Egzosomy pochodzące z łożyska łagodzą indukowaną hipoksją apoptozę trofoblastów oraz progresję stanu zapalnego poprzez SASH1

Podsumowanie

Białko zawierające domeny SAM i SH3 1 (SASH1) zostało zidentyfikowane jako kluczowy regulator apoptozy trofoblastu i stanu zapalnego w preeklampsji (PE). Egzosomy pochodzące z łożyska (P-EXOS) łagodzą uszkodzenia wywołane hipoksją poprzez supresję ekspresji SASH1. Wyniki te ujawniają nowy mechanizm leżący u podstaw patogenezy PE i wskazują na SASH1 jako potencjalny cel terapeutyczny.

Streszczenie

SASH1 jest białkiem adaptorowym sygnałowym uczestniczącym wzroście komórek, apoptozie i regulacji odpornościowej, które jest coraz częściej badane w komórkach nowotworowych i odpornościowych. Pojawiające się dowody sugerują, że SASH1 odgrywa istotną rolę w odpowiedziach zapalnych i homeostazie komórkowej, procesach ściśle powiązanych z rozwojem PE. Celem niniejszego badania było ustalenie, czy SASH1 przyczynia się do apoptozy trofoblastu i odpowiedzi zapalnych w PE oraz czy P-EXOS wykazuje działanie ochronne poprzez regulację SASH1. W badaniu przeanalizowano trzy zestawy danych transkrypomicznych związanych z PE (GSE75010, GSE10588 oraz GSE60438) w celu zidentyfikowania wspólnych genów różnicowo wyrażonych (DEG), po czym przeprowadzono analizy wzbogacenia Gene Ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Dalsze zastosowanie algorytmów uczenia maszynowego pozwoliło na wyselekcjonowanie kluczowych genów kandydatów, a dane z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek wykorzystano do charakterystyki heterogeniczności komórkowej w tkance łożyskowej oraz do określenia wzorców ekspresji specyficznych dla poszczególnych typów komórek. SASH1 został zidentyfikowany jako wspólny gen kandydat i był znacząco upregulowany w komórkach trofoblastu z próbek PE. In vitro opracowano model komórkowy trofoblastu HTR-8/SVneo poddanego hipoksji, łącząc go z wyciszeniem (knockdown) SASH1, nadekspresją SASH1 oraz kokulturą z P-EXOS. Eksperymenty funkcjonalne wykazały, że wyciszenie SASH1 znacząco hamowało indukowaną hipoksją apoptozę trofoblastu i zmniejszało wydzielanie cytokin prozapalnych, w tym IL-6, IL-1β i TNF-α, podczas gdy nadekspresja SASH1 promowała apoptozę i odpowiedzi zapalne. Ponadto terapia P-EXOS wyraźnie zmniejszyła ekspresję SASH1 na poziomie mRNA i białka oraz złagodziła indukowane hipoksją uszkodzenie trofoblastu, podczas gdy nadekspresja SASH1 w dużej mierze zniosła te efekty ochronne. Podsumowując, wyniki te wskazują, że SASH1 odgrywa krytyczną rolę w apoptozie trofoblastu i odpowiedziach zapalnych w PE. P-EXOS może łagodzić indukowane hipoksją uszkodzenia trofoblastyczne poprzez tłumienie ekspresji SASH1, dostarczając nowych informacji na temat mechanizmów molekularnych i potencjalnych celów terapeutycznych w PE.

Wprowadzenie

PE (przełoma ciśnieniowa) to specyficzne dla ciąży zaburzenie wieloukładowe, które zazwyczaj występuje po 20. tygodniu gestacji i klinicznie charakteryzuje się nadciśnieniem tętniczym, białkomoczem oraz niewydolnością wielu narządów. Pozostaje ona główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności matek oraz noworodków na całym świecie¹. Pomimo ciągłych postępów w zarządzaniu klinicznym, ostatecznym leczeniem PE wciąż jest urodzenie łożyska, co podkreśla niepełne zrozumienie patogenezy tej choroby oraz pilną potrzebę zidentyfikowania nowych mechanizmów molekularnych i komórkowych, a także potencjalnych celów terapeutycznych^2,3.

Odpowiednia inwazja trofoblastów oraz promowanie prawidłowego rozwoju łożyska są krytycznymi mechanizmami leżącymi u podstaw patogenezy PE⁴. Podczas normalnej ciąży komórki trofoblastyczne naciekają błonę błoniastą macicy i przebudowują tętnice spiralne, aby ustanowić krążenie o niskim oporze i wysokiej wydajności. Zaburzona inwazja i migracja komórek trofoblastycznych prowadzi do zmniejszenia perfuzji łożyska, co skutkuje utrzymującym się środowiskiem hipoksycznym i stresem oksydacyjnym. Hipoksja bezpośrednio wpływa na apoptozę komórkową, a aberracyjne uwalnianie mediatorów prozapalnych zaburza homeostazę na styku matka-płód, co dodatkowo pogarsza dysfunkcję łożyska⁵. Stan zapalny jest również istotnym czynnikiem napędzającym PE. Stwierdzono, że poziomy IL-17, IL-6 i TNF-α są znacznie podwyższone w łożysku i krwi obwodowej pacjentek z PE⁶. Hipoksja i stan zapalny wzajemnie się potęgują, tworząc błędne koło, które nasila zapalenie systemowe, powoduje uszkodzenia śródbłonka i przyczynia się do nieprawidłowości łożyska. Molekularne sieci sterujące apoptozą trofoblastów i odpowiedziami zapalnymi pozostają w dużej mierze nieznane.

SASH1 jest członkiem rodziny wewnątrzkomórkowych białek rusztowaniowych SLy/SASH1, które pełni funkcję adaptora sygnalizacyjnego⁷. SASH1 został przede wszystkim scharakteryzowany jako supresor nowotworowy hamujący przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT), migrację oraz inwazję komórek poprzez oddziaływania z partnerami sygnałowymi, takimi jak CRKL oraz szlak PI3K-Akt-mTOR^8,9. Poza rolami supresyjnymi w nowotworach, pojawiające się dowody sugerują, że SASH1 uczestniczy w sygnalizacji zapalnej i regulacji odpornościowej⁷. Jednakże ekspresja i funkcja SASH1 w łożysku, szczególnie w kontekście biologii trofoblastu i PE, nie zostały dotąd zbadane.

Egzosomy wyłoniły się jako istotne mediatory komórkowe i są coraz częściej badane w kontekście ciąży¹⁰. Egzosomy transportują różnorodne biologicznie czynne ładunki, w tym białka, lipidy i niekodujące RNA, aby modulować funkcje komórek biorcy. Rosnąca liczba dowodów sugeruje, że P-EXOS odgrywają kluczową rolę w regulacji odpornościowej podczas ciąży, a ich aktywność i ładunek są znacząco zmienione w PE, co potencjalnie nasila stan zapalny¹¹. Egzosomy są również powiązane z regulacją stresu oksydacyjnego¹² i angiogenezy¹³, co może wywierać korzystny wpływ na powikłania związane z ciążą. Jednak ich cele molekularne i mechanizmy działania w PE pozostają nie do końca poznane.

Postawiono hipotezę, że białko SASH1 ulega dysregulacji w łożysku w PE i pełni funkcję kluczowego czynnika indukującego apoptozę trofoblastów oraz odpowiedzi zapalne, a P-EXOS mogą wywierać działanie ochronne przeciwko uszkodzeniom trofoblastów poprzez modulację ekspresji SASH1. Aby sprawdzić tę hipotezę, zintegrowano wiele zbiorów danych transkryptomicznych z PE oraz dane z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek z wykorzystaniem uczenia maszynowego opartego na wielu algorytmach w celu zidentyfikowania kluczowych genów kandydackich. Wykorzystując model komórek trofoblastycznych HTR-8/SVneo poddanych hipoksji oraz eksperymenty z interwencją opartą na egzosomach, zbadano funkcjonalną rolę SASH1 w dysfunkcji trofoblastów oraz potencjał terapeutyczny P-EXOS w PE.

Protokół

Oświadczenie etyczne

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Czwartego Szpitala w Shijiazhuang (numer zatwierdzenia 20200031). Przed pobraniem próbek od wszystkich dawców tkanek łożyska uzyskano pisemną świadomą zgodę. Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Pełna lista odczynników, materiałów eksploatacyjnych, sprzętu i oprogramowania użytych w tym protokole znajduje się w Tabeli materiałów.

Gromadzenie danych

Dane RNA-seq pobrano z bazy danych GEO. Zbiory danych obejmowały GSE75010, który zawiera dane o ekspresji genów z 157 łożysk z PE i 173 łożysk bez PE (N = 330). GSE10588 zawiera dane o ekspresji genów z 26 normalnych łożysk i 17 łożysk z ciężkim PE (N = 43). GSE60438 zawiera dane z profilowania transkryptomu decidua basalis od pacjentek z PE oraz z ciąż normotensyjnych (N = 125). Dane transkryptomiczne z pojedynczych komórek pobrano ze zbioru danych GEO GSE183338. Obejmuje on próbki pojedynczych jąder komórkowych z kosmków błonowych/interfejsu matczyno-płodowego w ciążach z PE oraz zdrowych ciążach.

Analiza DEG

W pierwszej kolejności poddano wstępnemu przetwarzaniu i normalizacji zbiory danych GSE75010, GSE10588 oraz GSE60438 dotyczące genów różnicowo wyrażonych (DEG) powiązanych z PE. Następnie, w oparciu o informacje o grupach próbek, przeprowadzono analizę różnicową przy użyciu pakietu R „limma”¹⁴. Wybrano geny o wartości p < 0.05 oraz |log2FC| > 0.5. Wykresy wulkaniczne (volcano plots) dla DEG wygenerowano za pomocą pakietu R ggplot2. Mapy ciepła (heat maps) dla 20 najważniejszych DEG sporządzono przy użyciu pakietu R pheatmap. Następnie wyznaczono część wspólną DEG wybranych z trzech zbiorów danych i skonstruowano sieć oddziaływań białko-białko (PPI) dla genów kandydackich za pomocą platformy online STRING, przyjmując wynik oddziaływania ≥0.15. Z tej sieci PPI zidentyfikowano 20 głównych genów węzłowych (hub genes) na podstawie stopnia ich łączności, rankując je za pomocą oprogramowania Cytoscape. Wyniki sieci PPI zwizualizowano przy użyciu oprogramowania Cytoscape lub platformy STRING.

Analiza wzbogacenia

Analizę wzbogacenia genów przeprowadzono przy użyciu pakietów ClusterProfiler i DOSE w połączeniu ze stroną internetową Metascape. Bazy danych pobrano z GO oraz KEGG. Analizę wzbogacenia wykonano za pomocą funkcji „EnrichGO”. Ścieżki z p < 0,05 uznano za istotnie wzbogacone. Wyniki wzbogacenia zwizualizowano przy użyciu pakietów „ggplot2” i „ggpubr”.

Uczenie maszynowe

Aby zidentyfikować stabilne i biologicznie istotne DEG związane z PE, przeprowadzono analizę selekcji cech z wykorzystaniem wielu modeli uczenia maszynowego w oparciu o publicznie dostępny zbiór danych transkryptomicznych GSE60438 (platforma: GPL6884). Zbiór ten zawiera profile ekspresji próbek decidua basalis pobranych podczas cesarskiego cięcia z ciąż z preeklampsją oraz ciąż normotensyjnych. Wstępnie przefiltrowane DEG zostały znormalizowane, a macierz ekspresji, wraz z odpowiadającymi im informacjami o grupach klinicznych, posłużyła jako dane wejściowe dla czterech różnych algorytmów uczenia maszynowego w celu zredukowania błędu modelu i zwiększenia stabilności selekcji cech.

Cztery algorytmy zastosowano jednocześnie, bez określonej kolejności. Analizę LASSO przeprowadzono przy użyciu pakietu „glmnet” w celu wykonania analizy regresji i wyboru istotnych genów jako cech. Do funkcji straty dodano człon regularyzacji L1, który redukuje współczynniki mniej istotnych cech do zera, umożliwiając tym samym selekcję cech. Metodę SVM-RFE zaimplementowano przy użyciu pakietu „e1071” w celu zbudowania maszyny wektorów wspierających z rekurencyjną eliminacją cech. Najpierw wytrenowano klasyfikator SVM, a następnie iteracyjnie usuwano najmniej informacyjne cechy na podstawie wag cech, co pozwoliło uzyskać optymalny podzbiór cech. Algorytm XGBoost zastosowano przy użyciu pakietu „xgboost” do budowy wielu drzew decyzyjnych. Każde drzewo dopasowywało reszty z poprzedniego drzewa, a ważone wyniki kumulowano w celu uzyskania końcowej predykcji. Algorytm Boruta wykonano przy użyciu pakietu „randomForest”, generując cechy zastępcze (shadow features), które konkurowały z rzeczywistymi cechami podczas trenowania lasu losowego. Zachowano cechy, których wartości istotności były znacząco wyższe niż w przypadku szumu losowego.

Analiza danych transkryptomicznych z pojedynczych komórek

Dane transkryptomiczne z pojedynczych komórek pobrano z bazy danych GEO, a surową macierz zliczeń pobrano z zestawu GSE183338. Macierz zliczeń zaimportowano za pomocą funkcji „Read10X” pakietu Seurat i przekonwertowano do formatu dgCMatrix. Poszczególne obiekty scalono w jeden zagregowany obiekt za pomocą funkcji „merge”, a etykiety komórek uczyniono unikalnymi przy użyciu „RenameCells”. Komórki niskiej jakości odfiltrowano na podstawie następujących kryteriów: usunięto geny wykazujące ekspresję w mniej niż trzech komórkach oraz wykluczono komórki wykazujące ekspresję mniej niż 200 genów. Komórki po kontroli jakości poddano normalizacji i zidentyfikowano geny o wysokiej zmienności. Globalną normalizację skalowania zastosowano przy użyciu „LogNormalize” (scale factor = 10 000), wyselekcjonowano geny o wysokiej zmienności (n = 2 000) za pomocą „FindVariableFeatures”, a dane przeskalowano przy użyciu „ScaleData”. Analizę głównych składowych przeprowadzono dla cech o wysokiej zmienności i zachowano 30 głównych składowych. Efekty serii między próbkami skorygowano metodą Harmony. Komórki wizualizowano i redukowano wymiarowo za pomocą UMAP. Grafy wspólnych najbliższych sąsiadów skonstruowano przy użyciu funkcji „FindNeighbors” i „FindClusters” w oparciu o algorytm Louvain. Parametr rozdzielczości (resolution) w funkcji „FindClusters” zoptymalizowano w zakresie od 0,1 do 1. Drzewo klastrowania zwizualizowano za pomocą funkcji „clustree”, a do zdefiniowania klastrów komórkowych wybrano rozdzielczość 0,9. Potencjalne dublety usunięto za pomocą algorytmu Scrublet. Klastry komórkowe adnotowano poprzez identyfikację różnicowo wyrażonych genów markerowych za pomocą funkcji „FindAllMarkers”. Zastosowano nieparametryczny test suma rang Wilcoxona z korektą Bonferroniego. Tożsamość komórek przypisano na podstawie markerów powierzchniowych, odpowiedniej literatury oraz bazy Cell Classification Database¹⁵.

Kultura komórek

Linia komórek trofoblastu HTR-8/SVneo była hodowana w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny/streptomycyny. Warunki hipoksji uzyskano poprzez hodowlę komórek w atmosferze 1% O₂, 5% CO₂ i 94% N₂ przez 24 h; kontrolę normoksji utrzymywano w atmosferze 20% O₂ i 5% CO₂¹⁶. Wszystkie procedury hodowli komórkowych należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II, stosując techniki aseptyczne. Pożywki hodowlane, odczynniki do transfekcji oraz odpady komórkowe należy utylizować zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.

Transfekcja komórek

Zsyntetyzowano plazmidy zawierające sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 oraz OE-NC. Komórki HTR-8/SVneo wysiano w płytkach 6-dołkowych z zagęszczeniem 5 × 10⁵ komórek na dołek. Następnie komórki przetransfekowano 2 µg plazmidu sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 lub OE-NC na dołek, stosując odczynnik do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie: DNA plazmidowe oraz odczynnik P3000 rozcieńczono w Opti-MEM, zmieszano z Lipofectamine 3000 rozcieńczoną oddzielnie w Opti-MEM, inkubowano przez 15 min w temperaturze pokojowej, a następnie dodano do komórek przy ich 70–80% konfluencji. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji oceniono ekspresję SASH1 za pomocą RT-qPCR i Western blot. Sekwencje docelowe shRNA użyte do wyciszenia SASH1 wymieniono w Supplementary Table 1.

Ilościowa PCR w czasie rzeczywistym

Całkowite RNA wyekstrahowano z komórek HTR-8/SVneo i poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA przy użyciu zestawu do odwrotnej transkrypcji w temperaturze 42 °C przez 30 min, a następnie w 85 °C przez 5 min. Ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) przeprowadzono z użyciem SYBR Green master mix w następujących warunkach cyklicznych: 95 °C przez 10 min, a następnie 40 cykli obejmujących 95 °C przez 15 s oraz 60 °C przez 1 min. Względną ekspresję mRNA obliczono metodą ΔΔCt, przyjmując β-actin jako referencję wewnętrzną. Sekwencje starterów użytych w tym eksperymencie wymieniono w Tabeli uzupełniającej 2.

Analiza Western blot

Całkowite białko wyekstrahowano z komórek HTR-8/SVneo przy użyciu buforu do lizy. Lizaty komórkowe zebrano, inkubowano na lodzie, a następnie wirowano przy 12 000 × g przez 30 min w temperaturze 4 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń. Stężenie białka określono za pomocą spektrofotometru. Równe ilości białka (50 µg) rozdzielono metodą SDS-PAGE, a następnie przeniesiono na membrany PVDF. Membrany zablokowano 5% roztworem mleka odtłuszczonego i inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C. Po przemyciu membrany inkubowano z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi, a prążki białkowe zwizualizowano za pomocą systemu detekcji z wzmocnioną chemiluminescencją.

Do detekcji białek zastosowano przeciwciała pierwotne: anty-SASH1 oraz anty-β-actin. Wykorzystano odpowiednie przeciwciała wtórne sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) – kozie anty-królicze oraz kozie anty-mysie. β-actin posłużyło jako wewnętrzna kontrola ładunku w celu zapewnienia równoważnej ilości naniesionego białka. Intensywność prążków białkowych zmierzono i określono ilościowo przy użyciu oprogramowania ImageJ.

Izolacja P-EXOS

P-EXOS wyizolowano z tkanki kosmków błon płodowych uzyskanej z łożysk donoszonych u zdrowych kobiet poddawanych planowemu cięciu cesarznemu. Tkankę kosmków błon płodowych dokładnie przemyto sterylnym PBS, posiekano na fragmenty o wielkości około 1 mm³ i hodowano w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej o 10% FBS pozbawionego egzosomów w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 48 h. Kondycjonowaną pożywkę poddano wirowaniu różnicowemu w następujący sposób: 300 × g przez 10 min w celu usunięcia komórek i resztek tkankowych; 2,000 × g przez 20 min w celu usunięcia szczątków komórkowych oraz 10,000 × g przez 30 min w celu usunięcia mikropęcherzyków, wszystko w temperaturze 4 °C. Otrzymany nadosad poddano ultrawirowaniu przy 120,000 × g przez 70 min w 4 °C w celu osadzenia egzosomów. Osad przemyto raz PBS i ponownie ultrawirowano przy 120,000 × g przez 70 min w 4 °C. Końcowy osad resuspendowano w PBS. Wyizolowane egzosomy scharakteryzowano za pomocą analizy Western blot w kierunku markerów egzosomów (PLAP, CD63 i TSG101, z GM130 jako kontrolą negatywną), a następnie poddano analizie za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu obserwacji morfologicznej.

Eksperyment pobierania komórkowego P-EXOS

Aby potwierdzić internalizację komórkową P-EXOS, egzosomy znakowano fluorescencyjnie lipofilowym barwnikiem błonowym PKH67 zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, P-EXOS inkubowano z PKH67 (4 µM) w rozcieńczalniku C przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie reakcję zatrzymano poprzez dodanie równiej objętości 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Znakowane egzosomy ponownie wyizolowano metodą ultrawirowania (120,000 × g, 70 min, 4 °C), aby usunąć niezwiązany barwnik. Następnie znakowane PKH67 P-EXOS (50 µg/mL) dodano do komórek HTR-8/SVneo i współinkubowano przez 24 h w warunkach normoksji lub hipoksji (1% O₂). Komórki przemyto następnie trzy razy PBS, utrwalono 4% paraformaldehydem przez 15 min, a jądra komórkowe przeciwbarwiono DAPI (1 µg/mL). Internalizację egzosomów znakowanych PKH67 zwizualizowano za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej (CLSM; wzbudzenie 490 nm, emisja 502 nm). W eksperymentach z funkcjonalną ko-kulturą komórki HTR-8/SVneo traktowano P-EXOS w stężeniu 50 µg/mL (ekwiwalent białka) w pełnej pożywce RPMI-1640 uzupełnionej o 10% FBS pozbawionego egzosomów w warunkach hipoksji (1% O₂) przez 24 h.

Test immunoenzymatyczny (ELISA)

Zebrano nadsącz z hodowli komórkowych, a poziomy IL-6, IL-1β i TNF-α zmierzono odpowiednio za pomocą zestawów ELISA do IL-6, IL-1β i TNF-α, zgodnie z instrukcjami producentów. Absorbancję przy 450 nm zmierzono za pomocą czytnika mikroplatek, a rzeczywiste stężenia obliczono na podstawie krzywych wzorcowych.

Metoda TUNEL (znakowanie końców nacięć dUTP za pomocą TdT)

Komórki apoptotyczne wykryto przy użyciu zestawu do testu TUNEL zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, komórki utrwalono 4% paraformaldehydem przez 15 min w temperaturze pokojowej, permeabilizowano 0,1% Triton X-100 w PBS przez 5 min na lodzie, a następnie inkubowano z mieszaniną reakcyjną TUNEL przez 60 min w 37 °C w ciemności. Jądra komórkowe przeciwbarwiono DAPI, a komórki TUNEL-dodatnie zwizualizowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i poddano kwantyfikacji poprzez obliczenie procentu komórek TUNEL-dodatnich w co najmniej pięciu losowo wybranych polach dla każdej próbki.

Analiza statystyczna

Wszystkie dane analizowano przy użyciu programów R oraz GraphPad Prism. Zmienne ciągłe przedstawiono jako średnia ±SD. Porównania dwóch grup przeprowadzono za pomocą testu t-Studenta, natomiast porównania wielu grup wykonano przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z następującym po niej testem post hoc Tukeya. Istotność statystyczną dla zmiennych kategorycznych oceniano za pomocą testu chi-kwadrat lub dokładnego testu Fishera. O ile nie wskazano inaczej, korelacje między cząsteczkami obliczono za pomocą analizy korelacji Spearmana. Eksperymenty dotyczące charakterystyki egzosomów przeprowadzono z użyciem P-EXOS wyizolowanych od trzech niezależnych dawców łożyska. Eksperymenty na liniach komórkowych przeprowadzono w trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych, reprezentujących niezależne doświadczenia wykonane w różnych terminach z użyciem komórek HTR-8/SVneo o różnych pasażach, przy czym w każdym powtórzeniu zastosowano P-EXOS wyizolowane od innego dawcy łożyska. Za istotną statystycznie uznano wartość p < 0,05.

Wyniki

Analiza transkrypcyjna pacjentów zdrowych i z PE

W celu określenia różnic w ekspresji genów pomiędzy grupą kontrolną (Normal) a pacjentkami z PE, przeanalizowano różnicową ekspresję w połączonych zbiorach danych przy użyciu pakietu R limma. Zidentyfikowano łącznie 89 genów różnicowo eksponowanych (DEG) (p < 0,05 i |log₂FC| > 0,5), w tym 69 genów o zwiększonej ekspresji i 20 genów o zmniejszonej ekspresji dla zbioru GSE75010 (Rycina 1A). Odnotowano 2 097 genów różnicowo eksponowanych, z czego 1 121 wykazało zwiększoną ekspresję, a 976 zmniejszoną ekspresję (Rycina 1B). Dla zbioru GSE60438 stwierdzono 7 633 DEG, w tym 3 371 genów o zwiększonej ekspresji i 4 262 genów o zmniejszonej ekspresji (Rycina 1C). Znaczne różnice w liczbie DEG pomiędzy trzema zbiorami danych prawdopodobnie odzwierciedlają różnice w wielkości próby, pochodzeniu tkanek (kosmki łożyska vs. decidua basalis) oraz klasyfikacji stopnia ciężkości PE, co dodatkowo podkreśla wartość wyznaczania części wspólnej dla tych zbiorów w celu identyfikacji stabilnych, wspólnych DEG.

Analiza wzbogacenia funkcjonalnego DEG

W celu systematycznej identyfikacji kluczowych DEG powiązanych z PE przeprowadzono analizę zbiorów Venn dla DEG z zestawów danych PE GSE75010, GSE10588 i GSE60438, co pozwoliło ostatecznie zidentyfikować 56 wspólnych DEG (Rysunek 2A). Dla tych 56 wspólnych DEG skonstruowano sieć PPI przy użyciu platformy online STRING (wynik interakcji ≥0,15), a następnie zidentyfikowano 20 najważniejszych genów hubowych na podstawie stopnia ich łączności w sieci, dokonując rankingu za pomocą oprogramowania Cytoscape (Rysunek 2B). Na podstawie tych genów przeprowadzono również analizę wzbogacenia GO, aby zbadać potencjalne funkcje w kategoriach BP, CC i MF (Rysunek 2C). DEG wykazano najprawdopodobniej jako wzbogacone w zakresie wydzielania hormonów oraz regulacji sygnalizacji seryno-treoninowej kinazy receptora transbłonowego. Pod kątem komórkowym geny te lokalizowały się głównie w adhezjach ogniskowych, złączach komórka-podłoże oraz w różnorodnych genach związanych z pęcherzykami i lizosomami. W ramach funkcji molekularnych wzbogacone terminy obejmowały aktywność prolylowej hydroksylazy, aktywność hormonalną oraz transport transbłonowy cząsteczek związanych z lipidami. Wyniki te sugerują, że DEG mogą odgrywać istotną rolę w sygnalizacji komórek łożyska, interakcjach komórka-macierz oraz utrzymaniu funkcji związanych z układem endokrynnym. Jednocześnie stwierdzono, że analiza wzbogacenia ścieżek KEGG wskazała na najwyższe prawdopodobieństwo wzbogacenia DEG w interakcjach cytokina–receptor cytokinowy, interakcjach cząsteczek adhezyjnych komórek oraz w ścieżkach sygnalizacyjnych TGF-β i HIF-1 (Rysunek 2D). Wzbogacenie niektórych terminów związanych z wirusami (np. wirusy zapalenia wątroby, Ebolavirus) prawdopodobnie odzwierciedla niespecyficzne nakładanie się na wspólne geny regulujące odporność, a nie bezpośredni związek biologiczny z PE; zatem nacisk interpretacyjny pozostaje na ścieżkach związanych ze stanami zapalnymi, adhezją i hipoksją. Ścieżki te są powiązane z odpowiedzią zapalną, sygnalizacją pośredniczoną przez adhezję komórkową oraz sygnalizacją zależną od hipoksji i mogą wpływać na progresję PE poprzez zmianę stanu immunozapalnego oraz komunikacji międzykomórkowej w mikrośrodowisku łożyska.

Uczenie maszynowe identyfikuje SASH1 jako kluczowy gen w PE

W celu zidentyfikowania kluczowych genów prognostycznych zastosowano cztery metody uczenia maszynowego do selekcji cech. Regresja LASSO z walidacją krzyżową wykazała, że model osiągnął minimalny błąd walidacji krzyżowej dla log(λ.min) = -3.8075. Geny o niezerowych współczynnikach dla tej wartości λ zostały wybrane jako kluczowe cechy zidentyfikowane przez LASSO (Rysunek 3A–B). Algorytm Boruta ocenia istotność cech poprzez porównanie ich z cechami cieniowymi (shadow features). Geny o wartościach istotności wyższych niż shadowMax zostały oznaczone jako Potwierdzone (Confirmed) i uznane za kluczowe geny kandydackie, natomiast te o wartościach istotności niższych niż shadowMin zostały oznaczone jako Odrzucone (Rejected) i uznane za nieposiadające istotnego wkładu. Geny znajdujące się pomiędzy tymi dwoma progami zostały oznaczone jako Tymczasowe (Tentative), co wskazuje na potencjalną, ale niepewną istotność (Rysunek 3C). Analiza SVM-RFE wykazała, że przy zachowaniu 40–50 cech dokładność walidacji krzyżowej osiągnęła najwyższy lub bliski najwyższemu poziom, co sugeruje optymalną wydajność predykcyjną przy tej skali cech (Rysunek 3D). Umiarkowana dokładność walidacji krzyżowej (~0.6) wskazuje, że żaden pojedynczy algorytm nie działał optymalnie dla tego zbioru danych; dlatego przyjęto strategię przecięcia wyników z wielu algorytmów w celu zwiększenia odporności selekcji cech. Algorytm XGBoost określił względną istotność genów przy użyciu wartości Gain, identyfikując tym samym cechy o większym wkładzie w predykcję modelu (Rysunek 3E). Analiza przecięcia zbiorów (diagram Venna) wyników z czterech metod wykazała, że SASH1 był jedynym wspólnym genem. Chociaż SASH1 został zaklasyfikowany jako Tymczasowy przez algorytm Boruta, jego spójna selekcja we wszystkich trzech pozostałych algorytmach potwierdza jego wyznaczenie jako konsensusowego genu kandydackiego (Rysunek 3F).

Analiza pojedynczych komórek

Zbadano heterogeniczność komórkową i procesy molekularne w tkankach łożyska przy PE. Komórki poddano filtrowaniu jakościowemu na podstawie liczby wykrytych genów, liczby zliczeń RNA oraz procentowego udziału ekspresji genów mitochondrialnych. Komórki niskiej jakości (mniej niż 200 wykrytych genów lub ponad 20% zawartości genów mitochondrialnych) usunięto w celu uzyskania wysokiej jakości próbki pojedynczych komórek do dalszych analiz. Metryki kontroli jakości oraz identyfikacja genów o wysokiej zmienności przedstawione są na Rysunku uzupełniającym 1A–B. Po normalizacji i identyfikacji genów o wysokiej zmienności przeprowadzono analizę głównych składowych (PCA), wykorzystując 2000 najbardziej zmiennych genów oraz istotne składowe główne wyłonione za pomocą analizy JackStraw i analizy ElbowPlot (Rysunek uzupełniający 2A–B).

W oparciu o składowe główne zastosowano jednorodną aproksymację i projekcję rozmaitości (UMAP) w celu redukcji wymiarowości oraz przeprowadzenia klastrowania nienadzorowanego, w wyniku którego wszystkie komórki zostały zaklasyfikowane do 22 klastrów, co uwidoczniło wysoką heterogeniczność komórkową w tkance łożyska (Rysunek 4A). Poprzez analizę ekspresji markerowych genów specyficznych dla klastrów oraz wizualizację DEG na mapie ciepła (Rysunek 4B), każdy klaster został adnotowany na podstawie kanonicznego markera i ponownie rzutowany na osadzenie UMAP (Rysunek 4C). Na podstawie tych analiz zidentyfikowano główne populacje komórek łożyska, w tym limfocyty B/komórki plazmatyczne, komórki śródbłonka, fibroblasty/komórki stromalne, makrofagi/komórki dendrytyczne, komórki NK oraz limfocyty T i komórki trofoblastyczne. Porównania między grupą kontrolną a grupą PE wykazują, że kilka typów komórek wykazuje znaczną względną dystrybucję w łożyskach z PE, co sugeruje przebudowę mikrośrodowiska łożyska (Rysunek 4D).

Pochodzenie tkanki oraz stan chorobowy posłużyły do śledzenia komórek w tej samej projekcji UMAP w zależności od źródła tkanki (decydua vs. kosmki) i grupy chorobowej (kontrola vs. PE) (Rycina 4E). Rozkład liczby komórek był częściowo rozdzielony według pochodzenia tkanki, podczas gdy komórki z różnych grup chorobowych były silnie powiązane. Sugeruje to, że PE nie powoduje istotnej reorganizacji całej struktury transkrypcyjnej, lecz może wpływać na poszczególne populacje komórek lub konkretne cechy molekularne. Ekspresja SASH1 została naniesiona na UMAP, aby zbadać jej rozkład wśród populacji komórek łożyska (Rycina 4F–G). SASH1 wykazuje silną, specyficzną dla typu komórek ekspresję, z wyraźnymi różnicami między populacjami komórek decydualnych a kosmkowymi. Porównanie statystyczne ekspresji SASH1 między grupami PE a kontrolną w różnych typach komórek (test sum rang Wilcoxona) wykazało istotne różnice w wielu populacjach komórek łożyska, przy czym najsilniejszy wzrost zaobserwowano w komórkach trofoblastu z próbek PE (Rycina 4H). Wynik ten dostarcza dowodów na poziomie pojedynczych komórek, że dysregulacja SASH1 jest szczególnie wyraźna w przedziale trofoblastycznym, co uzasadnia wykorzystanie linii komórkowej trofoblastu HTR-8/SVneo do późniejszych eksperymentów funkcjonalnych.

Wyciszenie SASH1 hamuje indukowaną hipoksją apoptozę trofoblastów i odpowiedzi zapalne

Aby zweryfikować przewidywania bioinformatyczne, w warunkach hipoksji (1% O₂) opracowano model komórek trofoblastycznych związanych z PE. Przeprowadzono analizy qPCR i Western blot w celu oceny ekspresji SASH1 (Rysunek 5A–B). W porównaniu z komórkami HTR-8/SVneo w warunkach normoksji, komórki poddane hipoksji wykazały znacząco zwiększone poziomy ekspresji mRNA i białka SASH1, co dostarczyło wstępnej eksperymentalnej walidacji wyników bioinformatycznych. Aby ocenić wpływ wyciszenia SASH1 na procesy patologiczne związane z PE, w komórkach HTR-8/SVneo poddanych hipoksji wyciszono SASH1. Analizy ilościwego PCR i Western blot (Rysunek 5C–D) wykazały, że ekspresja SASH1 była znacząco zredukowana we wszystkich grupach sh-SASH1 w porównaniu z grupą sh-NC. Spośród nich sh-SASH1#3 wykazywał najwyższą wydajność wyciszenia i został zatem wybrany do kolejnych eksperymentów. Barwienie TUNEL oraz analizę ELISA przeprowadzono w trzech warunkach: kontroli normoksycznej (Normal), hipoksji z negatywnym kontrolnym shRNA (Hypoxia + sh-NC) oraz hipoksji z wyciszeniem SASH1 (Hypoxia + sh-SASH1). W porównaniu z grupą Normal, grupa Hypoxia + sh-NC wykazała znacząco zwiększoną apoptozę oraz podwyższoną sekrecję cytokin prozapalnych IL-1β, IL-6 i TNF-α, co potwierdziło uszkodzenie trofoblastów indukowane hipoksją. Wyciszenie SASH1 wyraźnie złagodziło te efekty, redukując apoptozę (Rysunek 5E) i poziomy cytokin (Rysunek 5F) do wartości zbliżonych do grupy Normal, co sugeruje, że wyciszenie SASH1 może w dużej mierze odwrócić indukowaną hipoksją apoptozę trofoblastów i odpowiedzi zapalne. Aby dalej ustalić przyczynową rolę SASH1, przeprowadzono eksperymenty z funkcją zwiększoną (gain-of-function). Analizy qPCR i Western blot potwierdziły pomyślną nadekspresję SASH1 w komórkach HTR-8/SVneo (Rysunek 5G–H). W warunkach normoksji nadekspresja SASH1 (OE-SASH1) znacząco zwiększyła apoptozę trofoblastów i sekrecję cytokin prozapalnych w porównaniu z grupą OE-NC, odtwarzając fenotyp indukowany hipoksją (Rysunek 5I–J). Podsumowując, dane z eksperymentów utraty i zwiększenia funkcji dowodzą, że SASH1 jest zarówno niezbędny, jak i wystarczający do wywołania apoptozy trofoblastów i odpowiedzi zapalnych, co potwierdza jego przyczynową rolę w patologii związanej z PE.

P-EXOS hamuje indukowaną hipoksją apoptozę trofoblastów oraz reakcje zapalne poprzez modulację SASH1

Przyjmuje się, że P-EXOS mają potencjaльную wartość terapeutyczną w PE. W niniejszym badaniu analiza bioinformatyczna wykazała, że SASH1 wiąże się ze szlakami sygnalizacyjnymi zależnymi od egzosomów (co wskazują analizy wzbogacenia GO i KEGG, Rysunek 2C–D), co doprowadziło nas do postawienia hipotezy, że P-EXOS mogą wywierać działanie ochronne w PE poprzez regulację SASH1. Przed badaniami funkcjonalnymi przeprowadzono charakterystykę wyizolowanych P-EXOS. Analiza Western blot potwierdziła obecność białek markerowych egzosomów PLAP, CD63 i TSG101, przy braku wykrywalnej ekspresji markera aparatu Golgiego GM130, co świadczy o wysokiej czystości wyizolowanych pęcherzyków. Transmisyjna mikroskopia elektronowa wykazała ponadto typowe pęcherzykowe struktury w kształcie czary (Rysunek 6A–B). Aby zweryfikować, czy P-EXOS mogą być efektywnie internalizowane przez komórki docelowe, wykonano barwienie immunofluorescencyjne w celu oceny wchłaniania komórkowego P-EXOS. W porównaniu z grupą kontrolną, komórki HTR-8/SVneo traktowane P-EXOS wykazywały wyraźne sygnały ko-lokalizacji na obrazach scalonych, co wskazuje, że P-EXOS zostały skutecznie zinternalizowane przez komórki HTR-8/SVneo (Rysunek 6C).

Następnie komórki HTR-8/SVneo współhodowano z P-EXOS w warunkach hipoksji. Zarówno analiza qPCR, jak i Western blot wykazały wyraźny spadek poziomów mRNA i białka SASH1 w grupie traktowanej P-EXOS w porównaniu z grupami kontrolnymi (Rysunek 6D–E), co dostarczyło wstępnych dowodów na istnienie interakcji regulacyjnej między P-EXOS a SASH1. Zgodnie z tymi zmianami molekularnymi, barwienie TUNEL wykazało znaczne osłabienie indukowanej hipoksją apoptozy w komórkach HTR-8/SVneo po zastosowaniu P-EXOS (Rysunek 6F). Jednocześnie testy ELISA wykazały wyraźnie zmniejszone wydzielanie cytokin prozapalnych, w tym IL-6, IL-1β i TNF-α (Rysunek 6G).

Aby ustalić, czy efekty ochronne P-EXOS są mechanistycznie zależne od supresji SASH1, przeprowadzono eksperyment ratunkowy (rescue experiment) w warunkach hipoksji. Komórki z nadekspresją SASH1 (OE-SASH1 + P-EXOS) porównano z komórkami kontrolnymi negatywnymi (OE-NC + P-EXOS). Nadekspresja SASH1 znacząco zniosła efekty ochronne P-EXOS, o czym świadczył wzrost apoptozy (Ryc. 6H) oraz zwiększone wydzielanie cytokin prozapalnych (Ryc. 6I) w porównaniu z grupą OE-NC + P-EXOS. Wyniki te wykazują, że efekt ochronny P-EXOS jest przekazywany specyficznie poprzez supresję SASH1, a nie za pośrednictwem równoległych szlaków, co podkreśla potencjał terapeutyczny P-EXOS w PE.

DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:

Zbiory danych wspierające wyniki niniejszego badania są publicznie dostępne i zostały pobrane z bazy danych Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), z numerami dostępu GSE75010, GSE10588, GSE60438 oraz GSE183338. Adnotacja typów komórek została przeprowadzona w odniesieniu do bazy Cell Classification Database (https://ngdc.cncb.ac.cn/celltaxonomy/). Nieprzycięte obrazy Western blot oraz wszystkie inne surowe dane eksperymentalne wspierające wyniki niniejszego badania znajdują się w folderze Supplementary Raw Data.

Rycina 1: Identyfikacja genów różnicowo wyrażonych (DEG) w tkankach łożyska i błony decydującej w PE w trzech niezależnych zbiorach danych. (A) Wykres wulkaniczny (volcano plot) DEG pomiędzy 157 próbkami łożyska z PE a 173 próbkami łożyska bez PE z połączonego zbioru danych GSE75010. (B) Wykres wulkaniczny DEG pomiędzy próbkami łożyska z ciężką postacią PE (n = 17) a normalnymi próbkami łożyska (n = 26) ze zbioru danych GSE10588. (C) Wykres wulkaniczny DEG pomiędzy próbkami błony decydującej w PE a próbkami kontrolnymi błony decydującej przy normotensji ze zbioru danych GSE60438. DEG zidentyfikowano przy użyciu p < 0,05 oraz |log₂FC| > 0,5. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Rycina 2: Analiza wzbogacenia funkcjonalnego i PPI wspólnych DEG powiązanych z przedewklampsją. (A) Diagram Venna DEG zidentyfikowanych w zbiorach danych związanych z PE: GSE75010, GSE10588 oraz GSE60438. (B) Sieć PPI dla 20 najważniejszych genów hub wybranych spośród 56 wspólnych DEG na podstawie stopnia łączności, uszeregowanych przy użyciu oprogramowania Cytoscape (wynik interakcji STRING ≥0,15). (C) Analizy wzbogacenia GO i KEGG wspólnych DEG przedstawione jako wykresy słupkowe. (D) Analizy wzbogacenia GO i KEGG wspólnych DEG przedstawione jako diagramy chordowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 3: Przesiewowe badanie kandydackich genów hub związanych z przedrzucawką z wykorzystaniem uczenia maszynowego. (A) Analiza regresji LASSO przedstawiająca profile współczynników genów kandydackich. (B) Wybór optymalnego parametru regularyzacji (λ) w regresji LASSO z zastosowaniem walidacji krzyżowej. (C) Algorytm Boruta. (D) Analiza SVM-RFE. (E) Algorytm XGBoost. (F) Diagram Venna przedstawiający część wspólną genów kandydackich zidentyfikowanych przez algorytmy LASSO, Boruta, SVM-RFE i XGBoost. Skróty: LASSO = least absolute shrinkage and selection operator; SVM-RFE = support vector machine recursive feature elimination. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4: Analiza transkryptomiczna pojedynczych komórek ujawnia specyficzne dla typów komórek wzorce ekspresji SASH1 w preeklampsji. (A) Klasteryzacja UMAP zbioru danych pojedynczych komórek. (B) Analiza adnotacji pięciu głównych markerów zbioru danych transkryptomu pojedynczych komórek PE GSE183338. (C) Adnotacja subpopulacji komórek. (D) Wykres słupkowy przedstawiający rozkład proporcji komórek w próbkach kontrolnych i z PE. (E) Wykres UMAP z kolorowaniem według pochodzenia tkanki (decydua i kosmki) oraz stanu choroby (kontrola i PE). (F) Wykres UMAP pokazujący ekspresję SASH1 w populacjach komórek łożyska pogrupowanych według pochodzenia tkanki (decydua i kosmki). (G) Wykres UMAP pokazujący ekspresję SASH1 w populacjach komórek łożyska pogrupowanych według stanu choroby (kontrola i PE). (H) Wykres skrzypcowy (violin plot) przedstawiający rozkład ekspresji SASH1 w różnych typach komórek łożyska. ns p > 0.05; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. Skróty: UMAP = uniform manifold approximation and projection; ns = nieistotne statystycznie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 5: SASH1 reguluje indukowaną hipoksją apoptozę i stan zapalny trofoblastów. (A) Analiza qPCR ekspresji mRNA SASH1 oraz densytometryczna kwantyfikacja poziomów białka SASH1 w komórkach HTR-8/SVneo w warunkach normalnych i hipoksji. (B) Reprezentatywne obrazy Western blot odpowiadające danym densytometrycznym przedstawionym w (A). (C) Analiza qPCR ekspresji mRNA SASH1 oraz densytometryczna kwantyfikacja poziomów białka SASH1 w komórkach HTR-8/SVneo poddanych działaniu hipoksji i przetransfekowanych konstruktami sh-NC lub sh-SASH1 (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 i sh-SASH1#3). (D) Reprezentatywne obrazy Western blot odpowiadające danym densytometrycznym przedstawionym w (C). (E) Barwienie TUNEL komórek HTR-8/SVneo w grupach Normal, Hypoxia + sh-NC oraz Hypoxia + sh-SASH1(#3). Pasek skali = 20 µm. (F) Analiza ELISA cytokin zapalnych (IL-1β, IL-6 i TNF-α) w grupach Normal, Hypoxia + sh-NC oraz Hypoxia + sh-SASH1(#3). (G) Analiza qPCR ekspresji mRNA SASH1 oraz densytometryczna kwantyfikacja poziomów białka SASH1 w komórkach HTR-8/SVneo przetransfekowanych konstruktami OE-NC lub OE-SASH1. (H) Reprezentatywne obrazy Western blot odpowiadające danym densytometrycznym przedstawionym w (G). (I) Barwienie TUNEL komórek HTR-8/SVneo w grupach Normal + OE-NC oraz Normal + OE-SASH1. Pasek skali = 20 µm. (J) Analiza ELISA cytokin zapalnych (IL-1β, IL-6 i TNF-α) w grupach Normal + OE-NC oraz Normal + OE-SASH1. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. Dane przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych powtórzeń biologicznych (n = 3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 6: P-EXOS łagodzi indukowane hipoksją uszkodzenia trofoblastów poprzez supresję SASH1. (A) Analiza Western blot białek markerowych P-EXOS: PLAP, CD63 i TSG101, przy czym GM130 służy jako kontrola negatywna. (B) Analiza morfologii P-EXOS za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Pasek skali = 1,0 µm. (C) Obrazy z konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego przedstawiające pobieranie P-EXOS znakowanych PKH67 (zielony) przez komórki HTR-8/SVneo (czerwony). Jądra barwiono DAPI (niebieski). Pasek skali = 20 µm. (D) Analiza qPCR ekspresji mRNA SASH1 oraz kwantyfikacja densytometryczna poziomów białka SASH1 w komórkach HTR-8/SVneo w grupach kontrolnej i P-EXOS. (E) Reprezentatywne obrazy Western blot odpowiadające danym densytometrycznym przedstawionym w (D). (F) Barwienie TUNEL komórek HTR-8/SVneo w grupach kontrolnej i P-EXOS. Pasek skali = 20 µm. (G) Analiza ELISA cytokin zapalnych (IL-1β, IL-6 i TNF-α) w komórkach HTR-8/SVneo poddanych hipoksji w grupach kontrolnej i P-EXOS. (H) Barwienie TUNEL komórek HTR-8/SVneo w grupach OE-NC + P-EXOS oraz OE-SASH1 + P-EXOS. Pasek skali = 20 µm. (I) Analiza ELISA cytokin zapalnych (IL-1β, IL-6 i TNF-α) w komórkach HTR-8/SVneo poddanych hipoksji w grupach OE-NC + P-EXOS oraz OE-SASH1 + P-EXOS. Skróty: P-EXOS = egzosomy pochodzące z łożyska; TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa; PLAP = łożyskową fosfataza alkaliczna; TSG101 = tumor susceptibility gene 101. *p < 0,05; **p < 0,01. Dane przedstawiono jako średnia ±SD z trzech niezależnych powtórzeń biologicznych (n = 3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Kontrola jakości danych single-cell RNA-seq. (A) Wykres skrzypcowy poziomów ekspresji genów po kontroli jakości. (B) Wykres cech zmiennych przedstawiający geny o wysokiej zmienności zidentyfikowane po kontroli jakości.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Wyznaczenie statystycznie istotnych głównych składowych dla klastrowania pojedynczych komórek. (A) Wykres kropkowy JackStraw służący do identyfikacji statystycznie istotnych głównych składowych. (B) Wykres łokciowy pokazujący wariancję wyjaśnioną przez główne składowe.Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Sekwencje docelowe shRNA użyte do wyciszenia SASH1.Sekwencje docelowe shRNA (5′–3′) dla kontroli negatywnej (sh-NC) oraz trzech konstruktów celujących w SASH1 (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 i sh-SASH1#3) wykorzystanych do wyciszania genów.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Sekwencje starterów użytych do ilościowego PCR.Sekwencje starterów forward i reverse (5′–3′) dla SASH1 oraz β-actin (wewnętrzna kontrola referencyjna) wykorzystane w analizie qPCR.Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W niniejszym badaniu, dzięki zintegrowanej analizie transkrypcyjnej, sekwencjonowaniu pojedynczych komórek oraz zastosowaniu uczenia maszynowego z wykorzystaniem wielu algorytmów, zidentyfikowano SASH1 jako kluczowy gen ulegający dysregulacji w PE, co jest szczególnie istotne w obliczu braku dostępnych terapii celowanych w PE¹⁷. Wykazano, że poziom SASH1 jest znacząco podwyższony w hipoksyjnych komórkach trofoblastów oraz specyficznie zwiększony w przedziale trofoblastycznym łożysk z PE w rozdzielczości pojedynczych komórek. Poprzez eksperymenty z utratą i nabyciem funkcji ustalono, że SASH1 jest zarówno konieczny, jak i wystarczający do indukowania apoptozy trofoblastów oraz sekrecji cytokin prozapalnych. Ponadto leczenie P-EXOS złagodziło indukowane hipoksją uszkodzenie trofoblastów, a efekt ochronny ten został zniesiony przez nadekspresję SASH1, co potwierdza, że cytoprotekcja pośredniczona przez P-EXOS jest mechanistycznie zależna od supresji SASH1.

Ponadto w PE zaobserwowano zmiany w proporcjach wielu typów komórek łożyska, w tym limfocytów B/komórek plazmatycznych, komórek śródbłonka, fibroblastów/komórek zrębowych, makrofagów/komórek dendrytycznych, komórek NK, limfocytów T oraz komórek trofoblastu. Wyniki te sugerują, że mikrośrodowisko łożyska ulega znacznemu przebudowaniu podczas PE. Takie zapalne mikrośrodowisko nie tylko zaostrza dysfunkcję trofoblastu, ale może również przyspieszać progresję choroby poprzez interakcje między układem odpornościowym a macierzą zewnątrzkomórkową¹⁸. Co więcej, zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) zostały ostatnio powiązane z nasileniem stanu zapalnego łożyska w PE¹⁹. Przypuszcza się, że SASH1 odgrywa istotną rolę w rozwoju PE poprzez swój udział w sygnalizacji zapalnej, adhezji komórkowej i procesach związanych z hipoksją. W niniejszym badaniu profile ekspresji genów wyekstrahowano z próbek łożyska pacjentek z PE oraz z ciąż normotensyjnych przy użyciu pakietu limma, a do selekcji cech zastosowano wiele algorytmów uczenia maszynowego: regresję LASSO, SVM-RFE, XGBoost oraz Boruta. We wszystkich algorytmach SASH1 konsekwentnie wyłaniał się jako konsensusowy gen kandydacki. Na poziomie pojedynczych komórek SASH1 wykazał ekspresję specyficzną dla typu komórek w różnych populacjach komórek łożyska i utrzymywał podwyższoną ekspresję w próbkach PE, przy czym najbardziej wyraźną różnicę zaobserwowano w komórkach trofoblastu, co sugeruje, że może on wywierać odmienne efekty funkcjonalne w różnych kontekstach komórkowych łożyska.

SASH1 jest białkiem adaptorowym sygnałowym, o którym doniesiono, że bierze udział w różnych procesach biologicznych, w tym w migracji i inwazji komórek, przejściu nabłonkowo-mezenchymalnym oraz regulacji sygnalizacji odpowiedzi na stres^8,9. Aby zbadać funkcjonalną rolę SASH1 w patologii związanej z PE, opracowano model trofoblastu indukowanego hipoksją z wykorzystaniem komórek HTR-8/SVneo. Nasze wyniki wykazały, że ekspozycja na hipoksję znacząco zwiększyła ekspresję SASH1, podczas gdy wyciszenie SASH1 wyraźnie złagodziło indukowaną hipoksją apoptozę i zmniejszyło wydzielanie cytokin prozapalnych, w tym IL-1β, IL-6 oraz TNF-α. Odwrotnie, nadekspresja SASH1 w warunkach normoksji była wystarczająca do odtworzenia fenotypu indukowanego hipoksją, co potwierdza przyczynną rolę SASH1 w napędzaniu uszkodzeń trofoblastu. Wyniki te sugerują, że SASH1 może negatywnie regulować stan funkcjonalny trofoblastu poprzez modulowanie odpowiedzi zapalnych. Biorąc pod uwagę, że trofoblasty stanowią główne źródło zapalnych mediatorów łożyska²⁰, zaburzona ekspresja SASH1 może stanowić kluczową podstawę molekularną dla amplifikacji stanu zapalnego w PE. Co istotne, proapoptotyczne i prozapalne funkcje SASH1 zaobserwowane w komórkach trofoblastu kontrastują z jego kanoniczną rolą supresora nowotworowego w komórkach rakowych, gdzie zazwyczaj hamuje on EMT i migrację^8,9. Ta zależna od kontekstu dwoistość funkcjonalna może odzwierciedlać specyficzne dla typu komórek różnice w partnerach oddziałujących z SASH1 oraz w wewnątrzkomórkowych sieciach sygnałowych i wymaga dalszych badań.

Egzosomy są uznawane za istotne mediatory komunikacji międzykomórkowej i są powiązane z patogenezą PE²¹. W szczególności P-EXOS mogą odgrywać ważną rolę w regulacji odporności podczas prawidłowej ciąży, na przykład w utrzymywaniu macierzyczno-płodowej tolerancji immunologicznej, co może zapewniać ochronę przed PE²². W niniejszym badaniu analiza bioinformatyczna wykazała powiązanie między SASH1 a szlakami sygnalizacyjnymi związanymi z egzosomami, co skłoniło do dalszych badań nad rolą P-EXOS w regulacji funkcji trofoblastów. Eksperymenty z kokulturą wykazały, że traktowanie P-EXOS znacząco obniżyło poziomy mRNA i białka SASH1 w komórkach trofoblastów poddanych hipoksji oraz wyraźnie złagodziło indukowaną hipoksją apoptozę i odpowiedzi zapalne. Co istotne, nadekspresja SASH1 zniosła te efekty ochronne, potwierdzając, że cytoprotekcja zapośredniczona przez P-EXOS jest mechanistycznie zależna od supresji SASH1, a nie działa poprzez równoległe szlaki.

Mechanizmy molekularne, dzięki którym P-EXOS hamuje ekspresję SASH1, pozostają do wyjaśnienia. Znane jest, że P-EXOS przenoszą różnorodne bioaktywne ładunki, w tym mikroRNA, białka i lipidy, które mogą modulować ekspresję genów w komórkach biorcy¹⁰. Jedną z możliwości jest dostarczanie przez P-EXOS specyficznych miRNA, które bezpośrednio lub pośrednio celują w SASH1. Alternatywnie, P-EXOS mogą modulować szlaki sygnalizacyjne wyższego rzędu — takie jak NF-κB lub PI3K-Akt — które zbiegają się w regulacji transkrypcyjnej SASH1. Biorąc pod uwagę, że SASH1 jest zaangażowany w szlak PI3K-Akt-mTOR w komórkach nowotworowych⁸, prawdopodobne jest, że zapośredniczowana przez egzosomy modulacja tej osi może przyczyniać się do obniżenia poziomu SASH1 w komórkach trofoblastów. Przyszłe badania wykorzystujące sekwencjonowanie ładunku egzosomalnego oraz inhibitory specyficzne dla danych szlaków będą niezbędne do przeanalizowania dokładnej kaskady molekularnej, poprzez którą P-EXOS reguluje ekspresję SASH1.

W niniejszym badaniu profilowanie transkrypcyjne zintegrowano z sekwencjonowaniem RNA pojedynczych komórek, aby zbadać zmiany molekularne w tkance łożyskowej w PE. Wykazano, że SASH1 odgrywa kluczową rolę w indukowanej hipoksją apoptozie trofoblastów i odpowiedziach zapalnych, a P-EXOS mogą wywierać działanie ochronne poprzez hamowanie ekspresji SASH1, co dostarcza nowych informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw PE i sugeruje potencjalną strategię terapeutyczną. Badanie to ma jednak kilka ograniczeń. Po pierwsze, wyniki funkcjonalne uzyskano głównie z unieśmiertelnionej linii komórkowej trofoblastów HTR-8/SVneo; konieczna jest walidacja w pierwotnych komórkach trofoblastycznych. Po drugie, ekspresja białka SASH1 nie została zwalidowana w klinicznych próbkach łożysk PE za pomocą immunohistochemii, co ogranicza interpretację translacyjną wyników i powinno zostać uwzględnione w przyszłych badaniach. Po trzecie, klasyfikator SVM-RFE wykazał umiarkowaną dokładność walidacji krzyżowej (~0,6), co odzwierciedla wrodzoną heterogeniczność zestawu danych; do opracowania bardziej stabilnych modeli diagnostycznych będą wymagane większe niezależne kohorty. Po czwarte, dokładny mechanizm molekularny, za pomocą którego P-EXOS hamuje ekspresję SASH1, pozostaje niejasny. Po piąte, w detekcji SASH1 metodą Western blot zaobserwowano nieswoiste prążki barwienia, co może wynikać z nieoptymalnej swoistości przeciwciała. Przeciwciało użyte w tym doświadczeniu jest przeciwciałem poliklonalnym, które zazwyczaj wykazuje niższą swoistość w immunodetekcji w porównaniu z przeciwciałami monoklonalnymi. Niemniej jednak nieswoiste prążki te nie wpływają na wyniki dotyczące białka SASH1 ani na wnioski z niniejszego badania. Przyszłe badania obejmujące eksperymenty in vivo, analizę próbek klinicznych oraz charakterystykę ładunku egzosomów są niezbędne, aby dalej wyjaśnić funkcjonalną rolę osi P-EXOS-SASH1 w PE i ocenić jej potencjał translacyjny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka RPMI-1640	Gibco	11875085
Pł Tkliwa Wołowa (FBS)	Gibco	16140071
FBS pozbawiony egzosomów	System Biosciences	EXO-FBS-50A-1
Penicylina/Streptomycyna	Thermo Fisher Scientific, CN	15140122
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000 (z odczynnikiem P3000)	Thermo Fisher Scientific, CN	L3000150
Pożywka Opti-MEM z obniżoną zawartością surowicy	Thermo Fisher Scientific, CN	31985070
Plazmid shRNA SASH1 (HuSH)	origene	TL301836
Plazmid ekspresyjny ORF SASH1	origene	RC218866
Kontrolny pusty wektor	origene	PS100001
Zestaw do odwrotnej transkrypcji	Thermo Fisher Scientific, CN	4368814
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific, CN	A46110
Primery SASH1	Sangon Biotech	Synteza na zamówienie
Primery β-aktyny	Sangon Biotech	Synteza na zamówienie
Bufor do lizy komórek	Beyotime	P0013B
Spektrofotometr NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, CN	NanoDrop Ultra
Membrana PVDF	Thermo Fisher Scientific, CN	88518
Przeciwciało anty-SASH1	ABclonal	A15248
Przeciwciało anty-β-aktyna	Abcam	ab6276
Wtórne przeciwciało kozie anty-królicze/anty-mysie sprzężone z HRP	Beyotime	A0208
Oprogramowanie ImageJ	NIH (domena publiczna)	ImageJ
Zestaw PKH67 do zielonej fluorescencyjnej znakowania komórek (zawiera rozcieńczalnik C)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN	MINI67
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN	10711454001
DAPI	Beyotime	C1002
Konfokalny skaningowy mikroskop laserowy (CLSM)	Leica	Leica TCS SP8
Zestaw ELISA Quantikine do ludzkiej IL-6	R&D Systems	D6050B
Zestaw ELISA DuoSet do ludzkiej IL-1β/IL-1F2	R&D Systems	DY201
Zestaw ELISA Quantikine do ludzkiego TNF-α	R&D Systems	DTA00D
Czytnik mikropłytek	Thermo Scientific	Multiskan FC
Zestaw do detekcji śmierci komórek in situ (zestaw do analizy TUNEL)	Roche	11684795910
Triton X-100	Beyotime	P0096
Paraformaldehyd (4%)	Beyotime	P0099
Mikroskop fluorescencyjny	Olympus	BX53
Wirówka chłodząca (wydajność 12 000 × g)	Eppendorf	Eppendorf 5430 R
Ultrawirówka (wydajność 120 000 × g)	Beckman Coulter	Optima MAX-XP
Oprogramowanie R	The R Foundation	v4.2.1
GraphPad Prism	GraphPad Software	v10.0
Seurat (pakiet R)	Satija Lab (open-source)	v4.0.4
Harmony (pakiet R, korekcja efektu serii)	Open-source	v1.2.0
Scrublet (pakiet Python, detekcja dubletów)	Open-source	v0.2.3
clustree (pakiet R)	Open-source	v0.5.1
glmnet (pakiet R, LASSO)	Open-source	v4.1.8
e1071 (pakiet R, SVM-RFE)	Open-source	v1.7-14
xgboost (pakiet R)	Open-source	v1.7.7.1
randomForest (pakiet R, Boruta)	Open-source	v4.7-1.1
Baza danych Gene Expression Omnibus (GEO)	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Baza danych STRING	string-db.org	https://www.string-db.org/
Metascape	metascape.org	https://metascape.org/
Oprogramowanie Cytoscape	Cytoscape Consortium	v3.10.4
ggplot2 (pakiet R)	Open-source	v3.5.1
limma (pakiet R)	Open-source	v3.58.1
pheatmap (pakiet R)	Open-source	v1.0.12
ClusterProfiler (pakiet R)	Open-source	v4.8.3
DOSE (pakiet R)	Open-source	v3.28.2
ggpubr (pakiet R)	Open-source	v0.6.0