Skuteczność diagnostyczna plazmowego miR-362-3p w połączeniu z ultrasonografią Dopplera w diagnostyce raka piersi

Podsumowanie

Współczynnik rozpoznawania raka piersi jest stosunkowo niski. Metoda tabeli czteropolowej została wykorzystana do analizy wartości diagnostycznej miR-362-3p w połączeniu z ultrasonografią Dopplera w przypadku raka piersi. Połączenie ultrasonografii Dopplera i miR-362-3p skutecznie poprawiło skuteczność diagnostyczną, zapewniając obiecującą metodę diagnostyki raka piersi.

Streszczenie

Rak piersi jest drugim pod względem częstości występowania złośliwym guzem na świecie, poważnie zagrażając życiu kobiet i nakładając ogromny ciężar ekonomiczny. Niniejsze badanie ma na celu zbadanie wartości miR-362-3p w połączeniu z ultrasonografią Dopplera w diagnostyce raka piersi. W badaniu wzięło udział 182 pacjentki z rakiem piersi i 147 pacjentek z dobroczynną chorobą piersi. Poziom miR-362-3p we krwi obwodowej pacjentek został zmierzony za pomocą metody reakcji łańcuchowej polimerazy z fluorescencyjną detekcją w czasie rzeczywistym (RT-qPCR). Analizę różnic w parametrach ultrasonografii Dopplera między dwoma grupami pacjentek przeprowadzono za pomocą testu chi-kwadrat. Krzywa charakterystyki operatora odbiornika (ROC) została wykorzystana do oceny skuteczności diagnostycznej miR-362-3p, Wskaźnika Oporu (RI) i Wskaźnika Pulsacji (PI). Skuteczność diagnostyczna ultrasonografii Dopplera w połączeniu z miR-362-3p we krwi obwodowej w diagnostyce raka piersi została przeanalizowana za pomocą metody tablicy czterokrotnej. Poziomy miR-362-3p były znacząco obniżone u pacjentek z rakiem piersi. Istniały istotne różnice w parametrach ultrasonografii dwuwymiarowej. miR-362-3p, RI i PI mają wartość diagnostyczną w raku piersi. Połączona wartość diagnostyczna trzech czynników była wyższa. Ultrasonografia w połączeniu z miR-362-3p znacząco poprawiła czułość, dokładność i wartość predykcyjną ujemną w diagnostyce raka piersi. Ultrasonografia Dopplera w połączeniu z miR-362-3p mogłaby poprawić skuteczność diagnostyczną raka piersi, co może zapewnić nieinwazyjne i potencjalne narzędzie pomocnicze w diagnostyce raka piersi.

Wprowadzenie

Według statystyk Międzynarodowej Agencji Badań nad Rakiem, wskaźnik zachorowalności na raka piersi przekroczył ten dla raka płuc w 2020 roku¹. Rak piersi to złośliwy guz, który często występuje i jest jedną z głównych przyczyn zgonów związanych z rakiem u kobiet na całym świecie¹. Wczesne rozpoznanie raka piersi przyczynia się do lepszej prognozy dla pacjentów. Biopsja tkanki jest standardowym złotym sposobem diagnozowania raka piersi. Jednak jest to inwazyjna metoda diagnostyczna i nie ma zastosowania u pacjentów z rakiem piersi we wczesnym stadium².

Ultrasonografia Dopplera jest powszechnie stosowaną techniką obrazowania do przesiewowego badania i pomocniczej diagnozy raka piersi³. Ultrasonografia Dopplera umożliwia dokładną ocenę wielkości guzków, sygnałów przepływu krwi i stanu przerzutów do węzłów chłonnych⁴. Ultrasonografia Dopplera piersi, ze względu na swoje zalety takie jak brak promieniowania jonizującego, bezpieczeństwo i nieinwazyjność, a także możliwość wielokrotnych badań, stała się jedną z najczęściej stosowanych technik obrazowania w przesiewowym badaniu i diagnozie raka piersi⁵. Jednak ultrasonografia Dopplera jest podatna na zakłócenia tła tkankowego podczas wykrywania nowotworów piersi o niskiej gęstości lub małej objętości, co prowadzi do znacznego spadku czułości diagnostycznej i utrudnia spełnienie klinicznych potrzeb wczesnej diagnozy⁶. Dlatego konieczne jest opracowanie biomarkerów osocza, które mogą pokonać ograniczenia technologii ultrasonografii Dopplera. Jeśli kombinacja dwóch metod może zwiększyć czułość diagnozy raka piersi, będzie miała znaczącą wartość kliniczna i praktyczną.

MicroRNAs (miRNAs) to klasa niekodujących cząsteczek RNA o długości około 20 do 24 nukleotydów^7,8. Jedną z cech miRNAs jest wysoki stopień konserwatyzmu podczas procesu ewolucji. miRNAs mają szerokie rozmieszczenie w tkankach, które są nie tylko specyficznie wyrażane w różnych komórkach tkanek ludzkich, ale także mogą stabilnie występować w wielu cieczach ustrojowych, takich jak krew i ślina⁹. Te cechy dystrybucji zapewniają zalety w rozwijaniu nieinwazyjnych markerów diagnostycznych. Funkcjonalnie miRNAs degradują mRNA poprzez komplementarne wiązanie się z regionami 3' nieprzetłumaczonymi (UTR)^10,11, uczestnicząc w serii kluczowych procesów patologicznych i fizjologicznych, takich jak reakcje zapalne komórek, stres oksydacyjny, apoptoza oraz proliferacja i różnicowanie¹². Duża liczba badań potwierdziła, że nieprawidłowe zmiany w profilach ekspresji miRNA są ściśle związane z występowaniem i rozwojem raka piersi^13,14. Dysregulacja ekspresji miRNA może promować złośliwą transformację komórek nabłonkowych piersi poprzez regulację sieci ekspresji onkogenów lub genów supresorowych nowotworów. miR-362-3p jest typowym czynnikiem hamującym progresję nowotworową. Wiele raportów wykazało, że miR-362-3p hamowało progresję raka piersi^15,16,17. Assiri i wsp. poinformowali, że niska ekspresja miR-362-3p była ściśle związana z złą prognozą i krótszym przeżyciem ogólnym u pacjentów z rakiem piersi¹⁵. Mechanizmicznie, miR-362-3p wywierało działanie przeciwnowotworowe w raku piersi poprzez wiązanie się z DEAD-box helikazą 5 (DDX5) w celu promowania proliferacji, inwazji i migracji komórek nowotworowych¹⁶. Ponadto zespół pod kierunkiem Kanga stwierdził, że miR-362-3p było znacząco obniżone w tkankach nowotworowych piersi, a ukierunkowana regulacja ekspresji miR-362-3p może stanowić nową potencjalną strategię terapeutyczną w leczeniu raka piersi¹⁷. Jednak nie ma żadnego raportu na temat tego, czy miR-362-3p może służyć jako wczesny marker diagnostyczny raka piersi.

Niniejsze badanie mierzyło poziom ekspresji miR-362-3p w osoczu i jednocześnie analizowało podstawowe parametry obrazu ultrasonografii Dopplera u pacjentów z rakiem piersi. Badanie dokładnie zbadał wartość zastosowania połączonego stosowania poziomów ekspresji miR-362-3p w osoczu i parametrów obrazu ultrasonografii Dopplera oraz wyraźnie wykazało skuteczność tego połączonego podejścia diagnostycznego w przesiewowym badaniu raka piersi oraz w różnicowaniu diagnostycznym między dobroczynnymi i złośliwymi chorobami piersi.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Zgoda została udzielona przez Komitet Etyczny Szpitala Uniwersyteckiego Shandong Drugiego Uniwersytetu Medycznego, Szkoły Medycyny Klinicznej, Shandong Drugi Uniwersytet Medyczny (numer zgody: wyfy-2023-ky-124). Pisemną zgodę na udział w badaniu uzyskały wszystkie osoby włączone do badania. Reaktancje i sprzęt użyty w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Osoby biorące udział w badaniu

Obliczenia wielkości próby przeprowadzono za pomocą oprogramowania G*Power 3.1, na podstawie niezależnej próby testu t Studenta. Ustawiono efekt średniej wielkości (Cohen’s d = 0.5, szeroko stosowany w badaniach obserwacyjnych klinicznych), dwustronny test, α = 0.05 i moc (1 − β) = 0.95. Obliczenia wskazały, że na co najmniej 105 uczestników wymagano w każdej grupie. Ostatecznie włączono 182 pacjentów z rakiem piersi i 147 pacjentów z łagodnymi zmianami piersi, a rzeczywista wielkość próby obu grup znacznie przekraczała minimalną wymaganą wielkość próby, zapewniając wystarczającą moc statystyczną do wsparcia wniosków badania i kontrolując ryzyko błędu typu II w akceptowalnym zakresie. Wszyscy uczestnicy byli ściśle i kolejno włączani zgodnie ze ujednoliconymi kryteriami włączania i wyłączania.

W latach 2023-2024 wszyscy pacjenci zostali włączeni w Szpitalu Uniwersyteckim Shandong Drugiego Uniwersytetu Medycznego, Szkole Medycyny Klinicznej, Shandong Drugi Uniwersytet Medyczny. Zmiany łagodne: niezłośliwe zmiany zostały potwierdzone przez badanie histopatologiczne. Rak piersi: złośliwe nowotwory zostały potwierdzone przez badanie histopatologiczne. Próbki krwi żylnej zostały pobrane od wszystkich uczestników po nocnym poście. Próbki krwi żylnej zostały przeciwzakrzepowe i skoncentrowane w celu oddzielenia osocza, zgodnie ze standardowymi procedurami, a następnie przeniesione do −80 °C do długotrwałego przechowywania, które następnie zostały wykorzystane do ekstrakcji miRNA. Wszystkie próbki osocza były ściśle ograniczone do nie więcej niż dwóch cykli mrożenia i odmrażania przed ekstrakcją RNA, aby zapobiec degradacji miRNA. Wszystkim pacjentom w pełni wyjaśniono protokół badania i dobrowolnie złożyli pisemną zgodę na udział w badaniu przed włączeniem.

Kryteria włączania dla pacjentów z rakiem piersi: (1) Pacjenci z potwierdzonym histopatologicznie pierwotnym rakiem piersi. (2) Brak leczenia chirurgicznego przed włączeniem. (3) Pacjenci, którzy nie otrzymywali radioterapii ani chemioterapii przed pobraniem próbek.

Kryteria włączania dla pacjentów z łagodnymi chorobami piersi: (1) Potwierdzone histopatologicznie łagodne zmiany piersi. (2) Brak innych ogólnoustrojowych nowotworów złośliwych lub zmian przedraków. (3) Nie w ciąży i nie karmiące. (4) Brak ciężkiej ostrej infekcji lub przewlekłej choroby zapalnej.

Kryteria wyłączania dla pacjentów z rakiem piersi i łagodnymi zmianami piersi: (1) Ciężka infekcja piersi lub ostra krytyczna choroba. (2) Ciężka dysfunkcja wątroby lub nerek, lub choroba autoimmunologiczna. (3) Pacjenci, którzy otrzymywali terapię hormonalną w ciągu ostatnich 6 miesięcy.

2. Badanie ultrasonograficzne z wykorzystaniem dopplerografii

Obie piersi pacjenta zostały dokładnie zbadane w czterech kwadrantanach za pomocą dopplerografii. Dwuwymiarowe skanowanie ultrasonograficzne zostało wykorzystane do rejestracji cech zmian, w tym granic, kształtu, wewnętrznego echo, tylnego echo oraz współczynnika proporcji zmiany. Obrazowanie dopplerowskie zostało zastosowane do oceny parametrów przepływu krwi zmiany, w tym wskaźnika oporu (RI), wskaźnika pulsacji (PI) oraz maksymalnej prędkości przepływu krwi (V_max). Sygnały przepływu krwi były klasyfikowane zgodnie z wcześniej opisanym systemem klasyfikacji¹⁸: Stopień 0: Brak sygnału przepływu krwi; Stopień I: Minimalny sygnał przepływu krwi; Stopień II: Długość sygnału przepływu krwi przekracza połowę średnicy zmiany; Stopień III: Obfite sygnały przepływu krwi.

3. Kryteria pozytywnego rozpoznania ultrasonograficznego raka piersi

Kryteria te obejmują (1) Niejasne granice; (2) Nieregularny kształt; (3) Nierównomierne wewnętrzne echo; (4) Osłabione tylne echo; (5) Współczynnik proporcji >1; (6) RI > 0,70; (7) PI > 1,50; (8) Maksymalna prędkość przepływu krwi (Vmax)> 18,00 cm/s; (9) Sygnał przepływu krwi ≥ stopień II. Każda zmiana, która spełnia którekolwiek z powyższych podejrzanych kryteriów, jest klasyfikowana jako klasa ultrasonograficzna dodatnia, podczas gdy zmiany bez podejrzanych cech są klasyfikowane jako klasa ultrasonograficzna ujemna.

Wyniki

Poziom miR-362-3p był znacząco obniżony u pacjentów z rakiem piersi

Porównano informacje bazowe kliniczne i cechy patofizjologiczne 182 pacjentów z rakiem piersi i 147 pacjentów z łagodnymi zmianami piersi. Szczegółowe dane przedstawiono w Tabeli 1. Do pomiaru poziomów miR-362-3p w osoczu u dwóch grup pacjentów zastosowano RT-qPCR. Wyniki wykazały, że krążąca ekspresja miR-362-3p u pacjentów z rakiem piersi była znacznie niższa niż u pacjentów z łagodnymi chor...

Dyskusja

Rak piersi jest jednym z najczęstszych rodzajów złośliwych nowotworów, stając się istotnym problemem zdrowia publicznego, zagrażającym zdrowiu ludzi^19,20. Wysokie współczynniki występowania i śmiertelności nie tylko powodują poważne wstrząsy psychologiczne w rodzinach pacjentów, ale także przynoszą ogromne obciążenie dla społeczeństwa i gospodarki. Większość pacjentów z rakiem piersi ma już doświadczyła miejscowej inwazji lub przerzutami odległymi w momencie diag...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BD Vacutainer K2EDTA Blood Collection Tube (purple cap)	USA	367861	Do pobierania krwi żylnej i przygotowania osocza do analizy miRNA.
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Laboratories	1855195	96-dołkowy, 6-kanałowy fluorometryczny instrument PCR, korzystający z przewodnictwa światłowodowym i chłodzenia CCD, z synchroniczną kolekcją fluorescencji w każdym dołku bez opóźnienia. Zakres dynamiczny osiąga 10 rzędów wielkości i jest zgodny zarówno z konwencjonalnym qPCR, jak i analizą krzywych topnienia o wysokiej rozdzielczości (HRM). Oprogramowanie obsługuje eksport w formacie RDML, jest zgodne zarówno z badaniami naukowymi, jak i testami klinicznymi, i jest powszechnie stosowany w eksperymentach takich jak ilościowa ilościowa ekspresji genów, typowanie SNP i analiza metylacji.
Kirgen 0.1 mL PCR Tubes (or 8-Strip PCR Tubes), Sterile	Shanghai, China	KG0811	Służy do przygotowywania i przeprowadzania reakcji qPCR.
Kirgen 1.5 mL Microcentrifuge Tubes, Sterile	Kirgen Biotech Co., Ltd.	KG2911	Służy do przechowywania próbek, przygotowywania reagentów i wirowania podczas ekstrakcji miRNA i odwrotnej transkrypcji.
miRcute miRNA Isolation Kit (Spin Column)	Beijing, China	DP501	Do izolacji i oczyszczania całkowitego RNA, w tym miRNA z próbek osocza ludzkiego, z wykorzystaniem technologii opartej na kolumnach wirowania.
miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit	Beijing, China	KR211	Do odwrotnej transkrypcji oczyszczonego miRNA w pierwszo-pasmowy cDNA metodą ogona poli(A).
miRcute Plus miRNA qPCR Kit (SYBR Green)	Beijing, China	FP411	Do ilościowej wykrywalności PCR w czasie rzeczywistym miRNA za pomocą chemii opartej na SYBR Green I.
Roche LightCycler 480 Multiwell Plate 96, White	Mannheim, Germany	4729692001	Stosowany do ilościowych badań PCR w czasie rzeczywistym na urządzeniu Roche LightCycler 480.
Siemens Acuson 14L5 / 14L5 SP Linear Array Probe	Siemens Healthineers	10041226	Wysokoczęstotliwościowa sonda liniowa, o zakresie częstotliwości 5–14 MHz, specjalnie zaprojektowana do badania narządów powierzchniowych, takich jak piersi i tarczyca. Oferuje wysoką rozdzielczość i doskonałe kontrasty tkankowe oraz wspiera elastografię i automatyczne skanowanie objętości piersi.
Siemens Acuson S2000/S3000/S1000 Ultrasound System	Siemens Healthineers	/	System ultrasonograficzny Dopplera kolorowego obsługuje funkcje obrazowania 3D/4D w czasie rzeczywistym i funkcje obrazowania sprężystości i jest szeroko stosowany w wielu działach, takich jak brzuch, układ krążenia, ginekolologia i położnictwo oraz pierś.
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4375786	96-kanałowy gradientowy instrument PCR, obsługuje optymalizację temperatury gradientowej; ma wysoką dokładność kontroli temperatury; stosowany do syntezy cDNA i konwencjonalnej amplifikacji PCR.