Ten artykuł wyjaśnia, jak nowatorskie cechy morfologiczne w komórkach i organoidalach można sprecyzować za pomocą transformacji liniowych skomplikowane polarne współrzędne (LCPC), przestrzennego algorytmu, który uchwytuje właściwości, których tradycyjne metryki, takie jak pole, objętość i powierzchnia, nie mogą. Omówione są najlepsze praktyki dotyczące orientacji kształtu i jego ustawienia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Algorytm analizy kształtów ilościowo opisuje morfologię przestrzenną i kontekst 2D do 3D hodowlą komórkowych dla nowatorskiej ilościowej oceny fenotypu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Liczne badania wykazały, że fenotyp morfologiczny komórki lub organoidu koreluje z jej podatnością na środki przeciwnowotworowe. Jednak tradycyjne metody pomiaru fenotypu opierają się na metrykach przestrzennych, takich jak powierzchnia, objętość, obwód i intensywność sygnału, które działają, ale są ograniczone. Podejścia te nie mogą mierzyć wielu kluczowych cech kontekstu przestrzennego, takich jak chiralność, czyli właściwość lewo- i prawoskrętności. Nie można użyć objętości do rejestracji chiralności, ponieważ lewa i prawa buty mają taką samą objętość. Chociaż kontekst przestrzenny w postaci chiralności, kierunku grawitacji i osi polaryzacyjnej jest intuicyjny dla ludzi, tradycyjne metryki używane przez biologów komórkowych, patologów, radiologów i praktyków uczenia maszynowego do tej pory nie mogą uchwycić tych fundamentalnych pojęć. Przekształcenie skomplikowanej polarnej transformacji liniowej (LCPC) to nowatorski algorytm, który może uchwycić kontekst przestrzenny w przeciwieństwie do jakiejkolwiek innej metryki. Transformacja LCPC przekształca dwuwymiarową (2D) konturę w dyskretną falę sinusoidalną, nakładając system siatki, który śledzi punkty przecięcia między konturem a liniami siatki. Zamienia kontur na sekwencję par dyskretnych współrzędnych, przy czym niezależna współrzędna (współrzędna x) odpowiada kolejnym pozycjom w przestrzeni 2D. Każda współrzędna zależna (współrzędna y) składa się z odległości między przecięciem konturu i linii siatki do początku lub linii bazowej systemu siatki. W postaci dyskretnej fali sinusoidalnej stosuje się następnie transformację Fouriera do danych. W ten sposób kształty komórek w kulturach komórkowych 2D i 3D są systematycznie i wielowymiarowo reprezentowane, umożliwiając solidną ilościową stratyfikację, która ujawni wgląd w oporność na leczenie.
Wprowadzenie
Hodowanie organoidów w trzech wymiarach (3D) okazało się lepsze niż hodowle komórek dwuwymiarowych (2D) w naśladowaniu biologii in vivo1,2. Organoidy stały się niezastąpione w badaniach nad rakiem do przesiewowych testów na skuteczne leczenie i pozyskiwania wglądu w progresję choroby3,4,5,6. Chociaż w biologii nowotworów dobrze wiadomo, że różnice w morfologii korelują z odrębnym zachowaniem biologicznym komórek i tkanek, dziedzina ta opiera się na tradycyjnych metrykach kształtu, które są ograniczone w zakresie. Niniejsze badanie opisuje nowy algorytm przestrzenny, który obiektywnie ilościowo określa subtelne cechy morfologiczne z bezprecedensową precyzją, przewyższając tradycyjne podejścia takie jak pole, objętość i pole powierzchni.
Transformacja zlinearyzowanych skompresowanych współrzędnych polarnych (LCPC) została stworzona w celu obiektywnego i ilościowego opisu złożonych morfologii obserwowanych w histopatologii tkanek, z zamiarem poprawy klasyfikacji polipów jelit7. Pragnięcie poszerzenia tego podejścia w celu uchwycenia makroskopowych cech przestrzennych opartych na MRI w patologiach mózgu, takich jak zaburzenie dwubiegunowe i choroba Alzheimera, doprowadziło do ulepszeń, które zwiększyły jego efektywność. Niniejsze badanie opisuje krokową procedurę i najlepsze praktyki stosowania dwóch wersji transformacji LCPC: układu siatki równoległej i układu siatki radialnej, z których oba mają skrypty open-source i filmy tutorialowe.
Oprócz tradycyjnych metod geometrycznych istnieje wiele abstrakcji, które okazały się skuteczne w pomiarze złożonych kształtów komórek i narządów. Obejmują one pomiar miary wyciągnięcia, skośności, kontrastu i kurtozy, wraz z momentami Zernike do uchwycenia okrągłości, asymetrii, nieregularności krawędzi i globalnej struktury konturu8,9,10. Analiza fraktalna była również przydatna do redukcji złożonych konturów do wartości skalarnych, takich jak wymiar fraktalny, który mierzy nieregularność konturu oraz lakunarność, która mierzy niezwykle nierównomierny wygląd luk w konturze11,12. Do pomiaru tekstury popularną metodą jest Macierz Współwystępowania Poziomów Szarości (GLCM) do pomiaru kontrastu, energii, jednorodności, korelacji i entropii13,14. Podczas gdy wszystkie te metody są przydatne, żadna z nich nie została zaprojektowana do przechwytywania kontekstu przestrzennego, takiego jak kierunek grawitacji, lewo- vs. prawostronne, czy lokalizacja centralnej struktury wsparcia, która wpływa na kierunek zmiany kształtu. Co więcej, wiele z nich generuje pojedynczą wartość skalarną lub tylko kilka wartości skalarnych, aby reprezentować informacje przestrzenne, dlatego cytowane badania często stosują je w połączeniu, aby ocenić złożone kształty.
Transformacja LCPC została zaprojektowana tak, aby uzyskać wiele cech z jednego pomiaru i umożliwić dodanie markerów przestrzennych, które kodują kontekst przestrzenny w kształcie, takie jak kierunek grawitacji. Najbliższa metoda do transformacji LCPC7 została opublikowana rok później15, dzieląc tę samą ideę początkową: zastosowanie transformacji Fouriera do konturów komórek, aby zmierzyć kształt w postaci widma częstotliwości. Jednak transformacja LCPC została niezależnie opracowana, aby była stosowana za pomocą odrębnych układów siatki, które miały być używane w połączeniu z wiedzą o kontekście przestrzennym poza kształtem, który jest mierzony. Co więcej, wynalazca transformacji LCPC wyjaśnia w niniejszej publikacji, że wynikające z niej widmo częstotliwości zawiera ogromne ilości ukrytych informacji przestrzennych. Plik uzupełniający 1 zawiera rozszerzoną dyskusję na temat kontekstów przestrzennych w biologii, które są często pomijane przy użyciu cytowanych metod, oraz jak transformacja LCPC może być zastosowana do uchwycenia tego kontekstu. Dla czytelników, których dane kształtów nie wykazują różnicy między grupą kontrolną a eksperymentalną, czy też ich oczy nie widzą różnicy w kształtach, lub dla których dane kształtów wykazują bardzo niewielką różnicę, nawet jeśli podejrzewają, że powinna być ona większa, powinni wypróbować transformację LCPC.
Transformacja LCPC zapewnia bezprecedensowe poziomy precyzji w pomiarze informacji przestrzennych, ponieważ reprezentuje kształty w wielu wymiarach. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod, takich jak pole i objętość, które dają tylko jedną wartość skalarną na kształt (czyli 25 cm2), wyniki transformacji LCPC mogą dawać wiele indeksów, z których każdy koreluje z różnym aspektem morfologicznym kształtu (czyli okrągłość vs. ostrakość naroży, gładkość vs. nierówności krawędzi). Transformacja LCPC opisuje kształt 2D poprzez nałożenie siatki prostych linii, które przecinają jego kontur. Każdy układ siat
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Pierwotne komórki ludzkie użyte w tym badaniu zostały uzyskane i kulturowane zgodnie z uprzednio zgłoszonymi procedurami etycznymi i zgody na udział w badaniu17. Prezentowane tu obrazy zostały wygenerowane z tych zatwierdzonych kultur komórkowych i są publikowane po raz pierwszy. Próbki tkanek zostały zebrane w Szpitalu Brigham and Women’s oraz na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Etyczny Instytucji (IRB) u pacjentów, którzy wyrazili zgodę na użycie ich tkanek w celach badawczych, zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami17. Żadne dodatkowe pobieranie próbek ludzkich nie zostało przeprowadzone w ramach tego badania.
1. Wyodrębnianie czystego kształtu konturów organoidalnych 2D dla transformacji LCPC
- Segmentuj zewnętrzny brzeg każdej organoidali za pomocą dowolnego oprogramowania do przetwarzania obrazów, takiego jak Microsoft’s Paint, MacOS’ Preview lub Fiji/ImageJ.
- Wyodrębnij kontury organoidali jako otwarte maski, które są niebieskimi liniami na białym tle.
- Izoluj każdą niebieską konturę na własnym białym płótnie.
UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy obraz zawiera więcej niż jedną konturę. - Przytnij każdą konturę, aby miała jeden piksel marginesu ze wszystkich czterech stron obiektu niebieskiego.
- Dodaj 100 pikseli białej przestrzeni ze wszystkich czterech stron, aby utworzyć nowe marginesy.
- Obróć obiekty tak, aby najdłuższa wewnętrzna długość była pozioma.
UWAGA: Ten krok obraca najdłuższą wewnętrzną linię w obrębie każdego obiektu w jego szerokość. Do tego celu są dostępne dwa skrypty. W przypadku zamkniętych kształtów, użyj Jupyter Notebook o nazwie “Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb”. W przypadku otwartych kształtów lub kształtów z wieloma komponentami, użyj Jupyter Notebook o nazwie “Rotate Green Line_v3.ipynb”. Narzędzie Rotate Green Line ma wideo tutorial, który jest linkowany w pliku ReadMe znajdującym się w tej samej lokalizacji co plik.ipynb. - Przytnij każdy obraz, aby miał jeden piksel marginesu ze wszystkich czterech stron niebieskiego obiektu.
UWAGA: Jest to to samo, co Krok 1.4. Cel przycinania tym razem, jednak, jest taki, że następny krok redimensionowania powiększa całe płótno, a nie tylko niebieski obiekt na nim. Tak więc, sprawiając, że niebieski obiekt ma prawie taką samą szerokość i wysokość jak samo płótno, redimensionowanie płótna do 400 pikseli szerokości powoduje też redimensionowanie obiektu do prawie 400 pikseli szerokości. Istnieje Jupyter Notebook o nazwie “Trim margin to 1-pixel border.ipynb”. - Zmień szerokość płótna każdego obrazu na 400 pikseli, jednocześnie zachowując proporcje.
UWAGA: Ten krok sprawia, że każdy obiekt ma tę samą szerokość. Zachowanie proporcji zapobiega skręcaniu obiektu podczas redimensionowania. Istnieje Jupyter Notebook o nazwie “Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb”. - Dodaj 100 pikseli białej przestrzeni ze wszystkich czterech stron, aby utworzyć nowe marginesy.
- Obróć każdy obraz o 90 stopni w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do nich, aby najdłuższa wewnętrzna długość była pionowa, zachowując spójność z wyborem dla wszystkich obrazów.
UWAGA: W powyższej kolejności czysty kształt uzyskuje się poprzez sekwencyjne wykonanie Kroków 1.6, 1.7, 1.8 i 1.9. Dodanie przestrzeni marginesu w Kroku 1.9 jest wymagane, aby uniknąć błędów w skryptach transformacji LCPC, które zostaną wykonane następnie, ale nie jest zaangażowane w wyodrębnianie czystego kształtu. Użytkownicy, którzy chcą mierzyć kształty “w skali”, nie muszą wykonywać Kroków 1.6, 1.7 i 1.8 w powyższej kolejności, chociaż powinni nadal przetwarzać obrazy maski, aby osiągnąć optymalną orientację przed zastosowaniem transformacji LCPC. - Wykonaj transformację LCPC na każdej konturze. Użyj skryptów Pythona dostarczonych dla metody siatki radialnej18 lub metody siatki równoległej19.
2. Wyodrębnianie kształtu w skali konturów organoidalnych 2D dla transformacji LCPC
UWAGA: Metoda krok po kroku wyodrębniania kształtu w skali obiektów jest podobna do metody wyodrębniania czystego kształtu w Protokole 1 powyżej. Kroki są nazywane identycznie w obu protokołach, aby ułatwić dopasowanie. Proszę odnieść się do uwag w Protokole 1 dla każdego kroku. Główna różnica między czystym kształtem a kształtem w skali polega na tym, że kształt w skali nie wymaga Kroków 1.6, 1.7 i 1.8, które są krokami redimensionowania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przekształcenie LCPC w układzie siatki radialnej zastosowane do organoidów raka piersi
Organoidy i guzy 3D mogą przybierać różnorodne kształty, z których niektóre są ewidentnie odmienne dla ludzkiego oka, mimo że tradycyjne mierniki wykazują statystycznie nieistotne różnice. Z drugiej strony, organoidy mogą również wykazywać kształty, które wydają się heterogeniczne, a zatem nieistotne dla ludzkiego oka, maskując powtarzające się subtelne morfologie reprezentujące odrębne podt...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podobnie jak w przypadku każdego narzędzia obliczeniowego, jakość wyjścia zależy od tego, czy wejścia spełniają oczekiwane zasady, na których narzędzie zostało zaprojektowane. Należy przestrzegać następujących zasad i stosować je jako kontrolę jakości podczas korzystania z dostarczonych skryptów Python. Po pierwsze, upewnij się, że otwarte maski są niebieskimi liniami na białym tle. Kolor niebieski był dowolnym założeniem i nie ma znaczenia, ale skrypty, które wykonują transformację LCPC, zostały napisane w celu wyszukiw...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia. Transformacja LCPC została skomerycjalizowana jako produkt oprogramowania “Shape Genie” przez BrainScanology, Inc., ale wnioski patentowe zostały wycofane, a firma została rozwiązana. To badanie jest dostępne jako preprint w BioRxiv, jak zacytowano w wymienionej publikacji47. Rysunek 4 przedstawia wcześniej niepublikowane widoki wygenerowane z 3D zestawu danych obrazowych, zgłoszonego31 i dostarczonego przez Gkontra; uprawnione uznaliśmy za ich autorstwo. Rysunek 3 oraz Dodatkowy Rysunek 1 przedstawiają wcześniej niepublikowane obrazy pochodzące z pierwotnych kultur komórek ludzkich utworzonych zgodnie z zatwierdzeniami etycznymi i procedurami zgody informowanej zgłoszonej21 przez współautora. Żadne dodatkowe pobranie ludzkich próbek nie zostało wykonane dla tego badania.
Podziękowania
Chcielibyśmy wyrazić uznanie Duane'owi Nicholsowi, nauczycielowi biologii w szkole średniej, który zmarł na raka jelita grubego. To zainspirowało wynalazek transformacji LCPC do charakteryzacji morfologii polipów jelita grubego. Po drugie, chcielibyśmy podziękować Thuan Trinhowi, który cierpiał na zaburzenie afektywne dwubiegunowe typu 2 i zainspirował ulepszenie transformacji LCPC, takie jak dodanie markerów do przechwytywania kontekstu przestrzennego. Transformacja LCPC jest potocznie nazywana transformacją Nguyen-Nichols-Trinh (NNT). Po trzecie, chcielibyśmy podziękować Paulowi Lealowi, głównemu inwestorowi anielskiemu, który wsparł startup, który próbował skomerycjalizować transformację LCPC. Po czwarte, chcielibyśmy podziękować Polyxeni Gkontrze, Ph.D., za udostępnienie mikroskopijnych zdjęć naczyń krążenia serca dla tego badania. Po piąte, chcielibyśmy podziękować DF/HCC Breast SPORE: Specialized Program of Research Excellence (SPORE) (NCI 1P50CA168504), chirurgicznym i patologicznym zespołom UCSF Breast Care Center oraz stażystom z Breast Care Center za pomoc w próbkach tkankowych i wsparcie finansowe ze strony National Institutes of Health (R01CA281361).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Add 100 pixels to margins.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1 | SciKit Learn | https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html | Used the NearestNeighbors function within the sklearn.neighbors package |
| BLUE_Color Extraction.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| Chamfer Distance via scipy version 1.15.1 | SciPy | https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html | Used cKDTree function within scipy.spatial package |
| Cliff's Delta | Tissue Spatial Geometrics Lab | https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta | Created an implementation of Cliff's Delta via the Python language |
| Enlarge Image Size by 3X.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| Fiji/ImageJ v2.14.0 | ImageJ.net | https://imagej.net/ | |
| Flip images HORIZontally.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| Flip images VERTically.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| GREEN_Color Extraction.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| Isolate Objects Empty Blue.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| MacOS Preview Version 11.0 | Apple Inc | https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac | |
| Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| Microsoft Paint | Microsoft | https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint | Was mentinoed as a potential useful tool for manual segmentation, but not used in this study |
| Microsoft Powerpoint Version 16.109.3 | Microsoft | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc | |
| PINK_Color Extraction.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1 | SciKit Learn | https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html | Used the PCA function with the sklearn.decomposition package |
| RED_Color Extraction (Mac).ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| RED_Color Extraction (Windows).ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| Rotate Green Line_v3.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| Rotate images 90CCW.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| Rotate images 90CW.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| Thicken Blue Lines.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
| Trim margin to 1-pixel border.ipynb | Tissue Spatial Geometrics Lab | GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | Python Script in a Jupyter Notebook |
Przedruki i uprawnienia
