Celem niniejszego badania było zidentyfikowanie kluczowych aktywnych składników Coptis chinensis i wyjaśnienie jego działania w interwencji w porażeniu mózgowym (PM) za pomocą ultrafiltracji powinowaczej i weryfikacji eksperymentalnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Celem niniejszego badania było zidentyfikowanie kluczowych aktywnych składników Coptis chinensis i wyjaśnienie jego działania w interwencji w porażeniu mózgowym (PM) za pomocą ultrafiltracji powinowaczej i weryfikacji eksperymentalnej.
Celem niniejszej pracy było zidentyfikowanie kluczowych aktywnych składników Coptis chinensis oraz wyjaśnienie jego mechanizmów działania w interwencji w porażeniu mózgowym (CP) poprzez ultrafiltrację powinowactwa. Wykorzystując acetylocholinoesterazę (AChE) jako cel, z ekstraktu C. chinensis wyselekcjonowano koptyzynę jako składnik o najsilniejszej zdolności wiązania, która wykazywała wskaźnik wiązania 21,9% i istotną in vitro aktywność inhibitorową (IC₅₀ = 3,24 µg/mL). Dokowanie molekularne i symulacje dynamiki molekularnej wykazały, że koptyzyna mogła stabilnie wiążać się z aktywną kieszenią AChE. Następnie przeprowadzono eksperymenty weryfikacyjne na modelu noworodków z hipoksyczno-niedokrwiennym uszkodzeniem mózgu (HIBD). Wyniki wykazały, że interwencja koptyzyna (10 mg/kg) znacząco poprawiła deficyty uczenia się przestrzennego i pamięci u zwierząt modelowych, zwiększyła przepływ krwi mózgowej w uszkodzonej półkuli, złagodziła patologiczne uszkodzenia tkanek mózgowych i hamowała nieprawidłową aktywację AChE w mózgu. Podsumowując, niniejsza praca połączyła technologię ultrafiltracji powinowactwa i potwierdziła, że koptyzyna, zidentyfikowana z ekstraktu C. chinensis, może hamować AChE i wywierać efekty neuroprotekcyjne oraz poprawiać przepływ krwi mózgowej. Stanowi ona kluczową bazę materiałową dla C. chinensis w leczeniu CP-podobnych niedoborów neurologicznych, zapewniając kandydatów do molekuł i naukowe dowody na rozwój związanych leków.
Porażenie mózgowe (PM) to trwałe syndrom spowodowane nieprogresywnym uszkodzeniem rozwijającego się mózgu płodów lub niemowląt, charakteryzujący się przede wszystkim zaburzeniami ruchowymi i nieprawidłowościami postawy. Mimo wielu dostępnych obecnie podejść klinicznych w leczeniu PM, nadal brakuje idealnych leków, które mogłyby fundamentalnie naprawić niedobory neurologiczne z minimalnymi skutkami ubocznymi. W przeciwieństwie do chemicznie syntetyzowanych leków, które zazwyczaj działają na pojedyncze cele i niosą ze sobą stosunkowo wysokie potencjalne toksyczności, tradycyjne leki chińskie (TCM), dzięki swoim zaletom wieloskładnikowym, wielocelowym i holistycznej regulacji, a także dobrym profilom bezpieczeństwa wykazanym w długotrwałej praktyce klinicznej, dostarczają nowych wglądów i zbiornik kandydatów do leków na leczenie złożonych zaburzeń mózgu1,2,3,4,5,6. Dlatego też, poszukiwanie wysoce skutecznych i niskotoksycznych składników chemicznych z TCM ma znaczące znaczenie naukowe i wartość kliniczną7.
Wśród złożonych mechanizmów patofizjologicznych porażenia mózgowego, dysfunkcja układu nerwowego cholinergowego odgrywa kluczową rolę8,9. Acetyloesteraza (AChE) to kluczowy enzym, który hydrolizuje neuroprzekaźnik acetylocholino (ACh). Nadmiernie wysoka aktywność tego enzymu prowadzi do wyczerpania ACh, upośledza przekazywanie sygnałów cholinergowych i w konsekwencji pogarsza zaburzenia kontroli ruchowej i poznawczej. Dlatego AChE stało się ważnym i dobrze ugruntowanym celem lekowym dla rozwoju środków neuroprotekcyjnych. Hamowanie aktywności AChE w celu podniesienia poziomów ACh w szczelinie synaptycznej jest uznawane za jedną z skutecznych strategii łagodzenia niedoborów neurologicznych związanych z PM. W kontekście hipoksyczno-niedokrwienia urazu mózgu, zaburzenie przekazywania neuroprzekaźników cholinergowych może dalsze pogarszać dysfunkcje neuronów, przyczyniając się tym samym do zaburzeń ruchowych i poznawczych związanych z PM. Dlatego AChE zostało wybrane w niniejszym badaniu nie tylko jako klasyczny neurofunkcjonalny cel, ale także jako mechanizmicznie istotny punkt wejścia do przesiewania związków bioaktywnych o potencjalnym działaniu przeciw PM.
Nowoczesne badania wykazały, że rośliny lecznicze mają szeroki zakres wartości działania farmakologicznego. Jako klasyczna tradycyjna chińska medycyna do usuwania ciepła i suszenia wilgoci, Coptis chinensis stanowi złożony system bogaty w różne alkaloidy izochinolinowe. Oprócz dobrze znanego berberyny, zawiera on również serię składników o podobnych strukturach i różnorodnych działaniach farmakologicznych, takich jak kopityna, epiberberyna, palmatina i jatroryzyna10. Te alkaloidy łącznie tworzą bazę materialną dla farmakologicznych działań C. chinensis. Poprzednie badania wykazały, że C. chinensis i jego alkaloidy posiadają właściwości przeciwzapalne, przeciwutleniające i potencjalne neuroprotekcyjne. Jednakże, biorąc pod uwagę tak złożony system składników, tradycyjne metody badawcze są trudne do szybkiego i dokładnego zidentyfikowania kluczowych aktywnych składników, które bezpośrednio działają na AChE, co znacznie ogranicza dogłębne wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw działania C. chinensis na uszkodzeniu mózgu11.
W porównaniu z konwencjonalną izolacją prowadzoną na podstawie aktywności, która zazwyczaj wymaga wielokrotnego frakcjonowania, testowania aktywności biologicznej i oczyszczania, a także może prowadzić do utraty lub zaniedbania nisko obecnych, ale o wysokiej spokrewnionych związków, ultrafiltracja powinowactwa umożliwia szybkie przesiewanie ligandów wiążących się z celem bezpośrednio ze złożonych mieszanin. Technika ta umożliwia wydajne i szybkie "łowienie" aktywnych ligandów, które wiązają się ze specyficznymi celami (np. AChE) bezpośrednio z wieloskładnikowych surowców ekstraktu TCM. Jest ona szczególnie przydatna dla systemów z wieloma składnikami alkaloidowymi, takimi jak C. chinensis, pozwalając na dokładne zidentyfikowanie efektywnych składników, które bezpośrednio współdziałają z celem złożonej mieszaniny12. W połączeniu z podejściami komputerowymi, w tym dokowaniem molekularnym i symulacjami dynamiki molekularnej, może intuicyjnie przewidywać tryb wiązania, rodzaje interakcji i stabilność kompleksów między składnikami a białkami docelowymi na poziomie atomowym, zapewniając tym samym solidne dowody teoretyczne i mechanizmiczne wyjaśnienia dla wyników przesiewania eksperymentalnego13.
Na podstawie powyższego tła, niniejsze badanie proponuje następującą hipotezę naukową: wśród różnych alkaloidów obecnych w C. chinensis, istnieją aktywne składniki, które mogą specyficznie hamować AChE, a te składniki są ba
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie procedury dotyczące dobrostanu zwierząt i eksperymentów zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych Pierwszego Szpitala Ludowego w Zunyi (Numer etyczny 2025-2-362). W trakcie modelowania i leczenia codziennie rejestrowano stan ciała i przeżywalność zwierząt.
Przygotowanie ekstraktu z C. chinensis
W niniejszym badaniu do przyspieszonej ekstrakcji frakcji n-butanolu z materiałów leczniczych C. chinensis wykorzystano akcelerator ekstrakcji. Dokładnie odważyono 1 g suszonego proszku C. chinensis i umieszczono pojedynczo w komórkach ekstrakcyjnych o pojemności 40 mL. Sekwencyjnie nad i pod komorą ekstrakcyjną umieszczono metalowe uszczelki i membrany filtratorów z włókna szklanego, aby przefiltrować próbkę, a następnie próbka została owinięta piaskiem kwarcowym. Podczas procesu ekstrakcji temperatura i ciśnienie ustawiono odpowiednio na 90 °C i 100 bar. Przyspieszony ekstrakt zebrano, a rozpuszczalnik ekstrakcyjny odparowano do sucha za pomocą obrotowego oparównika, aby uzyskać suszone ekstrakty o różnych polarnościach. Jako rozpuszczalnik rekonstytucyjny wybrano metan:wodę (50:50, v/v). Ekstrakt przefiltrowano przez mikroporowaną membranę o przepływie 0,45 μm i przechowywano w temperaturze 4 °C. Przed wykryciem próbki zbadano aktywność hamującą aktywność AChE przez rozpuszczalnik rekonstytucyjny. Wyniki wykazały, że jego efekt hamujący był znikomy, co wskazuje, że wybór rozpuszczalnika rekonstytucyjnego w tym eksperymencie nie wpłynie na wyniki eksperymentu.
Asekuracja aktywności inhibitorów acetylocholinoesterazy
Eksperyment przeprowadzono w płytce 96-dołkowej. Najpierw dodano PBS, a następnie sekwencyjnie AChE (0,1 U/mL) i próbki z C. chinensis. Po inkubacji w 37 °C przez 10 minut dodano chromogenny roztwór 5,5'-Ditiobis (2-nitrobenzoesan kwasu) (DTNB) (2,5 mmol/mL) i substrat ATChI (10 mmol/mL). Mieszaninę inkubowano w 37 °C przez kolejne 10 minut, a reakcji zaprzestano przez dodanie 60 μL 1% siarczanu dodecylosiarczanu sodu (SDS). Absorbancję mierzono przy długości fali 405 nm. Każda próbka C. chinensis została przygotowana w 4 grupach: Grupa kontrolna a: kolejno dodano PBS (120 μL), roztwór AChE (20 μL), roztwór DTNB (40 μL), roztwór ATChI (40 μL) i roztwór SDS (60 μL); Grupa kontrolna blank b: PBS (120 μL), roztwór DTNB (40 μL), roztwór ATChI (40 μL) i roztwór SDS (80 μL); Grupa próbkowa c: PBS (80 μL), ekstrakt z C. chinensis (20 μL), roztwór AChE (20 μL), roztwór DTNB (40 μL), roztwór ATChI (40 μL) i roztwór SDS (60 μL); Grupa próbkowa blank d: PBS (100 μL), ekstrakt z C. chinensis (20 μL), roztwór DTNB (40 μL), roztwór ATChI (40 μL) i roztwór SDS (60 μL). Huperzyna A została użyta jako kontrola dodatnia o początkowej koncentracji około 2,5 mg/mL. Początkowa koncentracja ekstraktu frakcji n-butanolu wynosiła około 1 mg/mL. Zarówno huperzyna A, jak i próbki zostały rozcieńczone gradientem 60%. Współczynnik hamowania obliczano według następującego wzoru: Współczynnik hamowania (%) = [1 - (c - d)/(a - b)] × 100%, gdzie a, b, c i d reprezentują wartości absorbancji dla grupy kontrolnej a, grupy kontrolnej blank b, grupy próbkowej c i grupy próbkowej blank d.
Współczynnik hamowania dla każdej przetestowanej koncentracji obliczano według wyżej opisanego wzoru. Następnie wykresy koncentracji-hamowania zostały skonstruowane przez przedstawienie współczynnika hamowania względem logarytmu koncentracji związków. Wartości IC20, IC50 i IC80 obliczono przez nieliniowe dopasowanie regresji za pomocą oprogramowania GraphPad Prism na podstawie dopasowanych krzywych koncentracji-odpowiedzi i zdefiniowano jako koncentracje wymagane do wywołania 20%, 50% i 80% hamowania aktywności AChE.
Asekuracja wiązania przy użyciu ultrafiltracji
Ultrafiltracja powinowactwa została przeprowadzona w celu przesiewu związków wiązających AChE z ekstraktu C. chinensis. Krótko rzecz ujmując, jako aktywny enzym zastosowano roztwór AChE (0,1 U/mL w PBS, pH 7,4). Kontrolę z inaktywowanym enzymem przygotowano poprzez podgrzanie tego samego roztworu AChE w kąpieli wodnej o temperaturze wrzenia przez 10 minut. Dla każdej reakcji 200 μL roztworu ekstraktu z C. chinensis mieszano z 200 μL aktywnego lub inaktywowanego roztworu AChE i inkubowano w 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji mieszaninę przeniesiono do 30 kDa ultrafiltracyjnej centrifugowej probówki i wyśrodkowano w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 12 000 × g. Utrzymany enzymowo-ligandowy kompleks był płukany trzykrotnie 200 μL PBS w tych samych warunkach wirowania w celu usunięcia niezwiązanych składników. Następnie dodano 200 μL 90% metanol, aby odseparować i eluować ligandy związane z AChE, po czym inkubowano przez 10 minut i wyśrodkow
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Analiza składników chemicznych w ekstrakcie z C. chinensis
Alkaloidy są głównymi składnikami akumulowanymi i głównymi aktywnymi składnikami materiałów leczniczych z C. chinensis. W niniejszym badaniu do analizy głównych składników chemicznych w C. chinensis wykorzystano technologię chromatograficzną (Rysunek 1A). Jak pokazano w Tabeli 1, wszystkie osiem analitów wykazywało dobrą liniowość w swoich odpowiednich zakresach kalib...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Obecnie opracowano różne metody i technologie zapobiegania i leczenia chorób mózgu20,21,22. W niniejszym badaniu przyjęto zintegrowaną strategię in vitro przesiewania, symulacji komputerowych i weryfikacji in vivo, aby systematycznie wyjaśnić podstawę materialną i mechanizm wielocelowy C. chinensis w poprawianiu objawów przypominających porażenie mózgowe indukowanych przez HIBD. Głównym odkryciem jest ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują, że nie mają znanych konkurencyjnych interesów finansowych ani osobistych relacji, które mogłyby wydawać się wpływające na prace zgłoszone w niniejszym artykule.
To dzieło było wspierane przez Zunyi Science and Technology Plan Project (Zunshi Kehe Support HZ (2020) Nr 110).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | CATO Research Chemicals Inc. | 416046844 | Test inhibicji acetylocholinoesterazy |
| Acetylcholinesterase (AChE) | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd | C1682 | Test inhibicji acetylocholinoesterazy |
| Acetylthiocholine iodide (ATChI) | Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd | 1037408 | Test inhibicji acetylocholinoesterazy |
| Aetonitrile | Thermo Fisher Scientific Inc | 1162577 | Faza ruchoma chromatografii cieczowej |
| AutoDock Vina | AutoDock | Wersja 1.2.5 | |
| Berberine standard | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | 110713-201814 | Analiza składu chemicznego |
| Columbamine standard | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180712 | Analiza składu chemicznego |
| Coptisine standard | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180309 | Analiza składu chemicznego |
| E-916 accelerated solvent extractor | Büchi Labortechnik AG, Switzerland | E916-008 | Ekstrakcja frakcji n-butanolu |
| Epiberberine standard | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180309 | Analiza składu chemicznego |
| Formic acid | Thermo Fisher Scientific Inc | 1270563 | Faza ruchoma chromatografii cieczowej |
| GaussView 6 | Gaussian | https://gaussian.com/gaussview6/ | |
| Glaucine standard | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180615 | Analiza składu chemicznego |
| Jatrorrhizine standard | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180607 | Analiza składu chemicznego |
| Magnoflorine standard | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180205 | Analiza składu chemicznego |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific Inc | 1162578 | Faza ruchoma chromatografii cieczowej |
| Microporous membrane | Millipore Filter Company | 2139547 | Filtracja wyciągów |
| Palmatine standard | Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd | CHB180226 | Analiza składu chemicznego |
| Prism | GraphPad | https://www.graphpad.com/ | |
| PyMOL | PyMOL | https://pymol.org/ | |
| Sodium carbonate | Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd | 15138805 | Test inhibicji acetylocholinoesterazy |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd | 11019349 | Test inhibicji acetylocholinoesterazy |