Artykuł metodologiczny

Mikropłytka platforma do badania mikrobiologicznego wytrącania tlenków metali w mediach porowatych

238 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71047

⸱

12 czerwca 2026

 ,  ,  , 
1Department of Civil and Environmental Engineering, University of California, Davis, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis, 3Energy Geosciences Division, Earth and Environmental Sciences Area, Lawrence Berkeley National Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia system mikrofluidyczny do badania mikrobiologiczne precipitacji minerałów tlenku manganu. Powstawanie biomineralu jest mierzone in situ za pomocą mikroskopii optycznej i analizy obrazu. To podejście może być dostosowane do badania precipitacji innych charakterystycznie zabarwionych biogenicznych minerałów w środowiskach porowatych.

Streszczenie

Drobnoustroje powszechnie wytrącają nanocząstki tlenków metali w glebach, osadach i innych środowiskach porowatych istotnych z ekologicznego punktu widzenia. Jednak formacja i reaktywność tlenków manganu (Mn) i żelaza (Fe) pozostają słabo scharakteryzowane w fizycznie złożonych środowiskach. Chociaż systemy laboratoryjne mogą uwzględniać porowate media jako podłoże, wymagają destrukcyjnego pobierania próbek i nie nadają się łatwo do analiz na skalę porów. Dynamiczna, ale niedostępna natura porowatych mediów wymaga zatem możliwości rozdzielania mikrobialnie pośredniczonej precipitacji minerałów in situ i w czasie rzeczywistym. Aby uzupełnić tę lukę, opracowano platformę mikrofluidyczną do oceny mikrobialnej precipitacji tlenków metali w modelowej przestrzeni porowej. Ta platforma jest zweryfikowana z użyciem bakteryjnego gatunku wytrącającego Mn Pseudomonas putida GB-1. Rozwój biofilmu i związana z tym precipitacja tlenku Mn są wizualizowane w ciągłym przepływie z mikroskopią kolorowej jasnego pola z techniką time-lapse. Algorytm subtrakcji obrazów jest następnie łączony z pomiarami masy końcowej, aby oszacować szybkość precipitacji tlenku Mn. To podejście zapewnia narzędzie do systematycznego testowania, jak mikrobiальna precipitacja tlenków metali zmienia się w odpowiedzi na zmieniające się warunki fizyczne i chemiczne.

Wprowadzenie

Minerały tlenków metali odgrywają krytyczną rolę w cyklu biogeochemicznym1. Tlenki manganu (Mn) i żelaza (Fe) są naładowane ujemnie w pH zbliżonym do neutralnego i łatwo adsorbują metale kationowe2,3,4,5,6,7,8, regulując dostępność mikroelementów i mobilność zanieczyszczeń w reozymie i strefie hiporhealnej. Minerały te wpływają na stabilność i degradację materii organicznej9,10,11,12, determinując absorpcję węgla przez rośliny i mikroby glebowe. W systemach inżynieryjnych (np. filtrach do uzdatniania wody, sztucznych mokradlach) osadzanie tlenków metali jest bezpośrednio wykorzystywane do usuwania Mn lub Fe i remediacji współwystępujących zanieczyszczeń13,14,15,16,17. Te tlenki metali są rozpoznawalne po ich charakterystycznych kolorach, które wahają się od okrowego do ciemnobrązowego i czarnego18,19.

Precypitacja tlenków metali jest zwykle ułatwiana przez mikroorganizmy w procesie znanym jako biomineralizacja20,21,22. Liczne bakterie i grzyby utleniające Mn syntezują wielomiedziowe oksydazy i peroksydazy, które katalizują transfer elektronów z Mn(II) do Mn(III) i Mn(IV) w warunkach tlenowych, co prowadzi do osadzenia tlenków Mn(III, IV) przypominających birnessyt2,23,24. Ponadto, zróżnicowane bakterie utleniające Fe enzymatycznie utleniają Fe(II) do Fe(III) w warunkach obniżonego pH lub niskietlenowych, produkując (oksy)hydr(oksydy) Fe(II, III), w tym ferrihydryt i magnetyt25,26,27,28. Te biogeniczne minerały osadzają się obok powierzchni komórkowych i gromadzą na polimerach pozakomórkowych, osłonkach i innych strukturach komórkowych, tworząc zespoły mikroby-minerał2,23,25,27,29,30.

Mimo powszechności biomineralizacji Mn i Fe w złożonych środowiskach, brakuje szczegółowych informacji na skalę porów. Przestrzenie porowe są strukturalnie heterogeniczne, wykazując preferencyjny przepływ płynów i nieuniformny transport reaktantów, które determinują dystrybucję reakcji biogeochemicznych31,32,33,34,35. Co więcej, aktywność mikrobiologiczna może generować lokalne gradienty geochemiczne, które promuje lub ogranicza biomineralizację, podczas gdy fluktuacje w chemii płynu porowego (np. pH, rozpuszczony tlen, potencjał redoks) mogą wzmacniać osadzanie minerałów lub ułatwiać rozpuszczanie34,35. Badania nad biomineralizacją Mn i Fe zazwyczaj polegają albo na warunkach dobrze wymieszanych w partii30,36,37,38,39,40 lub kolumnach41,42,43,44 do ilościowego określania kinetyki utleniania lub charakteryzowania osadów biomineralnych. Jednak eksperymenty w partii nie mają heterogeniczności przestrzennej niezbędnej dla środowisk porowych. Kolumny zawierające spakowane granulaty zapewniają odpowiednią architekturę fizyczną, ale są ograniczone w swojej użyteczności, ponieważ wymagają destrukcyjnego pobierania próbek w statycznych punktach czasowych, co zatrzymuje postęp eksperymentu i uniemożliwia niezakłócone obserwacje na skalę porów. Dlatego potrzebne są nowe podejścia eksperymentalne do badania mikrobialnego osadzania tlenków metali w środowiskach porowych.

Systemy mikrofluidalne są narzędziem do badania reakcji biogeochemicznych in situ i w czasie rzeczywistym. Reaktory mikrofluidalne mogą być szybko i tanio wykonane z powtarzalnymi i dostosowywalnymi geometriami, które symulują naturalne lub idealizowane środowiska porowe45. Powstałe urządzenia są optycznie przejrzyste, ułatwiając niedestrukcyjną wizualizację i ilościową ocenę procesów na skalę porów, w tym tworzenie biofilmu46,47,<

Protokół

UWAGA: Niniejszy protokół opiera się na kilku założeniach dotyczących wiedzy użytkownika oraz dostępnej aparatury. Po pierwsze, użytkownicy powinni mieć dostęp do pomieszczenia czystego (cleanroom) i znać procedury fotolitografii w celu wykonania formy mikrofluidycznej lub nabyć gotową formę komercyjną. Następnie, użytkownicy powinni być zaznajomieni z podstawowymi metodami mikrobiologicznymi, takimi jak stosowanie technik aseptycznych, przygotowywanie roztworów stokowych oraz wysiewanie na płytki. Użytkownicy muszą mieć również dostęp do autoklawu, mikrowirówki, inkubatora z wytrząsaniem oraz spektrometru mas. Na koniec, użytkownicy powinni biegle posługiwać się mikroskopią optyczną i analizą obrazu.

1. Wytwarzanie i montaż reaktora mikroprzepływowego

UWAGA: Reaktory mikrofluidyczne użyte w tym protokole zostały zaprojektowane w programie AutoCAD z geometrią ziaren piasku zaadaptowaną z pracy Wang i wsp.55. Każda forma pozwala na wytworzenie sześciu powtarzalnych kanałów z przestrzenią porów 15 mm × 10 mm, porowatością 0,41 i objętością porów 2,3 µL. Z wyjątkiem obróbki plazmowej, reaktory są wytwarzane w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu utrzymania środowiska o niskim zapyleniu.

  1. Odlej kanały mikrofluidyczne z polidimetylosiloksanu (PDMS) metodą miękkiej litografii.
    1. W plastikowym kubku odważ bazę elastomeru i utwardzacz w stosunku 10:1 (tutaj odpowiednio 25 g i 2,5 g).
    2. Za pomocą plastikowego noża dokładnie wymieszaj bazę elastomeru i utwardzacz przez 10 min.
    3. Odgazuj PDMS w kubku w desykatorze próżniowym przez 1 h, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
    4. Wlej PDMS do formy i odgazuj przez 30 min, aby usunąć pozostałe powietrze.
    5. Umieść formę na płycie grzewczej i utwardzaj przez 3 h w temperaturze 95 °C.
    6. Po utwardzeniu i ochłodzeniu wytnij PDMS skalpelem i odklej go od formy.
    7. Na macie do cięcia rozdziel sześć kanałów mikrofluidycznych za pomocą żyletki, pozostawiając 2–3 mm marginesu wokół każdego kanału. W każdym kanale wykonaj otwory wlotowe i wylotowe za pomocą wycinaka do biopsji.
    8. Przykryj obie strony każdego kanału mikrofluidycznego paskiem przezroczystej taśmy, aby zapobiec osadzaniu się kurzu, i przechowuj w szalce Petriego o średnicy 100 mm.
  2. Na jeden dzień przed eksperymentem zmontuj końcowy reaktor mikrofluidyczny przy użyciu plazmy powietrznej.
    1. Usuń przezroczystą taśmę z jednego kanału mikrofluidycznego, a następnie opłucz PDMS oraz szklaną lamellkę 70% etanolem i wysusz sprężonym azotem.
      ​UWAGA: Etanol jest łatwopalny. Należy go używać i przechowywać zgodnie z kartą charakterystyki bezpieczeństwa.
    2. Umieść kanał mikrofluidyczny i lamellkę stroną górną do góry w oczyszczaczu plazmowym. Opróżnij komorę z powietrza przez 1 min, a następnie zastosuj plazmę przez 1 min (18 W i ~0,5 torr).
    3. Wyjmij kanał mikrofluidyczny i lamellkę z oczyszczacza plazmowego, a następnie nałóż lamellkę na PDMS, delikatnie opukując, aby zapewnić wiązanie. Przechowuj zmontowany reaktor w szalce Petriego o średnicy 100 mm przez noc.

2. Mikrofluidyczny system kontroli przepływu

UWAGA: W celu ułatwienia sekwencyjnego wstrzykiwania płynów przy minimalnych zakłóceniach ciśnienia i szybkości przepływu zastosowano modułowy system firmy Elveflow. Komponenty systemu obejmują kompresor powietrza, kontroler przepływu, zawór rozdzielczy, czujnik przepływu, stojak na zbiorniki z płynami (dla probówek stożkowych 15-mL) oraz oprogramowanie Elveflow Smart Interface (ESI) (Rysunek 1). Można stosować inne systemy kontroli przepływu, takie jak pompy strzykawkowe, działające w trybie infuzji lub wycofywania, z dedykowanymi strzykawkami lub zbiornikami dla każdego roztworu wejściowego oraz zaworem rozdzielczym o małej objętości martwej, aby umożliwić sekwencyjne wstrzykiwanie płynów przez jedną linię prowadzącą. Należy jednak zachować ostrożność podczas korzystania z pomp strzykawkowych, aby zminimalizować wahania ciśnienia, które mogą spowodować oderwanie biofilmu.

Schemat systemu chromatograficznego; konfiguracja eksperymentu rozdzielania DNA; obejmuje ścieżkę analizy i detektor.
Rysunek 1: System kontroli przepływu i geometria reaktora mikroprzepływowego. System eksperymentalny składa się z kontrolera przepływu (1) połączonego za pomocą przewodów pneumatycznych (2) ze stojakiem z rezerwuarem cieczy (3), zaworu rozdzielającego służącego do sekwencyjnego wstrzykiwania pożywki wzrostowej (GMMn) i roztworu soli (SSMn) (4), czujnika przepływu (5) połączonego z kontrolerem przepływu w celu zapewnienia informacji zwrotnej w czasie rzeczywistym i regulacji przepływu (6), rurki PEEK o małej średnicy wewnętrznej w celu zapewnienia oporu hydraulicznego (7) oraz pułapki na pęcherzyki powietrza (8) przed reaktorem mikroprzepływowym (9). Schemat systemu nie zachowuje proporcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Przygotować i skalibrować cały sprzęt zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Statyw z rezerwuarem cieczy, zawór rozdzielający i czujnik przepływu są zainstalowane wewnątrz specjalnie zbudowanego inkubatora mikroskopowego, aby utrzymać temperaturę eksperymentu na poziomie 30 °C.
  2. Ustawić regulator ciśnienia kompresora powietrza na 3 bar i połączyć wylot kompresora z wlotem kontrolera przepływu za pomocą pneumatycznego przewodu poliuretanowego.
  3. Do wylotu kontrolera przepływu przyłączyć filtr hydrofobowy w celu zapobiegania cofaniu się cieczy, a następnie połączyć kontroler przepływu z dwoma portami wlotowymi statywu z rezerwuarem cieczy za pomocą pneumatycznego przewodu z polieteru poliuretanowego, wykorzystując kolektor i adaptery z kolcami.
  4. Połączyć statyw z rezerwuarem cieczy, zawór rozdzielający i czujnik przepływu za pomocą przewodów w następujący sposób, stosując złączki bezkołnierzowe dla przewodów o średnicy zewnętrznej 1/16-in, chyba że zaznaczono inaczej.
    1. Połączyć dwa porty wylotowe statywu z rezerwuarem cieczy z dwoma pierwszymi portami wlotowymi zaworu rozdzielającego za pomocą 80 cm przewodu z politetrafluoroetylenu (PTFE) o średnicy wewnętrznej (ID) 1/32-in.
    2. Połączyć port wylotowy zaworu rozdzielającego z portem wlotowym czujnika przepływu za pomocą 15 cm przewodu PTFE o średnicy wewnętrznej 500-µm i złączki adapterowej.
    3. Do portu wylotowego czujnika przepływu przyłączyć 60 cm przewodu z polieteroeteroketonu (PEEK) o średnicy wewnętrznej 63,5-µm, używając złączki adapterowej.
      UWAGA: W przypadku eksperymentów wymagających innych szybkości przepływu należy dostosować długość przewodu PEEK tak, aby zapewnić wystarczający opór hydrauliczny dla stabilności przepływu.
    4. Połączyć przewód PEEK z 10 cm przewodu PTFE o średnicy wewnętrznej 500-µm za pomocą złączki łączącej.
    5. Przyłączyć przewód PTFE do portu wlotowego mikroprzepływowej pułapki na pęcherzyki wyposażonej w membranowy filtr PTFE (rozmiar porów ~10 µm).
    6. Do portu wylotowego pułapki na pęcherzyki przyłączyć 75 cm przewodu PTFE o średnicy wewnętrznej 200-µm w celu wytworzenia ciśnienia wstecznego dla skutecznego usuwania pęcherzyków. Przewód ten zostanie podłączony do otworu wlotowego reaktora mikroprzepływowego.
  5. Przed każdym eksperymentem wysterylizować system kontroli przepływu wraz ze wszystkimi podłączonymi przewodami i sprzętem, przepłukując go 1% roztworem wybielacza w ilości odpowiadającej trzykrotnej objętości systemu (~4 h na linię przewodów przy 7,0 µL·min-1), a następnie sterylną wodą ultrapure przez ten sam czas.
  6. Pomiędzy eksperymentami czyścić system kontroli przepływu w następujący sposób.
    1. Przepłukać zawór rozdzielający i czujnik przepływu, stosując 100% izopropanol i sterylną wodę ultrapure, aby zapobiec gromadzeniu się osadów lub precypitatów.
      ​OSTRZEŻENIE: Izopropanol jest łatwopalny. Należy go obchodzić i przechowywać zgodnie z kartą charakterystyki bezpieczeństwa.
    2. Zautoklawować pułapkę na pęcherzyki.
    3. Wymieniać membranowy filtr pułapki na pęcherzyki oraz przewód PTFE o średnicy wewnętrznej 200-µm po każdym eksperymencie, aby zapobiec zapchaniu (filtr membranowy) lub kolonizacji bakteryjnej (przewody).

3. Pożywki i roztwory eksperymentalne

  1. Przygotować płynną pożywkę Luria Broth (LB, formulacja Millera), autoklawując 2,5% proszku LB w wodzie ultrapurej w temperaturze 121 °C przez 20 min. W przypadku płytek z agarem LB, autoklawować 2,5% proszku LB i 1,5% agaru w wodzie ultrapurej w temperaturze 121 °C przez 20 min, następnie wlać do 100-mm szalek Petriego (~20 mL na szalkę) i pozostawić do ostygnięcia i stężenia.
  2. Z roztworów zapasowych sterylizowanych filtracyjnie, przygotowanych z odczynników klasy American Chemical Society (ACS) lub klasy bakteriologicznej w wodzie ultrapurej, przygotować po 30 mL każdego z poniższych roztworów. Skład roztworu soli oraz pożywki wzrostowej opracowano na podstawie Gehin et al.59.
    1. Przygotować roztwór soli bez Mn(II) (SS0): 0,4 mM CaCl2·2H2O, 0,25 mM MgSO4·7H2O, 0,25 mM Na2HPO4·2H2O, 0,15 mM KH2PO4, 1:2 Fe(III)-EDTA (20 µM FeCl3·6H2O i 40 µM EDTA z pH dostosowanym do 6,5 za pomocą 1M NaOH), bufor HEPES 10 mM (z pH dostosowanym do 7,0 za pomocą 1M NaOH), 5 mM (NH4)2SO4 oraz śladowe ilości metali (40 nM CuSO4·5H2O, 273 nM ZnSO4·7H2O, 84 nM CoCl2·6H2O, 53,7 nM Na2MoO4·2H2O) w sterylnej wodzie ultrapurej.
    2. Przygotować roztwór soli z Mn(II) (SSMn): Taki sam jak SS0 z dodatkiem 50 µM MnCl2·4H2O.
    3. Przygotować pożywkę wzrostową bez Mn(II) (GM0): Taka sama jak SS0 z dodatkiem 1,5 g·L-1 ekstraktu z drożdży i 1,5 g·L-1 kwasów kasamino.
    4. Przygotować pożywkę wzrostową z Mn(II) (GMMn): Taka sama jak GM0 z dodatkiem 50 µM MnCl2·4H2O.
      ​OSTRZEŻENIE: Roztwory soli i pożywki wzrostowe zawierają metale stwarzające zagrożenie dla zdrowia i środowiska. Należy obchodzić się z nimi i przechowywać zgodnie z kartami charakterystyki substancji.
  3. Przygotować roztwór kwasowy zawierający 40 mM dwuwodnian kwasu szczawiowego i 2% kwasu azotowego w wodzie ultrapurej do trawienia tlenków Mn wewnątrz reaktora mikroprzepływowego.
    ​OSTRZEŻENIE: Dwuwodnian kwasu szczawiowego i kwas azotowy są substancjami żrącymi, a kwas azotowy jest silnym utleniaczem. Należy obchodzić się z nimi i przechowywać zgodnie z kartami charakterystyki substancji.
  4. Przygotować 1% roztwór kwasu azotowego w wodzie ultrapurej do rozcieńczania próbek do analizy ICP-MS.

4. Hodowla bakterii

UWAGA: Hodowla bakterii jest prowadzona z zachowaniem zasad aseptyki na blacie laboratoryjnym przy użyciu palnika Bunsena. Materiały są sterylne, chyba że zaznaczono inaczej. Czasy inkubacji są określone dla P. putida GB-1 i mogą wymagać dostosowania w przypadku innych mikroorganizmów.

  1. Z zapasu przechowywanego w -80 °C wysiać P. putida GB-1 na płytkę z agarem LB. Inkubować płytkę przez około 20 h w temperaturze 30 °C, aby umożliwić wzrost kolonii bakteryjnych.
  2. Wieczorem przed eksperymentem dodać 10 mL pożywki LB do probówki stożkowej o pojemności 50 mL i zaszczepić jedną kolonię z płytki. Inkubować prekulturę LB w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przy 180 rpm przez 16 h, aż do osiągnięcia fazy stacjonarnej.
  3. Po 16 h inkubacji przenieść 1 mL prekultury LB do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i wirować przez 1 min przy 8,000 x g, aby uzyskać pellet bakterii.
  4. Przemyć alikwot trzy razy w celu usunięcia zużytej pożywki LB poprzez odlanie supernatantu, resuspensję pelletu komórkowego w 1 mL SS0 i wirowanie przez 1 min przy 8,000 x g. Resuspender końcowy pellet w 1 mL SS0.
  5. Zmierzyć gęstość optyczną (OD600) przemytej zawiesiny komórkowej w niesterylnej kuwecie za pomocą spektrofotometru. Oczekiwana wartość OD600 dla P. putida GB-1 na tym etapie wynosi 3,6–3,8, zatem wymagane jest co najmniej 5-krotne rozcieńczenie w SS0.
  6. Zaszczepić 20 mL GM0 przemywaną zawiesiną komórkową do początkowej wartości OD600 wynoszącej 0,01 w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 mL. Inkubować w temperaturze 30 °C przy 180 rpm przez 6 h, aż do osiągnięcia środkowej fazy wykładniczej.

5. Eksperyment biomineralizacji

  1. W dniu eksperymentu przygotuj system kontroli przepływu.
    1. Rozgrzej inkubator mikroskopowy do 30 °C.
    2. Wlej 10 mL GMMn i SSMn do dwóch probówek stożkowych o pojemności 15 mL i podłącz probówki do statywu z rezerwuarem cieczy. Przepłucz układ SSMn przez około trzy objętości systemu (~4 h przy 7,0 µL·min-1), a następnie GMMn przez ten sam czas.
  2. Nasyć przygotowany reaktor mikroprzepływowy 5 h po zaszczepieniu kultury w fazie średnio-eksponencjalnej.
    UWAGA: Nasycanie reaktora i szczepienie wykonuje się techniką aseptyczną na blacie laboratoryjnym przy użyciu palnika Bunsena. Materiały są sterylne, chyba że zaznaczono inaczej.
    1. Odgazuj reaktor w deskrykatorze próżniowym przez 20 min.
    2. Podczas odgazowywania reaktora pobierz 1–2 mL SS0 do plastikowej strzykawki o pojemności 3 mL, następnie podłącz igłę z tępym zakończeniem i 20 cm rurki Tygon o średnicy wewnętrznej (ID) 0,02 cala. Naciskaj tłok strzykawki, aż rurka zostanie całkowicie nasycona.
    3. Wyjmij reaktor z deskrykatora, a następnie podłącz rurkę do otworu wylotowego reaktora za pomocą pęsety kątowej i ręcznie nasyć reaktor za pomocą strzykawki, aż w otworze wlotowym reaktora utworzy się kropla.
    4. Podłącz 20 cm rurki Tygon o średnicy wewnętrznej 0,02 cala do otworu wlotowego reaktora. Kontynuuj podawanie SSMn do reaktora, aż wszystkie pęcherzyki powietrza zostaną usunięte (200–300 µL).
  3. Przygotuj inokulum do reaktora i zaszczep reaktor mikroprzepływowy.
    1. Wyjmij kulturę w fazie średnio-eksponencjalnej z inkubatora z wytrząsarką 6 h po zaszczepieniu i zmierz OD600. Oczekiwana wartość OD600 na tym etapie wynosi 1,6–1,8, dlatego zaleca się czterokrotne rozcieńczenie w SS0.
    2. Rozcieńcz kulturę w fazie średnio-eksponencjalnej w 2 mL SSMn do początkowej wartości OD600 wynoszącej 0,005 w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL. Obróć probówkę kilka razy, aby wymieszać zawartość.
    3. Umieść rurkę wlotową reaktora w probówce do mikrocentryfugi, upewniając się, że kropla cieczy styka się z inokulum, aby zapobiec wprowadzeniu powietrza do rurki. Częściowo zamknij probówkę do mikrocentryfugi i zabezpiecz pokrywkę taśmą, aby zapobiec kontaminacji.
    4. Pobierz 4–5 mL SSMn do szklanej strzykawki gazoszczelnej o pojemności 5 mL, aby zwilżyć cylinder, a następnie wypuść ciecz, aż w strzykawce pozostanie 0,5 mL. Umieść strzykawkę w pompie strzykawkowej.
    5. Zdejmij igłę z plastikowej strzykawki i podłącz ją do strzykawki szklanej, dbając o to, aby nie uwięznąć powietrza w gnieździe igły.
    6. Zaszczep reaktor za pomocą pompy strzykawkowej, wprowadzając inokulum do reaktora przez 20 min przy szybkości przepływu 8,33 µL·min-1 (~70 objętości porów).
    7. Po zaszczepieniu wyłącz pompę strzykawkową i pozostaw bakterie do osadzenia i przytwierdzenia na 1 h bez przepływu.
    8. Po 1 h wyjmij strzykawkę z pompy strzykawkowej, ale pozostaw ją podłączoną do rurki wylotowej.
  4. Podłącz zaszczepiony reaktor mikroprzepływowy do systemu kontroli przepływu.
    1. Przenieś reaktor i strzykawkę z blatu do inkubatora mikroskopowego.
    2. Na stoliku mikroskopu odłącz rurkę wlotową od reaktora.
    3. Delikatnie naciśnij tłok strzykawki, aby utworzyć kroplę w otworze wlotowym reaktora.
    4. Ręcznie zegnij rurkę PTFE z systemu kontroli przepływu pod kątem prostym (~1 cm od końca rurki), tak aby stykała się prostopadle z powierzchnią PDMS, minimalizując siły boczne i wnikanie powietrza do otworu wlotowego reaktora.
    5. Zanurz koniec rurki PTFE w 1% roztworze diakrylanu glikolu polietylenowego (PEG-DA), aby zwilżyć hydrofobową zewnętrzną stronę rurki. Upewnij się, że na końcu rurki PTFE znajduje się kropla GMMn, i podłącz rurkę do otworu wlotowego reaktora.
    6. Odłącz strzykawkę i umieść rurkę wylotową w niesterylnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 5 mL, aby zbierać effluent z reaktora.
    7. Ustaw szybkość przepływu na 1,33 µL·min-1 w oprogramowaniu systemu kontroli przepływu. Skonfiguruj program tak, aby dostarczać GMMn przez 15 h (~500 objętości porów) w celu promowania tworzenia biofilmu, a następnie SSMn przez 28,5 h (~1000 objętości porów), aby indukować biomineralizację Mn.
  5. Zamontuj reaktor mikroprzepływowy w wkładzie stolika mikroskopowego.
    UWAGA: Do ograniczenia niepożądanego wzrostu bakterii i precypitacji minerałów poza przestrzenią porów mikroprzepływowych stosowany jest specjalnie zbudowany system naświetlania ultrafioletem C (UVC) przymocowany do wkładu stolika mikroskopowego (Rysunek 2). Konstrukcja ta została zaadaptowana z pracy Ramos et al.60 i może być sterowana za pomocą programu automatycznego. Szczegóły znajdują się w pracy Fadely et al.61.
    1. Umieść ramkę próbki pod reaktorem dla stabilności, a następnie sztywno zamocuj ramkę i reaktor w wkładzie stolika, upewniając się, że są w pełni unieruchomione.
    2. Przymocuj rurkę PTFE do wkładu stolika kawałkiem taśmy, aby zapobiec odłączeniu rurki od otworu wlotowego reaktora.
    3. Ustaw ramiona UVC w odległości 3 mm od krawędzi przestrzeni porów po stronie wlotowej i 2 mm po stronie wylotowej, aby zminimalizować rozpraszanie światła ultrafioletowego i uszkodzenia biofilmu wewnątrz przestrzeni porów.
      UWAGA: Prawidłowe ustawienie UVC zaowocuje niewielką lub żadną akumulacją biomasy w obszarze wlotowym reaktora (Rysunek 3A). Ustawienie ramion UVC zbyt daleko od krawędzi wlotowej przestrzeni porów (Rysunek 3B) lub brak naświetlania (Rysunek 3C) prowadzi do precypitacji minerałów przed przestrzenią porów.
    4. Skonfiguruj program naświetlania reaktora. Naświetlaj obszary wlotowy i wylotowy reaktora przez 5 min w czasie t = 0 h, aby unaktywnić bakterie zdeponowane podczas szczepienia, a następnie naświetlaj tylko obszar wylotowy przez 5 min w czasie t = 17,5 h, aby unaktywnić pozostałe biofilmy.

Schemat komponentów mechanicznych przedstawiający montaż, z wyróżnieniem konstrukcji strukturalnej i analizy inżynieryjnej.
Rysunek 2: Niestandardowy system naświetlania promieniowaniem ultrafioletowym C (UVC) dla reaktorów mikroprzepływowych. (A). Widok z góry systemu zamontowanego na wkładzie stolika mikroskopu, przedstawiający ruchome ramiona (niebieskie) z przymocowanymi macierzami diod emitujących światło UVC (LED) (żółte prostokąty) oraz reaktor mikroprzepływowy zamontowany w ramce na próbkę (mały szary prostokąt). (B). Widok z dołu systemu przedstawiający diody UVC LED (beżowe kwadraty) osadzone w ruchomych ramionach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment mikroprzepływowy pokazujący wzorce przepływu cieczy w mikrokanale, seria A-C, obraz mikroskopowy.
Rysunek 3: Wpływ promieniowania UVC na obszar wlotowy reaktora mikroprzepływowego. (A). Obszar wlotowy reaktora po 5-minutowej obróbce UVC w czasie t = 0 h, wykazujący prawidłowe ustawienie, co zapewniło całkowite usunięcie niepożądanych biofilmów. (B). Obszar wlotowy reaktora z niewłaściwie ustawioną macierzą UVC, co pozostawiło resztkowe biofilmy w otworze wlotowym i poza przestrzenią porów, umożliwiając wytrącanie się tlenków Mn powyżej strumienia. (C). Obszar wlotowy reaktora bez obróbki UVC, co doprowadziło do intensywnego wzrostu biofilmu i wytrącania minerałów. Szare cieniowanie wyznacza przestrzeń porów. Pasek skali wynosi 2 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

6. Optyczna mikroskopia poklatkowa (time-lapse)

UWAGA: Do kolorowego obrazowania w jasnym polu wykorzystano odwrócony mikroskop epifluorescencyjny Nikon Ti2 Eclipse wyposażony w kamerę cyfrową (2304 x 2304 pikseli na pole widzenia), źródło białego światła, obiektyw 4x (1,62 µm·pixel-1) oraz oprogramowanie NIS Elements. Odpowiednie będą również inne mikroskopy optyczne z możliwością obrazowania w kolorze. Zastosowanie obrazowania kolorowego zwiększa czułość na niską masę tlenków Mn. Jeśli automatyzacja time-lapse nie jest dostępna, użytkownicy mogą pozyskiwać obrazy ręcznie, a następnie przetwarzać je jako serię czasową.

  1. Aby uzyskać wysokiej jakości obrazy, przeprowadź następujące kroki wyrównania i korekcji:
    1. W celu zapewnienia równomiernego oświetlenia ręcznie dostosuj ustawienie Köhlera zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Zoptymalizuj oświetlenie w polu jasnym, aby zapobiec niedo- lub prześwietleniu obrazu (Fusion Pad > Color > Auto Brightness oraz Fusion Pad > Color > Auto White).
      UWAGA: Najlepiej zoptymalizować oświetlenie w polu jasnym tylko raz na reaktorze, który zawiera już biofilmy i tlenki Mn, a następnie zastosować ten sam czas ekspozycji i balans kolorów we wszystkich kolejnych eksperymentach dla zachowania spójności oświetlenia. W tym przypadku zastosowano oświetlenie 5 ms z parametrami: czerwień 97,58%, zieleń 44,76% i niebieski 100%.
    3. Aby zapobiec artefaktom szycia podczas akwizycji mozaikowych obrazów przestrzeni porów mikroprzepływowych, zastosuj korekcję cieniowania (Acquire > Shading Correction Panel).
  2. Ustaw współrzędne środka obrazu mozaikowego (ND Acquisition > XY).
  3. Skonfiguruj obszar skanowania obrazu mozaikowego (tutaj 5 x 4 pola widzenia) i zastosuj 1% zakładki (ND Acquisition > Large Image).
  4. Skonfiguruj akwizycję kolorowych obrazów w polu jasnym z użyciem obiektywu 4x (ND Acquisition > λ).
  5. Ustaw częstotliwość obrazowania z odstępami 1 h przez 15 h (faza wzrostu) i 0,5 h przez 28,5 h (faza mineralizacji) (ND Acquisition > Time), a następnie uruchom program time-lapse.
    UWAGA: Czas trwania fazy wzrostu i mineralizacji jest specyficzny dla P. putida GB-1 i może być dostosowany w zależności od potrzeb dla innych mikroorganizmów.
  6. Po zakończeniu eksperymentu wyeksportuj obrazy w formacie Tagged Image File Format (TIFF) (Macro Panel > Export Images to TIFF).

7. Trawienie kwasowe i pomiar masy Mn

UWAGA: Do pomiaru masy Mn zatrzymanej w reaktorze mikroprzepływowym wykorzystuje się ICP-MS, jednak dopuszczalne jest użycie innych instrumentów, takich jak spektrometry emisji optycznej (ICP-OES). W przypadku braku dostępności aparatury analitycznej, próbki po trawieniu kwasowym można wysłać do laboratorium komercyjnego.

  1. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij reaktor z wkładki stolika mikroskopowego i odłącz przewody wlotowe i wylotowe.
  2. Pobierz 1,5 mL roztworu kwasu do szklanej strzykawki gazoszczelnej o pojemności 5 mL (osobnej od strzykawki użytej do inokulacji). Do strzykawki przymocuj igłę tępą oraz 20 cm przewodu PTFE o średnicy wewnętrznej 1/32 cala i ręcznie dozuj kwas, aż na końcu przewodu utworzy się kropla.
  3. Na blacie laboratoryjnym umieść strzykawkę w pompie strzykawkowej i podłącz przewód do otworu wlotowego reaktora, dbając o to, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza, które mogą uniemożliwić przenikanie roztworu kwasu do wszystkich porów. Do otworu wylotowego reaktora podłącz 30 cm przewodu PTFE o średnicy wewnętrznej 1/32 cala i umieść koniec przewodu wylotowego w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 mL.
  4. Wprowadzaj roztwór kwasu do reaktora przez 10 min z szybkością przepływu 100 µL·min-1.
  5. Po wstrzyknięciu roztworu kwasu odłącz igłę tępą od szklanej strzykawki. Napełnij plastikową strzykawkę o pojemności 10 mL powietrzem i podłącz ją do igły tępej, a następnie ręcznie wypchnij całe powietrze ze strzykawki, aby usunąć pozostały kwas z reaktora i przewodów do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 mL.
    UWAGA: Chociaż po przedmuchaniu powietrzem w przestrzeniach porowych może pozostać niewielka objętość roztworu kwasu, jest ona pomijalna w stosunku do całkowitej objętości wstrzykniętej. Użytkownicy pracujący z geometriami o mniejszej porowatości mogą rozważyć przedmuchiwanie dodatkowych objętości powietrza w celu usunięcia filmów cieczowych i resztek kwasu z słabo połączonych porów.
  6. Rozcieńcz strawioną próbkę w 1% kwasie azotowym zgodnie z zakresem kalibracji ICP-MS. W tym przypadku przygotuj 100-krotne rozcieńczenie (całkowita objętość 5 mL) w stożkowej probówce o pojemności 15 mL.
  7. Zmierz stężenie Mn w rozcieńczonej próbce za pomocą ICP-MS. Skoryguj zmierzone stężenie o czynnik rozcieńczenia i całkowitą objętość próbki, aby wyznaczyć masę Mn zatrzymaną w reaktorze.

8. Analiza obrazu

UWAGA: Zaleca się stosowanie oprogramowania MATLAB ze względu na wbudowane funkcje analizy obrazu, które zostały opisane w tekście. Można jednak wykorzystać inne narzędzia, takie jak ImageJ lub biblioteki analizy obrazu w języku Python, aby przeprowadzić porównywalne analizy. Kluczowe etapy analizy obrazu przedstawiono na Rysunku 4. Wszystkie skrypty do analizy obrazu zostały udostępnione jako pliki uzupełniające (Plik uzupełniający 1, Plik uzupełniający 2 oraz Plik uzupełniający 3).

Proces mikroskopii time-lapse, ustawienie mikroskopii w polu jasnym, schemat analizy maskowania obrazu.
Rycina 4: Schemat odejmowania obrazów w celu wyizolowania precypitatów tlenków Mn. Z kolorowych obrazów w polu jasnym wykonanych w trybie time-lapse zidentyfikowano obraz referencyjny (tref) (1), aby usunąć intensywność tła stacjonarnych biofilmów z wszystkich kolejnych obrazów w danych punktach czasowych (tn) (2). Wygenerowano maski binarne dla wszystkich tn (3), a następnie pomnożono je przez tref (4) oraz odpowiadające im tn (5), aby uchwycić zasięg biofilmu i biominerałów. Na koniec zamaskowane obrazy tn odjęto od zamaskowanych obrazów tref (6). Wynikowe macierze z korekcją intensywności określają spadek intensywności (a.u.) wynikający z akumulacji tlenków Mn w każdym pikselu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Wczytaj do obszaru roboczego obraz TIFF wysokiej rozdzielczości przedstawiający geometrię przestrzeni porów mikrofluidycznych (wyeksportowany z programu AutoCAD), aby użyć go jako maski ziaren (imread).
  2. Wyprostuj i zarejestruj kolorowe obrazy w jasnym polu, aby skutecznie zastosować maskę ziaren.
    1. Wygeneruj binarną mapę rejestracyjną obrazu z pierwszego punktu czasowego (t = 0 h).
      1. Wczytaj kolorowy obraz TIFF w jasnym polu do obszaru roboczego (imread).
      2. Wytnij obraz tak, aby był nieco większy niż rozmiar przestrzeni porów (imcrop).
      3. Wzmocnij ostrość obrazu, aby poprawić rozdzielczość granic ziaren (imsharpen).
      4. Zbinaryzuj obraz, korzystając z adaptacyjnego progu priorytetyzującego ciemne elementy (rgb2gray, adaptthresh z ustawieniem foreground polarity = "dark" i czułości dostosowaną według potrzeb, imbinarize, imcomplement).
      5. Wypełnij ziarna w otrzymanej binarnej mapie rejestracyjnej, aby utworzyć lite elementy (imfill z określeniem "holes"). Należy pamiętać, że nie wszystkie ziarna mogą zostać wypełnione.
      6. Eroduj binarną mapę rejestracyjną w razie potrzeby, aby usunąć szum w tle, a następnie przeprowadź dylatację, aby przywrócić utracone piksele na krawędziach ziaren (imerode, imdilate).
    2. Użyj algorytmu rejestracji opartego na transformacji cech niezmienniczych skalowo (SIFT), aby obliczyć macierz transformacji niezbędną do dopasowania binarnej mapy rejestracyjnej do maski ziaren (detectSIFTFeatures, extractFeatures, matchFeatures, estgeotform2d z ustawieniem transform type = "affine").
    3. Zastosuj tę macierz transformacji do binarnej mapy rejestracyjnej oraz obrazu z pierwszego punktu czasowego, a następnie nałóż je na maskę ziaren, aby ocenić dopasowanie (imwarp, imshowpair).
    4. Jeśli po rejestracji SIFT nadal występuje słabe dopasowanie, zastosuj w razie potrzeby rejestrację lokalną (cpselect, fitgeotform2d z ustawieniem transform type = "lwm", imwarp).
    5. Wytnij zarejestrowany obraz i maskę ziaren w razie potrzeby, aby usunąć artefakty rejestracji na krawędziach macierzy, a następnie zmień ich rozmiar do wymiarów przestrzeni porów (15 mm x 10 mm) (imcrop, imresize).
    6. Przetwórz wszystkie kolorowe obrazy w jasnym polu w pętli, aby zastosować tę samą rejestrację (imwarp).
  3. Zidentyfikuj wizualnie obraz referencyjny (tref, Panel 1 na Rysunku 4) z momentu, w którym biofilmy po raz pierwszy wchodzą w fazę stacjonarną, co określa się jako brak dalszego ruchu lub wzrostu (tutaj t = 18,5 h).
  4. Zbinaryzuj każdy obraz z punktu czasowego (tn, Panel 2 na Rysunku 4) (rgb2gray, adaptthresh z ustawieniem foreground polarity = "dark" i czułością dostosowaną według potrzeb, imbinarize, imcomplement) w taki sposób, aby kompleksy biofilmu i biominerałów miały wartość 1, a ziarna i puste pory wartość 0. Pomnóż każdą maskę punktu czasowego przez odwróconą maskę ziaren (imcomplement), aby usunąć pozostałe granice ziaren.
  5. Pomnóż tn przez odpowiadającą mu maskę punktu czasowego (Panel 3 na Rysunku 4), aby wyizolować obszar zainteresowania biofilmu i biominerałów (Panel 5 na Rysunku 4), a następnie pomnóż tref przez każdą maskę punktu czasowego, aby wyizolować ten sam obszar (Panel 4 na Rysunku 4).
  6. Odejmij wszystkie zamaskowane obrazy tn od zamaskowanego obrazu tref, aby ilościowo określić spadek intensywności pikseli związany z akumulacją tlenku Mn w każdym punkcie czasowym (imsubtract), a następnie przekształć je w złożone macierze z korekcją intensywności (rgb2gray, Panel 6 na Rysunku 4).
  7. Aby ocenić przestrzenną dystrybucję minerałów w przestrzeni porów (a.u.), zsumuj wartości w kolumnach (sum z ustawieniem dimension = 1) każdej macierzy z korekcją intensywności.
  8. Aby oszacować szybkość precypitacji tlenku Mn w czasie (µg·h-1):
    1. Zsumuj każdą macierz z korekcją intensywności (sum z ustawieniem dimension = "all"), aby określić całkowitą skorygowaną intensywność w każdym punkcie czasowym.
    2. Podziel całkowitą skorygowaną intensywność w każdym punkcie czasowym przez całkowitą skorygowaną intensywność w ostatnim punkcie czasowym, tak aby ostatni punkt czasowy miał wartość 1, a wszystkie poprzednie wartości były ułamkowe. Przeskaluj do µg, mnożąc przez masę Mn zmierzoną metodą ICP-MS.
    3. Oblicz pochodną względem czasu, dzieląc przyrost masy (µg) między następującymi po sobie punktami czasowymi (diff) przez odstęp czasu między obrazami (0,5 h).

Wyniki

Niniejszy protokół stanowi platformę eksperymentalną do obrazowania z rozdzielczością czasowo-przestrzenną procesu tworzenia się biofilmu oraz biomineralizacji Mn. Kolorowe obrazy w jasnym polu wykazały, że biofilmy P. putida GB-1 były rozmieszczone równomiernie w całej przestrzeni porów mikrofluidycznych w czasie t = 18,5 h przed rozpoczęciem precypitacji tlenków Mn (Rysunek 5A). Następnie tlenki Mn kumulowały się preferencyjnie po stronie wlotowej przestrzeni porów, najbliżej źródła dopływu Mn(II) (Rysunek 5B). Różnica między obrazem referencyjnym a kolejnymi punktami czasowymi obrazowania ujawniła wyizolowany wkład precypitatów tlenków Mn w całkowitą intensywność obrazu (Rysunek 5C) i umożliwiła ilościowe określenie zaobserwowanego gradientu akumulacji minerałów w skali reaktora (Rysunek 5D). W skali biofilmu ta metoda odejmowania obrazów pozwoliła uchwycić stopniową precypitację tlenków Mn na powierzchniach biofilmu oraz akumulację minerałów na krawędziach biofilmów w kontakcie z cieczą w porach (Rysunek 6).

Protokół dostarcza ponadto schematu postępowania w celu oszacowania kinetyki wytrącania tlenków Mn na podstawie odejmowania obrazów i pomiarów ICP-MS. W trzech powtórzeniach reaktory mikroprzepływowe zawierały 4,29 ± 0,22 µg Mn w końcowym punkcie czasowym eksperymentu. Trawienie kwasowe zawartości reaktora zostało wcześniej zwalidowane przy użyciu pomiarów masy tlenków Mn w synchrotronie, co wykazało błąd mniejszy niż 18%61. W związku z tym macierze skorygowane o intensywność zostały przeskalowane do tej końcowej masy. Wynikowa szacowana szybkość wytrącania tlenków Mn była niemonotoniczna, gwałtownie wzrastając między t = 19,5 h a t = 21 h, osiągając szczyt na poziomie 0,29 ± 0,04 µg·h-1, a następnie stopniowo spadając aż do t = 43,5 h (Rysunek 7). Należy zauważyć, że obliczenia szybkości nie uwzględniają nanocząstek tlenków Mn znajdujących się poniżej rozdzielczości mikroskopu optycznego ani żadnej masy tlenków utraconej w wyniku transportu w czasie trwania eksperymentu, która prawdopodobnie była minimalna. Podejście to wykorzystuje zatem powszechnie dostępne techniki mikroskopowe do półilościowej oceny trendów czasowych w kinetyce biomineralizacji.

Analiza porowatości gleby: obrazy mikroskopowe, mapowanie intensywności pikseli, wykres intensywności w funkcji odległości.
Rysunek 5: Rozkład biofilmów i tlenków Mn w skali reaktora. (A). Kolorowy obraz w jasnym polu biofilmów P. putida GB-1 w mikrofluidycznej przestrzeni porów na początku fazy stacjonarnej (t = 18,5 h, tref). (B). Kolorowy obraz w jasnym polu osadów tlenku Mn na biofilmach i wokół nich P. putida GB-1 w końcowym punkcie czasowym eksperymentu (t = 43,5 h). (C). Skorygowana pod kątem intensywności macierz akumulacji minerałów w końcowym punkcie czasowym eksperymentu (t = 43,5 h), gdzie ziarna przedstawiono w kolorze szarym, a pory w białym. Pasek skali wynosi 1 mm. (D). Jednowymiarowy rozkład przestrzenny całkowitej skorygowanej intensywności od strony wlotowej (lewo) do wylotowej (prawo) przestrzeni porów (t = 43,5 h). Linia ciągła reprezentuje średnią ruchomą z zakresu 1 mm wzdłuż przestrzeni porów od wlotu do wylotu, uśrednioną z trzech powtórzeń eksperymentu, a zacieniowanie reprezentuje odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wzrost komórkowy w czasie; obrazy mikroskopowe i analiza z kontrastem w wielu punktach czasowych.
Rysunek 6: Akumulacja tlenków Mn w skali biofilmu. (A). Wybrane kolorowe obrazy w polu jasnym reprezentatywnych biofilmów P. putida GB-1. Tlenki manganu były wykrywalne najpierw jako zmiana koloru z szarego na brązowy na powierzchniach biofilmu (pokazane w t = 20 h i t = 21 h), a później jako akumulacja ciemnobrązowych osadów na krawędziach biofilmu (pokazane w t = 33 h i t = 43 h). (B). Matryce akumulacji minerałów z korektą natężenia, gdzie ziarna zaznaczono ciemnoszarym kolorem, pory białym, a leżące pod nimi biofilmy jasnoszarym. Pasek skali wynosi 150 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres szybkości wytrącania w funkcji czasu; analiza danych kinetyki reakcji i wahań szybkości.
Rysunek 7: Szacowanie szybkości wytrącania tlenków Mn w czasie. Szybkość (µg·h-1) określono poprzez przeskalowanie całkowitej skorygowanej intensywności w każdym punkcie czasowym do końcowej masy Mn zmierzonej za pomocą ICP-MS, a następnie wyznaczenie pochodnej po czasie. Markery reprezentują średnią z trzech powtórzeń eksperymentu, a obszar zacieniony reprezentuje odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Step1_ImageRegistration.m.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Step2_ImageSubtraction.m.Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Plik uzupełniający 3: Step3_Figures.m.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Ta platforma eksperymentalna oferuje unikalne możliwości badania przestrzenno-czasowych dynamiki procesów biogeochemicznych w środowiskach porowatych, wolnych od artefaktów, które uniemożliwiają uzyskanie danych wysokiej wierności. Takie podejście jest szczególnie dobrze przystosowane do biomineralizacji Mn i Fe, które produkują osady mineralne o charakterystycznych odcieniach żółtej ochry, brązu i czerni, które mogą być łatwo segmentowane za pomocą mikroskopii optycznej i analizy obrazu. Korzystając z biomineralizacji Mn jako przypadku studyjnego, możliwe jest ocena wzorców i szybkości osadzania minerałów in situ z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Kilka aspektów tego protokołu umożliwiło zebranie powtarzalnych pomiarów przemian biogeochemicznych. Po pierwsze, użycie zaworu sekwencyjnej iniekcji o małej objętości martwego zmniejszyło eksperymenty z wieloma płynami bez zakłócania biofilmów w przestrzeni porowej mikrofluidycznej. To ustawienie zachowało początkową przestrzenną dystrybucję biofilmu, zapobiegając przepływom ciśnienia, które mogą prowadzić do oderwania lub przemieszczenia biofilmów podczas zmiany wstrzykiwanych płynów, co może wystąpić z innymi instrumentami, takimi jak pompy strzykawkowe. Ten element zapewnia również użytkownikowi elastyczność w dostosowywaniu warunków geochemicznych nakładanych na mikroorganizmy zamieszkujące urządzenie. Wreszcie, ponieważ zachowało początkową dystrybucję biofilmu, to ustawienie pozwala użytkownikowi systematycznie testować, jak różne morfologie biofilmu lub ilości biomasy wpływają na dystrybucję i szybkość osadzania tlenku Mn.

Po drugie, łagodzenie tworzenia i wnikania bąbelków w przestrzeni porowej mikrofluidycznej umożliwiło kilkudniowe eksperymenty, które uchwyciły środowiskowo istotne skale czasowe biomineralizacji Mn. Bąbelki, częsty i często nieunikniony problem w długich eksperymentach powyżej temperatury pokojowej62,63, mogą rozdzielać i blokować pojedyncze pory, przekierowywać przepływ płynów i zakłócać postęp reakcji. Aby zapobiec uwięzieniu bąbelków w przestrzeni porowej, reaktor został w pełni nasycony przed inokulacją. Aby zminimalizować wprowadzenie bąbelków przez system kontroli przepływu, inkubator mikroskopu został ustawiony na 30 °C na długo przed eksperymentem, a wielokrotne objętości roztworu dopływowego zostały przepłukane przed przymocowaniem zainfekowanego reaktora. Ten krok usunął uwięzione powietrze z przewodów i armatury i zminimalizował ryzyko wygazowania płynu podczas eksperymentu. Do systemu kontroli przepływu zintegrowano również pułapkę na bąbelki, z odcinkiem 200-µm ID rury PTFE przymocowanej do wyjścia pułapki, aby zwiększyć opór i poprawić efektywność usuwania bąbelków. Wreszcie, aby zapobiec uwięzieniu powietrza lub wyciekom na granicy między przewodem dopływowym a otworem wejściowym reaktora, wszystkie połączenia zostały wykonane z kroplami płynu na obu końcach przewodu i wywierconego otworu, hydrofobowa rura PTFE została pokryta 1% PEG-DA, a koniec włożonego przewodu był utrzymywany prostopadle do powierzchni PDMS przez cały eksperyment.

Po trzecie, włączenie niestandardowego systemu napromieniania UVC do platformy eksperymentalnej utrzymało zdefiniowaną warunek graniczny geochemiczny i powtarzalnie ograniczało biomineralizację Mn w przestrzeni porowej mikrofluidycznej. Eksperymenty pilotażowe wykazały, że dodatkowe biofilmy w regionie wejściowym reaktora osadziły tlenki Mn w górę biegu od przestrzeni porowej, ograniczając dostępność Mn(II) w dół biegu. Krótkie napromienianie regionów wejściowych i wyjściowych reaktora z odpowiednim wyrównanie po okresie bez przepływu i osadzenia, zapobiegło rozwojowi biofilmu z dowolnych początkowo osadzonego bakterii. Ciągły jednokierunkowy przepływ płynu zapobiegał ponownej kolonizacji regionu wejściowego reaktora po tym początkowym napromienianiu UVC. Napromienianie regionu wyjściowego reaktora w t = 17,5 h przed początkiem fazy stacjonarnej i widocznym osadzanie tlenków Mn minimalizowało ilość akumulacji minerałów w dół biegu od przestrzeni porowej. Ułatwiło to bezpośrednie porównanie danych obrazów w jasnym polu z masą Mn strawioną i zmierzoną za pomocą ICP-MS.

Kombinacja odejmowania obrazów i pomiarów masy końcowej zapewniła półilościową metodę oceny kinetyka osadzania tlenków Mn in situ. Należy jednak zauważyć, że intensywność pikseli przestaje być bezpośrednio proporcjonalna do masy tlenków Mn w bardzo wysokiej gęstości minerału z powodu ograniczonej wrażliwości kamery na ciemne kolory61. Ocena tego nieliniowego zachowania mogłaby ulec poprawie poprzez kwasowe strawienie próbek w określonych punktach czasowych i porównanie strawionej masy z oryginalną masą skalowaną przez ostatni punkt czasowy eksperymentu. Jeśli wymagana jest dokładna ilościowa ocena masy minerału, użytkownicy mogą opracować krzywą kalibracyjną za pomocą próbek minerałów o znanej intensywności i masie, co zostało wcześniej wykazane w Fadely i in.61, lub

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To projekt był wspierany przez Narodowe Centrum Funduszu Nauki USA dla Geotechniki Bio-mediated i Bio-inspired (ERC-1449501), Szwajcarski Narodowy Fundusz Nauki (200021_188546) oraz Narodowe Centrum Funduszu Nauki USA (MCA-2322428, EAR-1847689, DMR-2003849). Część tego badania została przeprowadzona w UC Davis Center for Nano and Micro Manufacturing (CNM2). Dziękujemy Stevenowi Lucero i UC Davis Tech Foundry za projektowanie i produkcję inkubatora mikroskopowego oraz systemu napromieniowania UVC. Dziękujemy również Dr. Yuze Wang i Dr. Jasonowi DeJongowi za dostarczenie geometrii porowatego medium używanego do produkcji reaktorów mikrofluidycznych oraz Dr. Arunima Bhattacharjee, Dr. Noahowi Goshi, Dr. Gregory'emu Girardi i Dr. Hyehyun Kim za przydatne dyskusje i/lub szkolenie z zakresu fotolitografii i miękkiej litografii. Na koniec dziękujemy Dr. Gaitanowi Gehinowi, Dr. Tonyi Kuhl, Dr. Filippo Mielemu i Dr. Charlesowi Graddy'emu za cenne dyskusje na temat projektu eksperymentu i analizy obrazu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Adapter fitting (Elveflow, 6-40 to 1/4-28)Darwin MicrofluidicsLVF-KFI-08Używany do łączenia czujnika przepływu i bezflanszowych złączy.
Agar (Fisher BioReagents)Fisher ScientificBP9744Używany do nalewania płytek do ścierania zamrożonych szczepów.
Air compressor (Jun-Air)ElveflowKCP-110Używany do nadmuchiwania kontrolera przepływu.
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4, CAS: 7783-20-2)Sigma-AldrichA4915Używany do eksperymentalnych mediów i roztworów.
Angled tweezersTDI International7-SAUżywany do przymocowania wężyka do mikrofluidowego reaktora.
AutoCAD softwareAutodesk --Używany do projektowania geometrii mikrofluidowego reaktora.
AutoclaveSteris--Używany do sterylizacji materiałów i płynów. 
BalanceMettler ToledoME2002TUżywany do ważenia bazy elastomeru PDMS i czynnika utwardzającego.
Barbed adapter (1/4-28 swivel to 3/32-in barbed)ElveflowKFI-06Używany do podłączenia wężyka polieterowego poliuretanowego do złącza i stojaka zbiorników płynów.
Biopsy punch (Rapid-Core, 1.2-mm diameter)Darwin MicrofluidicsPT-T983-12-25Używany do wybijania otworów wlotowych/wylotowych w mikrofluidowych kanałach PDMS. 
Bleach (Chlorox)ULINES-19719Używany do sterylizacji systemu sterowania przepływem. Rozcieńczony do 1% w ultraczystej wodzie.
Blunt-tip needle (Jensen Global, 21-gauge)QSourceJG21-10HPX-J004Używany do podłączania wężyka do strzykawek. Wysterylizowany przez autoklawację przez 30 min.
Bunsen burnerHumboldtH-5970Używany do utrzymania sterylnego obszaru doświadczalnego.
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O, Fisher Chemical, CAS: 10035-04-8)Fisher ScientificC79Używany do eksperymentalnych mediów i roztworów.
Casamino acid (Fisher BioReagents, acid casein peptone)Fisher ScientificBP1424Używany do eksperymentalnych mediów.
Cell density meter (WPA Biowave CO8000)Avantor490005-906Używany do pomiaru OD600 kultur bakterii. 
Clear tape (Scotch Magic)ULINES-10223Używany do uniemożliwienia przyklejania się kurzu do mikrofluidowych kanałów PDMS.
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2·6H2O, CAS: 7791-13-1)Sigma-Aldrich255599Używany do eksperymentalnych mediów i roztworów.
Compressed nitrogenAirgasNIUHP300Używany do osuszania komponentów mikrofluidowego reaktora.
Conical tube (Falcon, 15-mL volume, polypropylene)Fisher Scientific14-959-49BUżywany do roztworów napływowych i próbek ICP-MS. Wstępnie wysterylizowany.
Conical tube (Falcon, 50-mL volume, polypropylene)Fisher Scientific14-432-22Używany do przedkultury LB. Wstępnie wysterylizowany.
Copper(II) sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O, CAS: 7758-99-8)Sigma-AldrichC8027Używany do eksperymentalnych mediów i roztworów.
Cutting matULINES-18543Używany do cięcia mikrofluidowych kanałów PDMS i wybijania otworów wlotowych/wylotowych.
Cuvette (Fisherbrand, 1.5-mL volume, polystyrene)Fisher Scientific 14-955-127Używany do pomiaru OD600 kultur bakterii. 
Digital camera (Hamamatsu ORCA-Fusion)Nikon77054115Używany do czasoprzestrzennej kolorowej obrazowania jasnopolowymi mikrofluidowych doświadczeń.
Distribution valve (MUX)ElveflowMUX-D-12Używany do sekwencyjnego wstrzykiwania wielu płynów.
Elveflow Smart Interface (ESI) softwareElveflow --Używany do sterowania szybkością przepływu/ciśnieniem między kontrolerem przepływu i czujnikiem przepływu oraz wykonywania przełączania zaworu dystrybucyjnego.
Erlenmeyer flask (Fisherbrand, 50-mL volume)Fisher ScientificFB50050Używany do średnio-eksponencjalnej kultury. Wysterylizowany przez autoklawację przez 30 min.
Ethanol (Fisher Chemical, reagent alcohol, 90% purity, CAS: 64-17-5)Fisher ScientificA962P-4Używany do czyszczenia PDMS i pokrywek szkła do produkcji reaktora. Rozcieńczony do 70% w ultraczystej wodzie.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, CAS: 60-00-4)Sigma-AldrichEDSUżywany do eksperymentalnych mediów i roztworów.
Flangeless fitting (1/4-28 for 1/16-in OD tubing)ElveflowKFI-17Używany do podłączania wężyka do komponentów sprzętowych Elveflow. Zestaw zawiera trzpień i nakrętki gwintowane.
Flow controller (OB1 MK3+)ElveflowOB1-2000Używany do zap

Bibliografia

  1. Scheinost, A. C., Singh, B., Goss, M. J., Oliver, M. Metal oxides. Encyclopedia of soils in the environment. , (2023).
  2. Tebo, B. M., et al. Biogenic manganese oxides: properties and mechanisms of formation. Annu Rev Earth Planet Sci. 32, 287-328 (2004).
  3. Droz, B., Dumas, N., Duckworth, O. W., Peña, J. A comparison of the sorption reactivity of bacteriogenic and mycogenic Mn oxide nanoparticles. Environ Sci Technol. 49, 4200-4208 (2015).
  4. Holguera, J. G., Etui, I. D., Jensen, L. H. S., Peña, J. Contaminant loading and competitive access of Pb, Zn and Mn(III) to vacancy sites in biogenic MnO₂. Chem Geol. 502, 76-87 (2018).
  5. Peña, J., et al. Mechanisms of nickel sorption by a bacteriogenic birnessite. Geochim Cosmochim Acta. 74, 3076-3089 (2010).
  6. Toner, B., Manceau, A., Webb, S. M., Sposito, G. Zinc sorption to biogenic hexagonal-birnessite particles within a hydrated bacterial biofilm. Geochim Cosmochim Acta. 70, 27-43 (2006).
  7. Castro, L., Blázquez, M. L., González, F., Muñoz, J. A., Ballester, A. Heavy metal adsorption using biogenic iron compounds. Hydrometallurgy. 179, 44-51 (2018).
  8. Whitaker, A. H., Duckworth, O. W. Cu, Pb, and Zn sorption to biogenic iron (oxyhydr)oxides formed in circumneutral environments. Soil Syst. 2, 18 (2018).
  9. Brüggenwirth, L., et al. Interactions of manganese oxides with natural dissolved organic matter: implications for soil organic carbon cycling. Geochim Cosmochim Acta. 366, 182-200 (2024).
  10. Li, H., Santos, F., Butler, K., Herndon, E. A critical review on the multiple roles of manganese in stabilizing and destabilizing soil organic matter. Environ Sci Technol. 55, 12136-12152 (2021).
  11. Li, Q., Hu, W., Li, L., Li, Y. Interactions between organic matter and Fe oxides at soil micro-interfaces: quantification, associations, and influencing factors. Sci Total Environ. 855, 158710 (2023).
  12. Song, X., et al. Towards a better understanding of the role of Fe cycling in soil for carbon stabilization and degradation. Carbon Res. 1, 5 (2022).
  13. Hennebel, T., De Gusseme, B., Boon, N., Verstraete, W. Biogenic metals in advanced water treatment. Trends Biotechnol. 27, 90-98 (2009).
  14. Marsidi, N., Abu Hasan, H., Sheikh Abdullah, S. R. A review of biological aerated filters for iron and manganese ions removal in water treatment. J Water Process Eng. 23, 1-12 (2018).
  15. Li, Y., Xu, Z., Ma, H., Hursthouse, A. S. Removal of manganese(II) from acid mine wastewater: a review. Water. 11, 2493 (2019).
  16. Li, S., et al. Biomineralization mediated by iron-oxidizing microorganisms. Minerals. 15, 868 (2025).
  17. Skousen, J., et al. Review of passive systems for acid mine drainage treatment. Mine Water Environ. 36, 133-153 (2017).
  18. Post, J. E. Manganese oxide minerals: crystal structures and economic and environmental significance. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 3447-3454 (1999).
  19. Cornell, R. M., Schwertmann, U. . The iron oxides: structure, properties, reactions, occurrences and uses. , (2003).
  20. Cosmidis, J., Benzerara, K. Why do microbes make minerals?. C R Geosci. 354, 1-39 (2022).
  21. Ehrlich, H., Bailey, E., Wysokowski, M., Jesionowski, T. Forced biomineralization: a review. Biomimetics. 6, 46 (2021).
  22. Hoffmann, T. D., Reeksting, B. J., Gebhard, S. Bacteria-induced mineral precipitation: a mechanistic review. Microbiology. 167, 001049 (2021).
  23. Hansel, C. M., Learman, D. R., Ehrlich, H. L., Newman, D. K., Kappler, A. Geomicrobiology of manganese. Ehrlich's geomicrobiology. , (2015).
  24. Tebo, B. M., Johnson, H. A., McCarthy, J. K., Templeton, A. S. Geomicrobiology of manganese(II) oxidation. Trends Microbiol. 13, 421-428 (2005).
  25. Kappler, A., Emerson, D., Gralnick, J. A., Roden, E. E., Muehe, E. M., Ehrlich, H. L., Newman, D. K., Kappler, A. Geomicrobiology of iron. Ehrlich's geomicrobiology. , (2015).
  26. Emerson, D., Fleming, E. J., McBeth, J. M. Iron-oxidizing bacteria: an environmental and genomic perspective. Annu Rev Microbiol. 64, 561-583 (2010).
  27. Fortin, D., Langley, S. Formation and occurrence of biogenic iron-rich minerals. Earth Sci Rev. 72, 1-19 (2005).
  28. Konhauser, K. O. Bacterial iron biomineralisation in nature. FEMS Microbiol Rev. 20, 315-326 (1997).
  29. Toner, B., et al. Spatially resolved characterization of biogenic manganese oxide production. Appl Environ Microbiol. 71, 1300-1310 (2005).
  30. Miot, J., et al. Extracellular iron biomineralization by photoautotrophic bacteria. Appl Environ Microbiol. 75, 5586-5591 (2009).
  31. Bottero, S., Storck, T., Heimovaara, T. J., van Loosdrecht, M. C. M., Enzien, M. V., et al. Biofilm development and the dynamics of preferential flow paths in porous media. Biofouling. 29, 1069-1086 (2013).
  32. Dentz, M., Le Borgne, T., Englert, A., Bijeljic, B. Mixing, spreading and reaction in heterogeneous media: a brief review. J Contam Hydrol. 120-121, 1-17 (2011).
  33. Gerke, H. H. Preferential flow descriptions for structured soils. J Plant Nutr Soil Sci. 169, 382-400 (2006).
  34. Jimenez-Martinez, J., Nguyen, J., Or, D. Controlling pore-scale processes to tame subsurface biomineralization. Rev Environ Sci Biotechnol. 21, 27-52 (2022).
  35. Or, D., Smets, B. F., Wraith, J. M., Dechesne, A., Friedman, S. P. Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media: a review. Adv Water Resour. 30, 1505-1527 (2007).
  36. Toyoda, K., Tebo, B. M. The effect of Ca2+ ions and ionic strength on Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. SG-1. Geochim Cosmochim Acta. 101, 1-11 (2013).
  37. Toyoda, K., Tebo, B. M. Kinetics of Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. SG-1. Geochim Cosmochim Acta. 189, 58-69 (2016).
  38. Learman, D. R., Wankel, S. D., Webb, S. M., Martinez, N., Madden, A. S., et al. Coupled biotic–abiotic Mn(II) oxidation pathway mediates the formation and structural evolution of biogenic Mn oxides. Geochim Cosmochim Acta. 75, 6048-6063 (2011).
  39. Bargar, J. R., et al. Biotic and abiotic products of Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. strain SG-1. Am Mineral. 90, 143-154 (2005).
  40. Mao, Q., Qin, W., Yan, B., Luo, L. Ferrous iron oxidation efficiency and kinetics by indigenous iron-oxidizing bacteria in acid mine drainage. Environ Technol Innov. 36, 103785 (2024).
  41. Farnsworth, C. E., Voegelin, A., Hering, J. G. Manganese oxidation induced by water table fluctuations in a sand column. Environ Sci Technol. 46, 277-284 (2012).
  42. Haukelidsaeter, S., et al. Efficient chemical and microbial removal of iron and manganese in a rapid sand filter and impact of regular backwash. Appl Geochem. 162, 105904 (2024).
  43. Li, C., et al. Immobilization of iron- and manganese-oxidizing bacteria with a biofilm-forming bacterium for effective removal of iron and manganese from groundwater. Bioresour Technol. 220, 76-84 (2016).
  44. Breda, I. L., Søborg, D. A., Ramsay, L., Roslev, P. Manganese removal processes during start-up of inoculated and non-inoculated drinking water biofilters. Water Qual Res J. 54, 47-56 (2019).
  45. Zhu, X., Wang, K., Yan, H., Liu, C., Zhu, X., et al. Microfluidics as an emerging platform for exploring soil environmental processes: a critical review. Environ Sci Technol. 56, 711-731 (2022).
  46. Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., de Anna, P., Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. ISME J. 13, 1700-1710 (2019).
  47. Aufrecht, J. A., Fowlkes, J. D., Bible, A. N., Morrell-Falvey, J., Doktycz, M. J., et al. Pore-scale hydrodynamics influence the spatial evolution of bacterial biofilms in a microfluidic porous network. PLoS ONE. 14, e0218316 (2019).
  48. Kurz, D. L., et al. Competition between growth and shear stress drives intermittency in preferential flow paths in porous medium biofilms. Proc Natl Acad Sci U S A. 119, e2122202119 (2022).
  49. Kurz, D. L., Secchi, E., Stocker, R., Jimenez-Martinez, J. Morphogenesis of biofilms in porous media and control on hydrodynamics. Environ Sci Technol. 57, 5666-5677 (2023).
  50. Borer, B., Tecon, R., Or, D. Spatial organization of bacterial populations in response to oxygen and carbon counter-gradients in pore networks. Nat Commun. 9, 769 (2018).
  51. Ceriotti, G., Borisov, S. M., Berg, J. S., de Anna, P. Morphology and size of bacterial colonies control anoxic microenvironment formation in porous media. Environ Sci Technol. 56, 17471-17480 (2022).
  52. Park, S., Anggraini, T. M., Chung, J., Kang, P. K., Lee, S. Microfluidic pore model study of precipitates induced by pore-scale mixing of an iron sulfate solution with simulated groundwater. Chemosphere. 271, 129857 (2021).
  53. Wielinski, J., et al. Spatiotemporal mineral phase evolution and arsenic retention in microfluidic models of zerovalent iron-based water treatment. Environ Sci Technol. 56, 13696-13708 (2022).
  54. Elmaloglou, A., et al. Microfluidic study in a meter-long reactive path reveals how structural heterogeneity shapes MICP-induced biocementation. Sci Rep. 12, 19553 (2022).
  55. Wang, Y., Soga, K., DeJong, J. T., Kabla, A. J. A microfluidic chip and its use in characterising particle-scale behaviour of microbial-induced calcium carbonate precipitation. Géotechnique. 69, 1086-1094 (2019).
  56. Wang, Y., et al. Microscale investigations of temperature-dependent microbially induced carbonate precipitation in the range 4–50 °C. Acta Geotech. 18, 2239-2261 (2023).
  57. Pucetaite, M., Ohlsson, P., Persson, P., Hammer, E. Shining new light into soil systems: spectroscopy in microfluidic soil chips reveals microbial biogeochemistry. Soil Biol Biochem. 153, 108078 (2021).
  58. Geszvain, K., McCarthy, J. K., Tebo, B. M. Elimination of manganese(II,III) oxidation in Pseudomonas putida GB-1 by a double knockout of two putative multicopper oxidase genes. Appl Environ Microbiol. 79, 357-366 (2013).
  59. Gehin, G., et al. Population-level control of two manganese oxidases expands the niche for bacterial manganese biomineralization. NPJ Biofilms Microbiomes. 11, 1-12 (2025).
  60. Ramos, G., Toulouze, C., Rima, M., Liot, O., Duru, P., et al. Ultraviolet control of bacterial biofilms in microfluidic chips. Biomicrofluidics. 17, 024107 (2023).
  61. Fadely, E. C., et al. Enhanced manganese oxidation at the biofilm–fluid interface drives pore-scale patterns in mineral precipitation. Environ Sci Technol. 60, 654-663 (2026).
  62. Lochovsky, C., Yasotharan, S., Günther, A. Bubbles no more: in-plane trapping and removal of bubbles in microfluidic devices. Lab Chip. 12, 595-601 (2012).
  63. Pereiro, I., Khartchenko, A. F., Petrini, L., Kaigala, G. V. Nip the bubble in the bud: a guide to avoid gas nucleation in microfluidics. Lab Chip. 19, 2296-2314 (2019).
  64. Gehin, G., et al. Pseudomonas putida coordinates the expression of two manganese oxidases and optimizes manganese oxide precipitation in response to aqueous Mn(II). Environ Sci Technol. 59, 13777-13786 (2025).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wytr canie tlenk w metalitlenki manganutlenki elazarozw j biofilmuPseudomonas putidamikroskopia w jasnym poluodejmowanie obraz w

Powiązane artykuły