejszyło żywotność komórek i zwiększyło poziom apoptozy w stosunku do grupy kontrolnej. Po wyciszeniu NEAT1 żywotność komórek wzrosła, a wskaźnik apoptozy spadł w porównaniu z grupą LPS + si-NC (P < 0.001; Rycina 2B,C). Po wyciszeniu NEAT1 obniżona przez LPS wartość TEER została istotnie przywrócona (P < 0.0001, Rycina 2D). LPS zmniejszył ekspresję mRNA ZO-1 oraz okludyny i zwiększył ekspresję klaudyny-2 w stosunku do kontroli, podczas gdy wyciszenie NEAT1 odwróciło te zmiany (P < 0.001, Rycina 2E-G). Leczenie LPS może wywołać odpowiedź zapalną w komórkach. Poziomy czynników prozapalnych TNF-α, IL-6, IL-8 i IL-1β w komórkach były wyższe niż w grupie kontrolnej. Po wyciszeniu NEAT1 zawartość czynników prozapalnych w komórkach uległa istotnemu zmniejszeniu w porównaniu z grupą si-NC (P < 0.0001, Rycina 3A-D). Sugeruje to, że niskie poziomy NEAT1 ograniczają indukowaną przez LPS dysfunkcję bariery jelitowej oraz odpowiedzi zapalne, a NEAT1 może przyczyniać się do progresji IBS-D.

Bezpośrednie wiązanie NEAT1 i wpływ na miR-29b-3p w komórkach Caco-2

W komórkach Caco-2 NEAT1 znajduje się głównie w cytoplazmie (Rysunek 4A). Miejsca wiązania NEAT1 i miR-29b-3p zostały przewidziane za pomocą bazy danych ENCORI. Na tej podstawie zaprojektowano sekwencje WT-NEAT1 oraz MUT-NEAT1 (Rysunek 4B). Wyniki eksperymentu DLR wykazały, że mimetyki miR-29b-3p zmniejszyły aktywność enzymatyczną WT-NEAT1 w porównaniu z mimetykiem NC, natomiast jego inhibitory zwiększyły ją w stosunku do inhibitora NC. Odwrotnie, żadna z tych terapii nie miała wpływu na MUT-NEAT1 (P < 0.0001, Rysunek 4C). Analiza RIP wykazała, że NEAT1 i miR-29b-3p występowały w znacznej ilości w frakcji przeciw-Ago2 w porównaniu z grupą przeciw-IgG, co wskazuje na specyficzną interakcję między nimi (P < 0.0001, Rysunek 4D). Wyniki te wskazują, że NEAT1 wiąże się specyficznie z miR-29b-3p. Jednocześnie poziom miR-29b-3p był wyraźnie obniżony u pacjentów z IBS-D w porównaniu z grupą HC (P < 0.0001, Rysunek 4E). AUC jego krzywej ROC wyniosło 0.856 (95% CI: 0.808–0.905), przy czułości 89.7% i swoistości 71.6% (Rysunek 4F). Analiza korelacji Pearsona ujawniła odwrotną korelację między poziomami NEAT1 a ekspresją miR-29b-3p (r = -0.744, P < 0.0001, Rysunek 4G).

Wpływ niskiego poziomu NEAT1 na uszkodzenie bariery jelitowej w komórkach Caco-2 traktowanych LPS oraz na poziomy miR-29b-3p

W komórkach Caco-2 traktowanych LPS ekspresja miR-29b-3p była wyraźnie obniżona w porównaniu z grupą kontrolną. Transfekcja si-NEAT1 zwiększyła poziomy miR-29b-3p, natomiast transfekcja inhibitorem miR-29b-3p ponownie obniżyła poziomy miR-29b-3p (P < 0,0001, Rysunek 5A). Wyciszenie NEAT1 zwiększyło żywotność komórek i zmniejszyło apoptozę, a efekty te zostały zniesione przez inhibitor miR-29b-3p (P < 0,01, Rysunek 5B,C). Indukowany przez LPS spadek TEER został przywrócony przez wyciszenie NEAT1, a przywrócenie to zostało ponownie zablokowane przez inhibitor miR-29b-3p (P < 0,0001, Rysunek 5D). Traktowanie LPS doprowadziło do zmniejszenia ekspresji mRNA ZO-1 oraz okludyny i zwiększenia ekspresji mRNA klaudyny-2 w porównaniu z grupą kontrolną. Po wyciszeniu NEAT1 poziomy miR-29b-3p wzrosły, poziomy mRNA ZO-1 i okludyny wzrosły, a poziomy mRNA klaudyny-2 spadły w porównaniu z grupą LPS + si-NC. Po inhibicji miR-29b-3p poziomy mRNA ZO-1 i okludyny spadły, a poziomy mRNA klaudyny-2 wzrosły w porównaniu z grupą LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC (P < 0,001, Rysunek 5E-G). NEAT1 (głównie subtyp cytoplazmatyczny NEAT1_1) działa jako gąbka dla miR-29b-3p. Wyciszenie NEAT1 uwalnia miR-29b-3p, co pośrednio zwiększa ekspresję ZO-1 i okludyny oraz zmniejsza ekspresję klaudyny-2, łagodząc indukowane przez LPS zaburzenie bariery. Wyniki te sugerują, że w tym modelu miR-29b-3p pozytywnie reguluje ekspresję ZO-1 i okludyny oraz negatywnie reguluje klaudynę-2, a efekty wyciszenia NEAT1 są zapośredniczone, przynajmniej częściowo, przez miR-29b-3p.

Następnie zbadaliśmy poziomy ekspresji białek połączeń ścisłych za pomocą analizy western blot. Jak pokazano na Rysunku 5H, wyciszenie NEAT1 zwiększyło obniżoną przez LPS ekspresję ZO-1 i okludyny oraz zahamowało ekspresję klaudyny-2 w porównaniu z grupą LPS + si-NC. Jednakże kotransfekcja inhibitorem miR-29b-3p osłabiła efekt ochronny wyciszenia NEAT1 w porównaniu z grupą LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC. Wyniki te potwierdzają wniosek, że wyciszenie NEAT1 przywraca ekspresję białek połączeń ścisłych, przynajmniej częściowo poprzez upregulację miR-29b-3p, co prowadzi do poprawy funkcji bariery jelitowej.

Wpływ niskiego poziomu NEAT1 na zapalenie jelit w komórkach Caco-2 traktowanych LPS oraz na ekspresję miR-29b-3p

W komórkach Caco-2 traktowanych LPS, LPS wywołał odpowiedź zapalną. Poziomy czynników prozapalnych TNF-α, IL-6, IL-8 oraz IL-1β były znacznie wyższe niż w grupie kontrolnej. Po wyciszeniu NEAT1 poziomy miR-29b-3p wzrosły, natomiast poziomy czynników prozapalnych uległy znacznemu obniżeniu w porównaniu z si-NC. Po inhibicji miR-29b-3p poziomy czynników zapalnych ponownie wzrosły (P < 0.0001, Rysunek 6A-D). Zatem wyciszenie NEAT1 hamuje uwalnianie cytokin zapalnych, przynajmniej częściowo, poprzez zwiększenie ekspresji miR-29b-3p.

Wyniki te wskazują, że poziomy NEAT1 są nieprawidłowo podwyższone w surowicy pacjentów z IBS-D oraz że NEAT1 wykazuje wysoką wartość AUC w rozróżnianiu pacjentów z IBS-D od zdrowych osób z grupy kontrolnej. Pod względem mechanistycznym, NEAT1 bezpośrednio wiąże i sekwestruje miR-29b-3p w cytoplazmie. W modelach komórkowych i funkcjonalnych eksperymentach ratunkowych, wyciszenie NEAT1 zwiększyło ekspresję miR-29b-3p, poprawiło przeżywalność komórek i wartość TEER, zredukowało apoptozę oraz osłabiło uwalnianie cytokin prozapalnych. Odkrycia te wspierają hipotezę, że NEAT1 negatywnie reguluje integralność bariery jelitowej poprzez hamowanie miR-29b-3p i sugerują, że celowanie w NEAT1 może stanowić potencjalną strategię diagnostyczną i terapeutyczną w IBS-D.

Dostępność danych:

Surowe dane będące podstawą rysunków i tabel zostały udostępnione jako Supplemental File 1 (arkusz z surowymi danymi) oraz Supplemental File 2 (nieedytowane obrazy western blot).

Rycina 1. Ekspresja i wartość diagnostyczna NEAT1 u pacjentów z IBS-D. (A) Poziomy ekspresji NEAT1 w surowicy zdrowych osób kontrolnych (HC, n = 116) i pacjentów z IBS-D (n = 116) wykryte metodą RT-qPCR; (B) Analiza krzywej ROC dla NEAT1 w celu odróżnienia pacjentów z IBS-D od zdrowych osób kontrolnych. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 116 na grupę). **** P < 0.0001. Skróty: IBS-D = zespół jelita drażliwego z biegunką; ROC = charakterystyka operacyjna odbiornika. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2. Wpływ NEAT1 na uszkodzenie bariery jelitowej indukowane LPS w komórkach Caco-2. (A) Transfekcja si-NEAT1 obniża poziomy NEAT1 indukowane przez LPS; (B) Żywotność komórek mierzona testem CCK-8 w czasie 0, 24, 48 i 72 h. Wyciszenie NEAT1 zwiększa żywotność komórek; (C) Stopień apoptozy określony metodą cytometrii przepływowej z barwieniem Annexin V-FITC/PI. Wyciszenie NEAT1 zmniejsza stopień apoptozy; (D) Transepitelna oporność elektryczna (TEER) zmierzona w monowarstwach Caco-2. Hamowanie NEAT1 zwiększa komórkową TEER; (E-G) Poziomy ekspresji mRNA dla (E) ZO-1, (F) okludyny i (G) klaudyny-2 zmierzone metodą RT-qPCR. Wyciszenie NEAT1 podnosi ekspresję mRNA dla ZO-1 i okludyny oraz obniża poziomy mRNA klaudyny-2. Dane przedstawiono jako średnia ± SD z sześciu niezależnych eksperymentów (n = 6 na grupę). *** P < 0.001; **** P < 0.0001, LPS w porównaniu do kontroli, LPS + si-NEAT1 w porównaniu do LPS + si-NC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 3. Wpływ wyciszenia NEAT1 na indukowane LPS uwalnianie cytokin prozapalnych w komórkach Caco-2. (A-D) Stężenia (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 oraz (D) IL-1β w nadsączach hodowli komórkowych zmierzone metodą ELISA. Wyciszenie NEAT1 obniża indukowane LPS poziomy TNF-α, IL-6, IL-8 i IL-1β. Dane przedstawiono jako średnia ± SD z sześciu niezależnych eksperymentów (n = 6 na grupę). **** P < 0.0001, LPS vs. kontrola, LPS + si-NEAT1 vs. LPS + si-NC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4. Bezpośrednie wiązanie NEAT1 i asocjacja z miR-29b-3p. (A) Lokalizacja subkomórkowa NEAT1 w komórkach Caco-2 określona przez frakcjonowanie jądrowo-cytoplazmatyczne (U6: kontrola jądrowa, GAPDH: kontrola cytoplazmatyczna). NEAT1 znajduje się głównie w cytoplazmie; (B) Przewidywane sekwencje wiążące WT i MUT NEAT1 dla miR-29b-3p z bazy danych ENCORI; (C) Test DLR potwierdził relację wiązania między NEAT1 a miR-29b-3p; (D) RIP potwierdził relację wiązania między NEAT1 a miR-29b-3p. Dane w A, C i D przedstawiają średnią ± SD z sześciu niezależnych eksperymentów (n = 6 na grupę). (E) Poziomy ekspresji miR-29b-3p w surowicy u zdrowych kontroli (HC, n = 116) i pacjentów z IBS-D (n = 116); (F) Krzywa ROC dla miR-29b-3p w celu rozróżnienia pacjentów z IBS-D od zdrowych kontroli; (G) Analiza korelacji Pearsona między poziomami NEAT1 a miR-29b-3p u pacjentów z IBS-D. NEAT1 był ujemnie skorelowany z ekspresją miR-29b-3p (r = -0,744, P < 0,0001). Dane w E przedstawiają średnią ± SD (n = 116 na grupę). **** P < 0,0001. Skróty: WT = typ dziki; MUT = mutant; DLR = dual-luciferase reporter; RIP = immunoprecypitacja RNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5. Wpływ wyciszenia NEAT1 na funkcję bariery jelitowej w komórkach Caco-2 traktowanych LPS oraz na miR-29b-3p. (A) Wyciszenie NEAT1 zwiększa poziom miR-29b-3p, natomiast transfekcja inhibitorami miR-29b-3p zmniejsza ekspresję miR-29b-3p. (B) Żywotność komórek zmierzona testem CCK-8. Niski poziom NEAT1 zwiększa żywotność komórek poprzez zwiększenie poziomu miR-29b-3p; (C) Wskaźnik apoptozy określony za pomocą cytometrii przepływowej. Niski poziom NEAT1 zmniejsza wskaźnik apoptozy poprzez zwiększenie poziomu miR-29b-3p; (D) Niski poziom NEAT1 zwiększa TEER komórek poprzez podniesienie poziomu miR-29b-3p; (E-G) Ekspresja mRNA (E) ZO-1, (F) okludyny i (G) klaudyny-2. Niski poziom NEAT1 zwiększa ekspresję ZO-1 i okludyny oraz zmniejsza ekspresję mRNA klaudyny-2 poprzez wzmocnienie miR-29b-3p. (H) Reprezentatywne obrazy z western blot pokazujące ekspresję białek ZO-1, okludyny, klaudyny-2 i GAPDH w określonych warunkach traktowania. Dane przedstawiono jako średnia ± SD z sześciu niezależnych eksperymentów (n = 6 na grupę). ** P < 0.01; *** P < 0.001; **** P < 0.0001, LPS vs. kontrola, LPS + si-NEAT1 vs. LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + inhibitor miR vs. LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC. Skróty: inhibitor miR = inhibitor miR-29b-3p; TEER = transepithelial electrical resistance (transepitelialny opór elektryczny). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 6. Wpływ wyciszenia NEAT1 na stan zapalny w komórkach Caco-2 traktowanych LPS oraz na poziom miR-29b-3p. (A-D) Stężenia (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 i (D) IL-1β w nadsączach hodowli komórkowych zmierzone metodą ELISA. Niski poziom NEAT1 zmniejsza zawartość TNF-α, IL-6, IL-8 i IL-1β w nadsączu komórkowym poprzez zwiększenie poziomu miR-29b-3p. Dane przedstawiono jako średnia ± SD z sześciu niezależnych eksperymentów (n = 6 na grupę). **** P < 0.0001, LPS vs. kontrola, LPS + si-NEAT1 vs. LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-inhibitor vs. LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC. Skrót: miR-inhibitor = inhibitor miR-29b-3p. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Gen	Sekwencja startera
NEAT1 forward	5’-GTGGCTGTTGGAGTCGGTAT-3’
NEAT1 reverse	5’-TAACAAACCACGGTCCATGA-3’
ZO-1 forward	5’-GCCGCTAAGAGCACAGCAA-3′
ZO-1 reverse	5’-TCCCCACTCTGAAAATGAGGA-3’
Occludin forward	5’-ATGGCAAAGTGAATGACAAGCGG-3’
Occludin reverse	5’-CTGTAACGAGGCTGCCTGAAGT-3’
Claudin-2 forward	5’-GTGACAGCAGTTGGCTTCTCCA-3’
Claudin-2 reverse	5’-GGAGATTGCACTGGATGTCACC-3’
miR-29b-3p forward	5’-GCTCTAGATCAGTTACAGAAAGACCACGA-3’
miR-29b-3p reverse	5’-GCTCTAGATAGTGTCCATGCACGGACC-3’
GAPDH forward	5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3’
GAPDH reverse	5’-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3’
U6 forward	5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’
U6 reverse	5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

Tabela 1: Sekwencje starterów.

Wskaźnik	Grupa kontrolna (N=116)	Grupa IBS-D (N=116)	P
Wiek, lata
< 40	63	54	0.293
≥ 40	53	62
Płeć
Mężczyzna	64	66	0.895
Kobieta	52	50
Palenie tytoniu
NIE	58	53	0.599
TAK	58	63
Spożywanie alkoholu
NIE	63	58	0.599
TAK	53	58
HADS, wynik
< 8	96	26	< 0.0001
≥ 8	20	90
Wypróżnienia, liczba/dobę
< 4	103	51	< 0.0001
≥ 4	13	65
Konsystencja stolca, skala bristolska
< 5	87	25	< 0.0001
≥ 5	29	91
Częstotliwość bólów brzucha, liczba dni
< 5	/	47	/
≥ 5	/	69
Nasilenie bólów brzucha, wynik
< 5	/	44	/
≥ 5	/	72

Tabela 2: Porównanie charakterystyki demograficznej i klinicznej między zdrową grupą kontrolną a pacjentami z IBS-D. Wartości przedstawiono jako liczbę uczestników dla każdej grupy (n = 116/grupa). Różnice między grupami oceniono za pomocą testu chi-kwadrat. Skróty: HADS = Hospital Anxiety and Depression Scale; IBS-D = zespół jelita drażliwego z przewagą biegunek.

Plik uzupełniający 1: Surowe dane stanowiące podstawę rycin i tabel. Plik ten zawiera surowe dane liczbowe wykorzystane do wygenerowania wyników ilościowych przedstawionych na Rycini 1, Rycini 2, Rycini 3, Rycini 4, Rycini 5 oraz Rycini 6, a także dane demograficzne/kliniczne podsumowane w Tabeli 2.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Nieedytowane obrazy western blot. Plik ten zawiera nieedytowane obrazy western blot dla ZO-1, occludin, claudin-2 oraz GAPDH, odpowiadające reprezentatywnemu panelowi western blot przedstawionemu na Rysunku 5H.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

IBS-D jest powszechnym funkcjonalnym zaburzeniem żołądkowo-jelitowym. Jego mechanizm patologiczny nie został w pełni wyjaśniony. W ostatnich latach lncRNA, jako kluczowe cząsteczki w regulacji epigenetycznej, wykazują duży potencjał w dziedzinie diagnostyki i leczenia chorób. LncRNA NEAT1 badano w kontekście różnych schorzeń, takich jak rak jelita grubego²⁴, glejak²⁵ oraz zawał mięśnia sercowego²⁶. Liczne badania wykazały, że NEAT1 bierze udział w regulacji odpowiedzi zapalnych¹³, proliferacji komórek²⁷ oraz integralności bariery jelitowej²⁸. Jednakże specyficzna ekspresja NEAT1 w IBS-D, jej wartość kliniczna oraz mechanizmy regulacyjne leżące u podstaw IBS-D nie zostały jeszcze dokładnie zbadane.

NEAT1 wykazuje zwiększoną ekspresję w różnych stanach zapalnych, takich jak zapalenie płuc²⁹, choroba zwyrodnieniowa stawów³⁰, zapalenie błony śluzowej nosa³¹ oraz sepsa³². Nasze wyniki są zgodne z doniesieniami z tych badań: ekspresja NEAT1 jest znacząco podwyższona u pacjentów z IBS-D. Sugeruje to, że może ona być powiązana z wystąpieniem IBS-D. Obecnie diagnoza IBS-D opiera się głównie na kryteriach objawowych Rzym IV, a obiektywne biomarkery laboratoryjne nie są dostępne. Choć kryteria te okazały się skuteczne w badaniach i wielu zastosowaniach klinicznych, wciąż posiadają one ograniczenia, w tym subiektywizm, nakładanie się objawów z innymi chorobami oraz opóźnienia diagnostyczne. Dalsza analiza krzywej ROC wskazuje, że NEAT1 posiada stosunkowo dobrą wartość diagnostyczną u pacjentów z IBS-D. Poziomy ekspresji NEAT1 w surowicy skutecznie odróżniają pacjentów z IBS-D od zdrowej grupy kontrolnej, przy AUC wynoszącym 0,867 oraz wysokiej czułości i swoistości. Sugeruje to, że NEAT1 rokuje jako narzędzie uzupełniające kryteria Rzym IV w diagnostyce lub jako nowy marker diagnostyczny IBS-D. Na przykład pacjenci zgłaszający przewlekły ból brzucha i zmiany w rytmie wypróżnień, u których stwierdzono podwyższony poziom NEAT1, mogą zostać ocenieni z większą pewnością, gdy wyniki biomarkerów zostaną rozważone wraz z kryteriami Rzym IV. Ułatwia to wczesne wdrożenie leczenia celowanego w objawy i pozwala uniknąć niepotrzebnych badań inwazyjnych. I odwrotnie, w przypadku pacjentów z prawidłowymi wynikami biomarkerów, którzy spełniają kryteria Rzym IV, uzasadniony jest ściślejszy monitoring w celu wykluczenia innych chorób organicznych. Zatem oczekuje się, że włączenie tych biomarkerów do praktyki klinicznej poprawi dokładność i efektywność diagnostyki, choć nadal wymagana jest prospektywna walidacja w warunkach klinicznych.

Objawy kliniczne występujące u pacjentów z IBS-D mogą być związane z upośledzeniem funkcji bariery jelitowej³³. Funkcja ta jest zapośredniczona przede wszystkim przez strukturę połączeń ścisłych (TJ) pomiędzy komórkami nabłonka jelitowego, w których istotną rolę odgrywają białka ZO-1 i okludyna^34,35. ZO-1 bierze udział w utrzymaniu bariery mechanicznej i przepuszczalności nabłonka śluzowego³⁶. Okludyna odpowiada przede wszystkim za tworzenie połączeń ścisłych między komórkami, które są kluczowe dla zachowania ich funkcji barierowej³⁷. Białko połączeń ścisłych klaudyna-2 odgrywa ważną rolę m.in. w tworzeniu komórkowych kanałów porowych³⁸. U pacjentów z IBS-D poziom białek ZO-1 i okludyny jest zazwyczaj obniżony, poziom klaudyny-2 podwyższony, bariera jelitowa jest uszkodzona, a przepuszczalność zwiększona. W niniejszym badaniu stwierdzono, że wyciszenie NEAT1 zwiększyło TEER w komórkowym modelu in vitro, co potwierdza szkodliwy wpływ NEAT1 na barierę jelitową w tym modelu. Na poziomie molekularnym hamowanie ekspresji NEAT1 doprowadziło do znaczącego wzrostu poziomów ekspresji mRNA kluczowych białek połączeń ścisłych ZO-1 i okludyny, podczas gdy ekspresja klaudyny-2 uległa zmniejszeniu. Sugeruje to, że NEAT1 może negatywnie regulować ekspresję białek połączeń ścisłych, naruszając barierę fizyczną nabłonka jelitowego i zwiększając jego przepuszczalność. Ostatecznie może to prowadzić do zjawiska tzw. „przeciekającego jelita”. Ponadto, rozpowszechniony w IBS-D stan zapalny o niskim nasileniu jest istotnym czynnikiem zaostrzającym uszkodzenia bariery³⁹. Liczne badania potwierdziły, że lncRNA mogą pełnić funkcję kluczowych węzłów regulacyjnych w szlakach sygnalizacji zapalnej⁴⁰. Nasze badania są z tym spójne. Wyciszenie NEAT1 znacząco redukuje uwalnianie prozapalnych cytokin TNF-α, IL-6, IL-8 i IL-1β indukowanych przez LPS. Jest to bardzo podobne do roli NEAT1 jako prozapalnego lncRNA w innych modelach zapalnych, co wskazuje, że w IBS-D może występować błędne koło zapalenie-uszkodzenie bariery-zapalenie, w którym NEAT1 odgrywa istotną rolę.

MikroRNA (miRNA) stanowią kolejną istotną klasę czynników zaangażowanych w regulację chorób. miR-29b-3p wykazuje niski poziom ekspresji w różnych odpowiedziach zapalnych komórek indukowanych przez LPS.^41,42Zgodnie z większością badań stwierdziliśmy, że poziomy miR-29b-3p były wyraźnie obniżone w surowicy pacjentów z IBS-D i wykazywały silną ujemną korelację z NEAT1 nadekspresja. Wykazaliśmy ponadto, że NEAT1 bezpośrednio wiąże się z miR-29b-3p w cytoplazmie i działa jak gąbka dla tego miRNA w tym modelu. Eksperyment z przywróceniem funkcji wykazał ponadto, że NEAT1 wpływa na żywotność i apoptozę komórek Caco-2, a także na poziomy ZO-1, okludyna, i mRNA dla claudyny-2, przynajmniej częściowo za pośrednictwem miR-29b-3p, co w konsekwencji wpływa na szczelność bariery jelitowej. Co istotne, nasze dane wskazują, że w kontekście dysfunkcji bariery jelitowej związanej z ZKJ, poziomy miR-29b-3p korelują dodatnio z ZO-1 or poziomów okludyny. Ta pozytywna regulacja może być pośrednia; na przykład miR-29b-3p może hamować transkrypcję białek połączeń ścisłych poprzez celowanie w ich represory transkrypcyjne, co znosi represję i promuje ekspresję ZO-1 or okludynę. Hipotezę tę potwierdzają również wcześniejsze badania, w których wykazano, że miR-29b-3p pełni rolę ochronną w stanach zapalnych poprzez oddziaływanie na negatywne regulatory funkcji barierowej⁴².

Jednakże geny docelowe, poprzez które miR-29b-3p reguluje ekspresję mRNA ZO-1 oraz okludyny, wymagają dalszych badań w celu uzupełnienia sieci ceRNA, co stanowi ograniczenie niniejszego badania. Ponadto nasze badanie posiada inne ograniczenia: po pierwsze, była to analiza jednocentrowa z relatywnie małą wielkością próby (do badania włączono tylko 116 pacjentów z IBS-D). Kliniczna wartość diagnostyczna NEAT1 wciąż wymaga dalszej walidacji w ramach wieloośrodkowych, prospektywnych badań kohortowych na dużą skalę. Po drugie, badanie to opiera się głównie na analizie korelacji klinicznych i modelach komórkowych in vitro. W przyszłości konieczne będzie wykorzystanie modeli zwierzęcych, aby zweryfikować rolę tej osi in vivo. Po trzecie, specyficzna sieć genów docelowych downstream dla miR-29b-3p, zaangażowana w patogenezę IBS-D, nie została jeszcze w pełni wyjaśniona. Przyszłe badania powinny skupić się na: (1) walidacji wartości diagnostycznej NEAT1 i miR-29b-3p u pacjentów z IBS-C i IBS-M; (2) przetestowaniu skuteczności terapeutycznej interwencji celujących w NEAT1 w modelach zwierzęcych; oraz (3) wyjaśnieniu precyzyjnego mechanizmu molekularnego, za pomocą którego miR-29b-3p reguluje białka połączeń ścisłych. Takie działania ułatwią translację kliniczną naszych odkryć.

Podsumowując, NEAT1 wykazuje wysoką ekspresję u pacjentów z IBS-D i posiada znaczną wartość diagnostyczną w tej kohorcie. Niskie poziomy NEAT1 mogą promować żywotność komórek, redukować apoptozę, łagodzić uszkodzenia bariery jelitowej oraz hamować odpowiedzi zapalne poprzez zwiększenie poziomów miR-29b-3p w komórkach Caco-2 traktowanych LPS. Oś NEAT1/miR-29b-3p dostarcza nowej perspektywy na złożone mechanizmy patofizjologiczne IBS-D. NEAT1 może służyć jako potencjalny biomarker diagnostyczny IBS-D, a oś NEAT1/miR-29b-3p może stanowić potencjalny cel terapeutyczny w tej jednostce chorobowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki 24-dołkowe	Corning	CLS3524	Do wysiewania komórek
Płytki 96-dołkowe	Corning	CLS3599	Do wysiewania komórek w testach CCK-8
Zestaw do badania apoptozy Annexin V-FITC/PI	Invitrogen	V13242	Do oznaczania poziomu apoptozy
Przeciwciało monoklonalne przeciwko AGO2	Proteintech	67934-1-Ig	Do immunoprecypitacji kompleksów RNA związanych z Ago2
Przeciwciało przeciwko Klaudynie-2	Invitrogen	32-5600	Przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało przeciwko GAPDH	Cell Signaling Technology	5174	Przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:5000; kontrola ładowania
Przeciwciało przeciwko ludzkim IgG	Proteintech	10284-1-AP	Stosowane jako kontrola negatywna w analizie RIP
Przeciwciało przeciwko Okludynie	Abcam	ab31721	Przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:500
Przeciwciało przeciwko ZO-1	Proteintech	21773-1-AP	Przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczenie 1:1000
Komórki Caco-2	SUNNCELL	SNL-068	Do tworzenia modeli bariery nabłonka jelitowego
Zestaw CCK-8	Solarbio	CA1210	Zestaw do analizy proliferacji komórek
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	Do rozdziału faz podczas ekstrakcji RNA
Pożywka DMEM	Gibco	11965092	Do hodowli komórek
Zestaw do analizy Dual-Luciferase Reporter	ThermoFisher	16186	Do oznaczania aktywności lucyferazy
Zestaw ELISA (dla IL-1β)	R&D Systems	DY201	Do oznaczania białek docelowych w nadsączach hodowli komórkowych
Zestaw ELISA (dla IL-6)	R&D Systems	D6050B	Do oznaczania białek docelowych w nadsączach hodowli komórkowych
Zestaw ELISA (dla IL-8)	R&D Systems	NBP3-28022	Do oznaczania białek docelowych w nadsączach hodowli komórkowych
Zestaw ELISA (dla TNF-α)	R&D Systems	DTA00D	Do oznaczania białek docelowych w nadsączach hodowli komórkowych
Substrat do wzmocnionej chemiluminescencji (ECL)	Thermo Fisher	32106	Do wizualizacji prążków białkowych
Etanol (75%)	Sigma-Aldrich	459844	Do przemywania osadu RNA
FBS (płodowa surowica bydlęca)	Gibco	10099141	Do hodowli komórek
Cytometr przepływowy	Beckman Coulter	B53002	Do oznaczania poziomu apoptozy
Przeciwciała wtórne sprzężone z HRP	Cell Signaling Technology	7074	Katalizują generowanie sygnału chemiluminescencyjnego z substratów ECL
Izopropanol	Sigma-Aldrich	1133502500	Do precypitacji RNA
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	Odczynnik do transfekcji
Lipopolisacharyd (LPS)	Sigma-Aldrich	L2880	Do indukowania tworzenia modelu komórkowego
Czytnik mikropłytek	BioTek	Epoch 2	Do pomiaru absorbancji próbek w płytkach 96-dołkowych
Mikrospektrofotometr Nanodrop	Thermo Scientific	ND-2000C	Do oznaczania stężenia i czystości RNA
Odtłuszczone mleko w proszku	Coolaber	CN7861	Do blokowania membran (roztwór 5%)
Zestaw PARIS	Thermo Fisher	AM1921	Do frakcjonowania jądrowo-cytoplazmatycznego
Penicylina–Streptomycyna	Gibco	15140122	W celu ochrony hodowli komórkowych przed kontaminacją
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA	Thermo Fisher	23225	Do oznaczania stężeń białek
Wektor Dual-Luciferase pmirGLO	Promega	E1330	Wektor reporterowy z podwójną lucyferazą
Zestaw odczynników PrimeScript RT	Takara	RR047A	Do odwrotnej transkrypcji RNA do cDNA
Membrana PVDF	Millipore	IPVH00010	Do transferu białek po SDS-PAGE
System do ilościowego PCR w czasie rzeczywistym z detekcją fluorescencyjną	Applied Biosystems	4365464	Do oznaczania genów docelowych
Bufor do lizy RIPA (z inhibitorami proteaz)	Thermo Fisher	89901	Do ekstrakcji białek całkowitych z komórek
Zestaw do immunoprecypitacji białek wiążących RNA	Sigma-Aldrich	17-701	Analiza immunoprecypitacji białek wiążących RNA (RIP) z użyciem magnetycznych kulek Protein A/G
Odczynniki do SDS-PAGE (żel 10%)	TargetMol	C0189	Do rozdziału białek według masy cząsteczkowej
SYBR Green master mix	Thermo Fisher	4309155	Do stosowania w testach PCR
Miernik TEER (woltomierz)	Millipore	MERS00002	Miernik oporu przezbłonowego, do pomiaru integralności warstwy pojedynczej
Komory Transwell	Corning Costar	CLS3413	Do hodowli monowarstw komórek i pomiaru TEER
Odczynnik TRIzol	Invitrogen	15596026CN	Do ekstrakcji całkowitego RNA