Algorytm analizy kształtów ilościowo opisuje morfologię przestrzenną i kontekst 2D do 3D hodowlą komórkowych dla nowatorskiej ilościowej oceny fenotypu

Summary

Ten artykuł wyjaśnia, jak nowatorskie cechy morfologiczne w komórkach i organoidalach można sprecyzować za pomocą transformacji liniowych skomplikowane polarne współrzędne (LCPC), przestrzennego algorytmu, który uchwytuje właściwości, których tradycyjne metryki, takie jak pole, objętość i powierzchnia, nie mogą. Omówione są najlepsze praktyki dotyczące orientacji kształtu i jego ustawienia.

Abstract

Liczne badania wykazały, że fenotyp morfologiczny komórki lub organoidu koreluje z jej podatnością na środki przeciwnowotworowe. Jednak tradycyjne metody pomiaru fenotypu opierają się na metrykach przestrzennych, takich jak powierzchnia, objętość, obwód i intensywność sygnału, które działają, ale są ograniczone. Podejścia te nie mogą mierzyć wielu kluczowych cech kontekstu przestrzennego, takich jak chiralność, czyli właściwość lewo- i prawoskrętności. Nie można użyć objętości do rejestracji chiralności, ponieważ lewa i prawa buty mają taką samą objętość. Chociaż kontekst przestrzenny w postaci chiralności, kierunku grawitacji i osi polaryzacyjnej jest intuicyjny dla ludzi, tradycyjne metryki używane przez biologów komórkowych, patologów, radiologów i praktyków uczenia maszynowego do tej pory nie mogą uchwycić tych fundamentalnych pojęć. Przekształcenie skomplikowanej polarnej transformacji liniowej (LCPC) to nowatorski algorytm, który może uchwycić kontekst przestrzenny w przeciwieństwie do jakiejkolwiek innej metryki. Transformacja LCPC przekształca dwuwymiarową (2D) konturę w dyskretną falę sinusoidalną, nakładając system siatki, który śledzi punkty przecięcia między konturem a liniami siatki. Zamienia kontur na sekwencję par dyskretnych współrzędnych, przy czym niezależna współrzędna (współrzędna x) odpowiada kolejnym pozycjom w przestrzeni 2D. Każda współrzędna zależna (współrzędna y) składa się z odległości między przecięciem konturu i linii siatki do początku lub linii bazowej systemu siatki. W postaci dyskretnej fali sinusoidalnej stosuje się następnie transformację Fouriera do danych. W ten sposób kształty komórek w kulturach komórkowych 2D i 3D są systematycznie i wielowymiarowo reprezentowane, umożliwiając solidną ilościową stratyfikację, która ujawni wgląd w oporność na leczenie.

Introduction

Hodowanie organoidów w trzech wymiarach (3D) okazało się lepsze niż hodowle komórek dwuwymiarowych (2D) w naśladowaniu biologii in vivo^1,2. Organoidy stały się niezastąpione w badaniach nad rakiem do przesiewowych testów na skuteczne leczenie i pozyskiwania wglądu w progresję choroby^3,4,5,6. Chociaż w biologii nowotworów dobrze wiadomo, że różnice w morfologii korelują z odrębnym zachowaniem biologicznym komórek i tkanek, dziedzina ta opiera się na tradycyjnych metrykach kształtu, które są ograniczone w zakresie. Niniejsze badanie opisuje nowy algorytm przestrzenny, który obiektywnie ilościowo określa subtelne cechy morfologiczne z bezprecedensową precyzją, przewyższając tradycyjne podejścia takie jak pole, objętość i pole powierzchni.

Transformacja zlinearyzowanych skompresowanych współrzędnych polarnych (LCPC) została stworzona w celu obiektywnego i ilościowego opisu złożonych morfologii obserwowanych w histopatologii tkanek, z zamiarem poprawy klasyfikacji polipów jelit⁷. Pragnięcie poszerzenia tego podejścia w celu uchwycenia makroskopowych cech przestrzennych opartych na MRI w patologiach mózgu, takich jak zaburzenie dwubiegunowe i choroba Alzheimera, doprowadziło do ulepszeń, które zwiększyły jego efektywność. Niniejsze badanie opisuje krokową procedurę i najlepsze praktyki stosowania dwóch wersji transformacji LCPC: układu siatki równoległej i układu siatki radialnej, z których oba mają skrypty open-source i filmy tutorialowe.

Oprócz tradycyjnych metod geometrycznych istnieje wiele abstrakcji, które okazały się skuteczne w pomiarze złożonych kształtów komórek i narządów. Obejmują one pomiar miary wyciągnięcia, skośności, kontrastu i kurtozy, wraz z momentami Zernike do uchwycenia okrągłości, asymetrii, nieregularności krawędzi i globalnej struktury konturu^8,9,10. Analiza fraktalna była również przydatna do redukcji złożonych konturów do wartości skalarnych, takich jak wymiar fraktalny, który mierzy nieregularność konturu oraz lakunarność, która mierzy niezwykle nierównomierny wygląd luk w konturze^11,12. Do pomiaru tekstury popularną metodą jest Macierz Współwystępowania Poziomów Szarości (GLCM) do pomiaru kontrastu, energii, jednorodności, korelacji i entropii^13,14. Podczas gdy wszystkie te metody są przydatne, żadna z nich nie została zaprojektowana do przechwytywania kontekstu przestrzennego, takiego jak kierunek grawitacji, lewo- vs. prawostronne, czy lokalizacja centralnej struktury wsparcia, która wpływa na kierunek zmiany kształtu. Co więcej, wiele z nich generuje pojedynczą wartość skalarną lub tylko kilka wartości skalarnych, aby reprezentować informacje przestrzenne, dlatego cytowane badania często stosują je w połączeniu, aby ocenić złożone kształty.

Transformacja LCPC została zaprojektowana tak, aby uzyskać wiele cech z jednego pomiaru i umożliwić dodanie markerów przestrzennych, które kodują kontekst przestrzenny w kształcie, takie jak kierunek grawitacji. Najbliższa metoda do transformacji LCPC⁷ została opublikowana rok później¹⁵, dzieląc tę samą ideę początkową: zastosowanie transformacji Fouriera do konturów komórek, aby zmierzyć kształt w postaci widma częstotliwości. Jednak transformacja LCPC została niezależnie opracowana, aby była stosowana za pomocą odrębnych układów siatki, które miały być używane w połączeniu z wiedzą o kontekście przestrzennym poza kształtem, który jest mierzony. Co więcej, wynalazca transformacji LCPC wyjaśnia w niniejszej publikacji, że wynikające z niej widmo częstotliwości zawiera ogromne ilości ukrytych informacji przestrzennych. Plik uzupełniający 1 zawiera rozszerzoną dyskusję na temat kontekstów przestrzennych w biologii, które są często pomijane przy użyciu cytowanych metod, oraz jak transformacja LCPC może być zastosowana do uchwycenia tego kontekstu. Dla czytelników, których dane kształtów nie wykazują różnicy między grupą kontrolną a eksperymentalną, czy też ich oczy nie widzą różnicy w kształtach, lub dla których dane kształtów wykazują bardzo niewielką różnicę, nawet jeśli podejrzewają, że powinna być ona większa, powinni wypróbować transformację LCPC.

Transformacja LCPC zapewnia bezprecedensowe poziomy precyzji w pomiarze informacji przestrzennych, ponieważ reprezentuje kształty w wielu wymiarach. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod, takich jak pole i objętość, które dają tylko jedną wartość skalarną na kształt (czyli 25 cm²), wyniki transformacji LCPC mogą dawać wiele indeksów, z których każdy koreluje z różnym aspektem morfologicznym kształtu (czyli okrągłość vs. ostrakość naroży, gładkość vs. nierówności krawędzi). Transformacja LCPC opisuje kształt 2D poprzez nałożenie siatki prostych linii, które przecinają jego kontur. Każdy układ siat

Protocol

Pierwotne komórki ludzkie użyte w tym badaniu zostały uzyskane i kulturowane zgodnie z uprzednio zgłoszonymi procedurami etycznymi i zgody na udział w badaniu¹⁷. Prezentowane tu obrazy zostały wygenerowane z tych zatwierdzonych kultur komórkowych i są publikowane po raz pierwszy. Próbki tkanek zostały zebrane w Szpitalu Brigham and Women’s oraz na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Etyczny Instytucji (IRB) u pacjentów, którzy wyrazili zgodę na użycie ich tkanek w celach badawczych, zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami¹⁷. Żadne dodatkowe pobieranie próbek ludzkich nie zostało przeprowadzone w ramach tego badania.

1. Wyodrębnianie czystego kształtu konturów organoidalnych 2D dla transformacji LCPC

1. Segmentuj zewnętrzny brzeg każdej organoidali za pomocą dowolnego oprogramowania do przetwarzania obrazów, takiego jak Microsoft’s Paint, MacOS’ Preview lub Fiji/ImageJ.
2. Wyodrębnij kontury organoidali jako otwarte maski, które są niebieskimi liniami na białym tle.
3. Izoluj każdą niebieską konturę na własnym białym płótnie.
   UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy obraz zawiera więcej niż jedną konturę.
4. Przytnij każdą konturę, aby miała jeden piksel marginesu ze wszystkich czterech stron obiektu niebieskiego.
5. Dodaj 100 pikseli białej przestrzeni ze wszystkich czterech stron, aby utworzyć nowe marginesy.
6. Obróć obiekty tak, aby najdłuższa wewnętrzna długość była pozioma.
   UWAGA: Ten krok obraca najdłuższą wewnętrzną linię w obrębie każdego obiektu w jego szerokość. Do tego celu są dostępne dwa skrypty. W przypadku zamkniętych kształtów, użyj Jupyter Notebook o nazwie “Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb”. W przypadku otwartych kształtów lub kształtów z wieloma komponentami, użyj Jupyter Notebook o nazwie “Rotate Green Line_v3.ipynb”. Narzędzie Rotate Green Line ma wideo tutorial, który jest linkowany w pliku ReadMe znajdującym się w tej samej lokalizacji co plik.ipynb.
7. Przytnij każdy obraz, aby miał jeden piksel marginesu ze wszystkich czterech stron niebieskiego obiektu.
   UWAGA: Jest to to samo, co Krok 1.4. Cel przycinania tym razem, jednak, jest taki, że następny krok redimensionowania powiększa całe płótno, a nie tylko niebieski obiekt na nim. Tak więc, sprawiając, że niebieski obiekt ma prawie taką samą szerokość i wysokość jak samo płótno, redimensionowanie płótna do 400 pikseli szerokości powoduje też redimensionowanie obiektu do prawie 400 pikseli szerokości. Istnieje Jupyter Notebook o nazwie “Trim margin to 1-pixel border.ipynb”.
8. Zmień szerokość płótna każdego obrazu na 400 pikseli, jednocześnie zachowując proporcje.
   UWAGA: Ten krok sprawia, że każdy obiekt ma tę samą szerokość. Zachowanie proporcji zapobiega skręcaniu obiektu podczas redimensionowania. Istnieje Jupyter Notebook o nazwie “Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb”.
9. Dodaj 100 pikseli białej przestrzeni ze wszystkich czterech stron, aby utworzyć nowe marginesy.
10. Obróć każdy obraz o 90 stopni w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do nich, aby najdłuższa wewnętrzna długość była pionowa, zachowując spójność z wyborem dla wszystkich obrazów.
    UWAGA: W powyższej kolejności czysty kształt uzyskuje się poprzez sekwencyjne wykonanie Kroków 1.6, 1.7, 1.8 i 1.9. Dodanie przestrzeni marginesu w Kroku 1.9 jest wymagane, aby uniknąć błędów w skryptach transformacji LCPC, które zostaną wykonane następnie, ale nie jest zaangażowane w wyodrębnianie czystego kształtu. Użytkownicy, którzy chcą mierzyć kształty “w skali”, nie muszą wykonywać Kroków 1.6, 1.7 i 1.8 w powyższej kolejności, chociaż powinni nadal przetwarzać obrazy maski, aby osiągnąć optymalną orientację przed zastosowaniem transformacji LCPC.
11. Wykonaj transformację LCPC na każdej konturze. Użyj skryptów Pythona dostarczonych dla metody siatki radialnej¹⁸ lub metody siatki równoległej¹⁹.

2. Wyodrębnianie kształtu w skali konturów organoidalnych 2D dla transformacji LCPC

UWAGA: Metoda krok po kroku wyodrębniania kształtu w skali obiektów jest podobna do metody wyodrębniania czystego kształtu w Protokole 1 powyżej. Kroki są nazywane identycznie w obu protokołach, aby ułatwić dopasowanie. Proszę odnieść się do uwag w Protokole 1 dla każdego kroku. Główna różnica między czystym kształtem a kształtem w skali polega na tym, że kształt w skali nie wymaga Kroków 1.6, 1.7 i 1.8, które są krokami redimensionowania.

Results

Transformacja siatki radialnej LCPC zastosowana do organoidów raka piersi

Organoidy i guzy 3D mogą przybierać różnorodne kształty, z których niektóre są oczywiście różne dla ludzkiego oka, mimo że tradycyjne metryki dają statystycznie nieistotne różnice. Z drugiej strony, organoidy mogą również wykazywać kształty, które wydają się heterogeniczne i tym samym nieistotne dla ludzkiego oka, maskując powtarzające się subtelne morfologie, które reprezentują odrębne podtypy. Pierwotne ludzkie organoidy piersiowe zostały wyekstrahowanie z pacjentów i hodowane w 3D zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem^17,20,21. Rys. 3A przedstawia trzy morfologiczne kategorie dostępne na podstawie wizualnej inspekcji: fenotyp cystyczny, fenotyp wielocystyczny i gęsty fenotyp wielocystyczny. Rys. 3B pokazuje, że zewnętrzne kontury tych organoidów zostały ręcznie zsegmentowane, a ich czysty kształt został wyodrębniony, co usuwa wpływ wielkości na ich kształty. Ponieważ kontury były okrągłej natury, transformacja siatki radialnej LCPC została zastosowana do czystych kształtów, po czym PCA. Należy zauważyć, że kontury nałożone na Rys. 3B zostały obrócone tak, że najdłuższa wewnętrzna linia jest pionowa, co oznacza, że ich orientacje nie są takie same jak w źródłowych obrazach. Rys. 3B przedstawia wykres punktowy pierwszych dwóch głównych składowych (PC), a klastryzacja K-średnich zidentyfikowała trzy klastry: 0, 1 i 2. Współczynniki Silhouette (SS) potwierdziły prawdopodobne istnienie dwóch oddzielnych klastrów między Klastra 0 a 1 (SS = 0,68) oraz Klastra 1 a 2 (SS = 0,69), podczas gdy wskazywały na słabe rozdzielenie między Klastra 0 a 2 (SS = 0,27). Mimo słabego współczynnika Silhouette między Klastra 0 i 2, oznakowane dane punktowe z czystym kształtem każdego punktu danych uzasadniają, że Klaster 2 reprezentuje najbardziej odrębny fenotyp: wysoce asymetryczne, nieokrągłe kontury (grubość konturów nie ma znaczenia w tym przypadku).

Podczas gdy kształt czysty usuwa wpływ wielkości na kształt, co jest niemożliwe przy pomiarze powierzchni i objętości, pomiar konturów organoidów w skali również ujawnia ciekawe wnioski. Rys. 3C przedstawia 3D wykres punktowy pierwszych trzech PC wynikających z transformacji siatki radialnej LCPC wykonanej na konturach, które zostały zsegmentowane z obrazów bez żadnej zmiany skali. To podejście oznacza, że transformacja LCPC mierzy jednocześnie kształt i wielkość organoidów. Rys. 3C pokazuje, że organoidy wielocystyczne i gęsto wielocystyczne są mniej gęsto upakowane w porównaniu z organoidami cystycznymi. Aby sprecyzować tę ekspansję, Rys. 3D pokazuje rozproszenie każdego fenotypu w jego wspólnej przestrzeni PCA. Przeciętna odległość do K-najbliższego sąsiada (KNND) jest obliczana dla każdego fenotypu, co wspiera wizualną ocenę zmniejszającej się gęstości kropek, przechodząc od organoidów cystycznych (KNND = 1,061) do organoidów wielocystycznych (KNND = 1,575) do gęsto wielocystycznych organoidów (KNND = 2,247); to zmniejszone rozproszenie kropek można również interpretować jako zwiększoną morfologiczną heterogeniczność zewnętrznych konturów. Wreszcie, dla porównania transformacji LCPC z tradycyjną metryką powierzchni, Rys. 3E pokazuje, że chociaż istnieje statystycznie istotna różnica między powierzchnią organoidów cystycznych a gęsto wielocystycznych (p = 0,016, test Wilcoxona Rank-Sum), nie ma żadnego wskazania na podstawie powierzchni, że istnieją trzy odrębne morfologiczne grupy wśród fenotypów, jak zidentyfikowano przez klastryzację K-średnich po analizie czystej kształtowej transformacji LCPC (Rys. 3B) lub że istnieje zwiększająca się morfologiczna heterogeniczność, jak pokazano przez analizę LCPC w skali (Rys. 3C–D). Rys. 3E pokazuje zmniejszające się rozproszenie punktów danych przechodzące od cystycznych do wielocystycznych do gęsto wielocystycznych organoidów, co jest przeciwieństwem tego, co obserwuje się w analizie LCPC w skali (Rys. 3C), podkreślając, że informacje przestrzenne uchwycone przez transformację LCPC są różne od tego, co uchwyca powierzchnia.

To samo podejście zastosowane do indywidualnych kształtów 2D na Rys. 3 i Dodatkowej Rysunku 1 dotyczy również konturów komórek w 2D kulturze komórkowej: pojedynczych komórek (takich jak czerwone krwinki krwi) lub klastrów komórek (takich jak w wymazaniach Pap z szyjki macicy). Pilotażowe badania dla każde

Discussion

Podobnie jak w przypadku każdego narzędzia obliczeniowego, jakość wyjścia zależy od tego, czy wejścia spełniają oczekiwane zasady, na których narzędzie zostało zaprojektowane. Należy przestrzegać następujących zasad i stosować je jako kontrolę jakości podczas korzystania z dostarczonych skryptów Python. Po pierwsze, upewnij się, że otwarte maski są niebieskimi liniami na białym tle. Kolor niebieski był dowolnym założeniem i nie ma znaczenia, ale skrypty, które wykonują transformację LCPC, zostały napisane w celu wyszukiwania niebieskich pikseli na białym tle. Po drugie, nie uruchamiaj skryptów transformacji LCPC na obrazach, które mają mniej niż 10 pikseli przestrzeni wolnej na wszystkich czterech stronach. Zapoznaj się z tym wideo, aby dowiedzieć się, dlaczego: “Parametr grubości marginesu - jak przygotować kontury kształtów”³³. Po trzecie, ten skrypt zakłada, że kontury twojego obiektu są niebieskimi pikselami na białym tle. Grubość linii powinna wynosić od 5 do 10 pikseli. Zapoznaj się z tym wideo, aby dowiedzieć się, dlaczego: “Parametr grubości linii - jak przygotować kontury kształtów”³⁴. Po czwarte, nie uruchamiaj skryptów transformacji LCPC na pustych obrazach. Spowoduje to błąd w skrypcie. Piąte, nie uruchamiaj skryptów transformacji LCPC na obrazach, które składają się tylko z plamki zanieczyszczeń. Spowoduje to błąd, ponieważ system siatki może nie wykryć plamki i tym samym próbować przeanalizować pusty obraz. Szóste, nie uruchamiaj skryptów transformacji LCPC na obrazach zawierających plamki niepożądanych zanieczyszczeń. Zanieczyszczenia mogą zmienić wysokość i szerokość obiektu otwartej maski, a tym samym powodować niedokładne wyniki. Siódme, zapoznaj się z tym wideo, aby zrozumieć, dlaczego ważne jest zrozumienie skali twoich obiektów przed ich analizą za pomocą transformacji LCPC: “Parametr skali - jak przygotować kontury kształtów”³⁵.

Jednym z najbardziej niezwykłych aspektów transformacji LCPC jest jej zdolność do rejestrowania kontekstu przestrzennego. Biologia jest pełna kontekstu przestrzennego, który jest niezbędny do zrozumienia natury. Na przykład komórki nabłonkowe mają biegunowość wierzchołkowo-podstawową^36,37,38,39. Co więcej, kierunek grawitacji, który jest zmieniany w warunkach mikrograwitacji, ma znaczący wpływ zarówno na fizjologię astronautów^40,41, jak i na morfologię komórek nowotworowych^42,43,44. Ostatnio, preneoplazja i neoplazja in situ mogą rosnąć do światła dzięki trzonkowi, który służy jako centralna struktura wsparcia, zapewniając dostęp do zaopatrzenia w krew. Tak więc, gdy te zmiany cofają się, cofają się zarówno od jamy światła, jak i w kierunku trzonka^45,46. Ponieważ został zaprojektowany w taki sposób, transformacja LCPC jest bardzo wrażliwa na kontekst przestrzenny i dlatego może wprowadzić dodatkową heterogeniczność, jeśli użytkownik nie jest ostrożny. Rysunek 6 opisuje, jak systematycznie orientować kształty przed zastosowaniem transformacji LCPC. Rysunek 7 opisuje, jak tradycyjna geometria nie może mierzyć pojęć kształtów oczywistych dla ludzi. Rysunek 8 przedstawia diagram, który wizualizuje różnicę między mierzeniem czystego kształtu a kształtu w skali. Rysunek 9 opisuje, że kontekst przestrzenny jest często zaniedbywany przy ilościowym określaniu kształtów w kulturze 2D, histologii i 2D przekrojach z obrazowania 3D. Należy pamiętać, że ze względu na ograniczenia przestrzeni, Plik uzupełniający 1 zawiera rozszerzoną dyskusję na temat Rysunku 6 i Rysunku 7 w sekcji 5 oraz Rysunku 8 i Rysunku 9 w sekcji 6.

Ponieważ FFT produkuje wielowymiarowe dane spektralne, ważne jest, aby użytkownik stał się przyzwyczajony do wyprowadzania indeksów z powtarzających się wzorców w widmach. Chociaż ten rękopis odnosi się do transformacji LCPC jako do zawierającej krok stosowania FFT, rzeczywista transformacja LCPC następuje przed etapem FFT (Rysunek 1A–B Krok 4, Rysunek 2A–B Krok 3). Jednak stosowanie FFT ujawnia obiektywne, systematyczne wnioski z dziedziny częstotliwości wyjścia transformacji LCPC. Tak więc transformacja LCPC nie byłaby tak skuteczna bez włączenia FFT jako ostatniego kroku. W transformacji LCPC FFT daje szereg koszy i ich wartości bezwzględne, z których wszystkie są statyczną wielowymiarową reprezent

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Used the NearestNeighbors function within the sklearn.neighbors package
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Used cKDTree function within scipy.spatial package
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Created an implementation of Cliff's Delta via the Python language
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Was mentinoed as a potential useful tool for manual segmentation, but not used in this study
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Used the PCA function with the sklearn.decomposition package
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook