Stowarzyszenie surowicowego lncRNA CASC11 z ciężkością urazu i stanem zapalnym w urazie rdzenia kręgowego

Podsumowanie

U pacjentów z uszkodzeniem rdzenia kręgowego (SCI) uporządkowanie CASC11 jest związane z ciężkością obrażeń. In vitro, downregulacja CASC11 łagodzi apoptozę i stany zapalne, sugerując związek z osią miR-130b-5p/SPP1. Te wyniki sugerują potencjalną rolę CASC11 jako kandydata biomarkera w patogenezie SCI.

Streszczenie

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) jest poważnym urazem ośrodkowego układu nerwowego. To jednocentrowé, obserwacyjne i in vitro badanie zbadał potencjał diagnostyczny CASC11 oraz jego możliwy mechanizm regulacji w SCI z wykorzystaniem klinicznych próbek surowicy i modeli komórek stymulowanych lipopolisacharydami.poziomy CASC11, miR-130b-5p i SPP1 zmierzono za pomocą czasowej reakcji łańcuchowej polimerazy w rzeczywistym czasie (RT-qPCR). Funkcje komórkowe i relacje dotyczące docelowych obszarów oceniono za pomocą zestawu do liczenia komórek kit-8 (CCK-8), cytometrii przepływowej, western blot, enzymatycznego testu immunosorbentowego (ELISA), raportu dual-luciferase oraz testu RNA immunoprecipitation (RIP). CASC11 był wysoce ekspresowany w SCI i związany z stanem zapalnym jako potencjalny biomarker diagnostyczny. W komórkach PC-12 traktowanych lipopolisacharydami (LPS), wyciszenie CASC11 łagodziło stłumioną aktywność komórek, apoptozę i stan zapalny, co zostało odwrócone przez inhibitor miR-130b-5p. Te odkrycia sugerują, że CASC11 jest związany z ciężkością SCI, podczas gdy dane in vitro wskazują na jego udział w odpowiedziach zapalnych i apoptotycznych poprzez osie CASC11/miR-130b-5p/SPP1. Badanie to jest ograniczone przez swój jednocentrowy projekt i brak potwierdzenia in vivo.

Wprowadzenie

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) oznacza tymczasowe lub trwałe zaburzenie układowe wynikające z uszkodzenia rdzenia kręgowego spowodowane siłami zewnętrznym lub chorobami, prowadzące do upośledzenia funkcji układu nerwowego ruchowego, czuciowego, odruchowego i autonomicznego^1,2. Pacjenci często napotykają na trwałe niedobory czynności fizycznych i powikłania, powodując znaczne cierpienia i obciążenia dla osób i rodzin. Etiologia SCI jest ogólnie klasyfikowana na urazy traumatyczne i nietraumatyczne pochodzenie³. Urazy traumatyczne, głównie wynikające z złamań kręgosłupa z powodu zewnętrznych sił, takich jak wypadki drogowe, upadki z wysokości i zdarzenia sportowe, stanowią rosnące wyzwanie w klinicznym zarządzaniu SCI⁴. Tymczasem kaskady wtórnych uszkodzeń inicjowane po początkowym urazie, szczególnie dysregulacja odpowiedzi zapalnej i apoptozy neuronów, są uważane za kluczowe czynniki przyczyniające się do ciągłego pogorszenia funkcji neurologicznych. Ostatnie badania podkreśliły krytyczną rolę neurozapalenie, regeneracji i odzysku funkcji w patofizjologii i naprawie SCI⁵. Jako centralna reakcja wtórna, neurozapalenie odgrywa podwójną rolę w procesie uszkodzenia i naprawy tkanek. Biorąc pod uwagę ograniczoną zdolność regeneracyjną uszkodzonego rdzenia kręgowego, wymagany jest synergistyczny podejście terapeutyczne łączące leczenie przeciwzapalne, przeszczepianie komórek, rehabilitację i interwencje molekularne⁶. Chociaż zakres diagnostyczny i terapeutycznych strategii został ustalony dla SCI, obecna praktyka klinicznna jest głównie zależna od badań obrazowych⁷. Jednak te techniki są ograniczone przez wysokie wymagania sprzętowe, rygorystyczne wymagania dla pacjenta i znaczne koszty finansowe⁸. W związku z tym istnieje pilna i niezadość spełniona potrzeba wygodnego, dokładnego i nieinwazyjnego biomarkera laboratoryjnego. Identyfikacja takiego markera umożliwiłaby wczesne rozpoznanie SCI bez zakłócania konwencjonalnych protokołów leczenia, ułatwiając tym samym opracowanie bardziej terminowych i skutecznych interwencji terapeutycznych.

Długie niekodujące RNA (lncRNA) reprezentują główną kategorię funkcjonalnych cząsteczek RNA, które, mimo braku potencjału kodowania białek, są integralnymi częściami szerokiej gamy funkcji biologicznych, w tym regulacji zapalenia i apoptozy⁹. LncRNA działają jako molekularne gąbki dla microRNA (miRNA), skutecznie uniemożliwiając tym miRNA powiązanie się z i wyciszenie ich docelowych mRNA¹⁰. Na przykład, lncRNA MAGI2-AS3 pośredniczy w miR-223-3p, przyspieszając gojenie się złamań¹¹. Targetowanie sieci lncRNA OIP5-AS1/miR-128-3p/Nrf2 przedstawia obiecujące podejście terapeutyczne do poprawy regeneracji w SCI¹². CASC11 charakteryzuje się 872-bp transkryptem zlokalizowanym na chromosomie 8q24.21, jest rozpoznawany jako cząsteczka o nieprawidłowej ekspresji w różnych rakach u ludzi¹³. CASC11 wykazuje pozytywną ekspresję u pacjentów z osteoporozą po menopauzie i ma zdolność do rozróżniania osób dotkniętych chorobą od zdrowych kontroli¹⁴. Ponadto, CASC11 wykazuje podobny wzór nadekspresji i potencjał terapeutyczny u pacjentów z złamaniami¹⁵. Na podstawie tych raportów, CASC11 może regulować reakcje zapalne i aktywność komórkową. Mimo tych wskazówek, wzór ekspresji i biologiczna rola CASC11 w SCI pozostają całkowicie nieznane. Biorąc pod uwagę, że nadmierne zapalenie i apoptoza są głównymi czynnikami napędzającymi wtórnego SCI, założyliśmy, że CASC11 może być kandydacki biomarkerem i czynnikiem regulacyjnym w SCI. Niniejsze badanie zbadał kliniczne skojarzenie i potencjał biomarkera CASC11 w SCI poprzez analizę kohorty pacjentów i modeli komórkowych in vitro (rysunek 1). Ponadto, zbadaliśmy możliwy mechanizm molekularny CASC11, w tym jego potencjalną rolę w modyfikacji reakcji zapalnej po SCI.

Protokół

Rekrutacja osób badanych

Pacjenci z ostrym urazem kręgosłupa (n = 300) leczeni w szpitalu od stycznia 2023 do maja 2025 roku zostali wybrani i sklasyfikowani w grupie całkowitego uszkodzenia rdzenia kręgowego (CSCI) (stopień A, n = 98), grupie niecałkowitego uszkodzenia rdzenia kręgowego (ISCI) (stopnie B, C i D; n = 95) oraz grupie z normalną funkcją neurologiczną (NNF) (stopień E, n = 107) zgodnie ze skalą upośledzenia American Spinal Injury Association (klasyfikacja AIS). Dla pacjentów z grupy NNF radiologiczne dowody na USK, takie jak obrzęk, stłuczenie lub ucisk, potwierdzono za pomocą obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI), ale nie wykazano żadnych deficytów czuciowych czy ruchowych. Kolejnych 90 zdrowych uczestników rekrutowanych w tym samym okresie wybrano jako grupę kontrolną. Kryteriami włączenia były: (1) rozpoznanie USK potwierdzone obrazowaniem (MRI lub CT), zgodnie z uznanymi wytycznymi dotyczącymi zarządzania klinicznego¹⁶; (2) uraz poniesiony w ciągu 24 godzin przed przyjęciem do szpitala; oraz (3) pełnoletni uczestnicy z pełnymi danymi klinicznymi. Kryteriami wykluczenia były: (1) historia wcześniejszej operacji związanej z złamaniem czy USK; (2) ciężka choroba tętnic wieńcowych lub istotna choroba układu krążenia i oddechowego; (3) ostra ciężka urazowa choroba czaszkowo-mózgowa; oraz (4) złośliwe guzy, choroby układu krążenia/mózgowo-naczyniowych lub choroby układu odpornościowego. Zgoda na przeprowadzenie tej badania została uzyskana od Komitetu Etycznego Czwartego Szpitala Ludowego w Shenzhen, a pacjenci zgodzili się na udział w badaniu. Zastosowane w badaniu procedury zgodne były z zasadami Deklaracji Helsińskiej.

Zbieranie próbek

Próbki krwi żylnej (5 ml) pobrano od uczestników podczas przyjęcia za pomocą rurek z separatorem surowicy w ciągu 24 godzin po urazie. Krew pozostawiono do zakrzepania w temperaturze pokojowej przez 30 min, a następnie wyśrodkowano w temperaturze 4 °C z prędkością 3000 x g przez 10 min. Surowica nadstanowa została starannie oddzielona, podzielona na części i przechowywana w temperaturze -80 °C do dalszej analizy.

Hodowla komórek i indukcja LPS

Komórki rakomochromocytomu szczura (PC-12) i komórki mikrogleju mysiego (BV-2) hodowano w pożywce Dulbecco’s zmodyfikowanej dla orła, uzupełnionej o 10% surowicy płodowej wołowej, w temperaturze 37 °C. Aby stworzyć in vitro modele uszkodzenia zapalnego, komórki PC-12 i BV-2 były eksponowane na działanie lipopolisacharydu (LPS) w stężeniach 0, 1, 5 i 10 μg/ml przez 12 godzin¹⁷. Każde stężenie było testowane w trzech niezależnych replikowanych biologii.

RT-qPCR

Całkowite RNA zostało izolowane z próbek za pomocą protokołu ekstrakcji fenol-chloroformowej, a następnie wytrącono za pomocą izopropanolu. Czystość RNA oceniono za pomocą spektrofotometrii, a próbki o stosunku A_{260/280 nm} w zakresie 1,8–2,1 wykorzystano do dalszej analizy. RNA została odwrotnie transkrybowana na cDNA zgodnie z protokołem zestawu do odwrotnej transkrypcji, a uzyskany cDNA został użyty jako szablon dla reakcji RT-qPCR z mieszanką SYBR Green na urządzeniu PCR. Gliceraldehydo-3-fosforan dehydrogenaza (GAPDH) została użyta jako gen referencyjny dla CASC11 i SPP1 mRNA, a mała nuklearna RNA (U6) została użyta jako gen referencyjny dla miR-130b-5p. Dla próbek surowicy syntetyczne cel-miR-39 zostało dodane do surowicy przed wyekstrahowaną RNA w celu kontroli zmian w odzyskiwaniu RNA. Pierwszare to: CASC11 do przodu 5'-ACCCTATGGAGAACCGAGAC-3' i odwrotnie 5'-GAGGACCAACTCAGTAGGAAAT-3'; miR-130b-5p do przodu 5'-ATCCATGGTTGAGCTTCCCG-3' i odwrotnie 5'-TAGTGCAACCTCGTCAGAGC-3'; i SPP1 mRNA do przodu 5'-GTTAAACAGGCTGATTCTGG-3' i odwrotnie 5'-CATGGTCATCATCATCTTCA-3'. Ekspresję obliczono za pomocą metody 2^-ΔΔCt. Każda reakcja RT-qPCR była przeprowadzana w trzech technicznych replikowanych z trzema biologicznymi replikowanymi.

Transfekcja

Wyciszenie CASC11 (si-CASC11), naśladownik/inhibitor miR-130b-5p, nadekspresja plazmidu SPP1 (ov-SPP1) i ich odpowiednie kontrole negatywne (NC) zostały syntetyzowane i przetransfekowane do komórek PC-12 i BV-2 za pomocą reagentu transfekcyjnego. Skuteczność transfekcji oceniono 48 godzin po transfekcji w trzech niezależnych replikowanych biologii.

Wyniki

Podstawowe dane dotyczące badanych

Charakterystyka początkowa pacjentów w grupach Kontrolnej, NNF, ISCI i CSCI przedstawiona jest w Tabeli 1. Analiza statystyczna nie wykazała istotnych różnic między grupami w zmiennych takich jak płeć, wiek, wskaźnik masy ciała (BMI), etiologia urazu i czas urazu (P > 0,05). Istotne różnice między czterema grupami obserwowano w przypadku długości pobytu, stopnia ASIA i stężenia pro-zapalnych cytokin takich jak czynni...

Dyskusja

SCI to wyniszczająca choroba ośrodkowego układu nerwowego, która często prowadzi do znaczących niedoborów w czuciowości, kontroli ruchowej i funkcji układu autonomicznego, co znacząco obniża jakość życia pacjenta i jego dalszy rokowanie¹⁸. Pacjenci mogą prezentować upośledzenie funkcjonalne i utratę czucia po urazie kręgosłupa, a badania obrazowe (takie jak MRI) mogą być wykorzystywane do oceny wystąpienia SCI¹⁹. Początek SCI wyzwala szkodliwe kaskady uszkodzeń wtórnych, kt...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BCA protein assay kit	Yeasen, China	P0010
CCK-8 solution	Sigma-Aldrich, USA	96992
Dual-luciferase reporter vector	Promega, USA	E133A	wektor pmirGLO
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	ATCC, Manassas, VA, USA	30-2002
ELISA kit for IL-1β	R&D Systems, USA	DY401
ELISA kit for IL-6	R&D Systems, USA	HS600B
ELISA kit for TNF-α	R&D Systems, USA	DTA00C
Fetal bovine serum	Gibco, Grand Island, NY, USA	10099141
Flow cytometer	BD FACSCalibur, USA	FACS101
Image analysis software	NIH, Bethesda, MD, USA	version 1.44p	oprogramowanie ImageJ
Isopropanol	Beijing Chemical Factory, China	32064
Lipid-based transfection reagent	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	L3000008	Lipofectamine 3000
Lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich, USA	L2880
Lysis buffer	Beyotime, China	P0013D	bufor RIPA
Microplate reader	Reagen, China	RNE90002
PC-12 and BV-2 cells	ATCC, Manassas, USA
Phenol-chloroform reagent	Thermo, USA	15596026	reagent Trizol
Reverse transcription kit	Takara, Japan	RR047A	PrimeScript RT Kit
RNA-binding protein immunoprecipitation kit	Millipore, USA	17-700	Magna RIP Kit
RNase-free microtubes	Axygen, Corning, NY, USA	MCT-150-C-S
Serum separator tubes	Terumo, Tokyo, Japan	VP-AS109K60
Statistical analysis software	San Diego, USA	version 9.0	GraphPad Prism
SYBR Green premix	Takara, Japan	RR420A	SYBR Premix Ex Taq