Dojrzewanie in vitro komórek jajowych myszy, zapłodnienie i hodowlą zarodków przedimplantacyjnych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedury dotyczące in vitro dojrzewania oocytów mysich, in vitro zapłodnienia i późniejszej kultury embrionów do etapu blastocysty.

Streszczenie

Dojrzewanie in vitro komórek jajowych myszy, w połączeniu z in vitro zapłodnieniem i następczym hodowlą zarodków, umożliwia wytworzenie zarodków przedimplantacyjnych w warunkach zdefiniowanych. Te procedury ułatwiają badanie funkcji biologicznych i mechanizmów molekularnych leżących u podstaw dojrzewania komórek jajowych, zapłodnienia i wczesnego rozwoju zarodka. Jednakże, pomyślne zastosowanie tego podejścia zależy od starannego postępowania z komórkami jajowymi i plemnikami, odpowiednich warunków hodowli i dokładnej oceny postępów rozwojowych na każdym etapie. W tym miejscu opisujemy metody izolowania niedojrzałych kompleksów komórek wieńczowych i komórek jajowych (COC) z jajników myszy, in vitro dojrzewania komórek jajowych, in vitro zapłodnienia i in vitro hodowli zarodków do stadium blastocysty. Te procedury obejmują przygotowanie i ekwilibrację mediów i miseczek hodowlania, izolację i selekcję COC po dysekcji jajników, zbieranie plemników i ich uwarunkowywanie, wykonywanie zapłodnienia w zstandaryzowanych warunkach i następczych hodowli zarodków w celu oceny rozwojowej. Postęp rozwojowy ocenia się za pomocą kryteriów morfologicznych, w tym tworzenie męskich i żeńskich jąder zarodkowych, podział na dwukomórkowy etap i tworzenie blastocysty. Ten protokół może być zintegrowany z badaniami nad dojrzewanie komórek jajowych i funkcją czynników matczynych, zapewniając cenne narzędzie do podstawowych badań w dziedzinie biologii rozrodu ssaków.

Wprowadzenie

Zrozumienie jakości oocytów i kompetencji rozwojowej jest niezbędne dla udanego zapłodnienia i późniejszego rozwoju zarodkowego^1,2. Dojrzewanie oocytów wymaga nie tylko dokładnej segregacji chromosomów podczas dojrzewania jądrowego, ale także dojrzewania cytoplazmatycznego, w tym redystrybucji organelli oraz akumulacji matczynych mRNA i białek³. Wczesny rozwój zarodkowy opiera się na mRNA i białkach pochodzących od matki, a zasoby matczyne w oocycie utrzymują rozwój przedimplantacyjny. Jednak tożsamość i funkcje wielu matczynych regulatorów embriogenezy ssaków pozostają niedostatecznie poznane⁴. Dlatego potrzebne są dalsze systematyczne badania, aby wyjaśnić mechanizmy leżące u podstaw dojrzewania oocytów, zapłodnienia i rozwoju zarodkowego.

Mysz jest szeroko stosowanym modelem do badań rozwoju zarodków przedimplantacyjnych. In vitro dojrzewanie (IVM) odnosi się do pobierania niedojrzałych oocytów z jąder i ich dojrzewania w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych⁵. Następnie in vitro zapłodnienie (IVF) umożliwia współinkubację dojrzałych oocytów z spermą zdolną do zapłodnienia, aby wygenerować zygoty do badań wczesnego rozwoju zarodkowego. Jednak w porównaniu z konwencjonalnym IVF przy użyciu in vivo–dojrzałych oocytów, oocyty pochodzące z IVM często wykazują niższe współczynniki dojrzewania i zapłodnienia oraz obniżoną kompetencję rozwojową⁶. Ograniczenia te są w dużej mierze spowodowane asynchronicznością dojrzewania jądrowego i cytoplazmatycznego w warunkach kultury in vitro. Ponadto stabilność wrzeciona meiotycznego w oocytach mysich jest wrażliwa na zmiany pH i temperatury podczas IVM, a zakłócenia wrzeciona mogą przyczyniać się do zatrzymania dojrzewania⁷. W konsekwencji, obniżona kompetencja oocytów pochodzących z IVM pozostaje główną barierą, ograniczającą efektywne produkowanie zarodków dla badań rozwojowych i mechanizmowych.

Zarodki przedimplantacyjne myszy mogą być również uzyskiwane poprzez pobieranie zygot pochodzących in vivo i hodowle in vitro (IVC). In vivo–pochodzące zygoty zebrane z jajowodów zapewniają stosunkowo zsynchronizowany punkt wyjściowy dla eksperymentów skupionych na zdarzeniach po zapłodnieniu⁸. Jednak dojrzewanie oocytów i akumulacja czynników matczynych zachodzą przed zapłodnieniem in vivo; dlatego zygoty pochodzące in vivo są mniej przystosowane do eksperymentalnej manipulacji warunkami dojrzewania lub zasobami matczynymi w celu oceny ich wpływu na późniejszy rozwój zarodków⁴. Dlatego optymalizacja protokołów IVM i IVF oraz przyjęcie znormalizowanych procedur operacyjnych z rygorystyczną kontrolą jakości (np. ścisłe zarządzanie temperaturą, pH i praktykami obsługi) są niezbędne, aby zminimalizować zmienność związaną z procedurą i chronić kompetencję rozwojową oocytów i zarodków.

Poniżej opisano protokół IVM–IVF–IVC szczegółowo opisujący przygotowanie mediów, izolację i selekcję COCs, procedury IVM i IVF oraz in vitro hodowlę zarodków (Rysunek 1). Protokół zawiera praktyczne, etapowe punkty kontrolne do rutynowej kontroli jakości, w tym wydalenie pierwszego ciała biegunowego (PB1), formowanie męskich i żeńskich jąder zarodkowych (2PN), podział na dwie komórki i formowanie blastocyst. Ten protokół umożliwia powtarzalne i efektywne generowanie zarodków przedimplantacyjnych w zdefiniowanych warunkach, wspierając badania mechanizmowe, optymalizację hodowli i zastosowania wtórnie w biologii rozwoju i rozrodu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Wykorzystywania Uniwersytetu Northwest A&F, Chiny (numer pozwolenia: 20230503).

1. Utrzymanie zwierząt

1. Zdobądź dzikich myszy C57BL/6 płci żeńskiej i DBA/2 płci męskiej i trzymaj je w warunkach wolnych od określonych patogenów (SPF), przy cyklu 12-godzinnym światło-cień, w temperaturze 20–22 °C i wilgotności 55% ± 10%. Zapewnij dietę hodowlaną i wodę ad libitum. Myszy męskie trzymaj pojedynczo (jedna mysz na klatkę).

2. Przygotowanie mediów

1. Aby przygotować pracujący roztwór PMSG 50 IU/mL, rozpuść 5000 IU gonadotropiny suczy końskiej (PMSG) w 100 mL sterylnego buforu fosforanowego (PBS).
   UWAGA: Rozdzielić roztwór na jednorazowe porcje po 1 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C. Każdą porcję rozmrażać w temperaturze pokojowej bezpośrednio przed użyciem.
2. Aby przygotować medium kulturowe IVM, dodaj składniki wymienione w Tabeli 1 do 100 mL podstawowego medium 199 (M199). Wyreguluj pH do 7,3–7,4, a następnie przefiltruj sterylnie przez filtr o przenikalności 0,22 µm do sterylnych butelek z medium. Oznakować butelkę "IVM" inicjałami, datą wytworzenia i datą ważności oraz przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 1 miesiąc.
3. Aby przygotować 0,1% (w/v) roztwór hialuronidazy, rozpuść 10 mg hialuronidazy w 10 mL medium M2.
   UWAGA: Przechowywać w jednorazowych plikach po 1 mL w temperaturze -20 °C i ogrzewać do 37 °C przed użyciem.

3. Przygotowanie naczyń (Rysunek 2)

UWAGA: Dostosuj liczbę kropel IVM, IVF i IVC zgodnie z przewidywaną liczbą COC i zarodków, używając 20–30 COC na 100 µL kropli dla IVM i IVF oraz 20–30 zarodków na 100 µL kropli dla kultury zarodków.

1. Przygotuj odpowiednią liczbę 35 mm naczyń do pobierania oocytów, każde zawierające 2 mL medium M2 uzupełnionego o 0,2 mM 3-izobutylo-1-metyloksantynę (IBMX). Użyj jednego naczynia do nakłucia jajnika i pobierania COC (jedno naczynie na dwie samice) oraz innego do płukania COC. Rozgrzej naczynia do 37 °C przed użyciem.
2. Przygotuj naczynia IVM.
   1. W 60 mm naczyniu przygotuj pięć 100 µL kropel medium IVM do płukania (oznaczyć naczynie jako "IVM wash").
   2. W oddzielnym 60 mm naczyniu przygotuj wiele 100 µL kropel medium IVM do dojrzewania (oznaczyć naczynie jako "IVM").
   3. Ostrożnie dodaj wystarczającą ilość oleju mineralnego, aby pokryć krople i zrównoważyć naczynia w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO₂ przez co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem pobierania oocytów.
3. Przygotuj naczynia IVF.
   1. W 60 mm naczyniu przygotuj jedną lub dwie 300 µL krople wstępnie zrównoważonego medium kulturowego zarodków do uwolnienia plemników i kapacitacji (oznaczyć naczynie jako "Kapacytacja plemników").
      UWAGA: Druga kropla do kapacitacji jest przygotowywana jako rezerwa na wypadek, gdy ruchliwość plemników w pierwszej kropli jest niewystarczająca, należy zebrać nową próbkę plemników z wywiewnika i poddać ją kapacitacji lub należy dostosować stężenie plemników przed zapłodnieniem.
   2. Przygotuj dwa oddzielne 60 mm naczynia, każde zawierające pięć 100 µL kropel wstępnie zrównoważonego medium kulturowego do płukania (oznaczyć naczynie jako "IVF wash").
      UWAGA: Użyj jednego "IVF wash" do płukania COC dojrzałych IVM przed zapłodnieniem i drugiego "IVF wash" do płukania przypuszczalnych zygot po współhodowli, aby usunąć komórki cumulus i resztki plemników.
   3. W oddzielnym 60 mm naczyniu przygotuj wiele 100 µL kropel wstępnie zrównoważonego medium kulturowego zarodków do zapłodnienia (oznaczyć naczynie jako "IVF").
      UWAGA: Wstępnie zrównoważone medium kulturowe zarodków jest używane zarówno do kapacitacji plemników, jak i zapłodnienia, aby utrzymać spójne warunki podczas przygotowywania plemników i zapłodnienia.
   4. Ostrożnie dodaj wystarczającą ilość oleju mineralnego, aby pokryć krople i zrównoważyć naczynia w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO₂ przez co najmniej 12 godzin przed rozpoczęciem procedury kapacitacji plemników.
4. Przygotuj naczynia IVC.
   1. W 60 mm naczyniu przygotuj pięć 100 µL kropel wstępnie zrównoważ

Wyniki

Używając tego protokołu, mysie COC-ki były sekwencyjnie przetwarzane poprzez in vitro dojrzewanie, in vitro zapłodnienie, oraz następcze in vitro hodowlę zarodków, co skutkowało reproduktywnym wytwarzaniem zarodków przedimplantacyjnych i rozwojem do etapu blastocysty w opisanym warunkach. Po 14 h IVM, COC-ki zazwyczaj wykazywały ekspansję komórek cumulus i nienaruszony morfologia oocytów. Dojrzewanie meiotyczne oocytów było mierzone przez denudację wyznaczonego zestawu oceny po IVM i punktowani...

Dyskusja

Niniejszy protokół zapewnia standaryzowaną procedurę dojrzewania komórek jajowych myszy in vitro, zapłodnienia in vitro oraz hodowli in vitro za pomocą niedojrzałych KOC, umożliwiając powtarzalne generowanie i ocenę zarodków przedimplantacyjnych na etapie blastocysty w określonych warunkach in vitro. W wielu badaniach wyniki IVM są wrażliwe na różnice w mediach, czasach inkubacji i obsłudze, które mogą zmniejszać kompetencję rozwojową po IVM^12,

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
35 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	150255
60 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	150270
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A8806
Breeding diet (rodent breeder chow)	Keao Xieli (Beijing,China)	N/A
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 150i
D-glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Disposable Pasteur Pipet	Kimble	DWK63A53WT-1000EA
Epidermal growth factor	Gibco	PHG0313
Fine dissecting scissors	Sigma-Aldrich	S3146-1EA
Fine-tip forceps	Rhino	SW14
Follicle-stimulating hormone	Millipore	869001
G-1 PLUS	Vitrolife	10128
G-IVF PLUS	Vitrolife	10136	(preequilibriated) embryo culture medium
Hemocytometer	Millicell	MDH-4N1
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4274
IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine)	Selleck	S5836
KnockOut Serum Replacement	Gibco	A3181501
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
Luteinizing hormone	Millipore	869003
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Medium 199	Gibco	11150-059
Micropipette	Gilson	F167350
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012027
Pregnant Mare Serum Gonadotropin	Ningbo Second hormone factory (Ningbo, China)	N/A
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P4562
Stereo microscope	Olympus	SZX10
Sterile medium bottles	Nalgene	46600-586
Sterile syringe needle	BD Biosciences	309623	1 mL, 27G1/2
Syringe Filter Unit	Millipore	SLGP033R
Thermo Plate	Tokai Hit	TPi-SZX2X