Cost-effective przepływ pracy dla mono- i multipleksowej immunofluorescencji w adhezyjnych dwuwymiarowych kulturach komórkowych na szkiełkach podstawkowych

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje kosztowo efektywny schemat postępowania dla mono- i multipleksowej immunofluorescencji (IF) przylegających dwuwymiarowych kultur komórkowych, który redukuje koszty eksperymentalne dzięki zastosowaniu niedrogich szkiełek nakrywkowych, standardowych płytek 24-dołkowych oraz warunków barwienia przy użyciu małych objętości minimalizujących zużycie przeciwciał, zapewniając jednocześnie reprezentatywne podejście do lokalizacji białek przy użyciu standardowej mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

Mikroskopia immunofluorescencyjna (IF) jest powszechnie stosowaną techniką wizualizacji lokalizacji i współdystrybucji białek z rozdzielczością pojedynczej komórki, przy jednoczesnym zachowaniu morfologii komórkowej i organizacji subkomórkowej. Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie praktycznego i kosztowo efektywnego schematu pracy dla jedno- i wielokrotnego barwienia immunofluorescencyjnego przylegających kultur komórkowych 2D z wykorzystaniem standardowych materiałów laboratoryjnych. Metoda opiera się na hodowli komórek na niedrogich szkiełkach podstawkowych umieszczonych w konwencjonalnych płytkach 24-dołkowych i wdraża multipleksowanie poprzez rozdzielenie gatunków gospodarzy przeciwciał pierwszorzędowych, zastosowanie spektralnie odrębnych fluoroforów oraz rygorystyczne warunki kontrolne, w tym kontrole bez przeciwciał pierwszorzędowych, bez przeciwciał, barwienia pojedynczego oraz kontrole przenikania sygnałów (crosstalk), aby zapewnić interpretowalność wielokrotnego barwienia IF. W celu zmniejszenia zużycia odczynników i przeciwciał, bez utraty jakości sygnału, zastosowano etapy barwienia przy użyciu małych objętości. Ten schemat pracy eliminuje konieczność stosowania specjalistycznych płytek lub komór do obrazowania i jest kompatybilny z rutynową mikroskopią fluorescencyjną szerokopolową lub konfokalną. Ogólnie rzecz biorąc, niniejszy protokół zapewnia dostępny i praktyczny schemat barwienia immunofluorescencyjnego do reprezentatywnej oceny lokalizacji i współdystrybucji białek w przylegających kulturach komórkowych. Adaptacja do innych typów komórek lub paneli przeciwciał wymaga optymalizacji specyficznej dla celu, w tym walidacji przeciwciał, ustalenia warunków fiksacji i permeabilizacji, wyboru fluoroforów oraz sprawdzenia kompatybilności z mikroskopem i zestawami filtrów.

Wprowadzenie

Mikroskopia immunofluorescencyjna (IF) jest szeroko stosowana do wizualizacji lokalizacji subkomórkowej, względnej liczebności oraz kolokalizacji białek w utrwalonych komórkach, co pozwala na powiązanie markerów molekularnych z morfologią komórkową i kontekstem subkomórkowym^1,2. W przeciwieństwie do pomiarów zbiorczych (np. immunoblottingu) lub dysocjacyjnych analiz pojedynczych komórek (np. cytometrii przepływowej), IF zachowuje przestrzenną organizację komórki i jest szczególnie użyteczna w ocenie heterogeniczności fenotypowej między komórkami oraz zmian w subkomórkowym rozkładzie białek z rozdzielczością pojedynczej komórki^3,4,5. Ponieważ pytania badawcze coraz częściej wymagają jednoczesnej oceny wielu markerów, multipleksowa IF umożliwia równoczesne wykrywanie dwóch lub więcej celów w tej samej próbce, zazwyczaj poprzez łączenie przeciwciał pierwszorzędowych wytworzonych w różnych gatunkach gospodarzy z widmowo odmiennymi fluoroforami⁶ (Rysunek 1), przy użyciu strategii detekcji bezpośredniej i/lub pośredniej (Rysunek 2). Jednak multipleksowanie wprowadza kluczowe wyzwania techniczne, zwłaszcza reaktywność krzyżową przeciwciał i nakładanie się widm (spectral crosstalk), które mogą zaburzyć interpretację wyników, jeśli nie zostaną rozwiązane poprzez staranne zaprojektowanie panelu i zastosowanie rygorystycznych warunków kontrolnych^7,8.

Ogólnym celem tej metody jest zapewnienie praktycznego, niskokosztowego schematu postępowania, który znajduje szerokie zastosowanie w przypadku przeciwciał zwalidowanych metodą immunofluorescencji i jest zoptymalizowany do rutynowego obrazowania przylegających kultur 2D. Multipleksowanie jest realizowane poprzez rozdzielenie gatunków gospodarzy, zastosowanie spektralnie odmiennego fluoroforów oraz grup kontrolnych, które weryfikują poziom tła i efektywność barwienia^9,10. Dzięki zastosowaniu szklanych laseczek o średnicy 12 mm w standardowych płytkach 24-dołkowych zamiast specjalistycznych szkiełek z komorami, schemat ten pozwala uniknąć kosztownych materiałów eksploatacyjnych na rzecz materiałów standardowo dostępnych w większości laboratoriów hodowli komórkowych. W tym schemacie wykorzystuje się również znacznie mniej roztworu barwiącego na jednostkę powierzchni wzrostu (150 µL dla ≈1,13 cm², czyli ≈133 µL/cm²) niż w porównywalnych formatach laseczek z komorami^11,12, które zazwyczaj wymagają 300–500 µL/cm², co odpowiada około 2- do 4-krotnej redukcji zużycia przeciwciał i odczynników w przeliczeniu na powierzchnię. W związku z tym protokół umożliwia jakościową wielocelową ocenę lokalizacji markerów i ich wspólnego rozkładu przy użyciu standardowych mikroskopów szerokopolowych lub konfokalnych, wraz z przeciwbarwieniem cytoszkieletu i jąder komórkowych. Przedstawiony schemat postępowania jest przeznaczony do konwencjonalnego multipleksowego IF w utrwalonych komórkach, opartego na rozdzieleniu gatunków gospodarzy i rozróżnialności spektralnej, i nie jest przeznaczony do iteracyjnych lub wysokowymiarowych podejść multipleksowych.

Protokół

Badanie to nie angażowało uczestników będących ludźmi ani zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono z wykorzystaniem linii komórkowej osteosarcoma psa D17, będącej uznaną linią komórkową pozyskaną z publicznego banku komórek (Banco de Células do Rio de Janeiro, Cat. No. 0276). W związku z powyższym nie było wymagane uzyskanie zgody komisji etycznej.

1. Hodowla linii komórkowych

1. Utrzymywać komórki adherentne w standardowych warunkach hodowli (37 °C, 5% CO₂, inkubator z nawilżaniem), stosując odpowiednią pożywkę kompletną dla używanej linii komórkowej.
   UWAGA: Jako reprezentatywny przykład, komórki osteosarcoma psiej linii D17 (Banco de Células do Rio de Janeiro [BCRJ], nr kat. 0276) są hodowane w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyku-antymykotyku, pasażowane przy 70–80% konfluencji przy użyciu trypsyny-EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego) i wykorzystywane w zwalidowanym zakresie pasaży (np. pasaż 5–20).
2. Przed rozpoczęciem eksperymentów potwierdzić brak zakażenia mycoplasmapy za pomocą zwalidowanego testu wykrywania mycoplasmapy.

2. Przygotowanie płytki 24-dołkowej i szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Powierzchnie szkiełek zakrywek należy oczyścić poprzez zanurzenie w 70% etanolu (5 min, powtórzone 3×) przed sterylizacją jedną z poniższych metod; po sterylizacji szkiełka zakrywek powinny być przechowywane w zamkniętym pojemniku w temperaturze pokojowej do momentu użycia.

1. Umieścić czyste, okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm w szklanej płytce Petriego (lub uchwycie do nakrywek) i wysterylizować w autoklawie. W autoklawie należy wysterylizować również parę metalowych pęset z cienkimi końcówkami.
2. Alternatywa: Oczyścić nakrywki i pęsety 70% etanolem, pozostawić do wyschnięcia, a następnie przeprowadzić dekontaminację powierzchni za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV) (30 min) w komorze z laminarnym przepływem powietrza przed użyciem. Sterylne nakrywki przechowywać w zamkniętym pojemniku w temperaturze pokojowej do momentu użycia.
3. W komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając sterylnej pęsety, przenieść jedną sterylną nakrywkę do każdego dołka przeznaczonego dla grup eksperymentalnych w 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek.
4. Opcjonalnie: pokryć nakrywki powłokami zwiększającymi adhezję zgodnie z instrukcją producenta lub ustalonymi wytycznymi laboratoryjnymi, jeśli jest to wymagane dla stosowanego typu komórek.
   UWAGA: Opcje powłok (poli-L-lizyna, kolagen I lub fibronektyna) oraz ich stężenia robocze są wymienione w Tabeli materiałów. W przypadku większości adherentnych linii komórkowych hodowanych na szkle wystarczające są niesterylizowane nakrywki; składniki powłok mogą być antygenowe, dlatego wybrana powłoka nie powinna krzyżowo reagować z żadnym przeciwciałem w panelu.
5. Jeśli nakrywki zostały pokryte powłoką, odessać nadmiar roztworu, wypłukać raz sterylnym solfizjologiem (PBS) i pozostawić nakrywki do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza przed wysianiem komórek.

3. Grupy eksperymentalne

1. Należy uwzględnić panel kontroli odpowiedni dla projektu multipleksowego.
   UWAGA: Kontrola bez przeciwciał (brak przeciwciała pierwszorzędowego i drugorzędowego) ujawnia wewnętrzną autofluorescencję, a kontrola bez przeciwciała pierwszorzędowego (koktajl przeciwciał drugorzędowych bez żadnego przeciwciała pierwszorzędowego) pozwala ocenić nieswoiste wiązanie przeciwciał drugorzędowych oraz tło we wszystkich kanałach jednocześnie; ponieważ w tym protokole stosowane są przeciwciała drugorzędowe o ściśle odrębnych widmach, ta pojedyncza kontrola ocenia każde przeciwciało drugorzędowe niezależnie w jego odpowiednim kanale, spełniając tę samą funkcję, co oddzielna kontrola tylko z przeciwciałem drugorzędowym dla każdego fluoroforu. Kontrole z pojedynczym barwieniem, w których każda para przeciwciało pierwszorzędowe–drugorzędowe jest stosowana indywidualnie, weryfikują działanie każdego przeciwciała przed kombinacją multipleksową i, poprzez porównanie z warunkiem multipleksowym, umożliwiają ocenę przesłuchów spektralnych (spectral crosstalk) dla każdej pary fluoroforów. Jeśli to możliwe, w celu potwierdzenia sprawności testu stosuje się kontrolę pozytywną wykazującą ekspresję docelowego antygenu.

4. Wysiewanie (rozsiewanie) komórek na szkiełkach podstawowych

1. W komorze z laminarnym przepływem powietrza odczepić komórki za pomocą trypsyny (lub innej odpowiedniej metody dysocjacji), zneutralizować i resuspendować w pełnej pożywce hodowlanej.
2. Policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
3. Rozcieńczyć komórki do stężenia 6 × 10⁴–1 × 10⁵ cells/mL.
4. Dodać 0,5 mL zawiesiny komórkowej do każdego dołka (końcowo: 3 × 10⁴–5 × 10⁴ cells/well).
   UWAGA: W razie potrzeby można użyć sterylnego końcówki do pipety, aby delikatnie upewnić się, że szkiełko nakrywkowe leży płasko na dnie dołka, unikając jego porysowania.
5. Inkubować komórki w standardowych warunkach (37 °C, 5% CO₂) do czasu, aż komórki przylgną i osiągną pożądany stopień konfluencji lub do momentu osiągnięcia wyznaczonego punktu czasowego eksperymentu.

5. Obróbka komórek (Opcjonalnie)

1. Wybierz czas rozpoczęcia traktowania zgodnie z planem eksperymentu. Traktowanie może obejmować terapię farmakologiczną, stymulację cytokinami, manipulacje genetyczne w celu indukcji lub wyciszenia ekspresji genu docelowego lub inne interwencje eksperymentalne, w zależności od potrzeb.
2. Oznacz dołki w celu zidentyfikowania grup kontrolnych i traktowanych.
3. Inkubuj przez wymagany czas; unikaj nadmiernego zagęszczenia komórek (over-confluency), ponieważ nadmierny wzrost zwiększa tło i zaburza morfologię.
   UWAGA: Przed utrwaleniem komórki powinny przylgnąć do szkiełka podstawowego, chyba że plan eksperymentu wymaga utrwalenia bezpośrednio po wysianiu.
4. W przypadku celów szybko wydzielanych (np. cytokin), dodaj brefeldynę A (BFA) do pożywki hodowlanej do końcowego stężenia 1–10 µg/mL (zazwyczaj 5 µg/mL) i inkubuj przez 4–6 h w 37 °C, 5% CO₂ przed utrwaleniem.
5. Usuń pożywkę zawierającą BFA i bezzwłocznie przejdź do etapu Utrwalania.

6. Barwienie immunofluorescencyjne

UWAGA: Od momentu fiksacji technika sterylna nie jest wymagana; barwienie można przeprowadzać na blacie laboratoryjnym, korzystając z dygestorium chemicznego zawsze podczas pracy z odczynnikiem oznaczonym jako OSTROŻNIE. Próbki nie mogą w żadnym momencie wyschnąć; podczas aspiracji należy pozostawić cienką warstwę buforu, a następnie niezwłocznie dodać kolejny roztwór.

1. Fiksacja (wybrać jedną metodę):
   UWAGA: Środek utrwalający dobiera się w zależności od lokalizacji celu i wrażliwości epitopu (patrz sekcja Dyskusja): Paraformaldehyd (PFA) (formaldehyd przygotowany z paraformaldehydu) nadaje się do większości celów i jest kompatybilny z faloidyną; metanol może wspomagać wykrywanie niektórych epitopów jądrowych lub fosforylowanych, ale upośledza barwienie F-aktyny.
   1. Fiksacja PFA (zalecana dla większości celów):
      1. Odssać medium i delikatnie wypłukać raz solą buforową Tris (TBS) (0,5 mL/dołek).
      2. Dodać 4% PFA w PBS (buforze fosforanowym) (0,5 mL/dołek) i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej (≈25 °C).
      3. Odssać PFA i przemyć 3× TBS (odsysiwać niezwłocznie; nie dopuszczać do wyschnięcia dołków).
         UWAGA: OSTROŻNIE: PFA jest toksyczny i potencjalnie rakotwórczy. Roztwory PFA należy przygotowywać w certyfikowanym dygestorium chemicznym, stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej (fartuch laboratoryjny, rękawice i ochrona oczu). Unikać wdychania i kontaktu ze skórą oraz utylizować odpady zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi bezpieczeństwa chemicznego.
2. Alternatywnie, fiksacja metanolem (użyteczna dla niektórych antygenów jądrowych i określonych epitopów fosforylowanych):
   1. Schłodzić 100% metanol do −20 °C.
   2. Dodać lodowaty metanol bezpośrednio do komórek (0,5 mL/dołek) i inkubować przez 5 min w −20 °C.
   3. Przemyć 3× TBS (odsysiwać niezwłocznie; nie dopuszczać do wyschnięcia dołków).
      UWAGA: Po fiksacji metanolem dodatkowa permeabilizacja może być niepotrzebna i powinna zostać zoptymalizowana dla konkretnego przeciwciała/epitopu. Fiksacja metanolem może uszkodzić epitopy błonowe i upośledzić barwienie faloidyną sprzężoną z fluoroforem/F-aktyny. OSTROŻNIE: Metanol jest toksyczny, lotny i łatwopalny. Należy go używać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub w dygestorium chemicznym, stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej; trzymać z dala od otwartego ognia i źródeł ciepła. OPCJONALNY PUNKT ZATRZYMANIA: Po fiksacji próbki można przechowywać w 4 °C w PBS zawierającym niskie stężenie utrwalacza (np. PBS + 0,1% PFA) do jednego tygodnia; czas przechowywania należy zwalidować dla każdego antygenu.
3. Wygaszanie aldehydów (opcjonalnie)
   1. Inkubować z 50 mM glicyną w TBS (0,5 mL/dołek) przez 5 min w temperaturze pokojowej (≈25 °C).
   2. Przemyć 3× TBS + 0,05% polisorbatasem 20.
      UWAGA: Glicyna neutralizuje wolne grupy aldehydowe pozostałe po fiksacji PFA, redukując autofluorescencję związaną z utrwalaniem i poprawiając specyficzność barwienia przeciwciałami.
4. Permeabilizacja
   1. W przypadku celowania w białka błonowe pominąć permeabilizację i przejść do kroku 6.5.1.
   2. W przypadku celowania w białka wewnątrzkomórkowe lub jądrowe przeprowadzić permeabilizację za pomocą 0,1–0,3% niejonowego detergentu w TBS (0,5 mL/dołek) przez 5–10 min w temperaturze pokojowej (≈25 °C).
   3. Przemyć 3× TBS + 0,05% polisorbatasem 20 (TBST).
      UWAGA: Stężenie niejonowego detergentu etoksylanu oktylofenolu oraz czas inkubacji są optymalizowane pod kątem celu; poprawność ocenia się na podstawie sygnału w odpowiednim przedziale komórkowym, zachowanej morfologii, wyraźnie zdefiniowanej F-aktyny i niskiego tła (patrz sekcja Dyskusja). Jeśli stosowany jest saponina, należy go utrzymywać we wszystkich kolejnych buforach do przeciwciał i płukania. OSTROŻNIE: Niejonowy detergent etoksylan oktylofenolu jest szkodliwy w przypadku wdychania lub kontaktu ze skórą i może powodować podrażnienie oczu. Należy używać rękawic i unikać tworzenia aerozoli.
5. Blokowanie
   1. Dodać 0,5 mL/dołek roztworu blokującego (5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w TBS) i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej (≈25 °C).
   2. Odssać bufor blokujący.
   3. Przejść bezpośrednio do inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi (nie płukać).
6. Inkubacja z przeciwciałami pierwszorzędowymi
   UWAGA: Rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych są ustalone empirycznie poprzez miareczkowanie (patrz sekcja Dyskusja).
   1. Przygotować pojedyncze lub multipleksowe panele przeciwciał pierwszorzędowych w soli buforowej Tris zawierającej 0,05% polisorbasatu 20 i 1% BSA (TBST-BSA 1%), stosując wcześniej zoptymalizowane stężenia przeciwciał dla każdego celu.
   2. W przypadku immunofluorescencji multipleksowej połączyć wszystkie niesprzężone przeciwciała pierwszorzędowe skierowane przeciwko odrębnym antygenom z różnych gatunków gospodarzy (np. mysie anty-interferon-β (IFN-β) + królicze anty-p14ARF + kozie anty-aktyna) w jeden koktajl przeciwciał.
   3. Dodać 150 µL na dołek, upewniając się, że całe szkiełko nakrywkowe jest całkowicie pokryte roztworem przeciwciał.
      UWAGA: Aby zapobiec odparowywaniu przy małej objętości, płytkę inkubuje się w komorze nawilżonej (np. w szczelnej pudełku z wilgotną chusteczką).
   4. Inkubować przez 1,5 h w temperaturze pokojowej (≈25 °C) lub 12–16 h w 4 °C.
   5. Przemyć 3× TBST przez 3 min każde w temperaturze pokojowej (≈25 °C), odsysając roztwór niezwłocznie po każdym płukaniu.
7. Inkubacja z przeciwciałami wtórnymi (oraz bezpośrednio sprzężonymi pierwszorzędowymi, jeśli dotyczy)
   UWAGA: Od tego kroku próbki są przechowywane w ciemności, aby zapobiec fotobleachingowi. W celu zminimalizowania przesłuchów (crosstalk) stosuje się spektralnie odmienne fluorofory w przeciwciałach wtórnych i wszelkich bezpośrednio sprzężonych przeciwciałach pierwszorzędowych, a aby zminimalizować wiązanie z niepoznawczymi przeciwciałami pierwszorzędowymi, stosuje się gatunkowo specyficzne, silnie adsorbowane przeciwciała wtórne. Projekt panelu fluoroforów, w tym markerów jądrowych i cytoszkieletowych, oraz kompatybilność wzbudzenia/emisji mikroskopu są omówione w sekcji Dyskusja.
   1. Rozcieńczyć przeciwciała wtórne w roztworze TBST-BSA 1% stosując wcześniej zoptymalizowane stężenia. W przypadku detekcji multipleksowej połączyć wszystkie przeciwciała wtórne odpowiadające gatunkom gospodarzy użytych przeciwciał pierwszorzędowych (jedno przeciwciało wtórne na gatunek gospodarza) w jeden koktajl.
   2. Dodać 150 µL na dołek, upewniając się, że całe szkiełko nakrywkowe jest całkowicie pokryte.
   3. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej (≈25 °C).
      UWAGA: Jeśli panel zawiera jedno lub więcej bezpośrednio sprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych, dodać je razem z koktajlem przeciwciał wtórnych i przedłużyć inkubację do 1,5 h w temperaturze pokojowej (około 25 °C).
   4. Przemyć 3× TBST przez 3 min każde w temperaturze pokojowej (≈25 °C), odsysając roztwór niezwłocznie po każdym płukaniu.

7. Kontrastowanie jąder komórkowych i barwienie f-aktyny

1. Dodać barwnik jądrowy Hoechst 33342 (1:5000) rozcieńczony w TBS i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej (≈25 °C), chroniąc przed światłem. Jeśli F-aktyna ma być znakowana falloidyną, a nie przeciwciałem anty-aktynowym, należy dodać falloidynę (1:400) do tego samego roztworu.
2. Przemyć 3× roztworem TBST, odprowadzając płyn niezwłocznie po każdym przemyciu (nie dopuszczać do wyschnięcia dołków).
3. Dodać 0,5 mL TBS do każdego dołka, aby szkiełka podstawowe pozostały zanurzone do czasu ich wyjęcia lub montowania.

8. Odzyskiwanie szkiełek nakrywkowych i montaż na szkiełkach przedmiotowych

1. Podczas gdy szkiełka nakrywkowe pozostają zanurzone w TBS, wsuń końcówkę cienkiej igły lub skalpela pod krawędź nakrywki i delikatnie podważ ją do góry, aż jedna strona zostanie częściowo uniesiona. Za pomocą precyzyjnej pęsety chwyć szkiełko nakrywkowe i wyjmij je z dołka.
   UWAGA: Usuwanie szkiełka nakrywkowego, gdy nie jest ono zanurzone, może spowodować jego silne przyleganie do dna dołka z powodu napięcia powierzchniowego, co zwiększa ryzyko pęknięcia.
2. Trzymając szkiełko nakrywkowe pęsetą, ostrożnie usuń nadmiar TBS z krawędzi za pomocą aspiratora próżniowego lub papieru chłonnego. Unikaj dotykania powierzchni pokrytej komórkami.
   UWAGA: Należy unikać nadmiaru pozostałej cieczy, ponieważ może ona rozcieńczyć medium montażowe i pogorszyć przejrzystość oraz kontrast obrazu.
3. Połóż szkiełko nakrywkowe stroną z komórkami do dołu na czyste szkiełko przedmiotowe zawierające małą kroplę (≈3 µL) medium montażowego.
   UWAGA: Można zastosować komercyjne samoutwardzalne medium antyblaknące lub medium domowej roboty na bazie 80% glicerolu/fosforanu buforowanego soli (PBS); preparaty na bazie glicerolu uszczelnia się bezbarwnym lakierem do paznokci, a media bez barwnika jądrowego dobiera się po przeprowadzeniu przeciwbarwienia. Wytyczne dotyczące limitów przechowywania i stabilności fluoroforów znajdują się w sekcji Dyskusja.
4. Pozostaw szkiełka do utwardzenia w pozycji poziomej przez ≈24 h, chroniąc je przed światłem, przed przystąpieniem do akwizycji obrazów.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje metodę pojedynczego i multipleksowego barwienia immunofluorescencyjnego adherentnych komórek nowotworowych psa hodowanych na szkiełkach przedmiotowych, co umożliwia jednoczesną wizualizację markerów jądrowych, cytoplazmatycznych i cytoszkieletowych przy zachowaniu morfologii komórek. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 3.

W udanych eksperymentach komórki osteosarcoma psa D17, zmodyfikowane genetycznie w celu ekspresji psiego p14ARF oraz psiego IFN-β (rozdział 5.1), wykazały silne, odpowiednio rozmieszczone przestrzennie sygnały fluorescencyjne przy niskim tle i minimalnym barwieniu nieswoistym. W przypadku komórek wykazujących ekspresję p14ARF (Rysunek 3A), immunofluorescencja ujawniła lokalizację głównie jądrową, co jest zgodne ze znanym rozkładem subkomórkowym p14ARF. Zastosowanie permeabilizacji z użyciem 0,3% niejonowego detergentu oktylofenoletoxylowego umożliwiło wydajny dostęp przeciwciał do epitopów jądrowych przy jednoczesnym zachowaniu morfologii jądra i integralności cytoszkieletu, co potwierdziło wyraźne przeciwbarwienie jąder oraz struktury aktynowe zwizualizowane za pomocą przeciwciała przeciwko aktynie (fluorofor emitujący światło pomarańczowe).

W przypadku komórek wykazujących ekspresję IFN-β (Rycina 3A), po inkubacji z BFA w celu zablokowania sekrecji białek zaobserwowano sygnał cytoplazmatyczny, co umożliwiło wewnątrzkomórkową akumulację i detekcję tej rozpuszczalnej cytokiny. W tych warunkach łagodniejsza permeabilizacja była wystarczająca, aby umożliwić penetrację przeciwciał bez nadmiernego wypłukiwania zawartości cytoplazmy. Prawidłowe barwienie charakteryzowało się fluorescencją cytoplazmatyczną o charakterze od punktowego do rozproszonego, minimalnym prześwitem sygnału do jądra komórkowego oraz zachowaną architekturą aktyny.

Zaobserwowano nieoptymalne wyniki w przypadkach, gdy kluczowe parametry nie zostały odpowiednio zoptymalizowane. Niewystarczająca permeabilizacja skutkowała słabym lub brakiem sygnału p14ARF w jądrze, co pokazano dla warunków bez permeabilizacji (0% niejonowego detergentu oktylofenoletoxylowego; Rycina 3B oraz Rycina uzupełniająca 1). Z kolei nadmierna permeabilizacja (≥0,5% niejonowego detergentu oktylofenoletoxylowego lub wydłużony czas inkubacji) może prowadzić do częściowej utraty barwienia cytoszkieletu, zwiększenia fluorescencji tła oraz naruszenia morfologii komórek. W eksperymentach z białkami szybko wydzielanymi (np. IFN-β), pominięcie BFA często powodowało słabszy sygnał wewnątrzkomórkowy, co odzwierciedlało szybką sekrecję, a nie błąd protokołu.

Kontrole z pojedynczym barwieniem (Supplementary Figure 2) wykazały sygnał wyłącznie w kanale odpowiadającym każdemu z celów, co potwierdza specyficzność obserwowanego barwienia immunofluorescencyjnego. Warunki kontroli negatywnej, w tym kontrole bez przeciwciał pierwszorzędowych oraz kontrole bez przeciwciał (Supplementary Figure 2), wykazały oczekiwane barwienie jąder komórkowych przy pomijalnym sygnale w kanałach zależnych od przeciwciał, co wskazuje na niską autofluorescencję i minimalne nieswoiste wiązanie przeciwciał wtórnych.

Wspólnie te reprezentatywne wyniki wykazują, że protokół umożliwia detekcję białek o różnych lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, pod warunkiem dostosowania procesu fiksacji, stopnia permeabilizacji oraz specyficznych strategii zależnych od celu (np. blokowania sekrecji) do biologii badanego obiektu. Prawidłowa optymalizacja skutkuje silną, specyficzną fluorescencją przy niskim tle i zachowanej morfologii komórkowej, podczas gdy warunki nieoptymalne prowadzą do słabszych lub bardziej zaszumionych sygnałów oraz zmienionej struktury komórek.

Rysunek 1: Schemat blokowy przebiegu procesu immunofluorescencji jedno- i wielokrotnej.Główne etapy od utrzymania hodowli komórkowych po akwizycję obrazów, w tym dwa punkty decyzyjne wymagające wyboru zależnego od celu: metoda fiksacji (PFA versus metanol) oraz permeabilizacja (w zależności od subkomórkowej lokalizacji celu). Opcjonalna obróbka eksperymentalna, w tym wstępna inkubacja z brefeldyną A (BFA) dla celów szybko wydzielanych, jest wskazana jako odgałęzienie przed fiksacją. Opcjonalne kroki pominięte dla przejrzystości (np. gaszenie aldehydów) są opisane w pełnym protokole. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Schematyczny przedstawienie strategii detekcji fluorescencyjnej opartej na przeciwciałach.Detekcja bezpośrednia wykorzystuje przeciwciała pierwszorzędowe sprzężone z fluoroforem, natomiast detekcja pośrednia wykorzystuje niesprzężone przeciwciała pierwszorzędowe w połączeniu z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem; jest to strategia zastosowana w niniejszym protokole. W zastosowaniach multipleksowych detekcja pośrednia wymaga niesprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych otrzymanych u różnych gatunków gospodarzy, co pozwala każdemu przeciwciału drugorzędowemu selektywnie rozpoznawać odpowiadające mu przeciwciało pierwszorzędowe bez reaktywności krzyżowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3: Multipleksowa immunofluorescencja komórek osteosarcoma psiego D17. Komórki D17 (5 × 10⁴) wysiano na szkiełka przedmiotowe w płytkach 24-dołkowych i utrwalono 4% paraformaldehydem (PFA) przez 10 min w 25 °C. Komórki poddano multipleksowej immunofluorescencji z użyciem przeciwciał pierwszorzędowych przeciwko p14ARF (1:200; fluorofory emitujące zielone światło), przeciwko aktynie (1:200; fluorofory emitujące pomarańczowe światło) oraz przeciwko interferonowi-β (IFN-β) (1:200; fluorofory emitujące światło dalekiej czerwieni), z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi w rozcieńczeniu 1:500. Jądra komórkowe poddano przeciwbarwieniu. Przed detekcją IFN-β komórki potraktowano BFA (5 µg/mL, 4 h) w celu zablokowania sekrecji białek. (A) Komórki permeabilizowano 0,3% niejonowym detergentem przez 10 min w 25 °C. (B) Komórki przetworzone bez permeabilizacji (0% niejonowego detergentu). Reprezentatywne obrazy z 2 niezależnych powtórzeń biologicznych, z których każde wykonano w 2 powtórzeniach technicznych. Na tym rysunku przedstawiono wyłącznie kanały złączone; poszczególne kanały znajdują się na Rysunku uzupełniającym 1. Różnice w znakowaniu są widoczne między warunkami, szczególnie w przypadku p14ARF (A; strzałki), celu wewnątrzjądrowego, którego sygnał nie występował w grupie niepermeabilizowanej (B). Panele A i B zostały pozyskane i przetworzone przy użyciu identycznych ustawień (Tabela uzupełniająca 1). Kontrole negatywne i kontrole z pojedynczym barwieniem odpowiadające temu panelowi przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 2. Pasek skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Poszczególne kanały fluorescencji odpowiadające Rycini 3, uporządkowane według markerów z podziałem na komórki permeabilizowane (lewa kolumna) i niepermeabilizowane (prawa kolumna). Warunki przedstawione obok siebie: Hoechst 33342 (A, B), p14ARF (C, D; fluorofory emitujące światło zielone), aktyna (E, F; fluorofor emitujący światło pomarańczowe) oraz IFN-β (G, H; fluorofory emitujące światło dalekiej czerwieni), wraz z odpowiadającymi im panelami scalonymi (I, J), zgodnymi odpowiednio z Rycina 3A i 3B. Strzałki wskazują reprezentatywne barwienie jądrowe p14ARF; elipsy wskazują odpowiednio reprezentatywne barwienie aktyny (E) i IFN-β (G). Utrata sygnału jądrowego p14ARF, wraz z suboptymalnym znakowaniem IFN-β i aktyny, jest widoczna w warunkach braku permeabilizacji. Pozostały sygnał zaobserwowany w (D; gwiazdka) odzwierciedla przenikanie spektralne (crosstalk) z współistniejących fluoroforów, co zostało potwierdzone jego brakiem w odpowiadających im kontrolach z pojedynczym barwieniem oraz kontrolach z samym przeciwciałem wtórnym (Rycina uzupełniająca 2). Pasek skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Połączone kontrole immunofluorescencji odpowiadające panelowi multipleksowemu na Rysunku 3. Dla każdej grupy kontrolnej poszczególne kanały (Hoechst 33342, fluorofory emitujące światło zielone, fluorofor emitujący światło pomarańczowe i fluorofory emitujące światło dalekiej czerwieni) przedstawiono obok obrazu złożonego (piąta kolumna). (A–E) Kontrola bez przeciwciał: komórki przetwarzane bez przeciwciał pierwszorzędowych lub drugorzędowych. (F–J) Kontrola tylko z przeciwciałami drugorzędowymi: komórki inkubowane z koktajlem przeciwciał drugorzędowych wobec braku przeciwciał pierwszorzędowych. (K–O) Kontrola barwienia pojedynczego p14ARF (fluorofory emitujące światło zielone). (P–T) Kontrola barwienia pojedynczego aktyny (fluorofor emitujący światło pomarańczowe). (U–Y) Kontrola barwienia pojedynczego IFN-β (fluorofory emitujące światło dalekiej czerwieni). Ustawienia akwizycji i przetwarzania były identyczne z tymi zastosowanymi na Rysunku 3 (Tabela uzupełniająca 1). Pasek skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Specyfikacje kostek filtrów fluorescencyjnych i kolejność akwizycji. Obrazy pozyskano sekwencyjnie przy użyciu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego w szerokim polu (obiektyw 40×/0.80) z wykorzystaniem wymienionych poniżej kostek filtrów, w podanej kolejności, dla każdego pola obrazowanego na Rysunku 3, Rysunku uzupełniającym 1 oraz Rysunku uzupełniającym 2. Obrazy pozyskano jako pojedyncze płaszczyzny optyczne (bez stosowania z-stackingu).Intensywność wzbudzenia ustawiono za pomocą kontroli intensywności fluorescencji na wskazanych poziomach, przy czym przysłona pola światła padającego była utrzymywana w pozycji 6 dla wszystkich kanałów. Ustawienia kamery (digitalizacja 8-bitowa, format 3072×2048, gamma 1.0) oraz stałe ustawienie cyfrowego wyostrzania były identyczne dla wszystkich kanałów i paneli, w tym dla obrazów kontrolnych na Rysunku uzupełniającym 2. W celu wyświetlenia zastosowano identyczną, pojedynczą liniową regulację jasności/kontrastu dla wszystkich kanałów i paneli. Obrazy wyeksportowano do formatu TIFF. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Przewodnik rozwiązywania typowych problemów technicznych w procedurze immunofluorescencji. Typowe problemy, prawdopodobne przyczyny i działania korygujące w całym protokole.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Kilka kroków jest kluczowych dla powtarzalnych wyników tego przepływu pracy w immunofluorescencji z wykorzystaniem szkiełek podstawowych. Wszystkie procedury są wykonywane w ograniczonej przestrzeni dołka hodowlanego płytki 24-dołkowej, co upraszcza obsługę, ogranicza manipulacje próbkami i umożliwia całkowite pokrycie szkiełka przy użyciu niewielkich objętości odczynników, co redukuje zużycie przeciwciał na jeden eksperyment. Ponieważ roztwory o małej objętości są podatne na odparowanie, inkubacje najlepiej przeprowadzać w komorze nawilżanej i nie wolno dopuścić do wyschnięcia próbek: nawet krótkotrwałe wyschnięcie zwiększa fluorescencję tła i pogarsza morfologię komórek. Podczas aspiracji na szkiełku pozostawia się cienką warstwę buforu, a kolejny roztwór dodaje się niezwłocznie.

Odpowiednie zagęszczenie wysiewu komórek oraz kontrolowany stopień konfluencji w momencie utrwalania są niezbędne do ograniczenia tła i zachowania morfologii, ponieważ nadmierny rozrost zwiększa tło i upośledza architekturę komórkową. Podobnie wymagana jest precyzyjna kontrola czasu i temperatury inkubacji w całym procesie, ponieważ oba te parametry wpływają na wydajność utrwalania, wiązanie przeciwciał oraz sygnał tła^5,13. W przypadku wahań warunków otoczenia, zastosowanie inkubatora z kontrolą temperatury lub suszarki ustawionej na 25 °C, w połączeniu ze spójnym czasem inkubacji we wszystkich powtórzeniach, poprawia powtarzalność.

Fiksacja jest pierwszym decydującym krokiem, ponieważ determinuje ona zachowanie antygenów oraz architekturę komórkową⁵, a utrwalacz jest dobierany w zależności od lokalizacji celu i wrażliwości epitopu. PFA jest zalecane dla większości celów związanych z błoną komórkową, cytoplazmatycznych, jądrowych i cytoszkieletowych, ponieważ zachowuje ono architekturę, utrzymuje rozkład antygenów i jest kompatybilne z barwieniem F-aktyny faloidyną. Metanol może być preferowany dla niektórych antygenów jądrowych, które są słabo wykrywane po fiksacji sieciującej, w szczególności w przypadku fosfo-epitopów lub epitopów wrażliwych na aldehydy, jednak zaburza on integralność błony, ekstrahuje białka rozpuszczalne i upośledza barwienie faloidyną/F-aktyną; kompatybilność należy zweryfikować dla każdego celu ^13,14,15,16. W przypadku rozpuszczalnych cytokin i innych szybko wydzielanych białek, fiksacja PFA w połączeniu z wstępną obróbką BFA pozwala na zachowanie sygnału wewnątrzkomórkowego przed utrwaleniem: BFA blokuje transport białek z retikulum endoplazmatycznego do aparatu Golgiego, co sprzyja wewnątrzkomórkowej akumulacji białek wydzielniczych i umożliwia ich wykrycie metodą immunofluorescencji. Gdy konieczne jest jednoczesne wykrycie celów o sprzecznych wymaganiach dotyczących fiksacji, wymagana jest optymalizacja empiryczna. Gliksal, niewielki dialdehyd, był zgłaszany jako alternatywa dla PFA, oferująca szybsze sieciowanie, lepsze zachowanie antygenów oraz kompatybilność z immunofluorescencją i mikroskopią superrozdzielczą; nie posiadamy bezpośredniego doświadczenia w fiksacji gliksalem i przedstawiamy ją jako opcję popartą literaturą^17,18.

Po utrwaleniu odpowiednia permeabilizacja umożliwia przeciwciałom dostęp do epitopów wewnątrzkomórkowych i jądrowych przy jednoczesnym zachowaniu integralności strukturalnej⁵. Niewystarczająca permeabilizacja zazwyczaj skutkuje słabym lub brakiem sygnału mimo nienaruszonej morfologii, co wskazuje na ograniczony dostęp przeciwciał, natomiast nadmierna permeabilizacja prowadzi do ekstrakcji białek rozpuszczalnych, rozpadu błon, utraty barwienia cytoszkieletu oraz zwiększenia tła. Z tego powodu rodzaj detergentu, jego stężenie oraz czas inkubacji są optymalizowane dla konkretnego celu. Prawidłową permeabilizację ocenia się na podstawie czterech kryteriów: (i) specyficznego sygnału w oczekiwanym przedziale podkomórkowym; (ii) zachowanej morfologii z wyraźnymi granicami jądra i cytoplazmy, rozróżnionymi odpowiednio za pomocą Hoechst 33342 i faloidyny; (iii) wyraźnego barwienia aktyny F, ponieważ rozproszony lub utracony sygnał cytoszkieletu świadczy o nadmiernej permeabilizacji; oraz (iv) niskiego poziomu tła w kontrolach negatywnych. Jeśli kryteria te nie zostaną spełnione, stężenie niejonowego detergentu octylofenolo etoksylanu i/lub czas inkubacji są korygowane empirycznie. W przypadku łączenia antygenów błonowych i wewnątrzkomórkowych w jednym panelu, łagodniejsze warunki (niższe stężenie detergentu, krótsza inkubacja) pozwalają zachować epitopy błonowe, umożliwiając jednocześnie dostęp do wnętrza komórki; przydatne jest wówczas zastosowanie serii czasowej rozpoczynającej się od 5 min i zwiększanej stopniowo. Jeśli zamiast tego używa się saponiny, musi ona znajdować się we wszystkich kolejnych buforach do przeciwciał i płukania, ponieważ jej działanie permeabilizujące jest odwracalne.

Stężenia przeciwciał ustala się empirycznie poprzez miareczkowanie, a nie na podstawie ogólnych zaleceń. Praktycznym podejściem jest zastosowanie serii rozcieńczeń szeregowych obejmujących co najmniej 3–4 stężenia powyżej i poniżej sugerowanego przez producenta rozcieńczenia (np. 1:50, 1:100, 1:200 i 1:400 dla zalecanego rozcieńczenia 1:200), naniesionych na powielone szkiełka podstawowe w identycznych warunkach. Każde rozcieńczenie jest oceniane pod kątem intensywności specyficznego sygnału w oczekiwanym przedziale; stosunku sygnału do tła poprzez porównanie próbek barwionych z odpowiadającą im kontrolą bez przeciwciał pierwszorzędowych oraz tła przeciwciał drugorzędowych z kontrolą bez przeciwciał; a także zachowania morfologii. Wybierane jest najniższe stężenie dające silny, specyficzny sygnał przy minimalnym tle. Utrzymujące się wysokie tło jest zazwyczaj niwelowane poprzez dalsze miareczkowanie, przedłużone blokowanie lub zwiększenie rygorystyczności płukania, podczas gdy słaby sygnał może wynikać z nadmiernej fiksacji, nieoptymalnego stężenia przeciwciał, niezdolności przeciwciała pierwszorzędowego do rozpoznania docelowego epitopu, niedopasowania przeciwciała drugorzędowego do gatunku gospodarza przeciwciała pierwszorzędowego (np. zastosowanie przeciwciała antykróliczego do przeciwciała pierwszorzędowego pochodzącego z myszy) lub utraty sygnału fluoroforu w wyniku degradacji przeciwciała drugorzędowego spowodowanej przeterminowaniem lub niewłaściwym przechowywaniem, w szczególności wielokrotną ekspozycją na światło. Jeśli sygnał jest nieobecny we wszystkich rozcieńczeniach, warto przedłużyć inkubację z przeciwciałami pierwszorzędowymi lub zmienić ją na inkubację nocną w 4 °C, potwierdzić ekspresję antygenu w linii komórkowej, zweryfikować kompatybilność przeciwciał z warunkami fiksacji i permeabilizacji, sprawdzić numer partii, przechowywanie i datę ważności przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, potwierdzić, że mikroskop posiada odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji dla danego fluoroforu, a jeśli problem nadal występuje, przetestować alternatywny klon. Podczas przygotowywania roztworów roboczych wymagana objętość koktajlu to liczba studni pomnożona przez 150 µL plus około 10% nadmiaru w celu zrekompensowania strat podczas pipetowania; objętość zapasu każdego przeciwciała jest równa tej sumie podzielonej przez jego czynnik rozcieńczenia (np. 825 µL ÷ 200 = 4,13 µL dla rozcieńczenia 1:200), a resztę uzupełnia się roztworem TBST–BSA 1%. To samo obliczenie stosuje się do koktajlu drugorzędowego, podstawiając odpowiedni czynnik rozcieńczenia.

Wydajność multipleksowania zależy ostatecznie od projektu panelu fluoroforów. Fluorofory przypisane do celów głównych, barwnika przeciwjądrowego oraz markera cytoszkieletu muszą być skoordynowane, aby uniknąć nakładania się widm lub powielania sygnału, a system obrazowania musi umożliwiać wzbudzenie i detekcję każdego wybranego fluoroforu^9,10; zakresy wzbudzenia i emisji dla każdego kostki filtra podano w Supplementary Table 1, co pozwala na bezpośrednie porównanie kompatybilności spektralnej w obrębie panelu. Użytkownikom adaptującym ten panel do innych fluoroforów zaleca się wybór kombinacji z minimalnym nakładaniem się kanałów sąsiednich, jeśli to możliwe, oraz weryfikację braku przesłuchów (crosstalk) w kontrolach z pojedynczym barwieniem przed połączeniem celów, tak jak zrobiono to w niniejszej pracy. Sygnał szczątkowy przypisywany współobecnym fluoroforom zaobserwowano we wszystkich pozyskanych kanałach w panelu multipleksowym (Supplementary Figure 1), ale był on nieobecny w odpowiadających im kontrolach z pojedynczym barwieniem oraz kontrolach z samym przeciwciałem wtórnym (Supplementary Figure 2), co wskazuje na spektralne przesłuchy wynikające ze zastosowania szerokopasmowych zestawów filtrów w akwizycji szerokopolowej (potencjalnie redukowalne przy użyciu wzbudzenia laserowego w mikroskopii konfokalnej). Biorąc pod uwagę separację przestrzenną między jądrową lokalizacją p14ARF a włóknistym/cytoplazmatycznym rozkładem aktyny i IFN-β, przesłuchy te nie wpływają na interpretację lokalizacji p14ARF w panelu multipleksowym. Ten schemat pracy opiera się na konwencjonalnym multipleksowaniu opartym na fluoroforach, w którym liczba jednocześnie rozróżnialnych celów jest ograniczona przez dostępne gatunki gospodarzy przeciwciał oraz spektralnie odróżnialne fluorofory. Multipleksowanie wyższego rzędu można osiągnąć poprzez cykliczną immunofluorescencję lub obrazowanie spektralne, które umożliwiają odpowiednio iteracyjne barwienie/wyblaczanie lub liniowe rozdzielanie (unmixing) nakładających się fluoroforów, lecz wymagają one specjalistycznego sprzętu i oprogramowania, których nie omówiono w niniejszym materiale^19,20.

Medium montażowe wpływa zarówno na jakość obrazu, jak i na trwałość sygnału. Można zastosować komercyjne, samoutwardzalne medium antyblaknące (antifade) lub, jako alternatywę domowej roboty, 80% glicerol w PBS (bez dodatku antifade i bez możliwości samoutwardzania); preparaty montowane w domowym glicerolu uszczelnia się bezbarwnym lakierem do paznokci, aby zapobiec wysychaniu i przesunięciu szkiełka nakrywnego, a media bez barwników jądrowych wybiera się w przypadku, gdy kontrastowanie jąder zostało już przeprowadzone. Obrazy najlepiej pozyskiwać niezwłocznie po utwardzeniu. Gdy natychmiastowe obrazowanie nie jest możliwe, utwardzone preparaty można przechowywać w ciemnym pudełku w temperaturze 4 °C przez 2–4 tygodnie lub w −20 °C do 6 miesięcy, pamiętając, że silnie fotolabilne fluorofory (np. fluorofory emitujące światło zielone) tracą sygnał z czasem, nawet w optymalnych warunkach przechowywania. Komercyjne media antyblaknące znacznie wydłużają stabilność fluoroforów w porównaniu z mediami na bazie glicerolu domowej roboty; w przypadku stosowania tych drugich zdecydowanie zaleca się akwizycję danych w ciągu 24–48 h. Bezbarwny lakier do paznokci jest kompatybilny z większością fluoroforów i nie wpływa w znacznym stopniu na zachowanie sygnału, pod warunkiem zapewnienia co najmniej 30 min utwardzania w ciemności przed przechowywaniem.

Od etapu fiksacji technika sterylna nie jest już wymagana, a barwienie może być przeprowadzane na blacie, z zastrzeżeniem korzystania z certyfikowanego dygestorium chemicznego w przypadku odczynników oznaczonych jako CAUTION. Linie komórkowe D17 oraz inne linie pochodzące z nowotworów są traktowane zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego dla materiałów z grupy ryzyka 1 lub 2, w zależności od przypadku. Wszystkie materiały mające kontakt z hodowanymi komórkami, szkiełka nakrywkowe, końcówki, pożywka oraz odpady ciekłe są dekontaminowane przed utylizacją: odpady ciekłe są inaktywowane wybielaczem do końcowego stężenia 10% przez co najmniej 30 min, a odpady stałe są wyrzucane do odpowiednich pojemników na odpady biologiczne. Odpady chemiczne zawierające PFA, metanol lub niejonowy detergent oktylofenoletoksylan są segregowane i utylizowane zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa chemicznego.

Choć ten schemat pracy został zaprojektowany jako szeroko użyteczny, należy go traktować raczej jako metodę podatną na adaptację w zależności od celu, a nie jako sztywną, uniwersalną procedurę; pomyślne zastosowanie zależy od zrozumienia przez badacza lokalizacji każdego antygenu, jego rozpuszczalności, dostępności epitopów oraz wrażliwości na utrwalanie i permeabilizację. Należy podkreślić dwa ograniczenia. Po pierwsze, ocena barwienia w niniejszym opracowaniu ma charakter jakościowy, oparty na porównaniu z kontrolami negatywnymi i oczekiwaną lokalizacją wewnątrzkomórkową, a nie na formalnej kwantyfikacji stosunku sygnału do tła; w związku z tym opisana tutaj spójność odzwierciedla powtarzalne barwienie jakościowe na powtarzalnych szkiełkach i w warunkach kontrolnych, a nie ilościowo zwalidowaną wydajność. W Tabeli uzupełniającej 2 zamieszczono zbiorczy przewodnik rozwiązywania problemów, podsumowujący typowe trudności, prawdopodobne przyczyny i działania naprawcze. Laboratoria wymagające odczytów ilościowych mogą korzystać z otwartoźródłowego oprogramowania do analizy obrazu w celu pomiaru średniej intensywności, odejmowania tła, kwantyfikacji opartej na obszarach zainteresowania (ROI) oraz profilowania intensywności²¹. Po drugie, reprezentatywne dane pochodzą z jednej adhezyjnej linii nowotworowej psa (D17), zatem rozszerzenie metody na inne typy komórek, gatunki lub kombinacje antygenów będzie wymagało specyficznej dla celu reoptymalizacji warunków utrwalania, permeabilizacji i stosowania przeciwciał.

Podsumowując, niniejszy protokół zapewnia elastyczny i kosztowo efektywny schemat pracy dla mono- i multipleksowej immunofluorescencji w adherentnych kulturach 2D, łącząc niskie zużycie odczynników ze spójną jakością barwienia przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego, umożliwiając jednocześnie świadomą adaptację w zależności od badanego celu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
24-dołkowe płytki do hodowli tkanek	Corning	3524	Wysiew na szkiełka i barwienie
Antybiotyk-antymykotyk	Gibco	15240062	Stosowany w celu zapobiegania kontaminacji bakteryjnej i grzybiczej w hodowli komórkowej.
Roztwór rozcieńczający przeciwciała (TBST-BSA 1%)	Przygotowany wewnętrznie	—	Do 10 mL: 2 mL 5% roztworu blokującego BSA + 5 µL Tween-20 + 7,995 mL TBS 1x (roztwór roboczy) do końcowej objętości 10 mL (końcowe stężenie: 1% BSA, 0,05% Tween-20 w TBS; pH 7,6). Przygotowywać na świeżo; w przypadku przechowywania trzymać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed kontaminacją, i zużyć w ciągu 1 tygodnia.
Roztwór blokujący	Przygotowany wewnętrznie	—	Do 10 mL: 0,5 g BSA rozpuszczone w 10 mL TBS 1x (1 mL stoku TBS 10x + 9 mL wody destylowanej); pH 7,6. Inkubacja przez 30 min w 25 °C; przygotowywać na świeżo.
(5% BSA w TBS)
Brefeldyna A	Sigma-Aldrich	B7651	5 µg/mL; 4 h wstępnej inkubacji w celu zablokowania sekrecji białek przed detekcją cytokin.
BSA (albumina surowicy bydlęcej)	Sigma-Aldrich	A7906	5% w TBS do blokowania; 1% w TBS + 0,05% Tween-20 jako rozcieńczalnik przeciwciał.
Odczynnik na bazie kolagenu (powlekanie szkiełek, opcjonalnie)	Corning	354231	Kolagen typu I pochodzący z bydlęcej skóry właściwej; rozcieńczony do 50 µg/mL w 0,01 N HCl; nanoszony w ilości 5–10 µg/cm² (≈100 µL/dołek); inkubować 1 h w temperaturze pokojowej (≈25°C); odessać i przepłukać PBS przed wysianiem komórek.
Szkiełka nakrywkowe, szklane, okrągłe 12 mm	Knittel Glass	100013	Podłoże do hodowli komórek adherentnych i barwienia.
Linia komórkowa osteosarcoma psa D17	Banco de células do Rio de Janeiro	276	Reprezentatywny model komórkowy; utrzymywany w DMEM uzupełnionym o 10% FBS i antybiotyk-antymykotyk; hodować w 37 °C, 5% CO2.
(BCRJ)
Woda dejonizowana/destylowana	Przygotowana wewnętrznie	—	Przygotowanie buforów.
DMEM (podłoże Eagle'a modyfikowane przez Dulbecco)	Gibco	12100-046	Podłoże kompletne do hodowli komórkowej.
Etanol	Supelco	1.00983	Dekontaminacja szkiełek i pęset.
Płodowa surowica bydlęca	Sigma-Aldrich	F7524	Suplement do podłoża hodowli komórkowej.
(FBS)
Fibronektyna	Gibco	33016015	Glikoproteina macierzy zewnątrzkomórkowej; rozcieńczona do 0,0125 mg/mL w podłożu do hodowli komórkowej; nanoszona w ilości 100 µL/dołek i inkubowana przez 1 h w temperaturze pokojowej (≈25°C) przed wysianiem komórek.
Metalowa pęseta z cienkim czubkiem	Różne	—	Manipulacja szkiełkami nakrywowymi.
Mikroskop fluorescencyjny	Leica Microsystems	DMi8	Szerokopolowy mikroskop fluorescencyjny DMi8 (Leica Microsystems), obiektyw HC PL FLUOTAR 40×/0,80 DRY; kompatybilny z fluoroforami w panelu (AF488, AF555, AF647, Hoechst).
Szklane preparaty mikroskopowe	Bioslide	—	Montaż zabarwionych szkiełek nakrywowych do obrazowania.
Szklana szalka Petriego lub uchwyt do szkiełek	Różne	—	Autoklawowanie/przechowywanie szkiełek nakrywowych.
Glicyna	Sigma-Aldrich	8.16E+09	Do 10 mL 50 mM roztworu: 37,5 mg glicyny rozpuszczone w 10 mL TBS 1x; pH 7,6. 5 min w 25 °C; opcjonalny etap wygaszania aldehydów po fiksacji, przed permeabilizacją; przygotowywać na świeżo.
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Do 10 mL roztworu roboczego: rozcieńczyć stok 1:5000 w TBS. Barwnik przeciwjądrowy; inkubować w ciemności; przygotowywać na świeżo.
Komora nawilżana	Różne/Przygotowana wewnętrznie	—	Do inkubacji przeciwciał; alternatywnie wykonana z zamkniętego plastikowego pudełka z wilgotnym papierem chłonnym.
ImageJ	Open source (NIH)	—	Stosowany do analizy obrazów po akwizycji.
Oprogramowanie do akwizycji obrazów	Leica Microsystems	LAS X 3.7.3	Stosowane do akwizycji obrazów na Leica DMi8.
Metanol	Merck	1.06009	Alternatywna fiksacja (antygeny jądrowe/fosfo-epitopy); schłodzony do −20 °C, inkubacja przez 5 min; może upośledzać barwienie faloidyną/F-aktyną.
Medium montażowe	Sigma-Aldrich	G2289	Do 10 mL: 8 mL glicerolu + 2 mL PBS, pH 7,6, wymieszać dokładnie. Brak właściwości anty-fadingowych i nie utwardza się samoistnie. Krawędzie szkiełka nakryć lakierem do paznokci, aby zapobiec wysychaniu/przesunięciu; przechowywać preparaty w 4 °C w ciemności i obrazować niezwłocznie, aby zminimalizować fotobleaching.
(na bazie glicerolu)
Medium montażowe (ProLongTM Glass)	Invitrogen	P36984	Zawiera odczynniki anty-fadingowe i utwardza się samoistnie w ciągu ok. 24 h w temperaturze pokojowej, w ciemności, tworząc trwały montaż (nie wymaga lakierowania krawędzi). Przechowywać preparaty w 2–8 °C, chroniąc przed światłem do czasu obrazowania.
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Komponent jonowy buforu TBS; utrzymuje fizjologiczną osmolarność w celu zachowania morfologii komórek i tkanek podczas etapów płukania i inkubacji przeciwciał.
Igła (cienka, np. 25–27G)	Różne	—	Używana jako dźwignia do delikatnego podniesienia/odczepienia szkiełka nakrywy od dna dołka bez uszkodzenia monowarstwy komórek.
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Do 10 mL: 0,4 g proszku paraformaldehydu rozpuszczonego w 8 mL PBS, podgrzanego do 60–65 °C z kilkoma kroplami 1N NaOH aż do przejrzystości, schłodzonego, z pH skorygowanym do 7,4 i dopełnionego do 10 mL roztworem PBS; filtrować przez filtr 0,2 µm przed użyciem. Przygotowywać na świeżo lub porcjować i przechowywać w −20 °C, unikając wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
Faloidyna, sprzężona z fluoroforem.	Invitrogen	Zależnie od wybranej fluorescencji.	Do 10 mL roztworu roboczego: rozcieńczyć stok 1:400 w TBS, pH 7,6, zgodnie z instrukcją producenta. Alternatywny znacznik cytoszkieletu/F-aktyny; przygotowywać na świeżo, w ciemności.
Fosforanowy bufor solny	Sigma-Aldrich	P4474-1L	Izotoniczny bufor fosforanowy (pH 7,4); utrzymuje fizjologiczną osmolarność w celu zachowania morfologii komórkowej podczas etapów fiksacji i płukania.
(PBS)
Poli-L-lizyna (powlekanie szkiełek, opcjonalnie)	Sigma-Aldrich	P8920	Syntetyczny polikationowy odczynnik do powlekania zwiększający elektrostatyczną adhezję komórek; stosowany w stężeniu 0,1 mg/mL w wodzie destylowanej; objętość wystarczająca do pokrycia powierzchni szkiełka; inkubować 30 min w 25 °C przed wysianiem komórek.
Przeciwciało pierwszorzędowe, anty-aktyna (pochodzenie: koza)	Santa Cruz Biotechnology	SC-1615	Przeciwciało anty-aktynowe; poliklonalne, niesprzężone, wykrywane przeciwciałem wtórnym anty-kozim. Stosowane w rozcieńczeniu roboczym 1:200.
Przeciwciało pierwszorzędowe, anty-IFN-β (pochodzenie: mysz)	Aviva Systems Biology	OAPB00536	Przeciwciało anty-IFN-β; poliklonalne, niesprzężone, wykrywane przeciwciałem wtórnym anty-mysim. Stosowane w rozcieńczeniu roboczym 1:200.
Przeciwciało pierwszorzędowe, anty-p14ARF (pochodzenie: królik)	Calbiochem	PC409	Przeciwciało anty-p14ARF; poliklonalne, niesprzężone, wykrywane przeciwciałem wtórnym anty-kroliczym. Produkt ten został wycofany, w przypadku planowania prac nad tym celem konieczna będzie walidacja nowego przeciwciała. Stosowane w rozcieńczeniu roboczym 1:200.
Przeciwciało wtórne, anty-królicze, sprzężone z Alexa Fluor 488	Thermo Fischer Scientific	A32731TR	Przeciwciało anty-królicze sprzężone z AF488. Stosowane w rozcieńczeniu roboczym 1:500.
Przeciwciało wtórne, anty-kozie, sprzężone z Alexa Fluor 555	Thermo Fischer Scientific	A-21432	Przeciwciało anty-kozie sprzężone z AF555. Stosowane w rozcieńczeniu roboczym 1:500.
Przeciwciało wtórne, anty-mysie, sprzężone z Alexa Fluor 647	Thermo Fischer Scientific	A-21235	Przeciwciało anty-mysie sprzężone z AF647. Stosowane w rozcieńczeniu roboczym 1:500.
Bufor solny Tris (TBS), stok 10x	Przygotowany wewnętrznie	—	Do 100 mL: rozpuścić 6,06 g bazy Tris i 8,77 g NaCl w 80 mL wody destylowanej; skorygować pH do 7,6 stężonym HCl; dopełnić do końcowej objętości 100 mL; autoklawować. Rozcieńczyć 1:10 w wodzie destylowanej dla uzyskania roztworu roboczego (TBS 1x) (końcowe: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6); przechowywać w temp. pokojowej lub 4 °C do 3 miesięcy.
TBST (TBS + 0,05% Tween-20)	Przygotowany wewnętrznie	—	Do 10 mL: 1 mL stoku TBS 10x + 8,995 mL wody destylowanej + 5 µL Tween-20 (0,05% v/v); pH 7,6. Bufor do płukania między etapami barwienia; przygotowywać na świeżo, zużyć w ciągu ok. 1 tygodnia w 4 °C.
Baza Tris	Sigma-Aldrich	252859	Odczynnik buforujący stosowany do przygotowania stoku TBS; utrzymuje stabilność pH w zakresie fizjologicznym (pH 7,6) dla buforów do płukania i rozcieńczania w immunofluorescencji.
Triton X-100 (niejonowy detergent etoksylan oktylofenolu)	Sigma-Aldrich	X100	Do 10 mL: 10 µL Triton X-100 w 9,99 mL TBS 1x dla TX100 0,1%; 30 µL w 9,97 mL TBS 1x dla TX100 0,3% (zależnie od celu; cele jądrowe wymagają wyższych stężeń).
Trypsyna-EDTA	Gibco	25200056	Stosowana do odrywania komórek.
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	Stosowany w TBS do przygotowania buforu do płukania (TBST) i rozcieńczalnika przeciwciał (TBST-BSA 1%).