Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
* These authors contributed equally
Białko zawierające domeny SAM i SH3 1 (SASH1) zostało zidentyfikowane jako kluczowy regulator apoptozy trofoblastu i stanu zapalnego w preeklampsji (PE). Egzosomy pochodzące z łożyska (P-EXOS) łagodzą uszkodzenia wywołane hipoksją poprzez supresję ekspresji SASH1. Wyniki te ujawniają nowy mechanizm leżący u podstaw patogenezy PE i wskazują na SASH1 jako potencjalny cel terapeutyczny.
SASH1 jest białkiem adaptorowym sygnałowym uczestniczącym wzroście komórek, apoptozie i regulacji odpornościowej, które jest coraz częściej badane w komórkach nowotworowych i odpornościowych. Pojawiające się dowody sugerują, że SASH1 odgrywa istotną rolę w odpowiedziach zapalnych i homeostazie komórkowej, procesach ściśle powiązanych z rozwojem PE. Celem niniejszego badania było ustalenie, czy SASH1 przyczynia się do apoptozy trofoblastu i odpowiedzi zapalnych w PE oraz czy P-EXOS wykazuje działanie ochronne poprzez regulację SASH1. W badaniu przeanalizowano trzy zestawy danych transkrypomicznych związanych z PE (GSE75010, GSE10588 oraz GSE60438) w celu zidentyfikowania wspólnych genów różnicowo wyrażonych (DEG), po czym przeprowadzono analizy wzbogacenia Gene Ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Dalsze zastosowanie algorytmów uczenia maszynowego pozwoliło na wyselekcjonowanie kluczowych genów kandydatów, a dane z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek wykorzystano do charakterystyki heterogeniczności komórkowej w tkance łożyskowej oraz do określenia wzorców ekspresji specyficznych dla poszczególnych typów komórek. SASH1 został zidentyfikowany jako wspólny gen kandydat i był znacząco upregulowany w komórkach trofoblastu z próbek PE. In vitro opracowano model komórkowy trofoblastu HTR-8/SVneo poddanego hipoksji, łącząc go z wyciszeniem (knockdown) SASH1, nadekspresją SASH1 oraz kokulturą z P-EXOS. Eksperymenty funkcjonalne wykazały, że wyciszenie SASH1 znacząco hamowało indukowaną hipoksją apoptozę trofoblastu i zmniejszało wydzielanie cytokin prozapalnych, w tym IL-6, IL-1β i TNF-α, podczas gdy nadekspresja SASH1 promowała apoptozę i odpowiedzi zapalne. Ponadto terapia P-EXOS wyraźnie zmniejszyła ekspresję SASH1 na poziomie mRNA i białka oraz złagodziła indukowane hipoksją uszkodzenie trofoblastu, podczas gdy nadekspresja SASH1 w dużej mierze zniosła te efekty ochronne. Podsumowując, wyniki te wskazują, że SASH1 odgrywa krytyczną rolę w apoptozie trofoblastu i odpowiedziach zapalnych w PE. P-EXOS może łagodzić indukowane hipoksją uszkodzenia trofoblastyczne poprzez tłumienie ekspresji SASH1, dostarczając nowych informacji na temat mechanizmów molekularnych i potencjalnych celów terapeutycznych w PE.
PE (przełoma ciśnieniowa) to specyficzne dla ciąży zaburzenie wieloukładowe, które zazwyczaj występuje po 20. tygodniu gestacji i klinicznie charakteryzuje się nadciśnieniem tętniczym, białkomoczem oraz niewydolnością wielu narządów. Pozostaje ona główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności matek oraz noworodków na całym świecie1. Pomimo ciągłych postępów w zarządzaniu klinicznym, ostatecznym leczeniem PE wciąż jest urodzenie łożyska, co podkreśla niepełne zrozumienie patogenezy tej choroby oraz pilną potrzebę zidentyfikowania nowych mechanizmów molekularnych i komórkowych, a także potencjalnych celów terapeutycznych2,3.
Odpowiednia inwazja trofoblastów oraz promowanie prawidłowego rozwoju łożyska są krytycznymi mechanizmami leżącymi u podstaw patogenezy PE4. Podczas normalnej ciąży komórki trofoblastyczne naciekają błonę błoniastą macicy i przebudowują tętnice spiralne, aby ustanowić krążenie o niskim oporze i wysokiej wydajności. Zaburzona inwazja i migracja komórek trofoblastycznych prowadzi do zmniejszenia perfuzji łożyska, co skutkuje utrzymującym się środowiskiem hipoksycznym i stresem oksydacyjnym. Hipoksja bezpośrednio wpływa na apoptozę komórkową, a aberracyjne uwalnianie mediatorów prozapalnych zaburza homeostazę na styku matka-płód, co dodatkowo pogarsza dysfunkcję łożyska5. Stan zapalny jest również istotnym czynnikiem napędzającym PE. Stwierdzono, że poziomy IL-17, IL-6 i TNF-α są znacznie podwyższone w łożysku i krwi obwodowej pacjentek z PE6. Hipoksja i stan zapalny wzajemnie się potęgują, tworząc błędne koło, które nasila zapalenie systemowe, powoduje uszkodzenia śródbłonka i przyczynia się do nieprawidłowości łożyska. Molekularne sieci sterujące apoptozą trofoblastów i odpowiedziami zapalnymi pozostają w dużej mierze nieznane.
SASH1 jest członkiem rodziny wewnątrzkomórkowych białek rusztowaniowych SLy/SASH1, które pełni funkcję adaptora sygnalizacyjnego7. SASH1 został przede wszystkim scharakteryzowany jako supresor nowotworowy hamujący przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT), migrację oraz inwazję komórek poprzez oddziaływania z partnerami sygnałowymi, takimi jak CRKL oraz szlak PI3K-Akt-mTOR8,9. Poza rolami supresyjnymi w nowotworach, pojawiające się dowody sugerują, że SASH1 uczestniczy w sygnalizacji zapalnej i regulacji odpornościowej7. Jednakże ekspresja i funkcja SASH1 w łożysku, szczególnie w kontekście biologii trofoblastu i PE, nie zostały dotąd zbadane.
Egzosomy wyłoniły się jako istotne mediatory komórkowe i są coraz częściej badane w kontekście ciąży10. Egzosomy transportują różnorodne biologicznie czynne ładunki, w tym białka, lipidy i niekodujące RNA, aby modulować funkcje komórek biorcy. Rosnąca liczba dowodów sugeruje, że P-EXOS odgrywają kluczową rolę w regulacji odpornościowej podczas ciąży, a ich aktywność i ładunek są znacząco zmienione w PE, co potencjalnie nasila stan zapalny11. Egzosomy są również powiązane z regulacją stresu oksydacyjnego12 i angiogenezy13, co może wywierać korzystny wpływ na powikłania związane z ciążą. Jednak ich cele molekularne i mechanizmy działania w PE pozostają nie do końca poznane.
Postawiono hipotezę, że białko SASH1 ulega dysregulacji w łożysku w PE i pełni funkcję kluczowego czynnika indukującego apoptozę trofoblastów oraz odpowiedzi zapalne, a P-EXOS mogą wywierać działanie ochronne przeciwko uszkodzeniom trofoblastów poprzez modulację ekspresji SASH1. Aby sprawdzić tę hipotezę, zintegrowano wiele zbiorów danych transkryptomicznych z PE oraz dane z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek z wykorzystaniem uczenia maszynowego opartego na wielu algorytmach w celu zidentyfikowania kluczowych genów kandydackich. Wykorzystując model komórek trofoblastycznych HTR-8/SVneo poddanych hipoksji oraz eksperymenty z interwencją opartą na egzosomach, zbadano funkcjonalną rolę SASH1 w dysfunkcji trofoblastów oraz potencjał terapeutyczny P-EXOS w PE.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenie etyczne
Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Czwartego Szpitala w Shijiazhuang (numer zatwierdzenia 20200031). Przed pobraniem próbek od wszystkich dawców tkanek łożyska uzyskano pisemną świadomą zgodę. Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Pełna lista odczynników, materiałów eksploatacyjnych, sprzętu i oprogramowania użytych w tym protokole znajduje się w Tabeli materiałów.
Gromadzenie danych
Dane RNA-seq pobrano z bazy danych GEO. Zbiory danych obejmowały GSE75010, który zawiera dane o ekspresji genów z 157 łożysk z PE i 173 łożysk bez PE (N = 330). GSE10588 zawiera dane o ekspresji genów z 26 normalnych łożysk i 17 łożysk z ciężkim PE (N = 43). GSE60438 zawiera dane z profilowania transkryptomu decidua basalis od pacjentek z PE oraz z ciąż normotensyjnych (N = 125). Dane transkryptomiczne z pojedynczych komórek pobrano ze zbioru danych GEO GSE183338. Obejmuje on próbki pojedynczych jąder komórkowych z kosmków błonowych/interfejsu matczyno-płodowego w ciążach z PE oraz zdrowych ciążach.
Analiza DEG
W pierwszej kolejności poddano wstępnemu przetwarzaniu i normalizacji zbiory danych GSE75010, GSE10588 oraz GSE60438 dotyczące genów różnicowo wyrażonych (DEG) powiązanych z PE. Następnie, w oparciu o informacje o grupach próbek, przeprowadzono analizę różnicową przy użyciu pakietu R „limma”14. Wybrano geny o wartości p < 0.05 oraz |log2FC| > 0.5. Wykresy wulkaniczne (volcano plots) dla DEG wygenerowano za pomocą pakietu R ggplot2. Mapy ciepła (heat maps) dla 20 najważniejszych DEG sporządzono przy użyciu pakietu R pheatmap. Następnie wyznaczono część wspólną DEG wybranych z trzech zbiorów danych i skonstruowano sieć oddziaływań białko-białko (PPI) dla genów kandydackich za pomocą platformy online STRING, przyjmując wynik oddziaływania ≥0.15. Z tej sieci PPI zidentyfikowano 20 głównych genów węzłowych (hub genes) na podstawie stopnia ich łączności, rankując je za pomocą oprogramowania Cytoscape. Wyniki sieci PPI zwizualizowano przy użyciu oprogramowania Cytoscape lub platformy STRING.
Analiza wzbogacenia
Analizę wzbogacenia genów przeprowadzono przy użyciu pakietów ClusterProfiler i DOSE w połączeniu ze stroną internetową Metascape. Bazy danych pobrano z GO oraz KEGG. Analizę wzbogacenia wykonano za pomocą funkcji „EnrichGO”. Ścieżki z p < 0,05 uznano za istotnie wzbogacone. Wyniki wzbogacenia zwizualizowano przy użyciu pakietów „ggplot2” i „ggpubr”.
Uczenie maszynowe
Aby zidentyfikować stabilne i biologicznie istotne DEG związane z PE, przeprowadzono analizę selekcji cech z wykorzystaniem wielu modeli uczenia maszynowego w oparciu o publicznie dostępny zbiór danych transkryptomicznych GSE60438 (platforma: GPL6884). Zbiór ten zawiera profile ekspresji próbek decidua basalis pobranych podczas cesarskiego cięcia z ciąż z preeklampsją oraz ciąż normotensyjnych. Wstępnie przefiltrowane DEG zostały znormalizowane, a macierz ekspresji, wraz z odpowiadającymi im informacjami o grupach klinicznych, posłużyła jako dane wejściowe dla czterech różnych algorytmów uczenia maszynowego w celu zredukowania błędu modelu i zwiększenia stabilności selekcji cech.
Cztery algorytmy zastosowano jednocześnie, bez określonej kolejności. Analizę LASSO przeprowadzono przy użyciu pakietu „glmnet” w celu wykonania analizy regresji i wyboru istotnych genów jako cech. Do funkcji straty dodano człon regularyzacji L1, który redukuje współczynniki mniej istotnych cech do zera, umożliwiając tym samym selekcję cech. Metodę SVM-RFE zaimplementowano przy użyciu pakietu „e1071” w celu zbudowania maszyny wektorów wspierających z rekurencyjną eliminacją cech. Najpierw wytrenowano klasyfikator SVM, a następnie iteracyjnie usuwano najmniej informacyjne cechy na podstawie wag cech, co pozwoliło uzyskać optymalny podzbiór cech. Algorytm XGBoost zastosowano przy użyciu pakietu „xgboost” do budowy wielu drzew decyzyjnych. Każde drzewo dopasowywało reszty z poprzedniego drzewa, a ważone wyniki kumulowano w celu uzyskania końcowej predykcji. Algorytm Boruta wykonano przy użyciu pakietu „randomForest”, generując cechy zastępcze (shadow features), które konkurowały z rzeczywistymi cechami podczas trenowania lasu losowego. Zachowano cechy, których wartości istotności były znacząco wyższe niż w przypadku szumu losowego.
Analiza danych transkryptomicznych z pojedynczych komórek
Dane transkryptomiczne z pojedynczych komórek pobrano z bazy danych GEO, a surową macierz zliczeń pobrano z zestawu GSE183338. Macierz zliczeń zaimportowano za pomocą funkcji „Read10X” pakietu Seurat i przekonwertowano do formatu dgCMatrix. Poszczególne obiekty scalono w jeden zagregowany obiekt za pomocą funkcji „merge”, a etykiety komórek uczyniono unikalnymi przy użyciu „RenameCells”. Komórki niskiej jakości odfiltrowano na podstawie następujących kryteriów: usunięto geny wykazujące ekspresję w mniej niż trzech komórkach oraz wykluczono komórki wykazujące ekspresję mniej niż 200 genów. Komórki po kontroli jakości poddano normalizacji i zidentyfikowano geny o wysokiej zmienności. Globalną normalizację skalowania zastosowano przy użyciu „LogNormalize” (scale factor = 10 000), wyselekcjonowano geny o wysokiej zmienności (n = 2 000) za pomocą „FindVariableFeatures”, a dane przeskalowano przy użyciu „ScaleData”. Analizę głównych składowych przeprowadzono dla cech o wysokiej zmienności i zachowano 30 głównych składowych. Efekty serii między próbkami skorygowano metodą Harmony. Komórki wizualizowano i redukowano wymiarowo za pomocą UMAP. Grafy wspólnych najbliższych sąsiadów skonstruowano przy użyciu funkcji „FindNeighbors” i „FindClusters” w oparciu o algorytm Louvain. Parametr rozdzielczości (resolution) w funkcji „FindClusters” zoptymalizowano w zakresie od 0,1 do 1. Drzewo klastrowania zwizualizowano za pomocą funkcji „clustree”, a do zdefiniowania klastrów komórkowych wybrano rozdzielczość 0,9. Potencjalne dublety usunięto za pomocą algorytmu Scrublet. Klastry komórkowe adnotowano poprzez identyfikację różnicowo wyrażonych genów markerowych za pomocą funkcji „FindAllMarkers”. Zastosowano nieparametryczny test suma rang Wilcoxona z korektą Bonferroniego. Tożsamość komórek przypisano na podstawie markerów powierzchniowych, odpowiedniej literatury oraz bazy Cell Classification Database15.
Kultura komórek
Linia komórek trofoblastu HTR-8/SVneo była hodowana w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny/streptomycyny. Warunki hipoksji uzyskano poprzez hodowlę komórek w atmosferze 1% O₂, 5% CO₂ i 94% N₂ przez 24 h; kontrolę normoksji utrzymywano w atmosferze 20% O₂ i 5% CO₂16. Wszystkie procedury hodowli komórkowych należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II, stosując techniki aseptyczne. Pożywki hodowlane, odczynniki do transfekcji oraz odpady komórkowe należy utylizować zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.
Transfekcja komórek
Zsyntetyzowano plazmidy zawierające sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 oraz OE-NC. Komórki HTR-8/SVneo wysiano w płytkach 6-dołkowych z zagęszczeniem 5 × 105 komórek na dołek. Następnie komórki przetransfekowano 2 µg plazmidu sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 lub OE-NC na dołek, stosując odczynnik do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie: DNA plazmidowe oraz odczynnik P3000 rozcieńczono w Opti-MEM, zmieszano z Lipofectamine 3000 rozcieńczoną oddzielnie w Opti-MEM, inkubowano przez 15 min w temperaturze pokojowej, a następnie dodano do komórek przy ich 70–80% konfluencji. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji oceniono ekspresję SASH1 za pomocą RT-qPCR i Western blot. Sekwencje docelowe shRNA użyte do wyciszenia SASH1 wymieniono w Supplementary Table 1.
Ilościowa PCR w czasie rzeczywistym
Całkowite RNA wyekstrahowano z komórek HTR-8/SVneo i poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji w temperaturze 42 °C przez 30 min, a następnie w 85 °C przez 5 min. Ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) przeprowadzono z użyciem SYBR Green master mix w następujących warunkach cyklicznych: 95 °C przez 10 min, a następnie 40 cykli obejmujących 95 °C przez 15 s oraz 60 °C przez 1 min. Względną ekspresję mRNA obliczono metodą ΔΔCt, przyjmując β-actin jako referencję wewnętrzną. Sekwencje starterów użytych w tym eksperymencie wymieniono w Tabeli uzupełniającej 2.
Analiza Western blot
Całkowite białko wyekstrahowano z komórek HTR-8/SVneo przy użyciu buforu do lizy. Lizaty komórkowe zebrano, inkubowano na lodzie, a następnie wirowano przy 12 000 × g przez 30 min w temperaturze 4 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń. Stężenie białka określono za pomocą spektrofotometru. Równe ilości białka (50 µg) rozdzielono metodą SDS-PAGE, a następnie przeniesiono na membrany PVDF. Membrany zablokowano 5% roztworem mleka odtłuszczonego i inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C. Po przemyciu membrany inkubowano z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi, a prążki białkowe zwizualizowano za pomocą systemu detekcji z wzmocnioną chemiluminescencją.
Do detekcji białek zastosowano przeciwciała pierwotne: anty-SASH1 oraz anty-β-actin. Wykorzystano odpowiednie przeciwciała wtórne sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) – kozie anty-królicze oraz kozie anty-mysie. β-actin posłużyło jako wewnętrzna kontrola ładunku w celu zapewnienia równoważnej ilości naniesionego białka. Intensywność prążków białkowych zmierzono i określono ilościowo przy użyciu oprogramowania ImageJ.
Izolacja P-EXOS
P-EXOS wyizolowano z tkanki kosmków błon płodowych uzyskanej z łożysk donoszonych u zdrowych kobiet poddawanych planowemu cięciu cesarznemu. Tkankę kosmków błon płodowych dokładnie przemyto sterylnym PBS, posiekano na fragmenty o wielkości około 1 mm3 i hodowano w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej o 10% FBS pozbawionego egzosomów w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 48 h. Kondycjonowaną pożywkę poddano wirowaniu różnicowemu w następujący sposób: 300 × g przez 10 min w celu usunięcia komórek i resztek tkankowych; 2,000 × g przez 20 min w celu usunięcia szczątków komórkowych oraz 10,000 × g przez 30 min w celu usunięcia mikropęcherzyków, wszystko w temperaturze 4 °C. Otrzymany nadosad poddano ultrawirowaniu przy 120,000 × g przez 70 min w 4 °C w celu osadzenia egzosomów. Osad przemyto raz PBS i ponownie ultrawirowano przy 120,000 × g przez 70 min w 4 °C. Końcowy osad resuspendowano w PBS. Wyizolowane egzosomy scharakteryzowano za pomocą analizy Western blot w kierunku markerów egzosomów (PLAP, CD63 i TSG101, z GM130 jako kontrolą negatywną), a następnie poddano analizie za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu obserwacji morfologicznej.
Eksperyment pobierania komórkowego P-EXOS
Aby potwierdzić internalizację komórkową P-EXOS, egzosomy znakowano fluorescencyjnie lipofilowym barwnikiem błonowym PKH67 zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, P-EXOS inkubowano z PKH67 (4 µM) w rozcieńczalniku C przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie reakcję zatrzymano poprzez dodanie równiej objętości 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Znakowane egzosomy ponownie wyizolowano metodą ultrawirowania (120,000 × g, 70 min, 4 °C), aby usunąć niezwiązany barwnik. Następnie znakowane PKH67 P-EXOS (50 µg/mL) dodano do komórek HTR-8/SVneo i współinkubowano przez 24 h w warunkach normoksji lub hipoksji (1% O₂). Komórki przemyto następnie trzy razy PBS, utrwalono 4% paraformaldehydem przez 15 min, a jądra komórkowe przeciwbarwiono DAPI (1 µg/mL). Internalizację egzosomów znakowanych PKH67 zwizualizowano za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej (CLSM; wzbudzenie 490 nm, emisja 502 nm). W eksperymentach z funkcjonalną ko-kulturą komórki HTR-8/SVneo traktowano P-EXOS w stężeniu 50 µg/mL (ekwiwalent białka) w pełnej pożywce RPMI-1640 uzupełnionej o 10% FBS pozbawionego egzosomów w warunkach hipoksji (1% O₂) przez 24 h.
Test immunoenzymatyczny (ELISA)
Zebrano nadsącz z hodowli komórkowych, a poziomy IL-6, IL-1β i TNF-α zmierzono odpowiednio za pomocą zestawów ELISA do IL-6, IL-1β i TNF-α, zgodnie z instrukcjami producentów. Absorbancję przy 450 nm zmierzono za pomocą czytnika mikroplatek, a rzeczywiste stężenia obliczono na podstawie krzywych wzorcowych.
Metoda TUNEL (znakowanie końców nacięć dUTP za pomocą TdT)
Komórki apoptotyczne wykryto przy użyciu zestawu do testu TUNEL zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, komórki utrwalono 4% paraformaldehydem przez 15 min w temperaturze pokojowej, permeabilizowano 0,1% Triton X-100 w PBS przez 5 min na lodzie, a następnie inkubowano z mieszaniną reakcyjną TUNEL przez 60 min w 37 °C w ciemności. Jądra komórkowe przeciwbarwiono DAPI, a komórki TUNEL-dodatnie zwizualizowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i poddano kwantyfikacji poprzez obliczenie procentu komórek TUNEL-dodatnich w co najmniej pięciu losowo wybranych polach dla każdej próbki.
Analiza statystyczna
Wszystkie dane analizowano przy użyciu programów R oraz GraphPad Prism. Zmienne ciągłe przedstawiono jako średnia ±SD. Porównania dwóch grup przeprowadzono za pomocą testu t-Studenta, natomiast porównania wielu grup wykonano przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z następującym po niej testem post hoc Tukeya. Istotność statystyczną dla zmiennych kategorycznych oceniano za pomocą testu chi-kwadrat lub dokładnego testu Fishera. O ile nie wskazano inaczej, korelacje między cząsteczkami obliczono za pomocą analizy korelacji Spearmana. Eksperymenty dotyczące charakterystyki egzosomów przeprowadzono z użyciem P-EXOS wyizolowanych od trzech niezależnych dawców łożyska. Eksperymenty na liniach komórkowych przeprowadzono w trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych, reprezentujących niezależne doświadczenia wykonane w różnych terminach z użyciem komórek HTR-8/SVneo o różnych pasażach, przy czym w każdym powtórzeniu zastosowano P-EXOS wyizolowane od innego dawcy łożyska. Za istotną statystycznie uznano wartość p < 0,05.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Analiza transkryptomiczna zdrowych pacjentek oraz pacjentek z PE
Aby określić różnice w ekspresji genów pomiędzy grupą kontrolną (Normal) a pacjentkami z PE, przeanalizowano różnicową ekspresję w połączonych zbiorach danych przy użyciu pakietu R limma. Zidentyfikowano łącznie 89 DEG (p < 0,05 oraz |log2FC| > 0,5), w tym 69 genów o zwiększonej ekspresji i 20 genów o zmniejszonej ekspresji dla GSE75010 (Ryc. 1A). W przypadk...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W niniejszym badaniu, dzięki zintegrowanej analizie transkrypcyjnej, sekwencjonowaniu pojedynczych komórek oraz zastosowaniu uczenia maszynowego z wykorzystaniem wielu algorytmów, zidentyfikowano SASH1 jako kluczowy gen ulegający dysregulacji w PE, co jest szczególnie istotne w obliczu braku dostępnych terapii celowanych w PE17. Wykazano, że poziom SASH1 jest znacząco podwyższony w hipoksyjnych komórkach trofoblastów oraz specyficznie zwiększony w przedziale trofoblastycznym łożysk z PE w rozdziel...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W niniejszym badaniu nie występuje konflikt interesów.
Niniejsze badanie było finansowane przez program badawczy Medical Science Research Key Program prowadzony przez Hebei Provincial Health Commission w Chinach (nr 20210075).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywka RPMI-1640 | Gibco | 11875085 | |
| Pł Tkliwa Wołowa (FBS) | Gibco | 16140071 | |
| FBS pozbawiony egzosomów | System Biosciences | EXO-FBS-50A-1 | |
| Penicylina/Streptomycyna | Thermo Fisher Scientific, CN | 15140122 | |
| Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000 (z odczynnikiem P3000) | Thermo Fisher Scientific, CN | L3000150 | |
| Pożywka Opti-MEM z obniżoną zawartością surowicy | Thermo Fisher Scientific, CN | 31985070 | |
| Plazmid shRNA SASH1 (HuSH) | origene | TL301836 | |
| Plazmid ekspresyjny ORF SASH1 | origene | RC218866 | |
| Kontrolny pusty wektor | origene | PS100001 | |
| Zestaw do odwrotnej transkrypcji | Thermo Fisher Scientific, CN | 4368814 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific, CN | A46110 | |
| Primery SASH1 | Sangon Biotech | Synteza na zamówienie | |
| Primery β-aktyny | Sangon Biotech | Synteza na zamówienie | |
| Bufor do lizy komórek | Beyotime | P0013B | |
| Spektrofotometr NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, CN | NanoDrop Ultra | |
| Membrana PVDF | Thermo Fisher Scientific, CN | 88518 | |
| Przeciwciało anty-SASH1 | ABclonal | A15248 | |
| Przeciwciało anty-β-aktyna | Abcam | ab6276 | |
| Wtórne przeciwciało kozie anty-królicze/anty-mysie sprzężone z HRP | Beyotime | A0208 | |
| Oprogramowanie ImageJ | NIH (domena publiczna) | ImageJ | |
| Zestaw PKH67 do zielonej fluorescencyjnej znakowania komórek (zawiera rozcieńczalnik C) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | MINI67 | |
| Albuminy surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | 10711454001 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| Konfokalny skaningowy mikroskop laserowy (CLSM) | Leica | Leica TCS SP8 | |
| Zestaw ELISA Quantikine do ludzkiej IL-6 | R&D Systems | D6050B | |
| Zestaw ELISA DuoSet do ludzkiej IL-1β/IL-1F2 | R&D Systems | DY201 | |
| Zestaw ELISA Quantikine do ludzkiego TNF-α | R&D Systems | DTA00D | |
| Czytnik mikropłytek | Thermo Scientific | Multiskan FC | |
| Zestaw do detekcji śmierci komórek in situ (zestaw do analizy TUNEL) | Roche | 11684795910 | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096 | |
| Paraformaldehyd (4%) | Beyotime | P0099 | |
| Mikroskop fluorescencyjny | Olympus | BX53 | |
| Wirówka chłodząca (wydajność 12 000 × g) | Eppendorf | Eppendorf 5430 R | |
| Ultrawirówka (wydajność 120 000 × g) | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| Oprogramowanie R | The R Foundation | v4.2.1 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v10.0 | |
| Seurat (pakiet R) | Satija Lab (open-source) | v4.0.4 | |
| Harmony (pakiet R, korekcja efektu serii) | Open-source | v1.2.0 | |
| Scrublet (pakiet Python, detekcja dubletów) | Open-source | v0.2.3 | |
| clustree (pakiet R) | Open-source | v0.5.1 | |
| glmnet (pakiet R, LASSO) | Open-source | v4.1.8 | |
| e1071 (pakiet R, SVM-RFE) | Open-source | v1.7-14 | |
| xgboost (pakiet R) | Open-source | v1.7.7.1 | |
| randomForest (pakiet R, Boruta) | Open-source | v4.7-1.1 | |
| Baza danych Gene Expression Omnibus (GEO) | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| Baza danych STRING | string-db.org | https://www.string-db.org/ | |
| Metascape | metascape.org | https://metascape.org/ | |
| Oprogramowanie Cytoscape | Cytoscape Consortium | v3.10.4 | |
| ggplot2 (pakiet R) | Open-source | v3.5.1 | |
| limma (pakiet R) | Open-source | v3.58.1 | |
| pheatmap (pakiet R) | Open-source | v1.0.12 | |
| ClusterProfiler (pakiet R) | Open-source | v4.8.3 | |
| DOSE (pakiet R) | Open-source | v3.28.2 | |
| ggpubr (pakiet R) | Open-source | v0.6.0 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.