Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In Vitro Test na degradację LpxC przez proteazę związaną z błoną FtsH i adaptor LapB z Escherichia coli

153 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71092

⸱

22 czerwca 2026

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Yale University School of Medicine, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Escherichia coli reguluje biosyntezę lipopolisacharydów (LPS) głównie poprzez kontrolowanie degradacji LpxC, deacetylazy katalizującej pierwszy zobowiązany krok syntezy LPS. Celem tego protokołu jest ustanowienie wrażliwego, ilościowego in vitro testu degradacji dla LpxC, z wykorzystaniem zrekonstituowanej proteazy AAA+ FtsH i adaptora LapB w proteoliposomeach.

Streszczenie

Ten protokół przedstawia wrażliwy, ilościowy in vitro test degradacji LpxC za pomocą zrekonstruowanej proteazy AAA+ (ATPazy związanej z różnorodnymi procesami komórkowymi) FtsH i adaptora LapB w proteoliposomeach. Proteasy AAA+ to zależne od ATP maszyny molekularne, które utrzymują homeostazę białkową i regulują różnorodne procesy komórkowe w cytoplazmie lub na błonach komórkowych. W porównaniu z ich cytoplazmatycznymi odpowiednikami, wiązane z błonami proteazy AAA+ są słabo scharakteryzowane ze względu na trudności techniczne w rekonstytucji i pomiarze ich aktywności in vitro. Tutaj, stosujemy system FtsH–LapB–LpxC jako model do opracowania opartego na fluorescencji testu degradacji w proteoliposomeach. FtsH i LapB są zrekonstruowane w proteoliposomeach, aby naśladować natywne środowisko błony, a LpxC jest kowalencyjnie oznakowane fluorescującym barwnikiem Atto488. Degradacja jest inicjowana przez połączenie proteoliposomek z oznakowaną LpxC i ATP i kończona kwasem trichlorooctowym (TCA). Pomyślny test jest zdefiniowany przez zależny od czasu wzrost fluorescencji w rozpuszczalnej frakcji nadstanowej po precipitacji TCA, co odpowiada uwolnieniu fluorescencyjnych fragmentów peptydowych wygenerowanych przez proteoliza LpxC. Ten sygnał umożliwia bezpośrednie ilościowe określenie początkowych szybkości degradacji w zdefiniowanych warunkach. W porównaniu z tradycyjnymi testami opartymi na żelu SDS-PAGE, ta metoda zapewnia znacznie lepszą czułość i umożliwia ilościową analizę kinetyczną. Ponadto, system proteoliposomek umożliwia systematyczne badanie, w jaki sposób komponenty białkowe, takie jak adaptory i anty-adaptory, jak również skład lipidowy, wpływają na degradację LpxC. Chociaż opracowany dla systemu FtsH–LapB–LpxC, ten test można łatwo dostosować do innych wiązanych z błonami proteaz AAA+ i substratów, zapewniając ogólną platformę do badania proteolizy związanej z błonami in vitro.

Wprowadzenie

 Proteasy AAA+ są zachowanymi, zależnymi od ATP maszynami molekularnymi, które odgrywają centralne role w kontroli jakości białek i regulacyjnej proteolizie1,2. Maszyny te zawierają sześciomeryczny pierścień domeny AAA+ ATPazy, która hydrolizuje ATP, rozpoznaje, odwija i translokuje substraty do domeny proteazy przedziałowej w celu degradacji1. Podczas gdy cytoplazmatyczne proteazy AAA+ takie jak ClpXP3 i Lon4 zostały dobrze scharakteryzowane za pomocą dobrze ugruntowanych testów in vitro, wiązane z błoną proteazy AAA+ pozostają stosunkowo słabo poznane. Ta luka w dużej mierze odzwierciedla wyzwania techniczne związane z rekonstytucją białek błonowych w określonych środowiskach lipidowych i ilościowym mierzeniem ich aktywności proteolitycznej in vitro. Ogólnym celem tej metody jest ustanowienie wrażliwych, ilościowych testów do badania aktywności proteolitycznej wiązanych z błoną proteaz.

FtsH jest jedyną niezbędną proteazą AAA+ w Escherichia coli i służy jako prototypowa wiązana z błoną proteaza AAA+5,6,7. Zakotwiczona wewnętrznej błonie przez N-końcowe helisy transbłonowe, FtsH degraduje zróżnicowane zestawy substratów cytoplazmatycznych i wiązanych z błoną, regulując w ten sposób kontrolę jakości białek błonowych, reakcje na stres i homeostazę lipidową8,9,10,11. Jednym z jego najlepiej scharakteryzowanych substratów jest LpxC, rozpuszczalna deacetylaza, która katalizuje pierwszy zobowiązany krok w biosyntezie lipopolisacharydów (LPS)12,13. Skuteczna degradacja LpxC przez FtsH wymaga białka błonowego LapB, które funkcjonuje jako adaptor do specyficznego rozpoznania LpxC i dostarczenia go do proteazy14,15,16,17,18.

Mimo swojego fizjologicznego znaczenia, ilościowa analiza proteolizy pośredniczonej przez FtsH in vitro była ograniczona, szczególnie w przypadku substratów cytoplazmatycznych takich jak LpxC. Tradycyjne testy degradacji in vitro używają FtsH oczyszczonego w micelach detergentowych13,19, które nie zapewniają środowiska błonowego dla wiązanej z błoną proteazy. Ponadto, testy degradacji często opierają się na wykrywaniu znikania substratu opartym na SDS-PAGE13, które może być pracochłonne, o niskiej wydajności i niewystarczająco wrażliwe na analizy kinetykę. Bardziej niedawno, FtsH rekonstytuowany w bicele został użyty do badania degradacji substratów błonowych, jak pioniersko wykazał zespół Heedeok Hong20; jednak, porównywalny system do analizy substratów cytoplazmatycznych nadal nie istnieje. Tutaj, adaptujemy rekonstytucję bicele Heedeok Hong do rekonstytucji proteoliposomem, aby naśladować środowisko błonowe. Oprócz tego, wodorozpuszczalny substrat LpxC jest znacznikowym fluorescencją, co umożliwia wrażliwe i ilościowe pomiary kinetyki degradacji LpxC zależnej od FtsH/LapB in vitro.

Ta metoda powinna być stosowana, gdy naukowcy muszą ilościowo mierzyć proteolizę pośredniczoną przez FtsH wodorozpuszczalnych substratów. Zapewnia ona kilka zalet w porównaniu z istniejącymi podejściami. Po pierwsze, fluorescencyjność oparta na detekcji produktów proteolitycznych, zamiast znikania substratu, znacznie poprawia wrażliwość i zakres dynamiczny, ułatwiając ilościowe porównania aktywności proteolitycznej. Po drugie, użycie proteoliposomek zachowuje kontekst błonowy wymagany dla funkcji FtsH, umożliwiając jednocześnie precyzyjną kontrolę nad składem białkowym i lipidowym18. Wreszcie, chociaż opracowany przy użyciu systemu FtsH-LapB-LpxC, ten protokół jest łatwo przystosowywalny do innych wiązanych z błoną proteaz AAA+ i ich cytoplazmatycznych substratów, które wymagają wiązanych z błoną mechanizmów degradacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Labeling LpxC with Atto488

  1. Przygotowanie LpxC
    1. Ekspresja i oczyszczanie białka LpxC jak opisano wcześniej18. Zmień bufor oczyszczonego LpxC z Tris na 50 mM bufor fosforanowy, pH 7.6 (6 mM NaH2PO4, 44 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) przez filtrację gelową używając kolumny wysokiej rozdzielczości (np. Superdex 200 Increase 10/300 GL).
    2. Skoncentruj LpxC używając kolumny ultrafiltracyjnej do osiągnięcia końcowej koncentracji co najmniej 5 mg/mL w 4 °C.
  2. Labeling LpxC z Atto488
    1. Rozcieńczyć 0.5 mg LpxC w 50 mM buforze fosforanowym, pH 7.6, do końcowej objętości 225 μL. Dodaj 25 μL 1 M sodu bikarbonatu aby ustawić pH na około 8.3.
    2. Rozpuścić 0.24 mg reaktywnego barwnika Atto488 w 20 μL 0.1 M buforu sodu bikarbonatu aby przygotować roztwór bazowy (0.012 mg/μL). Przygotować roztwór roboczy przez rozcieńczenie 2 μL roztworu bazowego z 18 μL 0.1 M buforu sodu bikarbonatu, osiągając końcową koncentrację 0.0012 mg/μL.
    3. Natychmiast dodać 4 μL roztworu roboczego Atto488 do roztworu białka (odpowiadającemu proporcji molowej LpxC: Atto488 3:1). Owinąć probówkę folią aluminiową i inkubaować w 4 °C przez 2 h z delikatnym mieszaniem (18 rpm).
      UWAGA: Zarówno bazowy jak i roboczy roztwór Atto488 mogą być błyskawicznie zamrożone w ciekłym azocie i przechowywane w -80 °C.
  3. Separowanie LpxC-Atto488 od wolnego barwnika
    1. Równoważ kolumnę PD-10 desalting z 10 mL ultraczystej wody, następnie z 15 mL 50 mM buforu fosforanowego, pH 7.6.
    2. Zastosować mieszaninę reakcji labelującej do kolumny i pozwolić jej w pełni wejść w żywicę.
    3. Elutować z 5 mL 50 mM buforu fosforanowego, pH 7.6. Dwie oddzielne pasma odpowiadające LpxC-Atto488 (pierwsze pasmo) i wolnemu barwnikowi Atto488 (drugie pasmo) powinny stać się widoczne. Zbierać frakcje z pierwszego pasma w alikwotach około 0.5 mL.
    4. Analizować elutowane frakcje przez SDS-PAGE. Wizualizować fluorescencje pod oświetleniem UV przed barwieniem Coomassie Brilliant Blue (CBB).
    5. Zbierać frakcje zawierające LpxC-Atto488 i skoncentrować oznaczone białko do około 2 mg/mL.
    6. Szacować efektywność labelowania poprzez zmierzenie stężenia białka i stężenia Atto488 używając mikrowolumometru spektrofotometrycznego.
      UWAGA: Proporcja stężenia Atto488 (w pmol/μL) do stężenia LpxC (w mg/mL) w zakresie 2-5 wskazuje na odpowiedni poziom labelowania. To odpowiada proporcji molowej Atto488 do LpxC w zakresie 1:15 do 1:6 po labelowaniu.
    7. Rozdziela LpxC-Atto488 do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1.5 mL, błyskawicznie zamrażać w ciekłym azocie i przechowywać w -80 °C. W tym momencie protokół może być zatrzymany na maksymalnie 3 miesiące.
      UWAGA: Ciekły azot jest bardzo zimny; obsługiwać z odpowiednim sprzętem ochronnym (rękawice kriogeniczne, ochrona oczu).

2. Rekonstytuowanie FtsH/LapB w proteoliposomes

  1. Przygotowanie liposomów
    1. Przenieść 100 mg 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosforylocholeiny (POPC) w chloroformie do szklanej probówki testowej. Odparować rozpuszczalnik pod łagodnym strumieniem N2, następnie wysuszyć w ssącej chłodni przez noc.
      UWAGA: POPC ma temperaturę przejścia fazowego około -2 °C i jest szeroko stosowany w biofizyce błon, formulacjach liposomów i systemach modelowych komórek.
      UWAGA: Chloroform może uszkodzić oczy, skórę, wątrobę, nerki i układ nerwowy. Wymagany jest odpowiedni sprzęt ochronny (rękawice, ochrona oczu, maseczka) podczas obsługi. Obsługiwać w wyciągu za pomocą szklanej strzykawki.
    2. Dodać 1,315 μL bufru A (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl) do wysuszonych filmów POPC. Znowu rozpuścić lipidy poprzez naprzemienne 1 min sonikacji w łaźni wodnej i 1 min wirowania z maksymalną prędkością przez łącznie około 15 min lub do całkowitego zmieszania. (końcowe stężenie lipidu: 100 mM).
      UWAGA: Aby poprawić resuspendowanie lipidów, ustawić głębokość zanurzenia szklanej probówki w sonikatorze wodnym tak, aby uzyskać maksymalne zmieszanie. Resuspendowane lipidy mogą być przechowywane w -20 °C. W tym momencie protokół może być zatrzymany na maksymalnie 1 miesiąc.
    3. Rozdziela zawiesinę liposomów do porcji po 200 μL i przechowywać w -

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby poprawić wrażliwość in vitro testu degradacji, substrat LpxC został oznaczony fluorescencyjnym barwnikiem Atto488. Grupa succinimidylowa Atto488 reaguje skutecznie z pierwotnymi grupami aminowymi LpxC w łagodnie zasadowych warunkach. Ponieważ bufor Tris zawiera pierwotne aminy, które zakłócają tę reakcję, LpxC oczyszczony w buforze Tris został zamieniony na bufor fosforanowy przez filtrację żelową przed oznaczeniem. W przypadku reakcji oznaczania zastosowano stosunek molowy LpxC do Atto488 wynoszący 3:1, aby...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pierwszym krytycznym etapem tego protokołu jest etykieta Atto488 dla LpxC. Umiarkowane etykietowanie jest kluczowe dla dokładnego pomiaru aktywności degradacji in vitro. Na podstawie naszych eksperymentów optymalizacyjnych, optymalnym stosunkiem molowym LpxC do Atto488 jest od 9:1 do 3:1. Nadmierne stosowanie Atto488 prowadzi do nadmiernego etykietowania, co prawdopodobnie zakłóca stan natywny LpxC. W tych warunkach różnica w degradacji LpxC-Atto488 przez FtsH samodzielnie w porównaniu z FtsH/LapB jest znacznie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Wszystkie badania przeprowadzono na Uniwersytecie Yale. W.M. jest wspierany przez National Institute of General Medical Sciences w ramach numerów grantów R01GM137068 i RM1GM149406 oraz przez Fundację Rodziny Richard and Susan Smith poprzez Nagrodę Odyssey.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1.5 mL microcentrifuge tubeUSA scientific1415-2500
200 nm polycarbonate membraneAvanti Polar Lipids610006
4-20% SDS-PAGEHome made
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigmaA26209
Atto 488 Protein Labeling KitSigma38371
Bio-Beads SM-2 Bio-Rad152-8920Nonpolar polystyrene adsorbent 
Black 96-well plate Costar3915
Bromophenol blueSigma114391
Coomassie Brilliant Blue R250Sigma1.12553
DTTSigmaD9779
EthanolSigma459844
Filter supportAvanti Polar Lipids610014
Glass syringeAvanti Polar Lipids610017
Glass test tubeKIMBLE45066-16150
GlycerolAvantor2136-01
Magnesium acetate tetrahydrateSigma228648
MethanolSigma179337
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75-002-436
Mini-extruderAvanti Polar Lipids610000
MLA-80 rotor Beckman367096Fixed-angle rotor 
Plate readerTecanInfinite M1000 PRO
POPC Avanti Polar Lipids850457C
Refrigerated microcentrifugeThermo Fisher Scientific75002559
SDSAmerican BioAB01920-00500
Sodium bicarbonate SigmaS6014
Sodium chlorideSigmaS9888
Sodium dihydrogen phosphateSigma38400100
Sodium phosphate dibasicSigma567547
SonicatorFisherbrandFB-11201
SpectrophotometerSCILOGEXSCI-V1000
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva 28990944High-resolution gel filtration column 
Tabletop ultracentrifugeBeckmanOptima MAX-XP
TCEP HClGold BiotechnologyTCEP1
Trichloroacetic acid SigmaT6399
Tris BaseSigma252859
Triton X-100 SigmaT8787
Ultracentrifuge tubes Beckman355647
Ultrafiltration column MilliporeUFC8030
Vortex-Genie 2 MixerScientific IndustriesSI-0236 
Zinc acetate dihydrateSigma379786
β-mercaptoethanolSigma444203

Bibliografia

  1. Sauer, R. T., Baker, T. A. Aaa+ proteases: ATP-fueled machines of protein destruction. Annu Rev Biochem. 80 (1), 587-612 (2011).
  2. Neuwald, A. F., Aravind, L., Spouge, J. L., Koonin, E. V. AAA: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res. 9 (1), 27-43 (1999).
  3. Kim, Y. I., Burton, R. E., Burton, B. M., Sauer, R. T., Baker, T. A. Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpxP degradation machine. Mol Cell. 5 (4), 639-648 (2000).
  4. Gur, E., Sauer, R. T. Recognition of misfolded proteins by Lon, a AAA+ protease. Genes Dev. 22 (16), 2267-2277 (2008).
  5. Ogura, T., Wilkinson, A. J. Aaa+ superfamily ATPases: Common structure-diverse function. Genes Cells. 6 (7), 575-597 (2001).
  6. Tomoyasu, T., et al. The Escherichia coli FtsH protein is a prokaryotic member of a protein family of putative ATPases involved in membrane functions, cell-cycle control, and gene expression. J Bacteriol. 175 (5), 1344-1351 (1993).
  7. Tomoyasu, T., et al. Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli. J Bacteriol. 175 (5), 1352-1357 (1993).
  8. Ito, K., Akiyama, Y. Cellular functions, mechanism of action, and regulation of FtsH protease. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 211-231 (2005).
  9. Chai-Danino, M., et al. Membrane-embedded polar residues target membrane proteins for degradation by the quality control protease FtsH. bioRxiv. , (2023).
  10. Arends, J., Thomanek, N., Kuhlmann, K., Marcus, K., Narberhaus, F. In vivo trapping of ftsh substrates by label-free quantitative proteomics. Proteomics. 16 (24), 3161-3172 (2016).
  11. Westphal, K., Langklotz, S., Thomanek, N., Narberhaus, F. A trapping approach reveals novel substrates and physiological functions of the essential protease ftsh in Escherichia coli. J Biol Chem. 287 (51), 42962-42971 (2012).
  12. Young, K., et al. The envA permeability cell division gene of Escherichia coli encodes the second enzyme of lipid a biosynthesis: UDP-3-o-(r-3-hydroxymyristoyl)-n-acetylglucosamine deacetylase. J Biol Chem. 270 (51), 30384-30391 (1995).
  13. Ogura, T., et al. Balanced biosynthesis of major membrane components through regulated degradation of the committed enzyme of lipid a biosynthesis by the AAA protease FtsH (HflB) in Escherichia coli. Mol Microbiol. 31 (3), 833-844 (1999).
  14. Klein, G., Kobylak, N., Lindner, B., Stupak, A., Raina, S. Assembly of lipopolysaccharide in Escherichia coli requires the essential LapB heat shock protein. J Biol Chem. 289 (21), 14829-14853 (2014).
  15. Mahalakshmi, S., Sunayana, M. R., Saisree, L., Reddy, M. YciM is an essential gene required for regulation of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli. Mol Microbiol. 91 (1), 145-157 (2014).
  16. Nicolaes, V., et al. Insights into the function of YciM, a heat shock membrane protein required to maintain envelope integrity in Escherichia coli. J Bacteriol. 196 (2), 300-309 (2014).
  17. Shu, S., Tsutsui, Y., Nathawat, R., Mi, W. Dual function of LapB (yciM) in regulating Escherichia coli lipopolysaccharide synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (17), e2321510121(2024).
  18. Shu, S., Mi, W. Regulatory mechanisms of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli. Nat Commun. 13 (1), 4576(2022).
  19. Tomoyasu, T., et al. Escherichia coli FtsH is a membrane-bound, ATP-dependent protease that degrades the heat-shock transcription factor sigma(32). EMBO J. 14 (11), 2551-2560 (1995).
  20. Yang, Y. Q., et al. Folding-degradation relationship of a membrane protein mediated by the universally conserved ATP-dependent protease FtsH. J Am Chem Soc. 140 (13), 4656-4665 (2018).
  21. Geertsma, E. R., Mahmood, N. A. B. N., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
  22. Asahara, Y., et al. FtsH recognizes proteins with unfolded structure and hydrolyzes the carboxyl side of hydrophobic residues. J Biochem. 127 (5), 931-937 (2000).
  23. Kihara, A., Akiyama, Y., Ito, K. Host regulation of lysogenic decision in bacteriophage lambda: Transmembrane modulation of FtsH (HflB), the cII degrading protease, by HflKC (HflA). Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (11), 5544-5549 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Proteaza FtsHadapter LapBrekonstytucja proteoliposomówproteaza AAA+test fluorescencyjnyhomeostaza białekanaliza kinetyczna

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.