Opracowanie protokołu rekonstrukcji pęcherzyków COPII bez komórek do badania sortowania STING w systemie komórkowym HEK-293

Podsumowanie

Protokół ten opisuje zoptymalizowany system wolnokomórkowy do rekonstytucji inkorporacji STING do pęcherzyków COPII, umożliwiający kontrolowaną analizę biochemiczną sortowania ładunków podczas eksportu ER.

Streszczenie

Szlak cGAS–STING jest centralnym elementem odporności wrodzonej. Po aktywacji białko STING rezydentyczne w retikulum endoplazmatycznym (ER) jest pakowane do pęcherzyków COPII i transportowane do aparatu Golgiego, aby rozpocząć sygnalizację w dalszej fazie. Pomimo znaczenia tego procesu, molekularne mechanizmy regulujące sortowanie STING w pęcherzykach COPII pozostają niedo do końca poznane. Przedstawiono tutaj zoptymalizowany workflow do in vitro rekonstrukcji pęcherzyków COPII, aby ułatwić kontrolowaną analizę wyboru ładunku. Opisana jest skalowalna metoda przygotowania cytosolu o wysokim stężeniu (30–40 mg/mL) z komórek zawiesinowych HEK-293F, połączona z prostą procedurą generowania półprzepuszczalnych komórek HEK-293T jako zdefiniowanego źródła błony. W porównaniu z tradycyjnymi systemami opartymi na komórkach adherentnych, takie podejście poprawia skalowalność, obniża koszty i zwiększa powtarzalność. Stosując STING jako model ładunku, pączkowanie pęcherzyków COPII oraz włączenie ładunku są weryfikowane analizą Western blot, z efektywnością pakowania bazalną na poziomie około 20% w określonych warunkach. System ten umożliwia kontrolowaną manipulację parametrami biochemicznymi, w tym stymulacją nukleotydów, w celu oceny ich wpływu na włączenie ładunku. Protokół ten zapewnia solidną i adaptowalną platformę do badania sortowania ładunków pośredniczonego przez COPII i może być rozszerzany o badania dodatkowych białek transbłonowych oraz czynników regulacyjnych zaangażowanych w eksport ER.

Wprowadzenie

Szlak sygnalizacyjny cGAS-STING pełni funkcję podstawowego mechanizmu wrodzonego układu odpornościowego, wykrywając cytosolowe dwuniciowe DNA (dsDNA) w celu inicjowania odpowiedzi przeciwwirusowej. Po wykryciu dsDNA enzym cGAS produkuje cykliczny dinukleotyd cGAMP, który działa jako drugi przekaźnik wiążący się ze STING ^1,2. Co istotne, STING znajduje się jako nieaktywny dimer w siatkówce endoplazmatycznej (ER) w warunkach stacjonarnych³. Jego aktywacja wymaga szybkiej, silnie regulowanej translokacji z oddziału ratunkowego do aparatu Golgiego. To właśnie w Golgim STING rekrutuje i aktywuje kinazy poniżej TBK1 i IRF3, prowadząc do produkcji interferonów typu I oraz cytokin prozapalnych⁴.

Transport STING jest pośredniczony przez pęcherzyki powlekane COPII, uniwersalne nośniki eksportu białek z ER⁵. Montaż powłoki COPII — obejmującej mały GTPazę Sar1, kompleks Sec23/24 z wewnętrznej powłoki oraz zewnętrzny kompleks Sec13/31 — odpowiada zarówno za deformację błony ER do pęcherzyków, jak i selektywne rekrutowanie ładunku ^6,7. Sec22b jest sortowany do pęcherzyków COPII za pomocą epitopu strukturalnego uznanego przez kompleks Sec23/24 COPII⁸. Inne ładunki to rodzina p24 oraz marker ERGIC ERGIC-53, oba zależą od motywu dihydrofobowego φC na końcu C do sortowania⁹. Natomiast niektóre białka zakotwiczone w ER, takie jak ryboforyna I (RPN1), pozostają ograniczone do ER i służą jako markery nienaruszonych struktur ER, ponieważ nie są transportowane przez pęcherzyki COPII¹⁰. W związku z tym, w eksperymentach rekonstrukcji pęcherzyków COPII bez komórek, Sec22b i p24 są często traktowane jako ładunki COPII, podczas gdy ryboforyna służy jako marker do monitorowania zanieczyszczenia ER w preparatach pęcherzyków. Chociaż ogólny mechanizm transportu COPII jest dobrze scharakteryzowany, konkretne sygnały molekularne wywołujące selektywną sekwestrację aktywowanego STING w tych pęcherzykach pozostają nieuchwytne. Zrozumienie tych mechanizmów sortowania jest kluczowe, ponieważ zaburzenia regulacji transportu STING są powiązane z różnymi chorobami autoimmunologicznymi i autozapalnymi, takimi jak naczynioterapia związana ze STING, która zaczyna się w niemowlęctwie (SAVI) oraz zespół COPA¹¹. Jednak badanie tych przejściowych i wysoce dynamicznych zdarzeń w nienaruszonych komórkach pozostaje technicznie trudne.

Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano zoptymalizowany system rekonstrukcji wolnych od komórek, który miał zbadać molekularne wymagania sortowania ładunków za pomocą COPII. Chociaż badania in vitro od dawna są podstawą biologii komórki^{, ich} powszechne zastosowanie często jest ograniczone przez wysokie koszty i złożoność przygotowania wysokiej jakości komponentów. W tym badaniu wprowadzono uprościony workflow, który wykorzystuje komórki zawiesinowe HEK-293F jako ekonomiczne źródło aktywnego cytosolu oraz półprzepuszczalne komórki HEK-293T jako odporne błony dawcy. Ogólny przebieg działania systemu rekonstrukcji pęcherzyków COPII bez komórek został zilustrowany na Rysunku 1. W tym systemie Sec22b był stosowany jako dodatnia kontrola do potwierdzania włączenia ładunku do pęcherzyków, natomiast RPN1 jako kontrola ujemna do monitorowania i wykluczania zanieczyszczenia błony ER. Wykorzystując STING jako ładunek dowodu koncepcji, badanie wykazało, że system skutecznie modeluje kluczowe biochemiczne aspekty sortowania STING. Platforma ta dostarczyła wszechstronnego, skalowalnego narzędzia do identyfikacji czynników cytosolowych i sygnałów błonowych odpowiedzialnych za sortowanie STING, z potencjalnymi zastosowaniami do badania szerokiego zakresu innych szlaków transportu pęcherzykowego.

Protokół

Linie komórkowe HEK-293F (RRID: CVCL_6642) i HEK-293T (RRID: CVCL_0063) zostały pozyskane z Centrum Zasobów Komórkowych w Peking Union Medical College. Obie linie komórkowe zostały potwierdzone przez profilowanie krótkich powtórzeń tandemowych (STR) i potwierdzone, że są wolne od skażenia mykoplazmą. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

W badaniu nie brał udziału żaden człowiek ani kręgowce. Dlatego nie wymagała się etycznego zatwierdzenia. Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego biobezpieczeństwa.

1. Przygotowanie cytosolu komórkowego HEK-293F

1. Nasiać komórki HEK-293F o gęstości 1× 10^{6 komórek} /mL w pożywce ssaków o 100 mL zdefiniowanej przez ssaki, uzupełnionej o 1% penicyliny–streptomycyny. Hodować komórki w stożkowej kolbce o pojemności 500 mL.
2. Inkubuj hodowlę zawiesiny w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ w inkubatorze wstrząsającym przez 60 godzin.
3. Pobieraj komórki przez wirowanie w 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Określ całkowitą liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.
4. Przemyj pellet komórkowy 50 mL lodowato zimnej soli fosforanowej (PBS). Wirować w 300 × g przez 5 minut w 4 °C.
5. Ponownie zawiesić pellet komórkowy w równej objętości lodowatego buforu B88 (20 mM HEPES, pH 7,3; 250 mM sorbitol; 150 mM octan potasu; 5 mM octan magnezu).
6. Rozlewaj komórki na lodzie, przepuszczając zawiesinę przez strzykawkę o pojemności 5 mL wyposażoną w igłę 22 gauge, co pozwala wykonać ponad 100 uderzeń.
7. Zbadaj lizę komórek za pomocą mikroskopu świetlnego. Usuwaj resztki komórkowe przez wirowanie w 20 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
8. Przelej supernatant do rurek ultrawirówki. Wirówka w 100 000 × g przez 1 godzinę w 4 °C.
   UWAGA: Upewnij się, że rurki ultrawirówek są odpowiednio wyważone, aby zapobiec uszkodzeniom sprzętu i zagrożeniom bezpieczeństwa.
9. Zbierz oczyszczony supernatant. Skoncentruj próbkę za pomocą urządzenia do ultrafiltracji o masie cząsteczkowej 3 kDa (MWCO) przy 4 000 × g przy 4 °C.
10. Zmierz stężenie białka za pomocą testu kwasu bicynchoninowego (BCA). Dostosuj stężenie do 30–40 mg/mL.
    UWAGA: Obchodzić się z ciekłym azotem za pomocą odpowiedniego sprzętu ochronnego, aby uniknąć urazów kriogenicznych.
11. Aliquot cytosol. Zamroz aliquoty na szybko, w ciekłym azotie i przechowuj w temperaturze −80 °C (Rysunek 2A)
    UWAGA: Unikaj więcej niż dwóch cykli zamrożenia i rozmrażania. Przechowuj aliquoty w temperaturze −80 °C przez maksymalnie 6 miesięcy.

2. Przygotowanie półprzepuszczalnych komórek HEK-293T

1. Komórki HEK-293T na tablicy wykazujące pełnowymiarowy ludzki STING o gęstości 3 × 10^{6 komórek} na naczynie o wymiarze 15 cm w 15 mL DMEM uzupełnionym o 10% surowicę płodową bydła i 1% penicylin-streptomycynę. Inkubuj w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 48 godzin.
2. Zbieraj komórki z mieszanką około 60%.
3. Aspiruj podłoże i przemyj komórki dwukrotnie 10 ml lodowatego PBS.
4. Dodaj 2 mL trypsyny–EDTA o stężeniu 0,25%. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2–3 minuty, aby odłączyć komórki.
5. Dodaj 200 μL inhibitora trypsyny soi (1 mg/mL), aby zatrzymać trypsynizację. Ponownie zawiesz komórki w 10 mL lodowatego buforu KHM (20 mM HEPES, pH 7,2; 110 mM octan potasu; 2 mM octan magnezu).
6. Rozpylaj komórki przez wirowanie w 250 × g przez 3 minuty. Usuń nadmiar.
   UWAGA: Digitonin jest toksyczna. Trzymaj się w okapie z odpowiednim środkiem ochrony osobistej.
7. Ponownie zawiesij komórki w 6 mL lodowatego buforu KHM. Dodaj 6 μL roztworu zapasowego digitoniny (40 mg/mL w DMSO).
8. Delikatnie mieszaj przez inwersję. Inkubuj na lodzie przez 5 minut.
9. Dodaj 8 mL bufora KHM, aby rozcieńczyć digitoninę. Wirówka w dawce 250 × g przez 3 minuty, aby pobrać komórki przepermeabilizowane.
10. Ponownie zawiesić pellet w 14 mL lodowatego bufora HEPES (50 mM HEPES, pH 7,3; 90 mM octana potasu). Inkubuj na lodzie przez 10 minut.
11. Wirówka na 250 × g przez 3 minuty. Ponownie zawiesić pellet w 1 mL lodowatego bufora KHM·Cl (20 mM HEPES, pH 7,3; 110 mM KCl; 2 mM MgCl₂).
12. Wirówka na 10 000 × g przez 15 sekund. Usuń nadmiar.
13. Ponownie zawiesić pellet w buforze 50 μL KHM·Cl. Zmierz stężenie białka za pomocą testu BCA i dostosuj do 5–7 mg/mL.

3. Eksperyment rekonstrukcji pęcherzyków COPII bez komórek

1. Przygotuj wszystkie odczynniki wymienione w Tabeli Materiałów. Należy je zażywać i przechowywać w temperaturze −80 °C.
2. Przygotuj mieszaninę reakcji 50 μL zawierającą 110 mM KCl, 20 mM HEPES (pH 7,2), 2 mM MgCl₂, koktajl inhibitorów proteazy (1×), 0,2 mM GTP oraz system regeneracji ATP (40 mM fosforanu kreatynowego, 0,2 mg/mL fosfokinazy kreatynowej, 1 mM ATP).
3. Dodaj cGAMP do końcowego stężenia 10 μM. Inkubuj reakcję w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
4. Dodaj 50 μg półprzepuszczalnych komórek HEK-293T. Mieszaj delikatnie.
5. Dodaj 80 μg cytosolu HEK-293F, aby zainicjować tworzenie pęcherzyków. Inkubuj w 37 °C przez 45 minut.
6. Umieść reakcję na lodzie, aby zakończyć pączkowanie. Wirówka w 12 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
7. Zbierz supernatant zawierający pęcherzyki. Zachowaj granulki zawierające organelle.
8. Ultrawirówka supernatantu w 100 000 × g przez 1 godzinę w 4 °C. Ponownie zawiesij osad pęcherzyka w buforze obciążającym białko 30 μL.
9. Próbki cieplne w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Wirówka w 20 000 × g przez 5 minut, aby usunąć osady.
10. Wykonaj SDS-PAGE i przenieś białka do membran PVDF. Sonda z przeciwciałami przeciwko Sec22b, STING i RPN1.

Wyniki

Podczas przygotowania cytosolu komórkowego HEK-293F oceniono dwa parametry w celu oceny jakości cytosolu. Komórki HEK-293F zostały wyhodowane w wysokiej gęstości, co dało ekstrakty cytosolowe o wysokim stężeniu białka. Ponadto zakres rozbicia komórek po lizie za pomocą strzykawki oceniono mikroskopią świetlną, co potwierdza skuteczną lizę komórek w zastosowanych warunkach (Rysunek 2B).

Do generowania półpermeabilizowanych komórek HEK-293T pozyskano hodowle z około...

Dyskusja

Odtworzenie istotnych reakcji biochemicznych in vitro położyło podwaliny pod systemy wolne od komórek, które odegrały kluczową rolę w licznych przełomowych odkryciach. Należą do nich identyfikacja cGAS jako cytosolowego czujnika DNA^14,15, wyjaśnienie roli cytochromu c w apoptozie oraz odkrycie pierwszej demetylonazy histonowej JHDM1^16,17. Takie zdefiniowane podejścia biochemiczne są szczególnie s...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5 mL sterylnych strzykawek	WEGO	V526273	Wykorzystywane do lizy komórek mechanicznych
Adenozyna 5&-trifosforan (ATP)	MCE	HY-B2176	100 mM w wodzie, pH 7,3, przechowywane przy i minus; 80 i stopni; C
Adobe Illustrator	Adobe Systems Incorporated	SCR_010279	Wykorzystywane do tworzenia ilustracji koncepcyjnych i schematów
System regeneracji ATP (10& razy;)	—	—	Mieszanina regenerująca energię zawierająca fosforan kreatyny, kinazę kreatynową i ATP
Zestaw do testowania białek BCA	Thermo Fisher	23227	Kolorymetryczny test białkowy
BioRender	BioRender	SCR_018361	Wykorzystywane do tworzenia ilustracji koncepcyjnych i schematów
BSA	Pochodzenie	BN20815	Odczynnik blokujący
Inkubator wstrząsający dwutlenkiem węgla	ZhiChu	ZCZY-CS8	Utrzymuje temperaturę, CO2 oraz mieszanie do hodowli zawiesiny
Inkubator CO2	Thermo Fisher	3110	Utrzymuje temperaturę i CO2 dla przylegającej kultury
Konwencjonalny mikroskop	Olympus	CX43	Wykorzystywane do oceny lizy i morfologii komórek
Kinaza kreatynowa	Roche	CKRO	Zapas 20 mg/mL w buforze, przechowywany na poziomie − 80 i stopni; C
Fosforan kreatyny	Roche	CRPHO-RO	Komponent systemu regeneracji ATP
Wirówka biurowa	Eppendorf	5810R	Stosowany do wirowania o niskich prędkościach
Digitonin	Sigma	D5628	Zapas 40 mg/mL w DMSO, przechowywany przy i minus; 20 & f; C
DMEM	Corning	10-013-CMR	Podłoże wzrostu dla ogniw HEK-293T
D-Sorbitol	Sangon	A100691	1 M roztworu w wodzie, przechowywany w temperaturze 4 i stopni; C
Reagent wykrywający ECL	Pochodzenie	BN16009	Podłoże chemiluminescencyjne
Zbiornik elektroforezy	Bio-Rad	1658001	Aparat dla SDS-PAGE
Serum bydła płodu (FBS)	Corning	35-015-CV	Suplement serum
Wirnik o stałym kącie (TFT 80.2)	Thermo Fisher	54456	Wirnik do ultrawirowania
Ogniwa FreeStyle 293-F	Thermo Fisher	R79007	Stosowany do przygotowania cytosolu
IgG przeciwmyszy dla kóz (H+L)	Invitrogen	31430	Przeciwciało wtórne sprzężone z HRP
IgG antykrólikowy dla kóz (H+L)	Invitrogen	31460	Przeciwciało wtórne sprzężone z HRP
GraphPad Prism	Oprogramowanie GraphPad	SCR_002798	Wykorzystywany do analizy statystycznej (jednokierunkowa ANOVA) oraz generowania ilościowego wykresu słupkowego na Rysunku 4D.
Guanozyna 5′-trifosforan (GTP)	MCE	HY-113225	10 mM w wodzie, pH 7,3, przechowywane przy − 80 i stopni; C
Komórki HEK-293T wyrażające ludzki STING	—	—	Generowane wewnętrznie; Wykorzystywane jako źródło membranowe
Bufor HEPES (1 M, pH 7,3)	Beyotime	C0215	Składnik buforowy do przygotowania roztworu
System obrazowania	Bio-Rad	12003153	Wykorzystywane do wykrywania sygnałów
Tetrahydrat octana magnezu	Badania Hampton	HR2-561	Składnik buforowy do przygotowania B88
Heksahydrat chlorku magnezu	Badania Hampton	HR2-559	Komponent bufora
Mikrowirówka	Eppendorf	5420R	Stosowany do wirowania średniej prędkości
Mikrowirówka	Eppendorf	5420	Wykorzystywane do rutynowej wirówki
Spektrofotometr NanoDrop	Thermo Fisher	840-317400	Wykorzystywane do ilościowania białek
OPM-CD Trans293 medium	OPM	P82019	Medium bezsurowiczne do hodowli zawieszenia HEK-293F
Penicylina– Streptomycyna (100& razy;)	Servicebio	G4003	Suplement antybiotykowy do hodowli komórek
Fenylymetylosulfonylofluorek (PMSF)	Sangon	A610425	Inhibitor proteazy
Inhibitory fosfatazy	Lablead	C0104	Zapobieganie defosforylacji białek
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)	Servicebio	G4202	Bufor dla płuczących komórek
Octan potasu	Sigma	236497	1 M roztworu w wodzie, przechowywany w temperaturze 4 i stopni; C
Zasilacz	Bio-Rad	1645052	Zapewnia napięcie do elektroforezy
Koktajl inhibitorów proteazy, wolny od EDTA	Roche	4693132001	Mieszanina inhibitorów proteaz o szerokim spektrum
Membrana PVDF	Millipore	ISEQ00010	Membrana do western blottingu
Przeciwciało RPN1 (króliczy mAb)	Abcam	ab197888	Tablica ER
SDS-PAGE żel (4– 20%)	—	—	Wykorzystywane do separacji białek
Bufor ładowania SDS-PAGE (5&razy;)	Solarbio	P1040	Bufor przygotowujący próbkę białka
Przeciwciało Sec22b (króliczy mAb)	Abcam	ab181076	Znacznik towarowy COPII
Inhibitor trypsyny sojowej (SBTI)	Sigma	T9128	Magazyn 1 mg/mL w PBS, przechowywany na poziomie − 20 & f; C
Przeciwciało STING (króliczy mAb)	CST	13647	Przeciwciało pierwotne
Bufor TBST	Servicebio	G0004	Bufor do płukania na immunobloting
Cykler termiczny	Bio-Rad	186-1096	Wykorzystywane do ogrzewania i inkubacji
Termostatyczna kąpiel metalowa	DLAB	5062102100	Utrzymuje stałą temperaturę
Komórka transferowa	Bio-Rad	1703930	Wykorzystywane do transferu białka
Trypsyna-EDTA (0,25%)	Servicebio	G4011	Wykorzystywane do odłączania komórek
Ultrawirówka	Thermo Fisher	75000100	Stosowany do wirowania o dużej prędkości
Rurki ultrawirówki (2 mL)	Thermo Fisher	54460	Rury kompatybilne z ultrawirowaniem
Rurka ultra-filtracyjna (4 mL, 10 kDa MWCO)	Millipore	UFC8010	Stosowane do koncentracji cytosolu