Algorytm analizy kształtów ilościowo opisuje morfologię przestrzenną i kontekst 2D do 3D hodowlą komórkowych dla nowatorskiej ilościowej oceny fenotypu

Podsumowanie

Ten artykuł wyjaśnia, jak nowatorskie cechy morfologiczne w komórkach i organoidalach można sprecyzować za pomocą transformacji liniowych skomplikowane polarne współrzędne (LCPC), przestrzennego algorytmu, który uchwytuje właściwości, których tradycyjne metryki, takie jak pole, objętość i powierzchnia, nie mogą. Omówione są najlepsze praktyki dotyczące orientacji kształtu i jego ustawienia.

Streszczenie

Liczne badania wykazały, że fenotyp morfologiczny komórki lub organoidu koreluje z jej podatnością na środki przeciwnowotworowe. Jednak tradycyjne metody pomiaru fenotypu opierają się na metrykach przestrzennych, takich jak powierzchnia, objętość, obwód i intensywność sygnału, które działają, ale są ograniczone. Podejścia te nie mogą mierzyć wielu kluczowych cech kontekstu przestrzennego, takich jak chiralność, czyli właściwość lewo- i prawoskrętności. Nie można użyć objętości do rejestracji chiralności, ponieważ lewa i prawa buty mają taką samą objętość. Chociaż kontekst przestrzenny w postaci chiralności, kierunku grawitacji i osi polaryzacyjnej jest intuicyjny dla ludzi, tradycyjne metryki używane przez biologów komórkowych, patologów, radiologów i praktyków uczenia maszynowego do tej pory nie mogą uchwycić tych fundamentalnych pojęć. Przekształcenie skomplikowanej polarnej transformacji liniowej (LCPC) to nowatorski algorytm, który może uchwycić kontekst przestrzenny w przeciwieństwie do jakiejkolwiek innej metryki. Transformacja LCPC przekształca dwuwymiarową (2D) konturę w dyskretną falę sinusoidalną, nakładając system siatki, który śledzi punkty przecięcia między konturem a liniami siatki. Zamienia kontur na sekwencję par dyskretnych współrzędnych, przy czym niezależna współrzędna (współrzędna x) odpowiada kolejnym pozycjom w przestrzeni 2D. Każda współrzędna zależna (współrzędna y) składa się z odległości między przecięciem konturu i linii siatki do początku lub linii bazowej systemu siatki. W postaci dyskretnej fali sinusoidalnej stosuje się następnie transformację Fouriera do danych. W ten sposób kształty komórek w kulturach komórkowych 2D i 3D są systematycznie i wielowymiarowo reprezentowane, umożliwiając solidną ilościową stratyfikację, która ujawni wgląd w oporność na leczenie.

Wprowadzenie

Hodowanie organoidów w trzech wymiarach (3D) okazało się lepsze niż hodowle komórek dwuwymiarowych (2D) w naśladowaniu biologii in vivo^1,2. Organoidy stały się niezastąpione w badaniach nad rakiem do przesiewowych testów na skuteczne leczenie i pozyskiwania wglądu w progresję choroby^3,4,5,6. Chociaż w biologii nowotworów dobrze wiadomo, że różnice w morfologii korelują z odrębnym zachowaniem biologicznym komórek i tkanek, dziedzina ta opiera się na tradycyjnych metrykach kształtu, które są ograniczone w zakresie. Niniejsze badanie opisuje nowy algorytm przestrzenny, który obiektywnie ilościowo określa subtelne cechy morfologiczne z bezprecedensową precyzją, przewyższając tradycyjne podejścia takie jak pole, objętość i pole powierzchni.

Transformacja zlinearyzowanych skompresowanych współrzędnych polarnych (LCPC) została stworzona w celu obiektywnego i ilościowego opisu złożonych morfologii obserwowanych w histopatologii tkanek, z zamiarem poprawy klasyfikacji polipów jelit⁷. Pragnięcie poszerzenia tego podejścia w celu uchwycenia makroskopowych cech przestrzennych opartych na MRI w patologiach mózgu, takich jak zaburzenie dwubiegunowe i choroba Alzheimera, doprowadziło do ulepszeń, które zwiększyły jego efektywność. Niniejsze badanie opisuje krokową procedurę i najlepsze praktyki stosowania dwóch wersji transformacji LCPC: układu siatki równoległej i układu siatki radialnej, z których oba mają skrypty open-source i filmy tutorialowe.

Oprócz tradycyjnych metod geometrycznych istnieje wiele abstrakcji, które okazały się skuteczne w pomiarze złożonych kształtów komórek i narządów. Obejmują one pomiar miary wyciągnięcia, skośności, kontrastu i kurtozy, wraz z momentami Zernike do uchwycenia okrągłości, asymetrii, nieregularności krawędzi i globalnej struktury konturu^8,9,10. Analiza fraktalna była również przydatna do redukcji złożonych konturów do wartości skalarnych, takich jak wymiar fraktalny, który mierzy nieregularność konturu oraz lakunarność, która mierzy niezwykle nierównomierny wygląd luk w konturze^11,12. Do pomiaru tekstury popularną metodą jest Macierz Współwystępowania Poziomów Szarości (GLCM) do pomiaru kontrastu, energii, jednorodności, korelacji i entropii^13,14. Podczas gdy wszystkie te metody są przydatne, żadna z nich nie została zaprojektowana do przechwytywania kontekstu przestrzennego, takiego jak kierunek grawitacji, lewo- vs. prawostronne, czy lokalizacja centralnej struktury wsparcia, która wpływa na kierunek zmiany kształtu. Co więcej, wiele z nich generuje pojedynczą wartość skalarną lub tylko kilka wartości skalarnych, aby reprezentować informacje przestrzenne, dlatego cytowane badania często stosują je w połączeniu, aby ocenić złożone kształty.

Transformacja LCPC została zaprojektowana tak, aby uzyskać wiele cech z jednego pomiaru i umożliwić dodanie markerów przestrzennych, które kodują kontekst przestrzenny w kształcie, takie jak kierunek grawitacji. Najbliższa metoda do transformacji LCPC⁷ została opublikowana rok później¹⁵, dzieląc tę samą ideę początkową: zastosowanie transformacji Fouriera do konturów komórek, aby zmierzyć kształt w postaci widma częstotliwości. Jednak transformacja LCPC została niezależnie opracowana, aby była stosowana za pomocą odrębnych układów siatki, które miały być używane w połączeniu z wiedzą o kontekście przestrzennym poza kształtem, który jest mierzony. Co więcej, wynalazca transformacji LCPC wyjaśnia w niniejszej publikacji, że wynikające z niej widmo częstotliwości zawiera ogromne ilości ukrytych informacji przestrzennych. Plik uzupełniający 1 zawiera rozszerzoną dyskusję na temat kontekstów przestrzennych w biologii, które są często pomijane przy użyciu cytowanych metod, oraz jak transformacja LCPC może być zastosowana do uchwycenia tego kontekstu. Dla czytelników, których dane kształtów nie wykazują różnicy między grupą kontrolną a eksperymentalną, czy też ich oczy nie widzą różnicy w kształtach, lub dla których dane kształtów wykazują bardzo niewielką różnicę, nawet jeśli podejrzewają, że powinna być ona większa, powinni wypróbować transformację LCPC.

Transformacja LCPC zapewnia bezprecedensowe poziomy precyzji w pomiarze informacji przestrzennych, ponieważ reprezentuje kształty w wielu wymiarach. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod, takich jak pole i objętość, które dają tylko jedną wartość skalarną na kształt (czyli 25 cm²), wyniki transformacji LCPC mogą dawać wiele indeksów, z których każdy koreluje z różnym aspektem morfologicznym kształtu (czyli okrągłość vs. ostrakość naroży, gładkość vs. nierówności krawędzi). Transformacja LCPC opisuje kształt 2D poprzez nałożenie siatki prostych linii, które przecinają jego kontur. Każdy układ siat

Protokół

Pierwotne komórki ludzkie użyte w tym badaniu zostały uzyskane i kulturowane zgodnie z uprzednio zgłoszonymi procedurami etycznymi i zgody na udział w badaniu¹⁷. Prezentowane tu obrazy zostały wygenerowane z tych zatwierdzonych kultur komórkowych i są publikowane po raz pierwszy. Próbki tkanek zostały zebrane w Szpitalu Brigham and Women’s oraz na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Etyczny Instytucji (IRB) u pacjentów, którzy wyrazili zgodę na użycie ich tkanek w celach badawczych, zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami¹⁷. Żadne dodatkowe pobieranie próbek ludzkich nie zostało przeprowadzone w ramach tego badania.

1. Wyodrębnianie czystego kształtu konturów organoidalnych 2D dla transformacji LCPC

1. Segmentuj zewnętrzny brzeg każdej organoidali za pomocą dowolnego oprogramowania do przetwarzania obrazów, takiego jak Microsoft’s Paint, MacOS’ Preview lub Fiji/ImageJ.
2. Wyodrębnij kontury organoidali jako otwarte maski, które są niebieskimi liniami na białym tle.
3. Izoluj każdą niebieską konturę na własnym białym płótnie.
   UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy obraz zawiera więcej niż jedną konturę.
4. Przytnij każdą konturę, aby miała jeden piksel marginesu ze wszystkich czterech stron obiektu niebieskiego.
5. Dodaj 100 pikseli białej przestrzeni ze wszystkich czterech stron, aby utworzyć nowe marginesy.
6. Obróć obiekty tak, aby najdłuższa wewnętrzna długość była pozioma.
   UWAGA: Ten krok obraca najdłuższą wewnętrzną linię w obrębie każdego obiektu w jego szerokość. Do tego celu są dostępne dwa skrypty. W przypadku zamkniętych kształtów, użyj Jupyter Notebook o nazwie “Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb”. W przypadku otwartych kształtów lub kształtów z wieloma komponentami, użyj Jupyter Notebook o nazwie “Rotate Green Line_v3.ipynb”. Narzędzie Rotate Green Line ma wideo tutorial, który jest linkowany w pliku ReadMe znajdującym się w tej samej lokalizacji co plik.ipynb.
7. Przytnij każdy obraz, aby miał jeden piksel marginesu ze wszystkich czterech stron niebieskiego obiektu.
   UWAGA: Jest to to samo, co Krok 1.4. Cel przycinania tym razem, jednak, jest taki, że następny krok redimensionowania powiększa całe płótno, a nie tylko niebieski obiekt na nim. Tak więc, sprawiając, że niebieski obiekt ma prawie taką samą szerokość i wysokość jak samo płótno, redimensionowanie płótna do 400 pikseli szerokości powoduje też redimensionowanie obiektu do prawie 400 pikseli szerokości. Istnieje Jupyter Notebook o nazwie “Trim margin to 1-pixel border.ipynb”.
8. Zmień szerokość płótna każdego obrazu na 400 pikseli, jednocześnie zachowując proporcje.
   UWAGA: Ten krok sprawia, że każdy obiekt ma tę samą szerokość. Zachowanie proporcji zapobiega skręcaniu obiektu podczas redimensionowania. Istnieje Jupyter Notebook o nazwie “Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb”.
9. Dodaj 100 pikseli białej przestrzeni ze wszystkich czterech stron, aby utworzyć nowe marginesy.
10. Obróć każdy obraz o 90 stopni w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do nich, aby najdłuższa wewnętrzna długość była pionowa, zachowując spójność z wyborem dla wszystkich obrazów.
    UWAGA: W powyższej kolejności czysty kształt uzyskuje się poprzez sekwencyjne wykonanie Kroków 1.6, 1.7, 1.8 i 1.9. Dodanie przestrzeni marginesu w Kroku 1.9 jest wymagane, aby uniknąć błędów w skryptach transformacji LCPC, które zostaną wykonane następnie, ale nie jest zaangażowane w wyodrębnianie czystego kształtu. Użytkownicy, którzy chcą mierzyć kształty “w skali”, nie muszą wykonywać Kroków 1.6, 1.7 i 1.8 w powyższej kolejności, chociaż powinni nadal przetwarzać obrazy maski, aby osiągnąć optymalną orientację przed zastosowaniem transformacji LCPC.
11. Wykonaj transformację LCPC na każdej konturze. Użyj skryptów Pythona dostarczonych dla metody siatki radialnej¹⁸ lub metody siatki równoległej¹⁹.

2. Wyodrębnianie kształtu w skali konturów organoidalnych 2D dla transformacji LCPC

UWAGA: Metoda krok po kroku wyodrębniania kształtu w skali obiektów jest podobna do metody wyodrębniania czystego kształtu w Protokole 1 powyżej. Kroki są nazywane identycznie w obu protokołach, aby ułatwić dopasowanie. Proszę odnieść się do uwag w Protokole 1 dla każdego kroku. Główna różnica między czystym kształtem a kształtem w skali polega na tym, że kształt w skali nie wymaga Kroków 1.6, 1.7 i 1.8, które są krokami redimensionowania.

Wyniki

Transformacja LCPC z siatką radialną zastosowana do organoidów raka piersi

Organoidy i guzy 3D mogą przyjmować różnorodne kształty, z których niektóre są ewidentnie odmienne dla ludzkiego oka, mimo że tradycyjne wskaźniki wykazują statystycznie nieistotne różnice. Z drugiej strony, organoidy mogą również wykazywać kształty, które dla ludzkiego oka wydają się heterogeniczne, a tym samym nieznaczące, maskując powtarzające się subtelne morfologie reprezentujące odrębne podtypy. Pierwotne ludzkie organoidy piersi pobrano od pacjentów i hodowano w 3D zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem^17,20,21. Rysunek 3A przedstawia trzy kategorie morfologiczne możliwe do rozróżnienia na podstawie inspekcji wizualnej: fenotyp cystyczny, fenotyp wielotorbielowaty oraz gęsty fenotyp wielotorbielowaty. Rysunek 3B pokazuje, że zewnętrzne kontury tych organoidów zostały poddane manualnej segmentacji i wyekstrahowano ich czysty kształt, co eliminuje wpływ wielkości na ich formy. Ponieważ kontury miały charakter kolisty, do czystych kształtów zastosowano transformację radialnej siatki LCPC, a następnie analizę PCA. Należy zauważyć, że kontury nałożone na Rysunek 3B zostały obrócone tak, aby najdłuższa linia wewnętrzna była pionowa, co oznacza, że ich orientacja nie jest taka sama jak na obrazach źródłowych. Rysunek 3B przedstawia wykres punktowy dwóch pierwszych głównych składowych (PCs), a klastrowanie K-średnich pozwoliło zidentyfikować trzy klastry: 0, 1 i 2. Wyniki Silhouette Score (SS) potwierdziły prawdopodobne istnienie dwóch oddzielnych klastrów pomiędzy Klastrem 0 a 1 (SS = 0.68) oraz Klastrem 1 a 2 (SS = 0.69), wskazując jednocześnie na słabą separację między Klastrem 0 a 2 (SS = 0.27). Pomimo niskiej wartości Silhouette Score między Klastrami 0 i 2, oznaczenie punktów danych czystym kształtem każdego z nich uzasadnia, że Klaster 2 reprezentuje najbardziej odrębny fenotyp: silnie asymetryczne, niekoliste kontury (grubość konturów nie ma w tym przypadku znaczenia).

Podczas gdy czysty kształt eliminuje wpływ rozmiaru na formę, co jest niemożliwe przy pomiarze pola powierzchni i objętości, pomiar konturów organoidów w oryginalnej skali pozwala również uzyskać interesujące spostrzeżenia. Rycina 3C przedstawia trójwymiarowy wykres punktowy trzech pierwszych składowych głównych (PC), uzyskanych w wyniku transformacji LCPC na siatce radialnej, przeprowadzonej na konturach segmentowanych z obrazów bez żadnego skalowania. Podejście to oznacza, że transformacja LCPC mierzy jednocześnie kształt i rozmiar organoidów. Rycina 3C pokazuje, że organoidy policystyczne i gęsto policystyczne są rozmieszczone rzadziej w porównaniu do organoidów cystycznych. Aby ilościowo określić to rozproszenie, Rycina 3D  przedstawia rozkład każdego fenotypu we wspólnej przestrzeni PCA. Dla każdego fenotypu obliczono średnią odległość do K najbliższych sąsiadów (KNND), co potwierdza wizualną ocenę spadku gęstości punktów przechodząc od organoidów cystycznych (KNND = 1.061) do organoidów policystycznych (KNND = 1.575) i organoidów gęsto policystycznych (KNND = 2.247); to zmniejszenie gęstości punktów można również interpretować jako wzrost heterogeniczności morfologicznej konturów zewnętrznych. Na koniec, w celu porównania transformacji LCPC z tradycyjnym miernikiem pola powierzchni, Rycina 3E pokazuje, że choć istnieje istotność statystyczna między polem powierzchni organoidów cystycznych a gęsto policystycznych (p = 0.016, test sum rang Wilcoxona), pomiar pola powierzchni nie wskazuje na istnienie trzech odrębnych grup morfologicznych wśród fenotypów, jakie zidentyfikowano za pomocą klastrowania K-średnich po analizie LCPC czystego kształtu (Rycina 3B), ani na wzrost heterogeniczności morfologicznej, jak wykazano w analizie LCPC w oryginalnej skali (Rycina 3C–D). Rycina 3E pokazuje zmniejszające się rozproszenie punktów danych przechodząc od organoidów cystycznych do policystycznych i gęsto policystycznych, co jest przeciwieństwem obserwacji z analizy LCPC w oryginalnej skali (Rycina 3C), co podkreśla, że informacje przestrzenne uchwycone przez transformację LCPC różnią się od informacji dostarczanych przez pomiar pola powierzchni.

To samo podejście zastosowane do poszczególnych kształtów 2D na Rysunku 3 oraz w Rysunku uzupełniającym 1, znajduje zastosowanie również do konturów komórek w hodowli komórkowej 2D: pojedynczych komórek (takich jak erytrocyty) lub skupisk komórek (jak w przypadku cytologii szyjki macicy). Badania pilotażowe dla każdego z tych przypadków opisano w filmach: analiza kształtu organoidów mózgu wykazujących różny stopień pofałdowania zewnętrznego konturu²²; analiza kształtu pęcherzyków płucnych in situ, gdzie te same zasady można zastosować do analizy hodowli komórkowej 2D²³; analiza kształtu tkanki szyjki macicy z rozmazów cytologicznych, w której kontur jądra oraz błony komórkowej są jednocześnie kwantyfikowane za pomocą transformacji LCPC z siatki radialnej²⁴; analiza kształtu erytrocytów zainfekowanych malarią oraz komórek sąsiadujących z komórkami zainfekowanymi, które same nie są zainfekowane²⁵; analiza kształtu erytrocytów w przebiegu anemii sierpowatej²⁶.

Równoległy system siatki do pomiaru gęstości lub tekstury jako wskaźnika informacji przestrzennej

Informacje przestrzenne obejmują coś więcej niż zwykłe pojęcia kształtu, takie jak kwadratowość, okrągłość czy krzywizna, ponieważ obejmują one również takie koncepcje jak tekstura i gęstość. Złożone sieci rurkowate, takie jak naczynia krwionośne, lub sieci rozgałęzione, takie jak filamenty cytoszkieletu, nie wpisują się w pojęcie kształtu w takim samym sensie, jak nasza oparta na geometrii intuicja dotycząca form, takich jak koła i wielokąty. Jednak gęstość i tekstura są bardzo użytecznymi pojęciami informacji przestrzennej dla zrozumienia struktury i funkcji komórek, organoidów oraz guzów. Analizując sposób ilościowego określania złożonych sieci w obrazowaniu fluorescencyjnym, biolodzy komórkowi mierzą takie cechy, jak średnia intensywność sygnału w obrębie obrazu lub procent całkowitej powierzchni obrazu zawierający sygnał. Podejścia te uznają, że informacje przestrzenne zawierają więcej niż to, co można opisać w kategoriach motywów geometrycznych.

Wzorce sieci naczyniowych w tkankach, guzach i organach na chipie nie są łatwo definiowalne za pomocą tradycyjnych motywów geometrycznych, lecz zyskują na interpretacji jako tekstura i gęstość. Remodeling naczyniowy w rozwoju nowotworu i oporności na leczenie jest dobrze udokumentowaną cechą raka (przegląd w²⁷). Przeanalizowano przekroje histopatologiczne 458 pierwotnych guzów neuroblastycznych²⁸, charakteryzując gęstość, rozmiar i kształt wszystkich naczyń krwionośnych oraz segmentów naczyniowych. Stwierdzono, że naczynia krwionośne były większe, liczniejsze i miały bardziej nieregularny kształt w guzach pacjentów z niekorzystnymi czynnikami prognostycznymi w porównaniu do guzów w kohorcie o korzystnym rokowaniu. Co ciekawe, wprowadzono termin „naczynia otaczające skupiska nowotworowe” (VETC)²⁹, aby opisać wzorzec naczyń krwionośnych otaczających skupiska małych guzów w obrębie większego raka hepatokomórkowego, co wiąże się z wyższym wskaźnikiem przerzutów i nawrotów. Ta sama grupa, która wprowadziła ten termin, ustaliła później, że rak hepatokomórkowy z obecnością VETC koreluje z pozytywną odpowiedzią na leczenie inhibitorem kinazy Sorafenibem³⁰. Zatem zdolność do ilościowego określania wzorców naczyniowych jest kluczowa dla prognozy i zrozumienia mechanizmów oporności.

W celu kwantyfikacji gęstych sieci rurek, wysp i odgałęzień, równoległy system siatek transformacji LCPC jest przydatny do pomiaru tego, co można określić mianem gęstości tekstury, zamiast kształtu. Jako przykład zastosowania równoległej siatki transformacji LCPC w tym celu, Rycina 4A przedstawia wzorce mikrokrążenia serca z badania nad naczyniami wieńcowymi³¹: dla gołego oka obiektywne i ilościowe rozróżnienie wzorców między obszarami zawałowymi a obszarami oddalonymi od miejsca uszkodzenia jest bardzo trudne. Poprzez wyodrębnienie maski naczyń krwionośnych (Rycina 4A Krok 1) i zastosowanie równoległej siatki transformacji LCPC można zaobserwować różnice ilościowe. Najpierw, aby zwiększyć czystość danych, każdy obraz został przycięty kołem o jednolitej średnicy, wycentrowanym w środku kwadratowego obrazu (Rycina 4A Krok 2), co zapewnia, że każdy obraz ma tę samą wysokość i szerokość niezależnie od obrotów. Następnie przycięte obrazy są obracane tak, aby główna oś naczyń (czerwone podwójne strzałki na Rycynie 4A Krok 1) była pionowa (Rycina 4A Krok 3). Następnie do obwodu obrazu naniesiono niebieską linię, aby zapewnić, że nawet obrazy z rzadkimi wzorcami naczyniowymi mają tę samą średnicę w przeliczeniu na niebieskie piksele (Rycina 4A Krok 4). Kroki 3 i 4 wykonano przy użyciu oprogramowania Fiji/ImageJ (v2.14.0). Na koniec zastosowano równoległą siatkę transformacji LCPC (Rycina 4A Krok 5). Analiza wyników za pomocą PCA i wykreślenie trzech pierwszych głównych składowych (PC) wykazuje, że obszary zawałowate grupują się oddzielnie od obszarów oddalonych (Rycina 4B). Obliczenia dystansu Chamfera (CD) kwantyfikują wzorce wizualne przedstawione na wykresach. 1 dzień po urazie miejsce zawału wykazuje wzorzec naczyniowy bardziej odległy od stanu podstawowego (Basal vs. 1Day_infarct: CD = 83.89) niż miejsce nieuszkodzone (Basal vs 1Day_remote: CD = 53.95). 1 dzień po urazie nieuszkodzone miejsce oddalone znajduje się bliżej miejsca uszkodzonego (1Day_remote vs 1Day_infarcxt: CD = 34.48) niż stanu podstawowego. 3 dni po urazie wzorce naczyniowe miejsca uszkodzonego oraz powiązanego z nim nieuszkodzonego miejsca oddalonego wykazują drastyczne odchylenie od stanu podstawowego oraz od siebie nawzajem (Basal vs. 3Days_Infarct: CD = 240.63; Basal vs. 3Days_Remote: CD = 67.28; 3Days_Remote vs. 3Days_Infarct: CD = 168.35). Bardzo interesujące jest to, że 7 dni po urazie wzorce naczyniowe miejsca uszkodzonego i nieuszkodzonego miejsca oddalonego zajmują przestrzeń 3D, która jest w przybliżeniu ortogonalna do stanu podstawowego, pozostając jednocześnie zgodnymi ze sobą w odległości mniejszej niż w 1. dniu po urazie (CD = 24.76 dla dnia 7 w porównaniu do 34.48 dla dnia 1). Dane sugerują dwie kwestie: (1) w miarę postępu gojenia wzorzec naczyniowy miejsca uszkodzonego i nieuszkodzonego miejsca oddalonego przyjmuje formy odmienne od stanu podstawowego; (2) program rekonstrukcji aktywowany w miejscu uszkodzenia wywołuje również podobne zmiany morfologiczne w powiązanych z nim nieuszkodzonych miejscach oddalonych.

Aby wykazać wszechstronność transformacji LCPC, obliczono tradycyjne parametry, takie jak procent powierzchni (Rysunek 5A) oraz całkowity obwód (Rysunek 5B) naczyń krwionośnych. Choć powierzchnia i obwód ujawniają zmiany między punktami w przebiegu czasowym, nie zapewniają one spójnej kwantyfikacji odrębnych układów przestrzennych naczyń. Powierzchnia i obwód są abstrakcjami, które mogą reprezentować wiele różnych układów naczyniowych i w związku z tym nie dostarczają informacji o tym, jak układ przestrzenny naczyń zmienia się w zależności od warunków leczenia i czasu trwania eksperymentu. Przy n = 3 dla każdej grupy test t oraz test Wilcoxona są niewiarygodne. Delta Cliffa jest metodą nieparametryczną i dobrze sprawdza się w wykazywaniu przesunięcia wielkości efektu. Główna różnica ujawniona poprzez pomiar procentowej powierzchni naczyń krwionośnych występuje między stanem bazowym a punktami czasowymi w 7. dniu; w przypadku całkowitego obwodu naczyń krwionośnych różnice występują między stanem bazowym a 1. dniem oraz między stanem bazowym a 7. dniem. Jednak powierzchnia i obwód nie wskazują na istnienie różnic między miejscami zawału a odpowiadającymi im nienaruszonymi miejscami odległymi, co jest bardzo zaskakujące, biorąc pod uwagę, że miejsce zawału zostało celowo uszkodzone. W tym punkcie ujawnia się wszechstronność transformacji LCPC w porównaniu z tradycyjnymi metrykami. Dla każdej próbki wyniki FFT, będące częścią transformacji LCPC, generują zestaw amplitud powiązanych z zestawem częstotliwości. Amplitudy każdego koszyka częstotliwości mogą zostać uśrednione, a następnie porównane między grupami badawczymi (Rysunek uzupełniający 1). Pozwala to na prostą ocenę tego, które koszyki częstotliwości wykazują największe różnice między grupami leczenia. Rysunek 5C przedstawia sześć koszyków, które wykazują wyraźne różnice w wielkości efektu między różnymi grupami leczenia, zwłaszcza między miejscami zawału a powiązanymi z nimi nienaruszonymi miejscami odległymi, w których powierzchnia i obwód nie wykazały żadnych różnic. Niezależne wartości w tych sześciu koszykach dostarczają wielu wskaźników wykazujących różnice ilościowe między warunkami leczenia. Co ciekawe, wzorzec między grupami dla koszyka 1 (Bin 1) w wynikach transformacji LCPC jest podobny do wyniku uzyskanego z pomiaru całkowitego obwodu. Pozostałe wskaźniki ujawniają jednak różnice ilościowe, które są ukryte zarówno w powierzchni, jak i w obwodzie. Wskaźniki charakterystyczne dla stanu bazowego: Bin 49, Bin 56, Bin 21. Wskaźniki charakterystyczne dla grup w 1. dniu: Bin 1, Bin 6, Bin 49. Wskaźniki charakterystyczne dla grup w 3. dniu: Bin 6, Bin 112, Bin 49. Wskaźniki charakterystyczne dla grup w 7. dniu: Bin 6, Bin 49, Bin 112. Dane te podkreślają wszechstronność i precyzję transformacji LCPC w stosunku do tradycyjnych podejść opartych na powierzchni i obwodzie.

Rysunek 1: Opis radialnego systemu siatki transformacji LCPC. (A) Krok 1: Interesujący kształt zostaje wysegmentowany i wyekstrahowany jako niebieska maska. Krok 2: Dla maski wyznaczany jest ograniczający prostokąt (bounding box, czyli najmniejszy prostokąt obejmujący obiekt i stykający się z nim z czterech stron). Na maskę nakładany jest system radialnych linii siatki wychodzących z centrum ograniczającego prostokąta. Decyzja o wyborze centrum ograniczającego prostokąta zamiast centroidu obiektu jako punktu początkowego była arbitralna. Krok 3: Odległość każdego przecięcia linii siatki z kształtem jest obliczana względem punktu początkowego. Linie siatki, które mają więcej niż jedno przecięcie, sumują wszystkie te odległości przecięć w jedną wartość dla danej linii siatki. Krok 4: Stosowana jest szybka transformata Fouriera (FFT), aby przekształcić dane z kroku 3 w wykres częstotliwości, stanowiący statyczną wielowymiarową reprezentację (Krok 5) kształtu z kroku 1. Krok 6: Na podstawie indeksu z kroku 5 można utworzyć wartość skalarną. Omówienie rodzajów obliczanych indeksów znajduje się na Rysunku 10. (B) Schemat blokowy przedstawiający uproszczony opis kroków transformacji LCPC dla radialnego systemu siatki. (C) Przykładowe motywy kształtów, dla których radialny system siatki jest optymalny. Kształty zostały narysowane w programie Microsoft PowerPoint. Obrazy te zostały stworzone przez autorów i nie wymagają żadnej licencji publikacyjnej ani zgód dotyczących praw autorskich. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Opis systemu siatki równoległej w transformacie LCPC. (A) Krok 1: Kształt budzący zainteresowanie jest ręcznie segmentowany i wyodrębniany jako maska binarna. Krok 2: Na kształcie, który został obrócony tak, aby podstawa była pozioma, nakładany jest system siatki równoległej. Krok 3: Odległość każdego przecięcia linii siatki z kształtem jest obliczana względem linii bazowej. Linie siatki, które mają więcej niż jedno przecięcie, sumują wszystkie te odległości przecięć do jednej wartości dla danej linii siatki. Krok 4: Stosuje się FFT, aby przekształcić dane z Kroku 3 w wykres częstotliwości, będący statyczną wielowymiarową reprezentacją kształtu z Kroku 1. Krok 6: Z Kroku 5 można utworzyć wartość skalarną za pomocą indeksu. Omówienie rodzajów obliczanych indeksów znajduje się na Rysunku 10. (B) Schemat blokowy przedstawiający uproszczony opis kroków transformaty LCPC dla systemu siatki równoległej. (C) Przykłady motywów kształtów, dla których system siatki równoległej jest optymalny. Kształty zostały narysowane w programie Microsoft PowerPoint. Obrazy te zostały stworzone przez autorów i nie wymagają żadnej licencji publikacyjnej ani zezwoleń dotyczących praw autorskich. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: Transformacja LCPC obiektywnie identyfikuje podtypy morfologiczne organoidów raka piersi. (A) Pierwotne ludzkie organoidy piersi zostały wyprowadzone zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami^17,20,21oraz zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającym 1. Na podstawie oceny wizualnej zaobserwowano i sklasyfikowano trzy fenotypy: torbielowaty, wielotorbielowaty oraz gęsty wielotorbielowaty. Pasek skali = 50 µm. (B) Zewnętrzne kontury organoidów zostały poddane segmentacji manualnej (Rycina uzupełniająca 2; kryteria opisane w Pliku uzupełniającym 1), a następnie wyznaczono czysty kształt tych konturów. Należy zauważyć, że kontury na schemacie zostały obrócone tak, aby najdłuższa linia wewnętrzna była pionowa; w związku z tym nie odpowiadają one ich oryginalnej orientacji. Następnie zastosowano transformację LCPC z siatką radialną, a wyniki przeanalizowano za pomocą PCA. Klasteryzacja K-średnich zidentyfikowała trzy klastry (0, 1 i 2), a w celu potwierdzenia ich istnienia obliczono współczynniki sylwetki (SS). Klaster 0 vs 1, SS: 0.68; Klaster 0 vs 2, SS: 0.27; Klaster 1 vs 2, SS: 0.69. (C) Zewnętrzne kontury organoidów zostały również zmierzone przy użyciu transformacji LCPC z siatką radialną na ich kształtach w skali rzeczywistej, tzn. kształtach takich, jakimi pojawiają się na obrazach względem siebie, bez żadnego zmiany rozmiaru. Wstawka jest powiększona, aby ukazać rzadsze upakowanie organoidów wielotorbielowatych i gęstych wielotorbielowatych w porównaniu z organoidami torbielowatymi. Dla B i C: Zielony = torbielowaty, Fioletowy = wielotorbielowaty, Żółty = gęsty wielotorbielowaty. (D) Dla każdego fenotypu oddzielnie wykreślono trzy pierwsze wartości PC i obliczono średnią wartość KNND, aby wykazać, że fenotyp torbielowaty jest najbardziej gęsto upakowany, podczas gdy fenotypy wielotorbielowaty i gęsty wielotorbielowaty wykazują mniejszą gęstość (co oznacza większą heterogeniczność). Mimo że zostały wykreślone oddzielnie, wszystkie trzy fenotypy dzielą tę samą przestrzeń PCA. Dla fenotypu torbielowatego średnią wartość KNND obliczono z wstawki, ponieważ wartości odstające występujące tylko w tym fenotypie zaburzają obliczenia. Średnie wartości KNND: Torbielowaty, 1.061; Wielotorbielowaty, 1.575; Gęsty wielotorbielowaty, 2.247. (E) Wykresy pudełkowe powierzchni organoidów pokazują malejący rozrzut punktów danych od organoidów torbielowatych, przez wielotorbielowate, aż po gęste wielotorbielowate, co jest przeciwieństwem tego, co zaobserwowano w analizie LCPC w skali rzeczywistej (Rycina 3C), co podkreśla, że informacje przestrzenne przechwycone przez transformację LCPC różnią się od informacji wynikających z powierzchni. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 4: Pomiar gęstości tekstury za pomocą transformacji LCPC z siatki równoległej. (A) Fotomikrografie mikrokrążenia w tkance serca zostały wcześniej uzyskane w innym badaniu^31,32. Obrazy nie są reprodukcjami z tych badań jako takie; reprezentują one nowe widoki wygenerowane z tego samego oryginalnego zestawu danych obrazowania 3D, o którym wspomniano w materiale³¹ i który został dostarczony przez Gkontrę. Chociaż zestaw danych został wcześniej opublikowany, konkretne obrazy przedstawione tutaj są publikowane po raz pierwszy. Nie pokazano obrazów z odległych obszarów nieuszkodzonych w każdym punkcie czasowym. Krok 1: Generowana jest maska 2D i wyznaczana jest ogólna oś wyrównania naczyń (czerwona podwójna strzałka). Krok 2: Uzyskano obszar kołowy z centrum w środku obrazu, aby wymusić taką samą wysokość każdego obrazu po ich obróceniu o różne kąty w następnym kroku (obracanie kwadratowych obrazów o różne kąty zmieniłoby wysokość obrazu w zależności od stopnia obrotu). Krok 3: Każdy obraz jest obracany tak, aby ogólna oś wyrównania wyznaczona w kroku 1 była pionowa. Krok 4: Wokół każdego obrazu zastosowano jednolity niebieski obramowanie, aby upewnić się, że każdy obraz ma taką samą średnicę, ponieważ obrazy o rzadszej gęstości mogą być krótsze (przykład: patrz „7 Days Post Myocardial Infarction” w kroku 3). Krok 5: Zastosowano transformację LCPC z siatki równoległej. (B) Wykresy punktowe trzech pierwszych PC wyników transformacji LCPC z siatki równoległej (fioletowy: stan podstawowy, zielony: miejsce zawału, żółty: obszar nieuszkodzony oddalony od miejsca zawału). Obliczenia odległości Chamfera w każdym punkcie czasowym pomiędzy trzema warunkami znajdują się w sekcji wyników. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5: Transformata LCPC mierzy cechy ukryte w polu powierzchni i obwodzie.W celu porównania z tradycyjnymi miarami kształtu zmierzono (A) procent pola powierzchni oraz (B) całkowity obwód sieci naczyniowych. (C) Aby wykazać precyzję, jaką można uzyskać z wyniku transformaty LCPC, porównano wartości poszczególnych koszy częstotliwości uzyskanych z FFT (Rycina uzupełniająca 1). Sześć koszy częstotliwości wybrano jako indeksy do obiektywnego ilościowego określenia różnic między grupami badawczymi. Dla wszystkich paneli, ze względu na ograniczoną wielkość próby w każdej grupie (n = 3), zamiast wartości p z testu suma rang Wilcoxona obliczono nieparametryczną deltę Cliffa dla wielkości efektu. Kilknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 6: Znaczenie systematycznego orientowania kształtów w celu uzyskania czystych danych. (A) Przykład identycznych kształtów, które są swoimi odbiciami lustrzanymi, oraz sposób, w jaki system równoległej siatki określa ich odmienną orientację, co w konsekwencji prowadzi do różnych wyników. (B) Przykład poziomego odwrócenia Kształtu 2, dzięki czemu jego orientacja odpowiada teraz Kształtowi 1, co pozwala na bardziej sprawiedliwe porównanie. W tej konfiguracji transformacja LCPC z równoległą siatką daje takie same wyniki dla Kształtu 1 i Kształtu 2. Taką zmianę orientacji należy przeprowadzać tylko wtedy, gdy nie istnieje kontekst przestrzenny sugerujący, że Kształtu 2 nie powinno się modyfikować. (C) Przykład czterech wariantów obiektów przypominających cyfrę „3”, z których niektóre są skierowane w niewłaściwym kierunku. (D) Przykład orientowania każdego obiektu w celu maksymalizacji czystości danych, które zostaną uzyskane z transformacji LCPC z równoległą siatką. (E) Przykład pomiaru szerszego wybrzuszenia elementów z Panelu C w oparciu o te same zasady orientacji co w Panelu D. (F) Przykład pomiaru dużych wypustek elementów z Panelu C przy zachowaniu kontekstu ich wyrównania, analogicznie do Panelu D. Motywacją do zachowania zasad wyrównania z Panelu D jest chęć przeanalizowania wkładu informacji przestrzennej w szerszym wybrzuszeniu w stosunku do wkładu węższego wybrzuszenia w obrębie tych zasad. Widzieć Rysunek suplementarny 3 w celu zapoznania się ze spektrami FFT powiązanymi z panelami C–F. Obrazy w A–B są ikonami z programu Microsoft PowerPoint. Kształty w C-F zostały narysowane w programie Microsoft PowerPoint. Obrazy te zostały stworzone przez autorów i nie wymagają żadnej licencji publikacyjnej ani zezwoleń autorskich. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 7: Niezdolność tradycyjnych miar kształtu do rozpoznawania oczywistego kontekstu. (A) Seria znaków wyboru (ptaszków) ma ten sam kształt, lecz ich rozmiar zwiększa się od lewej do prawej. W tej serii pole powierzchni każdego znaku jest różne, podczas gdy koncepcja kształtu pozostaje taka sama: tzn. zachowują one ten sam styl znaków wyboru. (B) Kwadrat jest obracany wokół swojego środka o 45 stopni, aż jego koncepcja kształtu stanie się tym, co ludzie nazywają rombem. Choć koncepcja kształtu kwadratu jest wyraźnie odmienna od koncepcji rombu, rotacje pośrednie są subiektywnie interpretowane jako „przechylone kwadraty” lub „przechylone romby”. Transformata LCPC może obiektywnie i precyzyjnie zmierzyć różnicę w każdym kroku tej serii. Kształty zostały narysowane w programie Microsoft PowerPoint. Obrazy te zostały stworzone przez autorów i nie wymagają żadnej licencji wydawniczej ani zezwoleń z tytułu praw autorskich. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 8: Wyjaśnienie pojęć kształtu czystego (pure shape) oraz kształtu w skali (at-scale shape). Pomiar obiektów „w skali” polega na mierzeniu kształtu obiektów zgodnie z ich oryginalnymi rozmiarami w stosunku do siebie nawzajem. „Kształt czysty” natomiast oznacza pomiar kształtu różnych obiektów w podobnej skali, co eliminuje wpływ wielkości na kształt. Ważne jest znalezienie obiektywnego sposobu zmiany rozmiaru porównywanych obiektów. Często optymalnym wyborem jest najdłuższa linia wewnętrzna (Krok 1). Oba obiekty są obrócone tak, aby najdłuższa linia wewnętrzna była pozioma (Krok 2). W tym przypadku oba obiekty zostały dodatkowo obrócone tak, aby wcięta strona była skierowana w dół. Następnie szerokość każdego obiektu, która ma teraz taką samą wartość jak najdłuższa linia wewnętrzna każdego obiektu, zostaje zmieniona na 400 pikseli, przy jednoczesnym zachowaniu proporcji obrazu, aby zapobiec zniekształceniu obiektów (Krok 3). Na koniec można opcjonalnie obrócić przeskalowane obiekty o 90 stopni (Krok 4) (w tym przypadku przeciwnie do ruchu wskazówek zegara) przed zastosowaniem transformacji LCPC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Przykład markerów przestrzennych w badaniach nad rakiem. (A>) Hipotetyczny przykład komórek migrujących w hodowli 2D poprzez rozszerzanie lamellipodiów w kierunku migracji. W kontekście morfologii migrujących komórek nabłonkowych, orientacja konturu każdej komórki w taki sposób, aby najdłuższa linia wewnętrzna zgodna z osią migracji była pionowa, jest najbardziej zasadna dla uchwycenia kontekstu przestrzennego. (B>) Hipotetyczne przykłady guzów lub zmian przednowotworowych rosnących wewnątrz otoczki, która nie zmienia kształtu. Zmiana wyrasta z szypułki, która stanowi centralną strukturę wspierającą. W miarę wzrostu lub obkurczania się zmiany, jej kontur przesuwa się w stronę wewnętrznej ściany otoczki lub od niej. Linie przerywane reprezentują racjonalny i obiektywny sposób określenia, jaka część otoczki powinna zostać obrysowana (pomarańczowa linia), tak aby nie dodać zbyt małej ani zbyt dużej ilości dodatkowych informacji. (C) Opcja 1 przedstawia transformację LCPC z równoległą siatką zastosowaną do konturu zmian bez uwzględnienia kontekstu położenia otoczki. Opcja 2 przedstawia to samo, ale z uwzględnieniem kontekstu przestrzennego położenia otoczki. Przykładowo, czerwone kropki reprezentują punkty przecięcia linii siatki (czarna strzałka, zielona linia) z konturem. W Opcji 2 każda linia siatki tworzy czwarte przecięcie, które nie występuje w Opcji 1, co ilościowo dodaje do wyniku w Opcji 2 kontekst przestrzenny, który jest całkowicie nieobecny w Opcji 1. Kształty zostały narysowane w programie Microsoft PowerPoint. Obrazy zostały stworzone przez autorów i nie wymagają żadnej licencji publikacyjnej ani zgody na prawa autorskie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 10: Hipotetyczne wyniki FFT oraz powszechne indeksy, które można z nich wyprowadzić. (A) Przedstawiono wykres częstotliwości będący wynikiem FFT dwóch hipotetycznych kształtów. Ponieważ wartości w Bin 3 i Bin 4 wykazują przeciwną tendencję, stosunek tych dwóch binów będzie dobrym indeksem reprezentującym różnicę między tymi dwoma kształtami. Czerwone i zielone linie przerywane reprezentują inne bin częstotliwości, które mogłyby zostać wykorzystane do wyprowadzenia odpowiednich indeksów. (B) Histogram dwóch hipotetycznych kształtów, których profile FFT wykazują schodkowo malejącą tendencję jako reprezentacja ich różnic morfologicznych. (C) Histogram dwóch hipotetycznych kształtów, których profile FFT różnią się najbardziej w regionie centralnym wzdłuż zakresu bin częstotliwości. (D) Przykłady hipotetycznych cech morfologicznych, które mogą dawać indeksy korelujące z ich obecnością. Kształty zostały narysowane w programie Microsoft PowerPoint. Obrazy te zostały stworzone przez autorów i nie wymagają żadnej licencji publikacyjnej ani zgód autorskich. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca 1: Wykresy pudełkowe porównujące wielkości różnych przedziałów częstotliwości w wynikach transformacji LCPC sieci naczyniowych. Transformacja LCPC sieci naczyniowych przedstawionych na Ryciniach 4 i 5 generuje zestaw przedziałów częstotliwości oraz ich wielkości reprezentujących każdy obraz. Wykresy pudełkowe wielkości w każdym przedziale służą do porównania wszystkich grup badawczych w celu zidentyfikowania, który przedział najlepiej nadaje się jako wskaźnik do stratyfikacji gęstości tekstury mierzonej za pomocą transformacji LCPC. Każdy wykres pudełkowy obejmuje n = 3 niezależne obrazy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Przykład pofragmentowanych organoidów guza piersi.Organoidy zostały poddane manualnej segmentacji przez eksperta, który rutynowo je hoduje i obserwuje pod mikroskopem. Rysunek ten przedstawia przykłady konturów pofragmentowanych organoidów. Pasek skali dla wszystkich obrazów mikroskopowych wynosi 50 µm. Pierwotne ludzkie komórki wykorzystane w niniejszym badaniu zostały pozyskane i hodowane zgodnie z procedurami zatwierdzenia etycznego i świadomej zgody, o których wspomniano w ²¹. Przedstawione tutaj obrazy pochodzą z tych zatwierdzonych kultur komórkowych i są publikowane po raz pierwszy. Nie pobierano żadnych dodatkowych próbek ludzkich. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 3: Widma FFT dla kształtów przedstawionych na Rycini 6. Wyniki FFT dla kształtów z Ryciny 6 zostały przedstawione tutaj, aby czytelnicy mogli zrozumieć wpływ zmiany orientacji kształtu na zawarte w nich informacje przestrzenne. Lewa kolumna wykresów posiada niezmienione osie y, natomiast prawa kolumna posiada osie przycięte w taki sposób, aby można było zwizualizować mniejsze wartości koszy. (A) Widma z transformaty LCPC na siatce równoległej dla czterech kształtów z Ryciny 6C w formie, w jakiej są wyświetlane, co oznacza brak reorientacji. (B) Widma z transformaty LCPC na siatce równoległej dla kształtów z Ryciny 6D, które zostały zreorientowane zgodnie z opisem w tekście. (C) Widma z transformaty LCPC na siatce równoległej dla kształtów z Ryciny 6E. (D) Widma z transformaty LCPC na siatce równoległej dla kształtów z Ryciny 6F w celu porównania z tymi z Ryciny 6E. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Szczegółowe informacje na temat najlepszych praktyk dotyczących transformaty LCPC.Ten plik uzupełniający zawiera obszerną dyskusję na temat najlepszych praktyk oraz dodatkowe uwagi metodologiczne. Struktura dokumentu przedstawia się następująco: Sekcja 1 – Kontekst przestrzenny, którego nie są w stanie uchwycić powierzchnia, objętość, obwód i chropowatość. Sekcja 2 – Najlepsze praktyki stosowania transformaty LCPC i interpretacji wyników. Sekcja 3 – Zrozumienie inherentnej polarności natury w celu maksymalizacji możliwości transformaty LCPC. Sekcja 4 – Interpretacja widm FFT wynikających z transformaty LCPC. Sekcja 5 – Jak orientować kształty przed ich pomiarem za pomocą transformaty LCPC. Sekcja 6 – Czym jest „Kształt Czysty” (Pure Shape) w porównaniu do „Kształtu w Skali” (At Scale Shape)? Sekcja 7 – Uwagi metodologiczne dotyczące metod statystycznych. Sekcja 8 – Uwagi metodologiczne dotyczące hodowli komórkowych i segmentacji organoidów. Sekcja 9 – Parametry FFT dla osób programujących własną transformatę LCPC. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Podobnie jak w przypadku każdego narzędzia obliczeniowego, jakość wyjścia zależy od tego, czy wejścia spełniają oczekiwane zasady, na których narzędzie zostało zaprojektowane. Należy przestrzegać następujących zasad i stosować je jako kontrolę jakości podczas korzystania z dostarczonych skryptów Python. Po pierwsze, upewnij się, że otwarte maski są niebieskimi liniami na białym tle. Kolor niebieski był dowolnym założeniem i nie ma znaczenia, ale skrypty, które wykonują transformację LCPC, zostały napisane w celu wyszukiwania niebieskich pikseli na białym tle. Po drugie, nie uruchamiaj skryptów transformacji LCPC na obrazach, które mają mniej niż 10 pikseli przestrzeni wolnej na wszystkich czterech stronach. Zapoznaj się z tym wideo, aby dowiedzieć się, dlaczego: “Parametr grubości marginesu - jak przygotować kontury kształtów”³³. Po trzecie, ten skrypt zakłada, że kontury twojego obiektu są niebieskimi pikselami na białym tle. Grubość linii powinna wynosić od 5 do 10 pikseli. Zapoznaj się z tym wideo, aby dowiedzieć się, dlaczego: “Parametr grubości linii - jak przygotować kontury kształtów”³⁴. Po czwarte, nie uruchamiaj skryptów transformacji LCPC na pustych obrazach. Spowoduje to błąd w skrypcie. Piąte, nie uruchamiaj skryptów transformacji LCPC na obrazach, które składają się tylko z plamki zanieczyszczeń. Spowoduje to błąd, ponieważ system siatki może nie wykryć plamki i tym samym próbować przeanalizować pusty obraz. Szóste, nie uruchamiaj skryptów transformacji LCPC na obrazach zawierających plamki niepożądanych zanieczyszczeń. Zanieczyszczenia mogą zmienić wysokość i szerokość obiektu otwartej maski, a tym samym powodować niedokładne wyniki. Siódme, zapoznaj się z tym wideo, aby zrozumieć, dlaczego ważne jest zrozumienie skali twoich obiektów przed ich analizą za pomocą transformacji LCPC: “Parametr skali - jak przygotować kontury kształtów”³⁵.

Jednym z najbardziej niezwykłych aspektów transformacji LCPC jest jej zdolność do rejestrowania kontekstu przestrzennego. Biologia jest pełna kontekstu przestrzennego, który jest niezbędny do zrozumienia natury. Na przykład komórki nabłonkowe mają biegunowość wierzchołkowo-podstawową^36,37,38,39. Co więcej, kierunek grawitacji, który jest zmieniany w warunkach mikrograwitacji, ma znaczący wpływ zarówno na fizjologię astronautów^40,41, jak i na morfologię komórek nowotworowych^42,43,44. Ostatnio, preneoplazja i neoplazja in situ mogą rosnąć do światła dzięki trzonkowi, który służy jako centralna struktura wsparcia, zapewniając dostęp do zaopatrzenia w krew. Tak więc, gdy te zmiany cofają się, cofają się zarówno od jamy światła, jak i w kierunku trzonka^45,46. Ponieważ został zaprojektowany w taki sposób, transformacja LCPC jest bardzo wrażliwa na kontekst przestrzenny i dlatego może wprowadzić dodatkową heterogeniczność, jeśli użytkownik nie jest ostrożny. Rysunek 6 opisuje, jak systematycznie orientować kształty przed zastosowaniem transformacji LCPC. Rysunek 7 opisuje, jak tradycyjna geometria nie może mierzyć pojęć kształtów oczywistych dla ludzi. Rysunek 8 przedstawia diagram, który wizualizuje różnicę między mierzeniem czystego kształtu a kształtu w skali. Rysunek 9 opisuje, że kontekst przestrzenny jest często zaniedbywany przy ilościowym określaniu kształtów w kulturze 2D, histologii i 2D przekrojach z obrazowania 3D. Należy pamiętać, że ze względu na ograniczenia przestrzeni, Plik uzupełniający 1 zawiera rozszerzoną dyskusję na temat Rysunku 6 i Rysunku 7 w sekcji 5 oraz Rysunku 8 i Rysunku 9 w sekcji 6.

Ponieważ FFT produkuje wielowymiarowe dane spektralne, ważne jest, aby użytkownik stał się przyzwyczajony do wyprowadzania indeksów z powtarzających się wzorców w widmach. Chociaż ten rękopis odnosi się do transformacji LCPC jako do zawierającej krok stosowania FFT, rzeczywista transformacja LCPC następuje przed etapem FFT (Rysunek 1A–B Krok 4, Rysunek 2A–B Krok 3). Jednak stosowanie FFT ujawnia obiektywne, systematyczne wnioski z dziedziny częstotliwości wyjścia transformacji LCPC. Tak więc transformacja LCPC nie byłaby tak skuteczna bez włączenia FFT jako ostatniego kroku. W transformacji LCPC FFT daje szereg koszy i ich wartości bezwzględne, z których wszystkie są statyczną wielowymiarową reprezent

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Used the NearestNeighbors function within the sklearn.neighbors package
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Used cKDTree function within scipy.spatial package
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Created an implementation of Cliff's Delta via the Python language
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Was mentinoed as a potential useful tool for manual segmentation, but not used in this study
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Used the PCA function with the sklearn.decomposition package
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook