Test oparty na immunofluorescencji do wykrywania ognisk RAD51 w jądrach jako markera naprawy rekombinacji homologicznej w komórkach raka jajnika

Podsumowanie

Foka RAD51 w jądrze są markerem aktywności rekombinacji homologicznej (HR). Niniejszy artykuł opisuje prostą metodę immunofluorescencji do wykrywania tych foki w komórkach rakowych, umożliwiającą ocenę funkcji HR i wspierającą badania przedkliniczne reakcji na czynniki uszkadzające DNA.

Streszczenie

RAD51 jest białkiem centralnym w szlaku rekombinacji homologicznej (HR) i jest niezbędny do dokładnego naprawiania podwójnych łamań DNA (DSBs). Po utworzeniu DSBs, resekcja końców DNA generuje pojedyncze nici DNA, które ułatwiają rekrutację i montaż filamentów nukleoproteinowych RAD51 w miejscach uszkodzeń. Proces ten prowadzi do powstania dyskretnych jądrowych ognisk RAD51, które służą jako powszechnie akceptowane funkcjonalne odczyty aktywności HR oraz jako surogatowy marker kompetencji HR. Ponieważ defekty w HR są częste w kilku nowotworach złośliwych, szczególnie rak jajnika i rak piersi, ocena tworzenia ognisk RAD51 stała się ważnym podejściem do oceny zdolności naprawczych DNA i przewidywania odpowiedzi na terapie uszkadzające DNA, w tym związki platyny i inhibitory poli(ADP-rybozy) polimerazy (PARP), których skuteczność jest mocno wpłynięta przez status naprawy HR. Niniejszy rękopis opisuje prosty, niezawodny i możliwy do powtórzenia protokół oparty na immunofluorescencji do wykrywania i ilościowej oceny jądrowych ognisk RAD51 w hodowlach komórek raka jajnika. Metoda polega na indukcji uszkodzenia DNA przez promieniowanie jonizujące (IR), następnie fiksacja, immunobarwienie przeciwciałami przeciwko RAD51 i γH2AX, mikroskopii konfokalnej oraz ręcznej ilościowej analizy ko-lokalizowanych ognisk RAD51/γH2AX. Protokół może być stosowany w warunkach podstawowych lub po genetycznych i farmakologicznych zakłóceniach, aby określić ich wpływ na funkcję HR. Wyniki reprezentatywne wykazują mocne indukowanie ognisk RAD51 w kompetentnych HR komórkach raka jajnika po uszkodzeniu DNA, podczas gdy wyczerpanie RAD51 znacząco zmniejsza tworzenie ognisk mimo porównywalnych poziomów DSBs, potwierdzając specyficzność testu. Ogólnie, ten protokół zapewnia niezawodny i odtwarzalny funkcjonalny test do oceny kompetencji HR, z szerokim zastosowaniem w przedklinicznym i potencjalnie translacyjnym badaniu nad rakiem.

Wprowadzenie

Złamania podwójnej nici DNA (DSB) należą do najcięższych form uszkodzeń DNA, ponieważ niedokładne naprawienie może zakłócić stabilność genomu i przyczyniać się do rozwoju nowotworów lub śmierci komórkowej^1,2,3. Aby przeciwdziałać tym zagrożeniom, komórki stosuje kilka ścieżek naprawczych DNA, w tym rekombinację homologiczną (HR), która jest uważana za najdokładniejszy mechanizm naprawy DSB^2,4,5. W przeciwieństwie do ścieżek naprawczych obciążonych błędami, HR wykorzystuje homologiczną sekwencję DNA jako szablon do przywrócenia informacji genetycznych w uszkodzonym miejscu. W związku z tym, HR działa głównie w fazach S i G2 cyklu komórkowego, gdy siostry chromatydy są dostępne jako szablony naprawcze^2,5. Warto zauważyć, że HR jest niezbędna dla dokładnej naprawy DSB powstających ze źródeł endogennych, takich jak stres replikacyjny, a także egzogennych obrażeń, w tym promieniowania jonizującego (IR) i chemioterapii uszkadzających DNA^2,5.

RAD51 jest centralnym efektorem ścieżki HR i odgrywa krytyczną rolę w wyszukiwaniu homologii i inwazji na nici podczas naprawy DSB za pośrednictwem HR^2,5. Po utworzeniu DSB, końce DNA przechodzą resekcję, proces inicjowany przez kompleks MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) i powiązane czynniki, które generują końcówki pojedynczej nici DNA o długości 3’. Te regiony pojedynczej nici są początkowo pokryte białkiem replikacyjnym A (RPA), które zapobiega formowaniu struktury wtórnej i stabilizuje pośrednik naprawczy^4,5,6. HR jest następnie inicjowane poprzez skoordynowane działania BRCA1, PALB2 i BRCA2, które ułatwiają rekrutacje i załadowanie RAD51 na przecięte DNA, wypierając RPA i promując formowanie filamentów nukleoprotein zawierających RAD51^4,5,6. Po złożeniu, te filamenty szukają homologicznych sekwencji DNA w obrębie siostrzanych chromatyd i katalizują wymianę nici, ułatwiając tym samym wierną restaurację uszkodzonego DNA^4,5,6. Akumulacja RAD51 w miejscach DSB jest widoczna mikroskopowo jako punktowe ogniska jądrowe, które można wykryć za pomocą immunofluorescencji^7,8,9,10. Ponieważ tworzenie tych ognisk odbija pomyślne zaangażowanie maszyn HR, analiza ognisk RAD51 stała się szeroko stosowanym funkcjonalnym podejściem do oceny zdolności HR i kompetencji naprawczych DNA w komórkach^7,8,9,10. Co ważne, to badanie mierzy zdolność komórek do wykonania odpowiedzi HR po uszkodzeniu DNA, a nie polega wyłącznie na poziomach ekspresji genów lub białek związanych z HR.

Defekty HR są często obserwowane w raku, szczególnie w guzach zawierających zmiany w BRCA1, BRCA2, RAD51 paralogach lub innych genach zaangażowanych w HR, a są szczególnie rozpowszechnione w rakie jajnika i piersi^{4,11,12,13,14}. Niedobór HR ma ważne implikacje terapeutyczne, ponieważ powoduje podwyższoną wrażliwość na środki uszkadzające DNA, takie jak terapia platyną i inhibitory poli(ADP-rybozy)polimerazy (PARP), dzięki zasadzie syntetycznej letalności^{4,11,12,13,14,15}. W związku z tym, niezawodne funkcjonalne badania oceniające aktywność HR są kluczowe zarówno dla badań mechanistycznych, jak i badań translacyjnych.

Niniejszy protokół opisuje oparty na immunofluorescencji assay do wykrywania i ilościowej oceny ognisk nuklearnych RAD51 po uszkodzeniu DNA w komórkach raka jajnika. Procedura obejmuje indukcję DSB DNA za pomocą IR, następnie immunofluorescencyjne wykrywanie RAD51 i γH2AX oraz ilościową ocenę współlokalizowanego ogniska nuklearnego za pomocą mikroskopii konfokalnej. Protokół jest demonstrowany na HR-kompetentnych komórkach OVCAR-8 i nabytych komórkach odpornych na inhibitory PARP ABT^R2 i zapewnia powtarzalne funkcjonalne podejście do oceny aktywności HR po utworzeniu DSB. Chociaż analiza ognisk RAD51 jest szeroko stosowana jako funkcjonalne mierniki aktywności HR, dostępne metody często koncentrują się na określonych ustawieniach eksperymentalnych i często brakuje szczegółowych wskazówek dotyczących integracji kontrolowanej indukcji us

Protokół

Wszystkie materiały i reagenty użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów, w tym informacje o producencie, numery katalogowe i stężenia przeciwciał. Przegląd protokołu jest przedstawiony na Rysunku 1.

UWAGA: W tym protokole używane są linie komórek raka jajnika OVCAR-8 i ABT^R2, które zostały wcześniej opisane^{15,16,17,18,19,20}. Komórki OVCAR-8 zostały uprzejmie przekazane przez Dr. Larry'ego Karnitza (Mayo Clinic), który pierwotnie otrzymał je od Dr. Dominic'a Scudiero (National Cancer Institute, NIH). Komórki ABT^R2 uprzejmie przekazał Dr. Scott Kaufmann (Mayo Clinic)²⁰. ABT^R2 jest PARPi-oporną pochodną mutacji BRCA2 linii komórek raka jajnika PEO1, która nabyła oporność poprzez przywrócenie ekspresji BRCA2. Ponieważ przywrócenie BRCA2 ponownie uruchomiło ładowanie RAD51 i aktywność HR, komórki ABT^R2 służą jako reprezentatywny model kompetencji HR. Tożsamość linii komórek została zweryfikowana na podstawie pochodzenia źródłowego i ustalonych cech zgłoszonych w literaturze^{15,16,17,18,19,20}. Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu komórek o niskiej liczbie przetoków (przetok 3–12) utrzymywanych w hodowli przez nie dłużej niż 1 miesiąc po rozmrożeniu. Linie komórek były rutynowo testowane na zakażenie mykoplazmą co 6 miesięcy za pomocą zestawu do wykrywania mykoplazm, a wszystkie kultury użyte w tym badaniu potwierdziły brak mykoplazm.

UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny i powinien być przygotowywany i przechowywany w certyfikowanym koczu chemicznym z dymem, nosząc odpowiednią odzież ochronną. Komórki pochodzenia ludzkiego powinny być przechowywane zgodnie z instytucjonalnymi procedurami bezpieczeństwa biologicznego z zastosowaniem odpowiednich praktyk izolacji. Triton X-100, media montażowe i lakier do paznokci powinny być przechowywane zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi bezpieczeństwa. Promieniowanie IR powinno być stosowane tylko przez wykwalifikowany personel i zgodnie z instytucjonalnymi zasadami bezpieczeństwa promieniowania. Odpady chemiczne, biologiczne i promieniotwórcze powinny być usuwane zgodnie z lokalnymi wymaganiami instytucjonalnymi i regulacyjnymi.

1. Hodowla komórek i utrzymanie

1. Hodowla komórek w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 uzupełnionej o 8% surowicy płodowej bydła w inkubatorze wilgotnym w 37 °C z 5% CO₂.
   UWAGA: Warunki hodowli są zgodne z tymi zastosowanymi w naszych wcześniejszych badaniach nad komórkami OVCAR-8 i ABT^R2^{15,16,17,18,19}. W tych warunkach obie linie komórek wykazują bujny wzrost i powtarzalne fenotypy odpowiedzi na uszkodzenie DNA.
2. W razie potrzeby wykonaj zakłócenia (np. redukcja/usunięcie genu), zgodnie z zoptymalizowanymi warunkami eksperymentalnymi^15,17.
   UWAGA: W tym protokole, redukcja RAD51 za pomocą siRNA jest przedstawiona jako reprezentatywny przykład zakłócenia genu przed analizą immunofluorescencyjną.
   1. Przygotuj 5 × 10⁶ komórek w 180 μL pożywki RPMI-1640 uzupełnionej o 8% surowicy płodowej bydła.
   2. Dodaj 20 μL 20 μM roztworu siRNA (2 μM siRNA na transfekcję) i delikatnie wymieszaj.
      UWAGA: Użyj następujących siRNA: Kontrolne siRNA lucferazy bez docelowego miejsca (siLUC): 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3'; siRNA RAD51 (siRAD51): 5'-GGGAUUUGUGAAGCCAAA-3'. Wszystkie siRNA zostały zakupione od Horizon Discovery.
   3. Przenieś zawiesinę komórek do kuwetki elektroporacyjnej o średnicy 4 mm.
   4. Elektroporuj komórki za pomocą elektroporatora BTX ECM 830 z dwoma impulsami 10 ms przy 280 V.
   5. Przenieś komórki do pełnego pożywka wzrostowej i inkubatoruj pod standardowymi warunkami hodowli w naczyniu 10 cm przez 24 h.
   6. Powtórz elektroporację siRNA, stosując te same warunki, które zostały opisane w Krokach 1.2.1–1.2.4.
   7. Inkubatoruj komórki pod standardowymi warunkami hodowli w naczyniu 15 cm przez kolejne 48 h.
   8. Zasiej część komórek do analizy immunofluorescencyjnej, zgodnie z opisem w Kroku 2. Pozostałe komórki zarezerwuj do walidacji redukcji RAD51 przez immunoblotting.
   <

Wyniki

IR indukuje tworzenie skupień RAD51 w miejscach DNA DSB w komórkach OVCAR-8
Aby funkcjonalnie ocenić aktywność HR, tworzenie skupień RAD51 zostało zbadane w komórkach raka jajnika OVCAR-8, które są biegłe w HR, po indukcji DNA DSB przez IR. Aby ustalić specyficzność testu i potwierdzić, że obserwowane skupienia reprezentują rzeczywiste zdarzenia HR zależne od RAD51, komórki zostały przetransfekowane albo niecelowym kontrolnym siRNA lucyferazy (siLUC) albo siRNA ukierunkowanym na <...

Dyskusja

Opisany tutaj układ wykrywania fokusów RAD51 w jądrze oparty na immunofluorescencji zapewnia niezawodne i funkcjonalne podejście do oceny aktywności HR w hodowlach komórek raka jajnika. W przeciwieństwie do analiz genomowych lub transkryptomowych, które pośrednio wyprowadzają status HR, tworzenie się fokusów RAD51 bezpośrednio odzwierciedla zdolność komórki do rekrutacji i złożenia podstawowego mechanizmu HR w miejscach uszkodzeń podwójnej struny DNA. Jako taki, ten test służy jako wrażliwa miara kompetencji HR po uszkod...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10% Polyacylamide gel recipe (Lower gel buffer 20 ml,ddH2O 33.4 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 26.6 mL. 10% APS (fresh) 200 µL  TEMED 70 µL)	Home-made	NA	Resolving gel for SDS-PAGE
10% Polyacylamide gel recipe (Upper gel buffer 10 mL, ddH2O 23.6 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 6.4 mL 10% APS (fresh) 160 µL  TEMED 40 µL)	Home-made	NA	Stacking geL for SDS-PAGE
100 mL Trypsin EDTA 1X, 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA in Sodium Bicarbonate	Corning	25-053-C1	Used to detach adherent cells during routine passaging and prior to cell seeding.
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Bio-Rad	1610780	Diluted to 1× and used for washing steps, blocking solution, antibody dilutions, fixation, and permeabilization.
10X Running buffer (6 L) Tris 181.8 g +Glycene 864.0 g+SDS 60 g	Home-made	NA	Run to proteins sample in the gel
10X Transfer (6 L) Tris 181.8 g+ Glycene 864 g	Home-made	NA	Transfter the protein from gel to membrane
10x Tris Buffered saline	Bio-Rad	1706435	buffer
30%  (w/v)Acrylamide ;0.8(w/v)/Bis-acrylamide stock solution (37.5:1)	Ultrapure EC-890	EC-890	For SDS-PAGE
ABTR2 cells	Mayo clinic	NA	acquired PARPi-resistant ovarian cancer cell lines
AKT Lysis Buffer Recipe (50 mM HEPES (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na3VO4, 10 mM 2-glycerophosphate, 10 μg/mL leupeptin, 5 μg/mL aprotinin, 5 μg/mL pepstatin, and 20 mM microcystin-LR.	Home-made	NA	Cell lysis buffer
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	16107000	Molecular biology as a polymerization for gels an oxidizing agent used as a free-radical initiator
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301	Sigma-Aldrich	05-636	Primary antibody used to detect γH2AX foci. Used at 1:1000 dilution
Anti-Rad51 (Ab-1) Rabbit pAb	Sigma-Aldrich	PC130	Primary antibody used to detect RAD51 nuclear foci as a marker of homologous recombination activity. Used at 1:1000 dilution
Bovine serum albumin Protease free	GoldBio	A-420-250	Used to prepare blocking solution (5% BSA in PBS) to reduce non-specific antibody binding during immunofluorescence staining.
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	12003154	Imaging system
Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	Zeiss LSM 780	Immunofluorescence imaging, γH2AX foci analysis, RAD51 foci quantification, protein co-localization, and 3D image acquisition
Countess II FL Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAF1000	Automated Cell Counter
Cover slips	Cardinal Health	M6045-10A	Placed over mounted samples to protect stained cells and enable high-resolution imaging.
ECM 830 Square Wave Electroporation System	Hbio-BTX	45-2052	Electroporation system suitable for applications for gene delivery in mammalian cells
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Added to RPMI-1640 (as 8%) to support cell growth and viability.
Glycine	Thermo Fisher Scientific	A13816.0C	Buffer
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	Secondary antibody used to detect γH2AX primary antibody. Used at 1:350 dilution
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034	Secondary antibody used to detect RAD51 primary antibody. Used at 1:350 dilution
GraphPad Prism	GraphPad Software	version 10.6.1	Statistical analysis, graph generation, and data visualization.
HEPES 1M	Corning	25060-C1	PH maiantance buffer in the pH 7.2-7.6 range
Hoechst 33342 solution (20 mM, 5 mL)	Thermo Fisher Scientific	62249	was used for nuclear staining
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse immunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7076S	Secondary antibody used for detection of mouse (β-actin) primary antibody in Western blotting.
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbitimmunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7074S	Secondary antibody used for detection of rabbit primary antibody (RAD51) in Western blotting.
Instant non-fat dry milk	Hyvee	G461A323	Blocking reagent
Laemmli Sample Buffer (4×)	Bio-Rad	1610747	Sample Buffer
Lonza's MycoAlert Mycoplasma Detection Assays	Lonza Bioscience	LT07-218	Used to routinely confirm that cell cultures are free of mycoplasma contamination.
Lower gel Recipe is (1 L)(Tris 181.7 g+SDS 4.0 g)PH to 8.8 w/cenc HCl	Home-made	NA	Resolving gel for SDS-PAGE
Mouse monoclonal Anti-beta Actin antibody	Abcam	ab8226	Primary antibody used to detect β-actin as a loading control in Western blot analyses.
Non-targeting control luciferase siRNA (siLUC): 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′	Horizon Discovery	NA	working concentration 20 nmol
Nunc Lab Tek II, 8-chamber slide W/cover RS Glass slide sterile	Thermo Fisher Scientific	154534	Used for seeding and culturing cells for immunofluorescence staining and confocal imaging.
OVCAR-8 cells	National Cancer Institute, (NIH)	NA	Ovarian cancer cell lines
Paraformaldehyde 16% Aqueous Solution EM Grade	Electron microscopy sciences	15710-S	Diluted to 3