Ekstrakt z Lycopus lucidus poprawia eksperymentalny zespół policystycznych jajników poprzez przebudowę mikrobioty jelitowej i metabolomu

Podsumowanie

Ekstrakt ZeLan poprawił fenotypy endokrynne i metaboliczne u szczurów z PCOS indukowanym przez DHEA. Zintegrowane sekwencjonowanie 16S rRNA i metabolomika surowicy wykazały częściowe przywrócenie alfa-różnorodności mikrobioty jelitowej, zmieniony skład mikrobiologiczny oraz zmiany w metabolitach obejmujące hormony steroidowe, kwasy żółciowe i krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe.

Streszczenie

Niniejsze badanie miało na celu zbadanie efektów terapeutycznych ekstraktu z ZeLan w zespole policystycznych jajników (PCOS) oraz ocenę jego związku z przebudową mikrobioty jelitowej i metabolomu. Dwadzieścia cztery samice szczurów Sprague-Dawley podzielono losowo na grupę kontrolną, grupę modelu PCOS indukowanego dehydroepiandrosteronem (DHEA) oraz grupę leczoną ZeLan (n = 8 w każdej grupie). Po 28 dniach interwencji zmierzono poziomy hormonów w surowicy za pomocą metody ELISA; skład mikrobioty jelitowej przeanalizowano przy użyciu sekwencjonowania genu 16S rRNA, a profile metaboliczne surowicy scharakteryzowano za pomocą UHPLC-Q-TOF-MS. Przeprowadzono analizę korelacji Spearmana z kontrolą wielokrotnych testów w celu zbadania powiązań między mikrobiotą a metabolomem. ZeLan znacząco poprawił fenotypy związane z PCOS, redukując masę ciała, poziom testosteronu (0,92 vs 1,85 ng/mL, P < 0,05), stosunek LH/FSH oraz poziomy insuliny w porównaniu z grupą modelu. Sekwencjonowanie wykazało, że ZeLan częściowo przywrócił alfa-różnorodność mikrobiologiczną (indeks Shannona: 5,79 vs 4,19) i obniżył stosunek Firmicutes do Bacteroidetes. ZeLan wiązał się z wzbogaceniem Lactobacillus i Ruminococcus oraz niższą liczebnością Bacteroides, Prevotella i Escherichia. Metabolomika zidentyfikowała 52 zmienione cechy metaboliczne, przy czym kluczowe zmiany dotyczyły hormonów steroidowych, kwasów żółciowych, takich jak kwas litocholowy, oraz krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, takich jak kwas masłowy. Wyniki te sugerują, że ZeLan łagodzi zaburzenia endokrynne i metaboliczne związane z PCOS oraz wiąże się z przebudową profilu mikrobiologicznego jelit i metabolicznego surowicy.

Wprowadzenie

Zespół policystycznych jajników (PCOS) stanowi jedno z najczęstszych zaburzeń endokrynnych dotykających kobiety w wieku rozrodczym, a jego globalna rozpowszechnienie szacuje się na od 6% do 20%, w zależności od zastosowanych kryteriów diagnostycznych¹. To złożone zaburzenie metaboliczne i rozrodcze charakteryzuje się zespołem objawów klinicznych, w tym hiperandrogenizmem, dysfunkcją owulacyjną oraz policystyczną morfologią jajników, co łącznie prowadzi do istotnych konsekwencji w zakresie reprodukcji, metabolizmu i zdrowia psychicznego². Poza bezpośrednim wpływem na płodność, PCOS jest coraz częściej rozpoznawany jako stan systemowy związany z długofalowymi powikłaniami zdrowotnymi, takimi jak cukrzyca typu 2, choroby układu sercowo-naczyniowego oraz rak endometrium, co nakłada znaczne obciążenia zarówno na poszczególnych pacjentek, jak i na systemy opieki zdrowotnej na całym świecie³. Patofizjologia PCOS pozostaje nie w pełni poznana, choć powszechnie przyjmuje się, że obejmuje ona złożone interakcje między predyspozycjami genetycznymi, czynnikami środowiskowymi a uwarunkowaniami dotyczącymi stylu życia, które kulminują w charakterystycznych zaburzeniach hormonalnych i metabolicznych obserwowanych u osób dotkniętych tym zespołem⁴.

Współczesne podejścia terapeutyczne w leczeniu PCOS koncentrują się przede wszystkim na łagodzeniu objawów poprzez interwencje farmakologiczne, w tym stosowanie doustnych środków antykoncepcyjnych w celu regulacji miesiączki, metformin w celu zwiększenia wrażliwości na insulinę oraz leków antyandrogennych w celu opanowania hirsutyzmu⁵. Jednakże konwencjonalne metody leczenia często zapewniają niepełną ulgę w objawach i są często związane z działaniami niepożądanymi, które ograniczają ich długoterminowe zastosowanie, szczególnie u kobiet planujących macierzyństwo⁶. W związku z tym rośnie zainteresowanie badaniem podejść medycyny komplementarnej i alternatywnej, w szczególności tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM), która zgromadziła wielowiekowe doświadczenie empiryczne w leczeniu zaburzeń ginekologicznych poprzez holistyczne mechanizmy regulacyjne⁷. Wśród licznych leków roślinnych badanych pod kątem leczenia PCOS, Lycopus lucidus Turcz. (znany w medycynie chińskiej jako ZeLan) przyciągnął znaczną uwagę ze względu na tradycyjne zastosowania w promowaniu krążenia krwi, usuwaniu zastojów i regulacji miesiączki⁸. Opublikowane badania fitochemiczne wskazują, że L. lucidus zawiera polifenole oraz frakcje bogate we flawonoidy o działaniu antyoksydacyjnym i przeciwzapalnym^8,9. Dlatego w niniejszym badaniu zestandaryzowana całkowita zawartość flawonoidów została przyjęta jako wskaźnik chemicznej kontroli jakości ekstraktu, choć identyfikacja konkretnych aktywnych monomerów odpowiedzialnych za regulację mikrobioty i metabolizmu będzie wymagała w przyszłości ukierunkowanej analizy fitochemicznej.

Mikrobiota jelitowa wyłoniła się jako kluczowy regulator metabolizmu i funkcji endokrynnych gospodarza, a narastające dowody potwierdzają jej udział w patogenezie różnych zaburzeń metabolicznych, w tym PCOS¹⁰. Koncepcja osi jelito-jajnik została zaproponowana w celu opisania dwukierunkowej komunikacji między mikroorganizmami jelitowymi a funkcją jajników, pośredniczonej przez metabolity mikrobiologiczne, sygnalizację immunologiczną oraz szlaki neuroendokrynne¹¹. U kobiet z PCOS konsekwentnie wykazuje się dysbiozę jelitową charakteryzującą się zmniejszoną różnorodnością mikrobiologiczną, zmienionym stosunkiem Firmicutes do Bacteroidetes oraz obniżoną liczebnością korzystnych bakterii, takich jak gatunki Lactobacillus i Bifidobacterium¹². Uważa się, że te zaburzenia mikrobiologiczne przyczyniają się do patofizjologii PCOS poprzez wiele mechanizmów, w tym zwiększoną przepuszczalność jelitową, systemowy stan zapalny o niskim nasileniu oraz zaburzony metabolizm kwasów żółciowych i krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA), co w konsekwencji wpływa na wrażliwość na insulinę i biosyntezę androgenów¹³. Co istotne, interwencje celowane w mikrobiotę jelitową, w tym probiotyki, prebiotyki i modyfikacje dietetyczne, przyniosły obiecujące rezultaty w łagodzeniu objawów PCOS, co wspiera uznanie osi jelito-jajnik za cel terapeutyczny¹⁴.

Metabolomika, obejmująca kompleksową analizę małocząsteczkowych metabolitów w systemach biologicznych, stanowi potężne narzędzie do charakteryzowania zaburzeń metabolicznych związanych ze stanami chorobowymi oraz do oceny biochemicznych efektów interwencji terapeutycznych¹⁵. Integracja sekwencjonowania genu 16S rRNA w celu profilowania mikrobiomu z metabolomiką niecelowaną umożliwia systematyczne badanie zależności między mikrobiotą jelitową a metabolizmem gospodarza, dostarczając wiedzy na temat interakcji mikrobiota-metabolom, które mogą towarzyszyć zarówno patogenezie choroby, jak i odpowiedziom na leczenie. Pomimo teoretycznych przesłanek wskazujących na celowanie w oś jelita-jajniki w leczeniu PCOS oraz tradycyjnego zastosowania ZeLan w zaburzeniach ginekologicznych, do tej pory nie przeprowadzono żadnych badań, które systematycznie analizowałyby, czy ekstrakt z ZeLan moduluje interfejs mikrobiota-metabolom jelit w PCOS. Luka w wiedzy ta ogranicza nasze rozumienie biologicznych odpowiedzi związanych z ZeLan i utrudnia racjonalną optymalizację tej interwencji botanicznej w leczeniu PCOS.

Niniejsze badanie zostało zaprojektowane w celu zbadania skuteczności terapeutycznej ekstraktu z ZeLan w modelu PCOS u szczurów indukowanym przez DHEA oraz oceny związanych z tym zmian w mikrobiocie jelitowej i metabolomie poprzez zintegrowaną analizę sekwencjonowania 16S rRNA i nietargetowanej metabolomiki. W szczególności oceniliśmy wpływ ekstraktu z ZeLan na fenotypy związane z PCOS, w tym masę ciała, poziom testosteronu w surowicy, stosunek hormonu lutenizującego do hormonu folikulstimulatingiego (LH/FSH) oraz poziom insuliny; scharakteryzowaliśmy zmiany w składzie mikrobioty jelitowej i różnorodności alfa po zastosowaniu ekstraktu z ZeLan; zidentyfikowaliśmy różnicowe cechy metabolitów surowiczych oraz wzbogacone szlaki metaboliczne powiązane z interwencją z użyciem ZeLan; oraz zbadaliśmy korelacje między konkretnymi taksonami drobnoustrojów jelitowych a kluczowymi metabolitami. Realizując te cele, dążyliśmy do dostarczenia dowodów z zakresu multiomiki na powiązanie modulacji osi jelito-jajnik przez ZeLan w przebiegu PCOS.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne w niniejszym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Wykorzystania Zwierząt (numer zatwierdzenia IACUC-2023-0156).

Zwierzęta

Samice szczurów Sprague-Dawley (n = 24, w wieku 6 tygodni, masa ciała 180–200 g) pozyskano z Centrum Zwierząt Laboratoryjnych jednostki afiliowanej i utrzymywano w kontrolowanych warunkach środowiskowych (temperatura 22 ± 2°C, wilgotność 50 ± 10%, 12-godzinny cykl światła/ciemności) z dostępem ad libitum do standardowej karmy dla gryzoni i oczyszczonej wody. Po tygodniowym okresie aklimatyzacji zwierzęta randomly przydzielono do trzech grup eksperymentalnych (n = 8 na grupę): grupy kontrolnej, grupy modelu PCOS oraz grupy leczonej ZeLan. Wielkość próby określono na podstawie wcześniejszych badań nad zmianami mikrobioty jelitowej w modelach PCOS, przy czym analiza mocy wykazała, że 8 zwierząt na grupę zapewni 80% mocy do wykrycia 1,5-krotnej różnicy w indeksach różnorodności alfa przy α = 0,05.

Ustanowienie modelu PCOS i protokół leczenia

Model PCOS został ustanowiony zgodnie z dobrze zwalidowanym protokołem, obejmującym codzienne podskórne wstrzyknięcia dehydroepiandrosteronu (DHEA; Sigma-Aldrich, USA) rozpuszczonego w oleju sezamowym w okolicy grzbietowej karku w dawce 6 mg/100 g masy ciała przez 21 kolejnych dni. Zwierzęta kontrolne otrzymywały równoważne objętości nośnika w postaci oleju sezamowego. Cały harmonogram eksperymentu obejmował 7 dni aklimatyzacji, 21 dni indukcji modelu oraz 28 dni interwencji, z pobraniem próbek końcowych w 56. dniu protokołu, wliczając okres aklimatyzacji (Rysunek 1). Ekstrakt ZeLan przygotowano z uwierzytelnionego ziela Lycopus lucidus Turcz. poprzez ekstrakcję wodną i zestandaryzowano tak, aby zawartość całkowitych flawonoidów wynosiła nie mniej niż 2,5% w badaniu wysokosprawnej chromatografii cieczowej, co stanowiło kryterium chemicznej kontroli jakości ekstraktu roślinnego. Po zakończeniu ustanawiania modelu indukowanego DHEA, szczury w grupie ZeLan otrzymywały codziennie przez 28 kolejnych dni ekstrakt ZeLan podawany przez zgłębnik do żołądka w dawce 200 mg/kg masy ciała, natomiast grupy Kontrolnej i Modelu otrzymywały równoważne objętości wody destylowanej. Dawka 200 mg/kg została wybrana jako eksploracyjna dawka farmakologiczna w oparciu o wcześniejsze doświadczenia z użyciem ekstraktów roślinnych u zwierząt oraz wstępne rozważania dotyczące tolerancji; formalna ocena zależności dawka-odpowiedź nie była częścią obecnego projektu. Masę ciała rejestrowano co tydzień przez cały okres eksperymentu. W tym projekcie eksperymentalnym pomyślne ustanowienie modelu PCOS oceniano na podstawie protokołu indukcji DHEA wraz z końcowymi fenotypami endokrynologicznymi i metabolicznymi, w tym masą ciała, poziomem testosteronu w surowicy, stosunkiem LH/FSH oraz poziomem insuliny na czczo. Badanie histopatologiczne jajników, liczenie pęcherzyków, kwantyfikacja ciał żółtych oraz seryjne monitorowanie cyklu rujowego nie zostały uwzględnione jako punkty końcowe potwierdzające model, w związku z czym interpretacja dysfunkcji jajników opierała się na odczytach endokrynologicznych i metabolicznych, a nie na bezpośredniej ocenie na poziomie tkanki.

Pobieranie i przetwarzanie próbek

Próbki (surowica i kał) pobrano od wszystkich trzech grup (n = 8 na grupę) do późniejszych analiz biochemicznych, mikrobioty i metabolomicznych. Pobrania końcowe przeprowadzono rano po nocnym poście, aby ograniczyć zmienność związaną z rytmem dobowym i karmieniem. Próbki krwi pobrano z aorty brzusznej w znieczuleniu i wirowano przy 3,000 × g przez 15 minut w temperaturze 4°C w celu uzyskania surowicy, którą rozdzielono na alykwouty i przechowywano w -80°C do czasu analiz hormonów i metabolomiki. Świeże próbki kału pobrano bezpośrednio z kątnicy w warunkach aseptycznych do sterylnych probówek kriogenicznych, transportowano w suchym lodzie, zamrażano gwałtownie w ciekłym azocie w ciągu 10 minut od pobrania i przechowywano w -80°C do czasu sekwencjonowania genu 16S rRNA.

Pomiary poziomu hormonów w surowicy

Stężenia testosteronu, hormonu luteinizującego (LH), hormonu folikulotropowego (FSH) oraz insuliny w surowicy oznaczono przy użyciu dostępnych komercyjnie zestawów do testów ELISA (Cusabio Biotech, Wuhan, Chiny) zgodnie z instrukcjami producenta. Stosunek LH/FSH obliczono jako złożony wskaźnik zaburzeń gonadotropin charakterystyczny dla PCOS. Wszystkie próbki analizowano w dubletach, a pomiary z współczynnikiem zmienności dubletów przekraczającym 15% powtarzano. Wymagano, aby współczynniki zmienności wewnątrz- i międzyseryjnej pozostawały odpowiednio poniżej 10% i 15%. Potencjalne wartości odstające weryfikowano z zapisami źródłowymi i informacjami o wydajności testu; żadna wartość nie została wykluczona wyłącznie na podstawie statystycznej bez udokumentowanej przyczyny technicznej.

Sekwencjonowanie genu 16S rRNA i analiza bioinformatyczna

Całkowite bakteryjne DNA genomowe wyekstrahowano z treści kąkielnika za pomocą zestawu QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Niemcy) zgodnie z protokołem producenta. Jakość i ilość DNA oceniono za pomocą spektrofotometrii NanoDrop oraz elektroforezy w żelu agarozowym, a ekstrakty DNA przechowywano w temperaturze -80°C przed przygotowaniem biblioteki. Regiony hiperzmienne V3-V4 genu 16S rRNA amplifikowano przy użyciu uniwersalnych starterów 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') i 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') z sekwencjami adapterów Illumina. Biblioteki amplikonów zostały przygotowane, oczyszczone, skwantyfikowane, połączone w stężeniach ekimolarnych i zsekwencjonowane na platformie Illumina NovaSeq 6000 (Novogene, Pekin, Chiny) z wykorzystaniem odczytów par końcowych 250 bp.

Surowe odczyty sekwencjonowania przetworzono przy użyciu potoku QIIME2 (wersja 2022.2). Odczyty parzyste zostały poddane demultipleksowaniu, scaleniu oraz filtracji jakościowej z progiem wyniku Phred wynoszącym co najmniej 20, a następnie przetworzone programem DADA2 w celu usunięcia sekwencji chimerycznych i wygenerowania wariantów sekwencji amplikonów (ASVs). Klasyfikację taksonomiczną przeprowadzono w oparciu o bazę referencyjną SILVA 138 przy użyciu naiwnego klasyfikatora Bayesa. W celu oceny różnorodności i bogactwa wewnątrzpróbek obliczono wskaźniki alfa-różnorodności, w tym indeks Shannon, indeks Simpson oraz estymator Chao1. Wyniki głębokości sekwencjonowania, w tym podsumowania odczytów, tabele liczebności ASV, pokrycie Good's oraz pliki krzywych rzadkości, potraktowano jako część zbioru danych mikrobiomu opisanego w sekcji Dostępność danych. Do identyfikacji taksonów związanych z chorobą w porównaniu grupy Kontrolnej z grupą Modelową wykorzystano analizę wielkości efektu dyskryminanta liniowego (LEfSe), stosując próg wyniku LDA większy niż 2.0 oraz P < 0.05; odwrócenie efektów związane z ZeLan oceniono poprzez porównanie kierunku zmian w liczebności taksonów w grupie ZeLan w stosunku do grupy Modelowej.

Niespecyficzna analiza metabolomiczna

Profilowanie metabolomiczne surowicy wykonano przy użyciu ultraszybkiej chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas z analizatorem czasu przelotu i quadrupolem (UHPLC-Q-TOF-MS; Agilent 1290 Infinity II/6550, USA). Próbki surowicy (100 μL) zmieszano z 400 μL zimnego roztworu metanol:acetonitryl (1:1, v/v) zawierającego standardy wewnętrzne, wymieszano w wortexie i inkubowano w temperaturze -20°C przez 1 godzinę w celu wytrącenia białek. Po wirowaniu przy 14 000 × g przez 15 minut nadfiltrات wysuszono w strumieniu azotu i rozpuszczono ponownie w 100 μL roztworu acetonitryl:woda (1:1, v/v) do analizy. Rozdział chromatograficzny przeprowadzono na kolumnie ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 × 100 mm, 1,8 μm) utrzymywanej w temperaturze 40°C, stosując wodę zawierającą 0,1% kwasu mrówkowego jako fazę ruchomą A oraz acetonitryl zawierający 0,1% kwasu mrówkowego jako fazę ruchomą B przy przepływie 0,30 mL/min. Do rozdziału metabolitów zastosowano program gradientowy zwiększający udział fazy organicznej od 5% do 95%, a następnie płukanie i reekswilibrację kolumny. Dane spektrometryczne zbierano w trybach dodatniej i ujemnej jonizacji z rozpylaniem elektrostatycznym w zakresie m/z 50–1200; parametry źródła obejmowały: napięcie kapilary 3,5 kV, przepływ gazu osuszającego 10 L/min, temperaturę gazu osuszającego 325°C, ciśnienie nebulizatora 35 psi oraz napięcie fragmentatora 120 V.

Surowe pliki danych przekonwertowano do formatu mzXML i przetworzono przy użyciu pakietu XCMS w programie R w celu detekcji piku, wyrównania czasów retencji oraz całkowania pól pod pikami. Próbki kontroli jakości, przygotowane poprzez połączenie równych alikwotów wszystkich ekstraktów surowicy, wprowadzano w całej sekwencji analitycznej w celu monitorowania stabilności instrumentu. Cechy z nadmierną liczbą brakujących danych lub niestabilną powtarzalnością w próbkach kontroli jakości zostały usunięte przed modelowaniem statystycznym. Identyfikację metabolitów przeprowadzono poprzez dopasowanie dokładnej masy, czasu retencji oraz wzorców fragmentacji MS/MS do bazy danych Human Metabolome Database (HMDB), METLIN oraz wewnętrznych bibliotek spektralnych. Wielowymiarowe analizy statystyczne wykonano za pomocą oprogramowania MetaboAnalyst 5.0. Cechy metabolitów zakwalifikowane do dalszego raportowania zostały wyłonione na podstawie kryterium łączonego, obejmującego wielowymiarowy wkład dyskryminacyjny, kierunek zmiany krotności (fold-change) oraz dowody statystyczne; wartości P skorygowano metodą Benjamini-Hochberg, aby uwzględnić wielokrotne testowanie. Pełna tabela z adnotacjami, zawierająca 52 cechy metabolitów, została przedstawiona jako Supplementary Table 1. Analizę wzbogacenia szlaków przeprowadzono z wykorzystaniem bazy danych Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

Analiza statystyczna

Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu programu SPSS w wersji 26.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) oraz oprogramowania R (wersja 4.2.1). Dane ciągłe przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD), a przed przeprowadzeniem testów inferencyjnych oceniono ich rozkład pod kątem normalności za pomocą testu Shapiro-Wilka. W przypadku danych o rozkładzie normalnym do porównań wielogrupowych zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie test post hoc Tukeya; w przypadku danych o rozkładzie nienormalnym zastosowano test Kruskala-Wallisa z testem post hoc Dunna. Korelacje między taksonami mikrobioty jelitowej a metabolitami surowicy oceniano za pomocą współczynnika korelacji rang Spearmana i wizualizowano w formie hierarchicznie klastrowanych map ciepła (heatmaps). Wartości P dla korelacji skorygowano pod kątem wielokrotnych porównań metodą kontrolowania współczynnika odkryć fałszywych Benjamini-Hochberga i interpretowano jedynie korelacje, które były spójne pod względem kierunku oraz istotne statystycznie. Dwustronną wartość P < 0,05 uznano za statystycznie istotną, chyba że określono inny próg skorygowanej wartości P.

Wyniki

Wpływ ekstraktu z ZeLan na fenotypy kliniczne PCOS

Podawanie DHEA wywołało u szczurów fenotypy endokrynne i metaboliczne przypominające PCOS, co objawiło się znacznymi wzrostami masy ciała, stężenia testosteronu w surowicy, stosunku LH/FSH oraz poziomu insuliny na czczo w porównaniu z grupą kontrolną (wszystkie P < 0,05). Ocena rozkładu z wykorzystaniem testu Shapiro-Wilka potwierdziła zasadność analizy parametrycznej dla głównych punktów końcowych dotyczących masy ciała i hormonów, zestawionych w Tabeli 1. Leczenie ekstraktem z ZeLan przez 28 dni znacząco poprawiło te zaburzenia metaboliczne i hormonalne. Masę ciała odnotowano na koniec okresu leczenia w 56. dniu protokołu, wliczając 7-dniowy okres aklimatyzacji. Jak przedstawiono w Tabeli 1, masa ciała w grupie Model (291,12 ± 15,35 g) była znacznie wyższa niż w grupie kontrolnej (227,45 ± 10,12 g, P < 0,05), natomiast leczenie ZeLan znacząco zredukowało masę ciała do 245,25 ± 10,21 g (P < 0,05 względem Model). Poziomy testosteronu w surowicy były wyraźnie podwyższone u szczurów w modelu PCOS (1,85 ± 0,21 ng/mL) w porównaniu z grupą kontrolną (0,51 ± 0,05 ng/mL), a interwencja z użyciem ZeLan obniżyła poziom testosteronu do 0,92 ± 0,12 ng/mL. Stosunek LH/FSH był znacząco zwiększony w grupie Model (3,28 ± 0,25) w stosunku do grupy kontrolnej (1,25 ± 0,11) i został częściowo znormalizowany przez leczenie ZeLan (1,85 ± 0,15). Poziomy insuliny na czczo były podwyższone u zwierząt modelowych (28,95 ± 2,35 mIU/L względem 12,55 ± 1,12 mIU/L w grupie kontrolnej) i uległy znacznemu obniżeniu po podaniu ZeLan (18,82 ± 1,55 mIU/L) (Rysunek 2). Wyniki te potwierdziły pomyślne wywołanie endokrynno-metabolicznego fenotypu przypominającego PCOS; jednak w ninianzym badaniu nie przeprowadzono histopatologii jajników, zliczania pęcherzyków, analizy ciał żółtych ani monitorowania cyklu rujowego.

Ekstrakt ZeLan przywrócił różnorodność alfa mikrobioty jelitowej

Analiza wskaźników alfa-różnorodności ujawniła istotne zmiany w strukturze mikrobiomu jelitowego związane z PCOS oraz jego leczeniem. Jak pokazano w Tabeli 2 oraz na Rysunku 3, indeks różnorodności Shannona był znacząco niższy u szczurów w modelu PCOS (4,19 ± 0,35) niż w grupie kontrolnej (6,51 ± 0,28; P < 0,05), co wskazuje na zmniejszenie alfa-różnorodności mikrobiologicznej w stanie chorobowym. Leczenie preparatem ZeLan częściowo przywróciło różnorodność mikrobiologiczną, a indeks Shannona wzrósł do 5,79 ± 0,26 (P < 0,05 w porównaniu z grupą Model). Spójne wyniki zaobserwowano dla indeksu Simpsona, który spadł z 0,98 ± 0,01 w grupie kontrolnej do 0,82 ± 0,03 u zwierząt w modelu i powrócił do poziomu 0,93 ± 0,02 po interwencji z użyciem ZeLan. Estymator Chao1, odzwierciedlający bogactwo gatunkowe, wykazał podobny wzorzec: indukcja PCOS znacząco obniżyła wartość Chao1 z 1215,3 ± 45,4 do 665,8 ± 52,1, podczas gdy leczenie preparatem ZeLan zwiększyło bogactwo do 963,5 ± 38,6. Wyniki te wspólnie wskazują, że PCOS wiąże się z dysbiozą mikrobiomu jelitowego charakteryzującą się zmniejszoną alfa-różnorodnością i bogactwem gatunkowym, a ekstrakt ZeLan może częściowo przywrócić strukturę społeczności mikrobiologicznej w kierunku profilu grupy kontrolnej.

Zmiany w składzie mikrobioty jelitowej

Profilowanie taksonomiczne na poziomie typu wykazało wyraźne różnice w składzie między grupami eksperymentalnymi. Jak przedstawiono na Rysunku 4, Firmicutes i Bacteroidetes były dominującymi typami we wszystkich grupach, stanowiąc łącznie ponad 85% całej społeczności bakteryjnej. W grupie Model odnotowano znacznie zwiększoną liczność Firmicutes (około 75%) przy jednoczesnym zmniejszeniu proporcji Bacteroidetes (około 15%) w porównaniu z grupą Kontrolną (Firmicutes około 40%, Bacteroidetes około 45%), co skutkowało wyraźnym wzrostem stosunku Firmicutes do Bacteroidetes (F/B), charakterystycznym dla dysbiozy metabolicznej. Leczenie preparatem ZeLan zmodulowało tę nierównowagę, redukując liczność Firmicutes do około 52% i zwiększając liczność Bacteroidetes do około 35%, co doprowadziło do częściowej normalizacji stosunku F/B w kierunku poziomów kontrolnych.

Do identyfikacji taksonów bakteryjnych odróżniających grupę kontrolną od grupy modelowej oraz zdefiniowania sygnatury mikrobiologicznej związanej z chorobą wykorzystano analizę LEfSe. Jak pokazano na rycinie 5, na poziomie rodzaju w grupie modelowej PCOS zaobserwowano znacznie podwyższoną liczebność Bacteroides (wynik LDA > 3,5), Prevotella (wynik LDA > 3,0) oraz Escherichia (wynik LDA > 2,5), które są zazwyczaj wiązane z dysfunkcją metaboliczną i stanami zapalnymi. Z kolei w grupie kontrolnej stwierdzono wzbogacenie w rodzaje korzystne, w tym Lactobacillus (wynik LDA > 3,0) i Ruminococcus (wynik LDA > 2,5), uznawane za istotne w utrzymaniu integralności bariery jelitowej i produkcji korzystnych metabolitów, takich jak krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe. Grupa ZeLan nie została przedstawiona jako oddzielna klasa LEfSe na rycinie 5, ponieważ analiza ta koncentrowała się na taksonach odróżniających stan chorobowy od zdrowego; efekty związane z ZeLan zinterpretowano na podstawie przesunięć liczebności w kierunku profilu grupy kontrolnej oraz korelacji mikrobiom-metabolom.

Profilowanie metabolomiczne i identyfikacja różnicowych metabolitów

Niekierowana analiza metabolomiczna wykazała istotne zaburzenia metaboliczne związane z PCOS oraz jego leczeniem ekstraktem z ZeLan. Wykres wulkaniczny w Rycina 6 przedstawia rozkład cech metabolitów pomiędzy grupą modelową a kontrolną, z wyróżnieniem cech o zwiększonej i zmniejszonej ekspresji na podstawie kierunku zmiany krotności (fold-change) oraz istotności statystycznej. W kompletnej tabeli raportu metabolomicznego dla porównania grupy modelowej z kontrolną zachowano łącznie 52 adnotowane cechy metabolitów. Pełna lista, obejmująca nazwę metabolitu, identyfikator HMDB, klasę biochemiczną, log2 fold change, wartość P oraz kierunek regulacji, została przedstawiona jako Tabela uzupełniająca 1. Tabela 3 przedstawia reprezentatywne adnotowane metabolity o wysokim znaczeniu biologicznym dla PCOS.

Tabela 3 podsumowuje reprezentatywne, kluczowe metabolity różnicowe o wysokich wartościach VIP i istotności biologicznej dla patofizjologii PCOS. Hormony steroidowe, w tym testosteron (VIP = 2.56, P < 0.001) i androstendion (VIP = 2.34, P < 0.001), były znacznie podwyższone u zwierząt w modelu PCOS, co jest zgodne ze stanem hiperandrogenizmu charakterystycznym dla tego schorzenia. Zaburzony był również metabolizm kwasów tłuszczowych, przy czym kwas palmitynowy (VIP = 2.12) i kwas arachidonowy (VIP = 1.89) wykazały istotne wzrosty, podczas gdy prozapalny mediator lipidowy prostaglandyna E2 był podobnie podwyższony (VIP = 2.05). Odwrotnie, metabolity związane z korzystną aktywnością mikrobioty jelitowej były zmniejszone u zwierząt z PCOS: kwas litocholowy, wtórny kwas żółciowy powstający w wyniku biotransformacji mikrobiologicznej, uległ znacznemu obniżeniu (VIP = 2.45), podobnie jak krótkołańcuchowy kwas tłuszczowy – kwas masłowy (VIP = 2.21). Dodatkowo, w grupie Model odnotowano spadek poziomu kwasu bursztynowego oraz niezbędnego aminokwasu L-tryptofanu, co sugeruje upośledzenie fermentacji mikrobiologicznej i zaburzony metabolizm aminokwasów.

Analiza wzbogacenia szlaków KEGG

Analiza wzbogacenia ścieżek z wykorzystaniem bazy danych KEGG ujawniła kilka szlaków metabolicznych w surowicy, które były istotnie zaburzone w PCOS i modulowane przez leczenie ZeLan. Jak przedstawiono na Rysunku 7, biosynteza hormonów steroidowych okazała się najbardziej wzbogaconą ścieżką (Rich Factor = 0.80, P < 0.01), co jest zgodne z fenotypem hiperandrogenowym w PCOS. Ścieżka steroidogenezy jajnikowej była podobnie silnie wzbogacona (Rich Factor = 0.75, P < 0.01), co odzwierciedla udział zaburzonej syntezy androgenów w dysfunkcji jajników. Biosynteza pierwotnych kwasów żółciowych wykazała istotne wzbogacenie (Rich Factor = 0.62, P < 0.02), co wskazuje na zaburzony krążenie jelitowo-wątrobowe kwasów żółciowych, które może być powiązane ze zmianami w mikrobiocie jelitowej. Metabolizm kwasu arachidonowego (Rich Factor = 0.56, P < 0.03) oraz ścieżka insulinooporności (Rich Factor = 0.40, P < 0.04) były również istotnie wzbogacone, co potwierdza występowanie stanów zapalnych i zaburzeń metabolicznych charakterystycznych dla PCOS. Ścieżka biosyntezy kwasów tłuszczowych wykazała umiarkowane wzbogacenie (Rich Factor = 0.30), co sugeruje udział dysregulacji metabolizmu lipidów.

Analiza korelacji mikrobiomu i metabolomu

W celu oceny zależności funkcjonalnych między składem mikrobioty jelitowej a zmianami metabolicznymi przeprowadzono analizę korelacji Spearmana z kontrolą stopy fałszywych odkryć (false-discovery rate) pomiędzy rodzajami bakterii o różnym stopniu liczebności a kluczowymi metabolitami. Hierarchicznie zgrupowana mapa ciepła korelacji przedstawiona na Rysunku 8 ujawnia wyraźne wzorce powiązań między mikrobiotą a metabolomem. Bakterie korzystne, w tym Lactobacillus i Ruminococcus, wykazały silne korelacje dodatnie z kwasem litocholowym (odpowiednio r = 0.72 i 0.68) oraz kwasem masłowym (odpowiednio r = 0.65 i 0.60), wykazując jednocześnie korelacje ujemne z testosteronem (r = -0.75 i -0.80) oraz androstendionem (r = -0.68 i -0.72). Wyniki te sugerują, że bakterie korzystne zidentyfikowane w analizie taksonomicznej były powiązane z metabolitami związanymi z androgenami oraz aktywnością metaboliczną związaną z SCFA.

Z kolei rodzaje bakterii związane z PCOS, takie jak Bacteroides, Prevotella i Escherichia, wykazały przeciwstawne wzorce korelacji. Bakterie te korelowały dodatnio z testosteronem (odpowiednio r = 0.85, 0.82 i 0.60), androstenedionem (r = 0.78, 0.75 i 0.55) oraz kwasem palmitynowym (r = 0.65, 0.60 i 0.45), wykazując jednocześnie ujemne korelacje z korzystnymi metabolitami, w tym z kwasem litocholowym i kwasem masłowym. Te wzorce korelacji wspierają istnienie powiązań funkcjonalnych między konkretnymi taksonami mikroflory jelitowej a zaburzeniami metabolicznymi charakterystycznymi dla PCOS, jednak nie dowodzą one bezpośredniego związku przyczynowo-skutkowego.

Dostępność danych:

Zbiory danych wygenerowane i przeanalizowane w ramach niniejszego badania obejmują metadane próbek, surowe dane fenotypowe, wskaźniki alfa-różnorodności 16S, zestawienia liczebności na poziomie typu, wyniki różnicowej analizy taksonów bakteryjnych, tabele różnicowej analizy metabolomicznej, reprezentatywne wyniki metabolitów, wyniki wzbogacenia ścieżek KEGG oraz macierz korelacji mikrobiota-metabolit. Te podstawowe dane źródłowe zostały udostępnione jako towarzyszący Supplementary File 1. Przetworzony zbiór danych dotyczący różnicowych metabolitów został przedstawiony w Supplementary Table 1.

Rysunek 1: Schemat badania i harmonogram leczenia. Schematyczna ilustracja przebiegu eksperymentu przedstawiająca 7-dniowy okres aklimatyzacji, 21-dniowy okres iniekcji DHEA lub nośnika, 28-dniowe podawanie ekstraktu ZeLan lub nośnika oraz końcowe pobranie próbek surowicy i kału w 56. dniu protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 2: Wpływ ekstraktu z ZeLan na parametry endokrynne i metaboliczne. Wykresy pudełkowe przedstawiające (A) stężenie testosteronu w surowicy, (B) stosunek LH/FSH oraz (C) masę ciała w grupie kontrolnej, modelowej i grupie leczonej ZeLan po okresie interwencji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3: Alfa-różnorodność mikrobioty jelitowej. Porównanie indeksu różnorodności Shannona pomiędzy grupami Control, Model i ZeLan, ilustrujące różnice w alfa-różnorodności mikrobioty jelitowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Skład mikrobioty jelitowej na poziomie typu. Skumulowany wykres słupkowy przedstawiający względną obfitość dominujących typów bakterii w mikrobiocie jelitowej grup Control, Model i ZeLan. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 5: Różnicowe taksony bakteryjne zidentyfikowane za pomocą analizy LEfSe. Analiza wielkości efektu liniowego dyskryminanta (LEfSe) identyfikująca rodzaje bakterii odróżniające grupę kontrolną od grupy modelowej. Wyniki LDA wskazują wielkość efektu taksonów o różnej liczebności. Zmiany związane z ZeLan opisano w sekcji Wyniki na podstawie przesunięć liczebności w stosunku do grupy modelowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 6: Różnicowe profilowanie metabolitów. Wykres wulkaniczny przedstawiający różnice w cechach metabolitów między grupą Model a grupą Kontrolną. Czerwone i niebieskie punkty reprezentują odpowiednio istotnie zwiększone i zmniejszone poziomy cech metabolitów, w oparciu o krotność zmiany (fold change) oraz istotność statystyczną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 7: Analiza wzbogacenia ścieżek KEGG. Wykres bąbelkowy przedstawiający istotnie wzbogacone ścieżki metaboliczne zidentyfikowane na podstawie metabolitów różnicowych. Rozmiar bąbelka reprezentuje liczbę zmapowanych metabolitów, a kolor bąbelka wskazuje istotność statystyczną (P-value) wzbogacenia ścieżki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 8: Korelacja między mikrobiotą jelitową a metabolitami w surowicy. Hierarchicznie zgrupowana mapa ciepła przedstawiająca współczynniki korelacji Spearmana pomiędzy rodzajami bakterii o zróżnicowanej liczebności a reprezentatywnymi metabolitami w surowicy. Kolor czerwony oznacza korelacje dodatnie, natomiast kolor niebieski oznacza korelacje ujemne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Grupa	N	Masa ciała (g)	Testosteron (ng/mL)	Stosunek LH/FSH	Insulina (mIU/L)
Kontrola	8	227.45 ± 10.12	0.51 ± 0.05	1.25 ± 0.11	12.55 ± 1.12
Model	8	291.12 ± 15.35a	1.85 ± 0.21a	3.28 ± 0.25a	28.95 ± 2.35a
ZeLan	8	245.25 ± 10.21b	0.92 ± 0.12b	1.85 ± 0.15b	18.82 ± 1.55b
Uwaga: Dane przedstawiono jako średnia ± SD. a = p < 0,05 w porównaniu z grupą kontrolną; b = p < 0,05 w porównaniu z grupą Model.

Tabela 1: Parametry hormonalne i metaboliczne u szczurów z PCOS. Zmierzono masę ciała, poziom testosteronu w surowicy, stosunek LH/FSH oraz poziom insuliny na czczo w grupach Kontrolnej, Modelu oraz leczonej preparatem ZeLan. Dane przedstawiono jako średnia ± SD.

Grupa	Indeks Shannona	Indeks Simpsona	Estymator Chao1
Kontrola	6.51 ± 0.28	0.98 ± 0.01	1215.3 ± 45.4
Model	4.19 ± 0.35a	0.82 ± 0.03a	665.8 ± 52.1a
ZeLan	5.79 ± 0.26b	0.93 ± 0.02b	963.5 ± 38.6b
Uwaga: Dane przedstawiono jako średnia ± SD. a = p < 0,05 w porównaniu z grupą kontrolną; b = p < 0,05 w porównaniu z grupą modelową.

Tabela 2: Wskaźniki alfa-różnorodności mikrobiomu jelitowego. Porównanie indeksu Shannona, indeksu Simpsona i estymatora Chao1 pomiędzy grupą kontrolną (Control), grupą modelową (Model) a grupą leczoną ZeLan. Dane przedstawiono jako średnia ± SD.

Nazwa metabolitu	ID HMDB	Klasa	Trend (model vs kontrola)	wartość p	Wskaźnik VIP
Testosteron	HMDB0000286	Steroid	W górę ↑	< 0.001	2.56
Androstenedion	HMDB0000055	Steryd	W górę ↑	< 0.001	2.34
Kwas palmitynowy	HMDB0000220	Kwas tłuszczowy	W górę ↑	< 0.001	2.12
Kwas arachidonowy	HMDB0001043	Kwas tłuszczowy	W górę ↑	0.003	1.89
Prostaglandyna E2	HMDB0001036	Lipid	W górę ↑	< 0.001	2.05
Kwas litocholowy	HMDB0000752	Kwas żółciowy	W dół ↓	< 0.001	2.45
Kwas masłowy	HMDB0000039	krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe	W dół ↓	< 0.001	2.21
Kwas bursztynowy	HMDB0000254	Kwas organiczny	W dół ↓	0.021	1.65
L-tryptofan	HMDB0000929	Aminokwas	W dół ↓	0.015	1.58
Uwaga: VIP = Variable Importance in Projection (zmienna o znaczeniu istotnym dla projekcji) > 1 uznano za istotne).

Tabela 3: Reprezentatywne różnicowe metabolity surowicy. Reprezentatywne adnotowane metabolity związane z PCOS i regulowane przez ekstrakt ZeLan, obejmujące identyfikatory HMDB, klasę metabolitu, trend regulacji, wartość P oraz wynik VIP. Pełna lista 52 adnotowanych cech metabolitów znajduje się w Tabeli uzupełniającej 1.

Tabela uzupełniająca 1: Kompletny adnotowany zestaw danych metabolicznych. Pełna lista 52 adnotowanych cech metabolitów zachowanych do raportowania metabolomicznego, zawierająca nazwę metabolitu, identyfikator HMDB, klasę biochemiczną, krotność zmiany (fold change), wartość P oraz kierunek regulacji.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Dane źródłowe wspierające analizy eksperymentalne, mikrobiomowe i metabolomiczne. Ten arkusz zawiera informacje o próbkach, pomiary fenotypów klinicznych, wskaźniki różnorodności sekwencjonowania 16S rRNA, względną obfitość drobnoustrojów na poziomie typu, analizę różnicową taksonów LEfSe, różnicową analizę metabolomiczną, reprezentatywne metabolity, analizę wzbogacenia ścieżek KEGG, dane macierzy korelacji oraz podsumowanie weryfikacji danych wykorzystane do wygenerowania rycin i tabel przedstawionych w manuskrypcie.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Niniejsze badanie dostarcza dowodów na to, że ekstrakt z ZeLan łagodzi fenotypy endokrynne i metaboliczne związane z PCOS w modelu szczurzym indukowanym DHEA oraz że efekty te są powiązane z korzystnymi zmianami w składzie mikrobioty jelitowej i profilach metabolicznych surowicy. Zintegrowane podejście multiomiczne wykazało, że leczenie ZeLan poprawiło hiperandrogenemię, podwyższony stosunek LH/FSH oraz insulinooporność, jednocześnie częściowo przywracając alfawersję różnorodności mikrobiomu jelitowego, przywracając równowagę w składzie mikrobiologicznym i normalizując kilka szlaków metabolicznych zaangażowanych w patofizjologię PCOS. Wyniki te rozszerzają obecne rozumienie biologicznych odpowiedzi na tradycyjne chińskie leki roślinne i wspierają dalsze badania nad osią jelito-jajnik jako potencjalnym celem interwencji w PCOS.

Obniżenie poziomu testosteronu w surowicy oraz stosunku LH/FSH po zastosowaniu ZeLan jest zgodne z poprzednimi badaniami wykazującymi właściwości antyandrogenne ekstraktów roślinnych zawierających flawonoidy i związki fenolowe¹⁶. Kompleksowy przegląd badań klinicznych nad zastosowaniem medycyny ziołowej w PCOS podsumował poprawę w zakresie parametrów endokrynnych i metabolicznych w ramach interwencji botanicznych¹⁷. Mechanizm, za pomocą którego ZeLan moduluje biosyntezę androgenów, może obejmować bezpośredni wpływ na steroidogenne szlaki jajnikowe, systemowe działanie przeciwzapalne i uwrażliwiające na insulinę lub efekty pośrednie związane z metabolitami mikrobioty jelitowej; obecny schemat badania nie pozwala na pełne rozdzielenie tych możliwości. Poprawa stosunku LH/FSH wskazuje na częściowe przywrócenie funkcji osi podwzgórze-przysadka-gonady, która jest powszechnie zaburzona w PCOS¹⁸. Systematyczne przeglądy eksperymentów na zwierzętach dotyczących tradycyjnych chińskich receptur medycznych w PCOS również zgłaszały poprawę wskaźników rozrodczych i endokrynnych¹⁹. Jednoczesna poprawa wskaźników związanych z insuliną sugeruje, że ZeLan może wywierać korzyści metaboliczne wykraczające poza regulację endokrynną, potencjalnie poprzez wzmocnienie obwodowego sygnałowania insulinowego lub redukcję mediatorów zapalnych, które upośledzają funkcję receptorów insulinowych²⁰.

Przywrócenie alfa-różnorodności mikrobioty jelitowej po zastosowaniu ZeLan jest spójne z odpowiedzią związaną z mikrobiomem. Zmniejszona alfa-różnorodność zaobserwowana u szczurów w modelu PCOS jest zgodna z rosnącą liczbą publikacji dokumentujących dysbiozę jelitową zarówno w eksperymentalnych modelach PCOS, jak i w populacjach klinicznych²¹. Insenser i wsp. donieśli ponadto, że profile mikrobioty jelitowej w PCOS są pod wpływem płci, hormonów płciowych oraz otyłości²². Nasza obserwacja, że leczenie ZeLan częściowo przywróciło indeks Shannona z poziomu 4,19 do 5,79, sugeruje, że ten ekstrakt roślinny może wspierać strukturę społeczności mikrobiologicznej. Podobne efekty przywracania różnorodności zgłaszano w przypadku innych ekstraktów roślinnych bogatych w polifenole, które mogą selektywnie promować korzystne populacje bakterii, jednocześnie hamując taksony potencjalnie patogenne²³. Zmiany taksonomiczne zaobserwowane na poziomie typu, w szczególności zmniejszenie stosunku Firmicutes do Bacteroidetes po zastosowaniu ZeLan, są istotne, biorąc pod uwagę uznaną zależność między podwyższonym stosunkiem F/B a dysfunkcjami metabolicznymi, w tym otyłością i insulinoopornością²⁴. Dodatkowe badania, w tym praca Jobiry i wsp. przeprowadzona u nastolatek z PCOS, wykazały zmienioną bioróżnorodność mikroorganizmów żołądkowo-jelitowych, co potwierdza biologiczną istotność składu mikrobiologicznego dla metabolizmu gospodarza²⁵.

Identyfikacja konkretnych rodzajów bakterii różnicowo powiązanych z PCOS i leczeniem ZeLan dostarcza biologicznego kontekstu dla powiązań między mikrobiotą a metabolomem zaobserwowanych w niniejszym badaniu. Wzbogacenie Lactobacillus i Ruminococcus u zdrowych kontroli oraz ich ubytek u zwierząt z PCOS są zgodne z wcześniejszymi doniesieniami podkreślającymi ochronną rolę tych rodzajów²⁶. Gatunki Lactobacillus są znane z produkcji kwasu mlekowego i peptydów przeciwdrobnoustrojowych, które utrzymują integralność bariery jelitowej i hamują rozwój bakterii patogennych, podczas gdy gatunki Ruminococcus są ważnymi producentami krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych poprzez fermentację błonnika pokarmowego²⁷. Przywrócenie tych korzystnych rodzajów po leczeniu ZeLan może poprawić funkcję bariery jelitowej i zwiększyć aktywność metaboliczną związaną z SCFA, co odzwierciedla wzrost poziomu kwasu masłowego zaobserwowany w analizie metabolomicznej. I odwrotnie, podwyższona liczebność Bacteroides, Prevotella i Escherichia u zwierząt z PCOS jest zgodna z badaniami wskazującymi na udział tych rodzajów w zaburzeniach zapalnych i metabolicznych²⁸. Gatunki Escherichia, w szczególności Escherichia coli, mogą produkować lipopolisacharyd, który może wywoływać systemowy stan zapalny i insulinooporność poprzez sygnalizację receptora Toll-like 4, co stanowi prawdopodobne ogniwo łączące dysbiozę jelitową z dysfunkcją metaboliczną powiązaną z PCOS²⁹.

Wyniki metabolomiczne dostarczają dowodów na istnienie metabolicznych powiązań między mikrobiotą jelitową a gospodarzem, które towarzyszą leczeniu preparatem ZeLan. Zmiany w zawartości wtórnych kwasów żółciowych, takich jak kwas litocholowy, są istotne biologicznie, ponieważ metabolity te powstają w wyniku bakteryjnej aktywności enzymatycznej³⁰. Kwasy żółciowe pełnią funkcję nie tylko w absorpcji lipidów, ale także jako cząsteczki sygnałowe regulujące metabolizm glukozy i lipidów poprzez receptor farnesoidalny X oraz białkowy receptor sprzężony z G5 Takedy, co sugeruje, że normalizacja profili kwasów żółciowych może przyczyniać się do poprawy homeostazy metabolicznej. Podobnie, przywrócenie poziomu kwasu masłowego jest istotne ze względu na jego liczne korzystne działanie, w tym wzmocnienie funkcji bariery jelitowej, właściwości przeciwzapalne oraz zwiększenie wrażliwości na insulinę. Korelacje zaobserwowane pomiędzy bakteriami korzystnymi a metabolitami ochronnymi, w przeciwieństwie do powiązań między bakteriami patogennymi a metabolitami szkodliwymi, stanowią wsparcie asocjacyjne dla hipotezy o osi jelito-jajnik, podkreślając jednocześnie potrzebę bezpośredniej walidacji mechanistycznej.

Implikacje kliniczne tych odkryć należy interpretować w granicach przedklinicznego projektu eksploracyjnego. Wyniki wspierają dalszą ocenę ekstraktu z ZeLan jako uzupełniającego podejścia w leczeniu PCOS, szczególnie w kontekście interwencji botanicznych, które mogą wpływać zarówno na wskaźniki endokrynno-metaboliczne, jak i na mikrośrodowisko jelitowe. Identyfikacja mikrobiologicznych i metabolicznych biomarkerów związanych z odpowiedzią na leczenie może pomóc w ukierunkowaniu przyszłych badań mechanistycznych i translacyjnych. Ponadto oś jelito-jajnik może w przyszłości wspierać strategie łączone, integrujące ZeLan z probiotykami lub modyfikacjami diety, jednak takie strategie wymagają kontrolowanej walidacji przed zastosowaniem klinicznym.

Należy uznać kilka ograniczeń niniejszego badania. Po pierwsze, mimo że szczurzy model indukowany DHEA odzwierciedla kilka cech ludzkiego PCOS, nie oddaje on w pełni heterogeniczności fenotypów ludzkiego PCOS, w tym podtypów szczupłych, otyłych, insulinoopornych i zapalnych; w związku z tym translacja kliniczna wymaga walidacji w dobrze scharakteryzowanych populacjach pacjentów. Po drugie, w badaniu zastosowano pojedynczą dawkę ZeLan bez gradientu dawka-odpowiedź lub pozytywnej kontroli lekowej, takiej jak metformin, zatem efektywny zakres dawek, skuteczność porównawcza oraz optymalny cykl podawania pozostają do ustalenia. Po trzecie, pobieranie próbek przeprowadzono wyłącznie w punkcie końcowym, co ogranicza interpretację dynamicznych zmian czasowych w mikrobiocie, metabolomach i profilach hormonalnych podczas okresu interwencji. Po czwarte, w projekcie doświadczalnym nie uwzględniono histopatologii jajników, liczenia pęcherzyków, ilościowego oznaczania ciał żółtych ani seryjnego monitorowania cyklu rujowego; zatem regenerację czynnościową jajników wywnioskowano z wskaźników endokrynnych i metabolicznych, a nie z bezpośredniej oceny na poziomie tkankowym i cyklicznym. Po piąte, badanie zidentyfikowało korelacje między taksonami drobnoustrojów a metabolitami, ale nie objęto go przeszczepem mikrobioty kałowej, eksperymentami na zwierzętach wolnych od drobnoustrojów (germ-free), celowaną suplementacją metabolitów, testami markerów zapalnych ani pomiarami enzymów steroidogennych jajnika, takich jak CYP17A1, CYP19A1 i StAR; w konsekwencji mechanizmy przyczynowe nie mogą zostać potwierdzone na podstawie obecnych danych. Po szóste, niecelowana metabolomika dostarcza dowodów na poziomie odkrywczym, a w przyszłych pracach wymagana będzie celowana walidacja ilościowa kluczowych metabolitów, takich jak kwas litocholowy, kwas masłowy i testosteron. Po siódme, w obecnej wersji pracy nie zastosowano wizualizacji beta-różnorodności, funkcjonalnej predykcji mikrobiologicznej ani zintegrowanego modelowania szlaków mikrobiota-metabolit-gen, co ogranicza możliwość zbudowania pełnej sieci regulacyjnej. Wreszcie, ekstrakt ZeLan został zestandaryzowany pod kątem całkowitej zawartości flawonoidów, jednak nadal konieczna jest kompleksowa jakościowa i ilościowa charakterystyka fitochemiczna aktywnych monomerów.

Podsumowując, ekstrakt z ZeLan poprawił fenotypy endokrynne i metaboliczne związane z PCOS w modelu szczurzym i wiązało się to z częściową regeneracją alfa-różnorodności mikrobiomu jelitowego, zmianą składu mikrobiologicznego oraz modulacją szlaków metabolicznych w surowicy, w tym biosyntezy hormonów steroidowych, metabolizmu kwasów żółciowych oraz metabolizmu związanego z krótkołańcuchowymi kwasami tłuszczowymi. Zaobserwowane korelacje między korzystnymi bakteriami a ochronnymi metabolitami, w przeciwieństwie do powiązań między bakteriami wzbogaconymi w PCOS a szkodliwymi metabolitami, wspierają biologicznie prawdopodobne powiązanie w obrębie osi jelito-jajnik. Wyniki te stanowią podstawę dla przyszłych badań mechanistycznych i translacyjnych nad zastosowaniem ekstraktu z ZeLan w leczeniu PCOS, podkreślając jednocześnie potrzebę walidacji przyczynowo-skutkowej i szerszej charakterystyki fitochemicznej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Acetonitryl	Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific	A955-4	Klasa Optima LC-MS, 4 L; faza ruchoma i rekonstytucja próbek
Kolumna ACQUITY UPLC HSS T3	Waters Corporation	186003539	100 Å, 1.8 μm, 2.1 × 100 mm; rozdział UHPLC
System elektroforezy w żelu agarozowym	Bio-Rad Laboratories	1704486	Horyzontalny system elektroforezy Mini-Sub Cell GT; ocena jakości DNA
Agilent 1290 Infinity II/6550 UHPLC-Q-TOF-MS	Agilent Technologies	G7120A/G7167B/G7116B/G6550B	Zestaw modułów 1290 Infinity II UHPLC sprzężony z 6550 iFunnel Q-TOF MS; platforma do niecelowanej metabolomiki surowicy
Algorytm DADA2	Bioconductor	Wersja 1.24.0	Generowanie ASV i usuwanie chimer; wersja dobrana do przepływu pracy R 4.2.1/Bioconductor 3.15
Dehydroepiandrosteron (DHEA)	Sigma-Aldrich / MilliporeSigma	D4000	Indukcja modelu PCOS; 6 mg/100 g masy ciała; CAS 53-43-0
Woda destylowana	Invitrogen / Thermo Fisher Scientific	10977015	UltraPure woda destylowana wolna od DNaz/RNaz; nośnik do gavage'u doustnego w grupach kontrolnej i modelowej
Kwas mrówkowy	Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific	A117-50	Klasa Optima LC-MS, 50 mL; dodatek 0.1% do faz ruchomych LC-MS
Human Metabolome Database	University of Alberta / HMDB	HMDB 5.0	Baza danych do adnotacji metabolitów
Platforma Illumina NovaSeq 6000	Illumina	20012850	System sekwencjonowania wykorzystany przez dostawcę usług sekwencjonowania do sekwencjonowania 16S rRNA metodą paired-end 250 bp
Ziele Lycopus lucidus Turcz.	Beijing Tongrentang Chinese Medicine Co., Ltd.	Partia ZL-20230315	Uwierzytelniony surowiec roślinny do wodnego ekstraktu ZeLan
Metanol	Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific	A456-4	Klasa Optima LC-MS, 4 L; wytrącanie białek w metabolomice surowicy
Baza danych METLIN	Scripps Research	METLIN Classic 2023	Baza danych do adnotacji mas-spektralnych metabolitów
Spektrofotometr NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Mikroobjętościowy spektrofotometr UV-Vis NanoDrop One; ocena ilości i czystości DNA
Zestaw QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit	Qiagen	51604	Ekstrakcja DNA z treści kątnicy; zestaw do izolacji DNA z kału, 50 preparacji
QIIME2	QIIME2 development team	Wersja 2022.2	Przetwarzanie sekwencji 16S rRNA
Oprogramowanie R	R Foundation	Wersja 4.2.1	Analiza statystyczna i przetwarzanie XCMS
Zestawy ELISA do oznaczania testosteronu, LH, FSH i insuliny w surowicy	Cusabio Biotech	CSB-E05100r; CSB-E12654r; CSB-E06869r; CSB-E05070r	Zestawy ELISA dla szczurów do ilościowego oznaczania testosteronu, LH, FSH i insuliny w surowicy
Olej sezamowy	Sigma-Aldrich / MilliporeSigma	S3547	Nośnik do iniekcji DHEA
Pentobarbital sodowy	Sigma-Aldrich / MilliporeSigma	P3761	Znieczulenie; 50 mg/kg domięśniowo
Oprogramowanie SPSS	IBM Corporation	Wersja 26.0	Analiza statystyczna
Uniwersalne startery 16S rRNA 338F/806R	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	Synteza na zamówienie: 338F/806R	Amplifikacja regionów V3-V4; 338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG, 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Pakiet XCMS	Bioconductor / R	Wersja 3.18.0	Detekcja pików, wyrównanie czasu retencji i integracja
Ekstrakt ZeLan	Własny ekstrakt wodny	Partia ZLE-20230402	Leczenie przez gavage doustny; standaryzowana zawartość całkowitych flawonoidów ≥2.5%