Artykuł metodologiczny

Równoległe in vivo badanie wyłączania i aktywacji genów w gruczołach piersiowych myszy

DOI:

10.3791/71115

⸱

24 lipca 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje skalowalne podejście do wewnątrzkanalikowego przesiewania CRISPR, umożliwiające równoległe in vivo badania nad wyłączeniem genów i aktywacją w gruczołach piersiowych myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekrany genetyki przesunięte są rutynowo stosowane do zakłócania tysięcy elementów genetycznych w sposób zgrupowany w celu stworzenia dużych map związku genotyp-fenotyp. Chociaż często przeprowadzane są w systemach kultury komórkowej, rosnące dowody potwierdzają, że ekrany in vivo mają moc ujawnienia nowej biologii, której nie można odtworzyć in vitro. Jednak szerokie zastosowanie tego podejścia było ograniczone przez dwa główne wyzwania: dominujący skutek na zakłóceniach utraty funkcji zamiast aktywacji genów oraz znaczne trudności techniczne z dostarczeniem złożonych bibliotek genetycznych do określonych tkanek in vivo. Aby przezwyciężyć te wyzwania, opisujemy prostą i wszechstronną strategię iniekcji do przewodów, która umożliwia wydajne i szybkie przesiewowe badania genomowe w gruczołach piersiowych myszy poprzez generowanie dziesiątek tysięcy osobnych klonów nabłonkowych. Ponadto dostarczamy wszystkich szczegółów niezbędnych do generowania bibliotek, iniekcji do przewodów, rozwikływania ekranów i analizy bibliotek CRISPR-Knockout i Aktywacji dla kompleksowych ekranów in vivo. Korzystając z tych narzędzi, które nazwano CRISPR-KOALA (Test Związany z Knockoutem i Aktywacją), zidentyfikowaliśmy nowe supresory nowotworowe i onkogeny w genomie kodującym i niekodującym w zgrupowanych bibliotekach wahających się od 46 lokacji do piątej części genomu. Co ważne, to podejście i analiza mogą być zastosowane do innych narządów w celu badania funkcji biologicznych dowolnego genu podczas homeostazy lub choroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania funkcjonalnej genomiki zapewniają potężną ramę do badania funkcji genów w skali1. Rozwój technologii edytacji genów CRISPR-Cas umożliwił systematyczne zakłócanie setek do tysięcy genów równolegle, a przesiewowe badania oparte na CRISPR w liniach komórek ssaków stały się filarem współczesnych badań nad biologią nowotworów2. Te in vitro podejścia zidentyfikowały geny niezbędne3, supresory nowotworowe4 oraz interakcje syntetycznie śmiertelne5 w różnorodnych kontekstach nowotworów. Jednak jednym z głównych ograniczeń jest niemożność uchwycenia złożonych biologicznych cech guzów in vivo, w tym interakcji z układem odpornościowym i stromą, gradientów składników odżywczych oraz struktury tkankowej w mikrośrodowisku2. Zgodnie z tym ograniczeniem, ostatnie badania wykazały, że wiele bona fide genów sterujących nowotworami nie wywiera mierzalnych efektów in vitro, zwłaszcza jeśli ich funkcja zależy od bodźców mikrośrodowiskowych, których brakuje w hodowli komórkowej6,7,8,9,10.

Grucz ssaków dostarcza unikalnie korzystnego kontekstu tkankowego do przesiewów funkcjonalnej genomiki in vivo. Komórki nabłonkowe gruczołu mlekowego są wysoce regeneracyjne, przechodzą kolejne rundy klonalnej ekspansji podczas cyklu estrusowego i są zorganizowane w rozgałęzioną sieć przewodów, która może być łatwo uzyskany i genetycznie manipulowany11,12,13. Te cechy wspierają dziesięciolecia mozaikowych analiz genetycznych i eksperymentów śledzenia linii i ustanawiają gruczoł mlekowy jako użyteczny system do badania funkcji genów intrinsycznych dla komórek i zależnych od mikrośrodowiska podczas homeostazy tkankowej i choroby14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. Co ważne, zakłócenia genetyczne mogą być ograniczone do nabłonkowego przedziału, umożliwiając bezpośrednie badanie nabłonkowych czynników transformacji, konkurencji komórkowej, wierności linii i progresji nowotworów w całym tkankowym kontekście.

Mimo że opracowano kilka strategii dostarczania zakłóceń genetycznych bezpośrednio do dorosłego gruczołu mlekowego in situ, pozostają znaczne trudności techniczne dla zastosowań wysokowydajnych. Dostarczanie adenowirusem rekombinazy Cre było szeroko stosowane do indukcji somatycznej rekombinacji warunkowych alleli w dorosłym gruczole mlecznym34,35,36,37, oferując wydajny sposób manipulacji funkcją genów bez złożonego hodowlano-genetycznego hodowania wymaganego dla tradycyjnych genetycznie zmodyfikowanych modeli myszy (GEMM). Podczas gdy adenowirus wysokiej titry może również dostarczyć komponenty CRISPR-Cas9 do komórek tkankowych, te wektory nie integrują się z genomem gospodarza38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. To poważnie ogranicza skalę przesiewów do ~10–55 genów, ponieważ każde miejsce docelowe gRNA musi być sekwencjonowane indywidualnie za pomocą sond inwersji molekularnej38,39,40,41,42,43,44,45,46,47. Co więcej, obecnie stosowane metody dostarczania dokanałowego umożliwiają bezpośredni dostęp do dokanałowego układu gruczołu mlekowego, ale wymagają albo inwazyjnej ekspozycji chirurgicznej gruczołu mlekowego5

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach były wykonywane zgodnie z wytycznymi kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Centrum Fenogenomiki (protokół 26-0272H).

1. Klonyzacja bibliotek CRISPR

UWAGA: Ta sekcja opisuje skupione klonowanie bibliotek CRISPR knockout i CRISPR activation z oligonukleotydów syntetyzowanych w macierzy do wirusów lentycznych. Rutynowo generujemy biblioteki zawierające do 4000 gRNA, które mogą być badane z pokryciem 400x-1000x w 8-20 myszy. Liczbę gRNA i pokrycie można dostosować według potrzeb, co wpłynie na liczbę myszy wymaganą do utrzymania mocy statystycznej. Zalecamy utrzymanie minimalnego pokrycia 400x, które może być wystarczające dla silnych fenotypów zysk funkcji.

  1. Projektowanie bibliotek Guide RNA
    1. Skompiluj listę wszystkich genów myszy do przebadania w ramach pojedynczego eksperymentu do dalszego projektowania bibliotek CRISPR, utrzymując osobne listy celów dla bibliotek CRISPR knockout (CRISPR-KO) i CRISPR activation (CRISPR-A).
      UWAGA: Biblioteki CRISPR-KO i CRISPR-A są generowane osobno i mogą być łączone na etapie transdukcji wirusowej w celu jednoczesnego badania.
    2. Dla bibliotek CRISPR-KO, wybierz od czterech do pięciu pojedynczych guide RNA (sgRNA) na gen używając algorytmów przewidywania wysokiej oceny takich jak CRISPick62,63, CHOPCHOP64, czy VBC Score65.
      UWAGA: VBC Score zapewnia bardzo wysoką skuteczność i aktywność na docelowych genach66. Niezależnie od narzędzia, preferuj guide z wysoką przewidywaną aktywnością na docelowych genach, minimalnym potencjałem off-target oraz kierowaniem się na egzony kodujące.
    3. Dla bibliotek CRISPR-A, wybierz osiem do dziesięciu guide na gen używając CRISPick62,63 czy CHOPCHOP64. Dla narzędzi, które pozwalają na określenie długości guide przez użytkownika (takich jak CHOPCHOP), ustaw długość guide na 14 bp przed wygenerowaniem guide. Jeśli używasz narzędzia, które generuje tylko guide 20 bp, przekształć te sekwencje na martwe guide RNA (dgRNA) zachowując 14 bp sekwencji bezpośrednio 5’ od motywu protospacer, którego docelowym obszarem są regiony promotorowe genów.
      UWAGA: dgRNA to skrócone sekwencje guide zaprojektowane w celu umożliwienia CRISPR-based aktywacji transkrypcyjnej na około 50-85% skuteczności pełnych długości sgRNA55 bez indukowania kleizenia DNA59,60,61.
    4. Skup wszystkie sgRNA lub dgRNA odpowiadające pojedynczemu eksperymentowi na osobne listy, aby umożliwić jednolite klonowanie, produkcję wirusów i in vivo badanie.
      UWAGA: sgRNA i dgRNA, które mają być badane razem, zostaną skupiony po produkcji wirusowej.
    5. Generuj skupione biblioteki kontroli negatywnej dla skupisk CRISPR-KO i CRISPR-A, włączając nie-docelowe55,67 i nie-genowe sekwencje gRNA68, jak opisano wcześniej, aby kontrolować efekty tła niezależne od zakłócenia lub aktywacji genu.
      ​UWAGA: W razie potrzeby można stworzyć oddzielne biblioteki nie-docelowych i nie-genowych gRNA, aby utworzyć dwie niezależne biblioteki kontroli negatywnej.
  2. Projektowanie puli oligonukleotydów i amplifikacja
    1. Zaprojektuj skupione oligonukleotydy tak, aby każdy gRNA zawierał sekwencję docelującą, zakończenia enzymu restrykcyjnego kompatybilne z docelowym podłożem wirusa lentycznego oraz sekwencje pierwszeństwa specyficzne dla biblioteki, aby umożliwić selektywną amplifikację z kompleksowego skupienia oligonukleotydów (Rysunek 1, Tabela 1).
    2. Przypisz unikalną parę pierwszeństw do każdej biblioteki gRNA, aby pozwolić na niezależną amplifikację poszczególnych bibliotek z wspólnego skupienia oligonukleotydów. Unikalne pary pierwszeństw są wymienione w Tabeli 1.
    3. Zamów skupione biblioteki oligonukleotydów z komercyjnej platformy syntezy matrycowej, upewniając się, że wszystkie gRNA są reprezentowane równocześnie w każdej puli.
    4. Amplifykacja poszczególnych bibliotek gRNA z pokrojonej puli oligonukleotydów za pomocą pierwszeństw specyficznych dla biblioteki w następującym mieszaniu reakcji. Reakcja może być zmodyfikowana, aby odpowiadać zaleceniom składowym określonej polimerazy. Przygotuj trzy reakcje z pokrojoną pulą oligonukleotydów i jedną reakcję kontrolną bez szablonu.
      4 ng Pokrojonego szablonu oligonukleotydów
      2,5 μL 10 μM Pierwszeństwo specyficzne dla pierwszeństwa
      2,5 μL 10 μM Pierwszeństwo specyficzne dla pierwszeństwa odwrotnego
      10 μL 5x

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół pulowanego przesiewania CRISPR in vivo w gruczole mlekowym myszy. Ten schemat postępowania może być wykorzystany w całości do projektowania i amplifikacji pulowanych bibliotek gRNA z macierzy oligonukleotydowych, klonowania bibliotek gRNA do szkieletów lentiwirusowych, produkcji lentiwirusów o wysokim mianie, przeprowadzania wewnątrzprzewodowej dostawy pulowanych bibliotek lentiwirusowych do dorosłego gruczołu mlekowego oraz odzyskiwania gRNA w celu dekonwolucji reprezentacji biblioteki na podstawie sekwencjonowania (Rysunek 1).

Prawidłową amplifikację i klonowanie pul gRNA najpierw ocenia się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Amplifikacja PCR bibliotek gRNA daje dyskretne prążki, co wskazuje na jednorodną amplifikację z pulnych macierzy chipów oligonukleotydowych (Ryc. 2A). Trawienie restrykcyjne szkieletów pXPR502 PPH-Cre oraz pLKO Cre prowadzi do wyraźnego oddzielenia zlinearyzowanego szkieletu od fragmentu wypełniającego (stuffer fragment) (Ryc. 2B,C). Efektywne trawienie i czyste odzyskanie szkieletu są kluczowe dla zminimalizowania ligacji tła oraz uzyskania wysokiej złożoności biblioteki podczas klonowania.

Ważnym aspektem przy stosowaniu CRISPR-KOALA jest wydajność dgRNA w połączeniu z aktywną nukleazą Cas9 w porównaniu z innymi konwencjonalnymi podejściami wykorzystującymi pełnowymiarowe sgRNA i nieaktywną nukleazę Cas9 (dCas9). Wykazaliśmy wcześniej, że dgRNA wraz z aktywną Cas9 są wystarczające do indukowania aktywacji genów z wydajnością wynoszącą około 50–85% wydajności pełnowymiarowych sgRNA55. Aby zrekompensować ten spadek aktywacji i zniwelować potencjalnie mniejszą wydajność dgRNA w stosunku do sgRNA, w projekcie naszej biblioteki postanowiliśmy uwzględnić dwukrotnie większą liczbę dgRNA na jeden gen. Ponieważ metodologia ta ogranicza się do wykorzystania aktywnej Cas9 do nokautu genów, uznaliśmy, że taki poziom aktywacji jest wystarczający dla przesiewu CRISPR. Aby to sprawdzić, przeprowadziliśmy zależną od dgRNA aktywację kilku genów endogennych, w tym Erbb2, Esr1 oraz Plgrkt, uzyskując silną ekspresję zarówno na poziomie mRNA, jak i białka55. Co istotne, regularnie osiągaliśmy 3- do 10-krotny wzrost ekspresji genów docelowych, co często jest bardziej istotne fizjologicznie niż 100- do 1000-krotne wzrosty obserwowane w wielu konwencjonalnych systemach CRISPR-A.

Złożoność biblioteki po ligacji i elektroporacji ocenia się poprzez wysiewanie rozcieńczeń seryjnych transformowanych bakterii. O udanym klonowaniu biblioteki świadczy obecność gęstych i równomiernie rozmieszczonych kolonii w reakcjach ligacji w porównaniu z nielicznymi koloniami na płytkach z kontrolą negatywną zawierającą jedynie szkielet wektora (Rysunek 3). Liczbę kolonii na płytkach z rozcieńczeniami wykorzystuje się do oszacowania reprezentatywności biblioteki, dążąc do uzyskania pokrycia przekraczającego 1 000-krotność (np. 1 000 kolonii bakteryjnych na gRNA w bibliotece). Niewystarczające pokrycie lub wysokie tło na płytkach z kontrolą negatywną wskazują na suboptymalną ligację i/lub elektroporację. W takim przypadku kroki te należy powtórzyć przed wielkoskalową ekspansją kultur bakteryjnych.

W przypadku wstrzykiwań dokanałowych do gruczołu piersiowego oraz pulowanych przesiewów in vivo, preparaty lentiwirusowe muszą zostać skoncentrowane w celu uzyskania wystarczająco wysokich mian funkcjonalnych. Produkcja wirusów o wysokim mianie może zostać zwalidowana poprzez mianowanie funkcjonalne z użyciem zarodkowych fibroblastów mysich LSL-tdTomato (MEF, JAX# 007909), ponieważ oba szkielety pLKO i pXPR502 opisane w niniejszym protokole wykazują ekspresję Cre. Niemniej jednak, w razie potrzeby można zastosować alternatywne metody dla innych szkieletów (np. z wykorzystaniem innego reportera fluorescencyjnego lub selekcji antybiotykowej w obrębie szkieletu lentiwirusowego). Wydajne preparaty lentiwirusowe wykazują wyraźną, zależną od dawki indukcję ekspresji tdTomato w zakresie liniowym, co umożliwia obliczenie mian funkcjonalnych (Rycina 4A–D). W przypadku pulowanych i multipleksowych przesiewów CRISPR-KO oraz CRISPR-A lentiwirusy są produkowane, koncentrowane i mianowane osobno, a miana funkcjonalne służą do normalizacji i mieszania dwóch bibliotek lentiwirusowych w określonych proporcjach przed infekcją.

Prawidłowe i wydajne dostarczanie połączonych bibliotek lentiwirusowych do gruczołu piersiowego u dorosłych osobników jest niezbędne do optymalnego zainfekowania nabłonka gruczołowego. Prawidłowe umieszczenie szklanej mikrokapilary w obrębie sutka w celu uzyskania dostępu do przewodu mlecznego (Rycina 5A) ma kluczowe znaczenie dla rozprowadzenia lentiwirusa w całym drzewie przewodowym. Odpowiednio dobrany rozmiar końcówki igły pozwala na załadowanie lentiwirusa do wnętrza igły, umożliwiając jednocześnie wprowadzenie jej do przewodu mlecznego przy minimalnym oporze. Pomyślne wstrzyknięcia można rozpoznać po jednolitym rozprowadzeniu barwnika Fast Green w całym drzewie przewodowym gruczołu piersiowego, co jest widoczne zewnętrznie bezpośrednio po iniekcji (Rycina 5B). W przeciwieństwie do tego, nieudane wstrzyknięcia charakteryzują się gromadzeniem się barwnika pod sutkiem, co świadczy o dostarczeniu preparatu do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego, a nie do przewodu mlecznego (Rycina 5C). Barwienie immunohistochemiczne przekrojów tkanki gruczołowej można wykorzystać do potwierdzenia infekcji komórek nabłonkowych (Rycina 5D), a cytometria przepływowa może służyć do ilościowego określenia proporcji zainfekowanych komórek nabłonkowych luminalnych i bazalnych (Rycina 5E), co w obu przypadkach potwierdza skuteczne celowanie w komórki nabłonka gruczołu piersiowego po podaniu wewnątrzprzewodowym.

Po odzyskaniu genomowego DNA poddaje się go amplifikacji metodą PCR w celu sekwencjonowania głębokiego nowej generacji, aby określić ilościowo, które gRNA zostały wzbogacone w danej próbce. Po PCR produkty rozdziela się za pomocą elektroforezy żelowej, co powinno przynieść produkty specyficzne dla lentiwirusa (Rycina 1 oraz Rycina 6). Sporadycznie może obserwować się niespecyficzną amplifikację, szczególnie w próbkach CRISPR-A (Rycina 6B), choć produkt ten zazwyczaj ma długość powyżej 1 000 bp i jest wyraźnie oddzielony od produktu interesującego nas; niemniej jednak obecność silnego prążka o oczekiwanej wielkości wskazuje na pomyślne odzyskanie biblioteki. Reakcje kontrolne bez matrycy nie powinny dawać żadnego wykrywalnego prążka, a obecność amplifikacji w tych kontrolach sugeruje kontaminację, co upośledzi późniejsze ilościowe oznaczenie biblioteki (Rycina 7A). Jeśli zaobserwowano taką kontaminację, każdy zapas starterów należy przetestować, używając wody jako matrycy, aby zidentyfikować źródło zanieczyszczenia, a następnie niezwłocznie wymienić dany starter lub startery. Oczyszczone amplikony łączy się w stosunkach ekvimolarnych i sekwencjonuje na platformie sekwencjonującej Illumina z krótkimi odczytami w celu późniejszej kwantyfikacji przewodników.

Sekwencjonowanie bibliotek dostarcza jasnego miernika sukcesu klonowania biblioteki i produkcji wirusów. Optymalnie wytworzone i poddane kontroli jakości biblioteki wykazują równomierną reprezentację gRNA, przy czym żadne (lub bardzo niewiele) z przewodników nie brakuje w transdukowanych komórkach (Rysunek 7B). W przypadku dużych bibliotek utrata niewielkiej liczby gRNA nie będzie miała znaczącego wpływu na wydajność biblioteki, jeśli pozostałe gRNA dla każdego genu są dobrze reprezentowane.

Do tej pory to podejście do przesiewania było wykorzystywane przede wszystkim do oceny skłonności pojedynczych klonalnych zaburzeń genetycznych do indukowania transformacji komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego oraz wzrostu guza w genetycznym tle uwrażliwionym na nowotwory36,55. Analiza i sekwencjonowanie pojedynczego guza klonalnego często ujawnia klonalne wzbogacenie pojedynczego gRNA, który może zostać zaklasyfikowany jako hit przesiewowy (Rysunek 7C). W niektórych przypadkach w guzach obecne są dwa lub więcej gRNA w w przybliżeniu równych proporcjach. Może to być wynik podwójnej infekcji lub dwóch klonów rosnących wspólnie w jedną masę guza. Czasami możliwe jest rozróżnienie tych dwóch możliwości poprzez pobranie próbek z wielu obszarów tego samego guza, jednak taki stopień szczegółowości zazwyczaj nie jest wymagany. Prawdziwe hity można łatwo odróżnić od wielokrotnych infekcji na podstawie ich częstego występowania w wielu guzach w ramach przesiewu, podczas gdy przypadkowe zdarzenia towarzyszące nie będą powtarzać się w wielu guzach. Naszym standardowym podejściem do wyznaczania hitów w całym przesiewie jest ustalenie progu liczby odczytów na poziomie 80%, gdzie każdy gRNA, który posiada co najmniej 80% odczytów w danej próbce, jest uznawany za hit. Ilościowe określenie liczby tych hitów we wszystkich sekwencjonowanych guzach pozwoli zidentyfikować geny o najsilniejszym efekcie fenotypowym.

Metodę tę można również zastosować w gruczołach mlekowych przed powstaniem guza, oceniając liczebność gRNA za pomocą narzędzi takich jak MAGeCK71. W takim układzie podejście to sprawdza się dobrze w kontekście screeningu wzbogacającego. Chociaż testowanie pod kątem ubytku jest możliwe, wymaga ono znacznie większej głębokości sekwencjonowania, a uzyskane dane mogą być mniej wiarygodne, ponieważ statystycznie trudno jest określić, czy gRNA uległo ubytkowi, czy po prostu nie było obecne na początku screeningu. CRISPR-StAR stanowi w tym względzie cenną alternatywną technologię9,10, ale wymaga optymalizacji pod kątem screeningu in vivo w modelach GEMMs.

Wspólnie te reprezentatywne wyniki stanowią punkty odniesienia dla kontroli jakości każdego głównego etapu procedury pulowanego screeningu CRISPR in vivo, od klonowania biblioteki i produkcji wirusów, po dostarczanie wewnątrzprzewodowe i dekonwolucję opartą na sekwencjonowaniu.

Schemat edycji genów CRISPR; eksperymenty z nokautem i aktywacją; sekwencjonowanie, metoda analizy danych.
Rysunek 1: Schematyczny przebieg procesu przesiewowego in vivo dla gruczołu mlekowego myszy. Protokół ten obejmuje projektowanie chipów oligonukleotydowych biblioteki gRNA, PCR i klonowanie biblioteki, przygotowanie lentiwirusa, wstrzyknięcia wewnątrzprzewodowe do gruczołu mlekowego oraz późniejszą analizę w celu wyłonienia pozytywnych wyników (hits). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki PCR biblioteki z biblioteką 80 bp oraz trawienia restrykcyjne wykazujące fragmenty DNA w elektroforezie żelowej.
Rysunek 2: Amplifikacja i klonowanie biblioteki gRNA. Reprezentatywne obrazy żelu agarozowego dla (A) reakcji PCR biblioteki gRNA, (B) strawionego szkieletu pXPR502 PPH Cre oraz (C) strawionego szkieletu pLKO Cre. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat płytek Petri do testów, transformacja DNA z kontrolą, analiza serii rozcieńczeń.
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy seryjnych rozcieńczeń puli bakterii transdukowanych biblioteką gRNA po elektroporacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykresy analizy transdukcji wirusowej; ekspresja tdTomato, wykresy rozrzutu; przedstawione wartości R-kwadrat.
Rysunek 4: Miareczkowanie lentiwirusowe. (A–D) Reprezentatywne wyniki cytometrii przepływowej służące do obliczenia mian wirusowych dla przykładu (A i B) preparatu wirusowego o niskim mianie oraz (C i D) preparatu wirusowego o wysokim mianie. W obu przypadkach MEF LSL-tdTomato zostały poddane transdukcji wirusami wykazującymi ekspresję Cre, zgodnie z opisem w sekcji 2.5. (E) Reprezentatywne wyniki porównania liczby kopii między plazmidem poddanym głębokiemu sekwencjonowaniu a transfected cells, przedstawiające jedną słabo reprezentowaną bibliotekę (po lewej), z dużą wariancją liczby kopii i wieloma gRNA o niskiej liczbie kopii, w porównaniu do dobrze reprezentowanej biblioteki o węższym rozkładzie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki w miejscu wstrzyknięcia; widoki mikroskopowe wstrzykniętych komórek; wykresy cytometrii przepływowej analizy ekspresji komórkowej.
Rycina 5: Wstrzyknięcie wewnątrzprowadzikowe do gruczołu mlekowego. (A) Widok szklanej igły wprowadzonej do sutka. (B) Prawidłowe wstrzyknięcie wskazane przez barwnik przenikający przez drzewo przewodowe, widziany z zewnątrz myszy (lewo) lub w gruczole mlekowym wypreparowanym bezpośrednio po wstrzyknięciu (prawo). (C) Nieudane wstrzyknięcie do gruczołu mlekowego, objawiające się gromadzeniem barwnika pod sutkiem. (D) Przekroje gruczołu mlekowego barwione przeciwciałem anty-GFP wykazujące zainfekowane komórki. (E) Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej wykazujące zainfekowane komórki luminalne i bazalne GFP+. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki elektroforezy; rozdział DNA, prążki żelowe dla pXPR502/pLKO przy 430bp/300bp; schemat analizy.
Rycina 6: Dekonwolucja próbek oparta na sekwencjonowaniu. Reprezentatywne żele z głębokiego sekwencjonowania dla (A) próbek MEF i plazmidów oraz (B) próbek nowotworowych. Należy zauważyć, że prążek 1 kb w niektórych próbkach CRISPR-A jest prążkiem nieswoistym i należy go zignorować. Konstrukty obecne w próbce są zaznaczone nad dołkami (KO dla pLKO oraz A dla pXPR502). Zmienność intensywności prążków jest zjawiskiem normalnym, jednak całkowity brak prążka wskazuje na nieudaną reakcję. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy i wykresy danych dotyczące mapowania CRISPR guide RNA oraz analizy plazmidu, guza i obszaru gruczołu mlekowego.
Rysunek 7: Reprezentacja biblioteki i reprezentatywne wyniki głębokiego sekwencjonowania guza. (A) Wyniki mapowania dla pomyślnie zsekwencjonowanego guza w porównaniu z zanieczyszczoną reakcją głębokiego sekwencjonowania, w której wiele odczytów nie może zostać zmapowanych do biblioteki. (B) Reprezentatywne wyniki pokazujące sekwencjonowanie plazmidu, guza klonalnego oraz obszaru gruczołu mlekowego. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Projekt biblioteki i primery.Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Tabela 2: Lista starterów do sekwencjonowania głębokiego.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczową kwestią dla zbiorczych badań CRISPR in vivo jest osiągnięcie wystarczającego pokrycia biblioteki, zachowując jednocześnie rozrzedzone, pojedyncze transdukcje komórek w celu zachowania rozdzielczości klonalnej2. W gruczołach sutkowych myszy kompartyment nabłonkowy szacunkowo składa się z około 3,5 × 105 komórek na gruczoł36. Przy średniej skuteczności transdukcji lentiwirusowej na poziomie 15%, która minimalizuje częstotliwość wielokrotnych infekcji w komórce, dostarczenie dokanałowe daje około 5 × 104 transdokowanych komórek nabłonkowych na gruczoł36,55. Wstrzyknięcie dwustronne do trzeciego gruczoła piersiowego i czwartego gruczoła brzusznego daje zatem około 2 × 105 transdokowanych komórek nabłonkowych na mysz36,55. W oparciu o te parametry, biblioteka zawierająca 4000 gRNA (równoważna ~1000 genomów dla CRISPR-KO lub ~500 genomów dla CRISPR-A) wymaga około 4 × 106 transdokowanych komórek, aby osiągnąć solidne przedstawienie 1000-krotnego na gRNA, co odpowiada wielkości kohorty około 20 myszy. Jeśli oczekuje się silny fenotyp zyskujący funkcję, niższe pokrycie (np. 400×, lub 8 myszy) może być wystarczające. Alternatywnie, wyższy wskaźnik infekcji, np. 30-35%, może być również możliwy, szczególnie dla większych bibliotek. Z drugiej strony, eksperymenty skoncentrowane na komórkach nabłonkowych gruczołów piersiowych mogą wymagać wyższych tytrów lentiwirusu lub większej liczby zwierząt, aby zapewnić wystarczające pokrycie, podczas gdy to podejście z użyciem lentiwirusu prawdopodobnie nie nadaje się do zakłóceń stromy ze względu na niezwykle niską zakaźność tych komórek36. To ilościowe ramy dostarczają praktycznej podstawy dla projektowania eksperymentów, równoważąc złożoność biblioteki, użycie zwierząt i rozdzielczość klonalną, i można je dostosować do innych kontekstów przesiewowych poprzez dostosowanie szacowanych liczb komórek docelowych i tkankowej skuteczności transdukcji.

Chociaż ten protokół umożliwia skalowalne zbiorcze przesiewanie CRISPR in vivo, należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń przy projektowaniu eksperymentów. Po pierwsze, skuteczna pokrycie biblioteki jest z natury ograniczona wielkością tkanki i osiągalną skutecznością transdukcji, co wymaga skoncentrowanych bibliotek zamiast genomowych dla większości zastosowań in vivo2. Zmienność skuteczności wstrzyknięcia dokanałowego między gruczołami i/lub zwierzętami może dalsze zmniejszać efektywne pokrycie i powinna być zminimalizowana poprzez staranną technikę wstrzyknięcia, spójne titrowanie wirusa i eksperymenty pilotażowe w celu oszacowania wskaźników infekcji przy różnym zakresie tytrów wirusa. Pomimo tych potencjalnych źródeł zmienności, niedawno pokazaliśmy, że przesiewania CRISPR z biblioteką 4000 gRNA osiągają prawie nasycenie w 20 myszy po dekonwolucji biblioteki55.

Aby zmniejszyć efektywną liczbę myszy potrzebną do utrzymania tak mocnego pokrycia, w praktyce jest możliwe wstrzyknięcie drugiego gruczołu piersiowego piersiowego i piątego gruczołu pachwinowego oprócz trzeciego gruczołu piersiowego piersiowego i czwartego gruczołu brzusznego, jak podkreślono w tym protokole. Podczas gdy sutki tych dodatkowych gruczołów są łatwo obserwowane pod mikroskopem sekcyjnym podczas zabiegu, pierwszy gruczoł piersiowy szyjny jest często przykryty i zasłonięty przez przednie kończyny przymocowywane do nosecone. Ponieważ każdy gruczoł piersiowy różni się od siebie, zarówno wewnątrz, jak i między parami72, liczba komórek nabłonkowych gruczołów piersiowych w tych dodatkowych gruczołach musiałaby zostać określona empirycznie, aby obliczyć efektywne pokrycie. Ważną kwestią jest jednak to, że wywoływanie guzów piersiowych w ośmiu gruczołach piersiowych jednej myszy może prowadzić do całkowitego łącznego wskaźnika obciążenia nowotworowego przed jawnym wzbogaceniem wszystkich klonów zawierających gRNA. Alternatywnie, nowe podejścia do zmniejszenia pokrycia wymaganego do przesiewania CRISPR in vivo, takie jak CRISPR-StAR (Stochastyczna Aktywacja przez Rekombinację)9,10 mogą być połączone z naszą technologią CRISPR-KOALA. CRISPR-StAR wprowadza unikalny ślad linii dla każdego gRNA oraz wewnętrznie kontrolowany ujemny kontrolę, co wykazało zmniejszenie wymagań pokrycia przesiewania w ustawieniach ksenograftu o ponad dwie rzędy wielkości9. Czy te zasady mogą być zastosowane do naszej technologii CRISPR-KOALA, pozostaje do ustalenia, ale oferuje ekscytującą możliwość dalszego zmniejszenia liczby zwierząt wymaganych na każde przesiewanie.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.S. jest konsultantem i założycielem ViVerita Therapeutics, a jego laboratorium sponsorowało umowy badawcze i umowy o świadczenie usług z ViVerita Therapeutics.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim członkom naszych laboratoriów za pomocne uwagi i dyskusje związane z tą pracą. Dziękujemy również i wyrażamy uznanie Centrum Fenogenomiki za całą pomoc i ekspertyzę związaną z pracą z myszami w Instytucie Badań Lunenfeld-Tanenbaum (LTRI) w Toronto, Kanada. To badanie było wspierane przez grant projektowy z Canadian Institutes of Health Research (PJT462506) i grant Terry Fox Research Institute Program Projects na rzecz D.S. (TFRI Project #1107) dla D.S. oraz przez Nicol Family Foundation. E.R.L. był wspierany przez Canadian Cancer Society Research Training Award i Frank Fletcher Memorial Fund. K.N.A. był wspierany przez H.L. Holmes Postdoctoral Award i granty 1318698 i 26089 od Cancer Research Society. J.N. był wspierany przez stypendium Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship – Master’s i Nagrodę Doktorską Canadian Institutes of Health Research (#193389). Y.L był wspierany przez stypendium Canadian Institutes of Health Research Research Excellence, Diversity, and Independence (#ED6-190718).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0.45 micron filterSigmaS2HVU02RE
12k or 92k oligo chipCustomarray Inc. (Genscript)
15 cm cell culture platesCorningCLS353004
293FTInvitrogenR70007
293NTSystems BiosciencesLV900A-1
Alkaline phosphataseNEBM0290L
AmplicillinFisher ScientificBP1760-25
ATPNEB9804S
ATPNEBP0756S
Cutsmart bufferNEBB6004S
Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq)Illumina
DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kitQiagen69506
Dulbecco’s modified Eagle mediumWisent319-015-CL
Endura electrocompetent cellsLucigen60242-1
EpiCult-B Mouse Medium KitStemcell Technologies05610
Esp3INEBR0734L
Fetal Bovine SerumWisent090-150
Gel DNA-cleanup kitZymo ResearchD4008
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation CuvettesBioRad1652089
Gentle Collagenase/HyaluronidaseStemcell Technologies7919
H11-Cas9Jackson LabratoriesJAX#028239
High-Speed CentrifugeBeckman CoulterMLS-50
Kim-wipeKimberly-Clark34155
LB AgarWisent Technologies800-011-LG
Micropipette pullerSutter InstrumentP97
Mini-prep plasmid KitFrogga BioPDH300
NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI)NEBR0580L
Oligo Clean and ConcentratorZymo ResearchD4061
Oligo cleanup kitZymo researchD4060
PAGE purified illumina sequencing primerIDT DNA
PCR MicropipettesDrummond5-000-1001-X10
PEI (polyethyleneimine)Sigma408727-100ML
Penicillin and StreptinomycinWisent450-201-EL
pLKO-CreAddgene158032
pMD2.GAddgene12259
Poly-L-LysineSigmaP2636-100MG
psPAX2Addgene12260
pXPR502-PPH-CreAddgene256776
Q5 Polymerase 2x Master mixNEBM0494L
Qubit Fluorometric QuantificationInvitrogenQ33327
R26-LSL-Cas9-EGFPJackson LabratoriesJAX#024857
R26-LSL-TdTomato miceJackson LabratoriesJAX#007909
SapINEBR0569L
T4 DNA ligaseNEBM0202L
Ultra-centrifuge tubesBeckman Coulter344058
Vacuum Filter UnitsFisher ScientificSCHVU02RE

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moresco, E. M. Y., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics. Am J Pathol. 182 (5), 1462-1473 (2013).
  2. Santinha, A. J., Strano, A., Platt, R. J. Methods and applications of in vivo CRISPR screening. Nat Rev Genet. 26 (10), 702-718 (2025).
  3. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nat Biotechnol. 34 (6), 631-633 (2016).
  4. Michels, B. E., et al. Pooled in vitro and in vivo CRISPR-Cas9 screening identifies tumor suppressors in human colon organoids. Cell Stem Cell. 26 (5), 782-792.e7 (2020).
  5. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  6. Han, K., et al. CRISPR screens in cancer spheroids identify 3D growth-specific vulnerabilities. Nature. 580 (7801), 136-141 (2020).
  7. Lyu, J., et al. DORGE: discovery of oncogenes and tumor suppressor genes using genetic and epigenetic features. Sci Adv. 6 (46), eaba6784(2020).
  8. Martin, T. D., et al. The adaptive immune system is a major driver of selection for tumor suppressor gene inactivation. Science. 373 (6561), 1327-1335 (2021).
  9. Uijttewaal, E. C. H., et al. CRISPR-StAR enables high-resolution genetic screening in complex in vivo models. Nat Biotechnol. 43, 1848-1860 (2024).
  10. Lowden, C. CRISPR-StAR to transform in vivo functional genomic screening. Nat Rev Cancer. 25 (6), 395-395 (2025).
  11. Brisken, C., Duss, S. Stem cells and the stem cell niche in the breast: an integrated hormonal and developmental perspective. Stem Cell Rev. 3 (2), 147-156 (2007).
  12. Fridriksdottir, A. J. R., Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L. Mammary gland stem cells: current status and future challenges. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 719-729 (2011).
  13. Visvader, J. E., Stingl, J. Mammary stem cells and the differentiation hierarchy: current status and perspectives. Genes Dev. 28 (11), 1143-1158 (2014).
  14. Wuidart, A., et al. Quantitative lineage tracing strategies to resolve multipotency in tissue-specific stem cells. Genes Dev. 30 (11), 1261-1277 (2016).
  15. Rios, A. C., Fu, N. Y., Cursons, J., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The complexities and caveats of lineage tracing in the mammary gland. Breast Cancer Res. 18 (1), 116(2016).
  16. Van Keymeulen, A., et al. Lineage-restricted mammary stem cells sustain the development, homeostasis, and regeneration of the estrogen receptor positive lineage. Cell Rep. 20 (7), 1525-1532 (2017).
  17. Mahendralingam, M. J., et al. Mammary epithelial cells have lineage-rooted metabolic identities. Nat Metab. 3 (5), 665-681 (2021).
  18. Casey, A. E., et al. Mammary molecular portraits reveal lineage-specific features and progenitor cell vulnerabilities. J Cell Biol. 217 (8), 2951-2974 (2018).
  19. Kim, H., et al. Differential DNA damage repair and PARP inhibitor vulnerability of the mammary epithelial lineages. Cell Rep. 42 (10), 113256(2023).
  20. Waas, M., et al. Droplet-based proteomics reveals CD36 as a marker for progenitors in mammary basal epithelium. Cell Rep Methods. 4 (4), 100741(2024).
  21. Dravis, C., et al. Epigenetic and transcriptomic profiling of mammary gland development and tumor models disclose regulators of cell state plasticity. Cancer Cell. 34 (3), 466-482.e6 (2018).
  22. Giraddi, R. R., et al. Single-cell transcriptomes distinguish stem cell state changes and lineage specification programs in early mammary gland development. Cell Rep. 24 (6), 1653-1666.e7 (2018).
  23. Trejo, C. L., Luna, G., Dravis, C., Spike, B. T., Wahl, G. M. Lgr5 is a marker for fetal mammary stem cells, but is not essential for stem cell activity or tumorigenesis. npj Breast Cancer. 3 (1), 16(2017).
  24. Dravis, C., et al. Sox10 regulates stem/progenitor and mesenchymal cell states in mammary epithelial cells. Cell Rep. 12 (12), 2035-2048 (2015).
  25. Boulanger, C. A., Wagner, K. U., Smith, G. H. Parity-induced mouse mammary epithelial cells are pluripotent, self-renewing and sensitive to TGF-β1 expression. Oncogene. 24 (4), 552-560 (2005).
  26. Matulka, L. A., Triplett, A. A., Wagner, K. U. Parity-induced mammary epithelial cells are multipotent and express cell surface markers associated with stem cells. Dev Biol. 303 (1), 29-44 (2007).
  27. Feng, Y., Manka, D., Wagner, K. U., Khan, S. A. Estrogen receptor-α expression in the mammary epithelium is required for ductal and alveolar morphogenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (37), 14718-14723 (2007).
  28. Hanasoge Somasundara, A. V., et al. Parity-induced changes to mammary epithelial cells control NKT cell expansion and mammary oncogenesis. Cell Rep. 37 (10), 110099(2021).
  29. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), dev169862(2020).
  30. Twigger, A. J., Khaled, W. T. Mammary gland development from a single cell ‘omics view. Semin Cell Dev Biol. 114, 171-185 (2021).
  31. Bach, K., et al. Time-resolved single-cell analysis of Brca1 associated mammary tumourigenesis reveals aberrant differentiation of luminal progenitors. Nat Commun. 12 (1), 1502(2021).
  32. Twigger, A. J., et al. Transcriptional changes in the mammary gland during lactation revealed by single cell sequencing of cells from human milk. Nat Commun. 13 (1), 562(2022).
  33. Ciwinska, M., et al. Mechanisms that clear mutations drive field cancerization in mammary tissue. Nature. 633 (8028), 198-206 (2024).
  34. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. J Virol. 77 (10), 5801-5809 (2003).
  35. Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage tracing of mammary epithelial cells using cell-type-specific Cre-expressing adenoviruses. Stem Cell Rep. 2 (6), 770-779 (2014).
  36. Langille, E., et al. Loss of epigenetic regulation disrupts lineage integrity, induces aberrant alveogenesis, and promotes breast cancer. Cancer Discov. 12 (12), 2930-2953 (2022).
  37. Bu, W., et al. Efficient cancer modeling through CRISPR-Cas9/HDR-based somatic precision gene editing in mice. Sci Adv. 9 (19), eade0059(2023).
  38. Li, C., et al. Quantitative in vivo analyses reveal a complex pharmacogenomic landscape in lung adenocarcinoma. Cancer Res. 81 (17), 4570-4580 (2021).
  39. Foggetti, G., et al. Genetic determinants of EGFR-driven lung cancer growth and therapeutic response in vivo. Cancer Discov. 11 (7), 1736-1753 (2021).
  40. Cai, H., et al. A functional taxonomy of tumor suppression in oncogenic KRAS–driven lung cancer. Cancer Discov. 11 (7), 1754-1773 (2021).
  41. Wang, G., et al. CRISPR-GEMM pooled mutagenic screening identifies KMT2D as a major modulator of immune checkpoint blockade. Cancer Discov. 10 (12), 1912-1933 (2020).
  42. Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nat Genet. 50 (4), 483-486 (2018).
  43. Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Sci Adv. 4 (2), eaao5508(2018).
  44. Rogers, Z. N., et al. A quantitative and multiplexed approach to uncover the fitness landscape of tumor suppression in vivo. Nat Methods. 14 (7), 737-742 (2017).
  45. Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nat Neurosci. 20 (10), 1329-1341 (2017).
  46. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  47. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  48. Wertz, M. H., et al. Genome-wide in vivo CNS screening identifies genes that modify CNS neuronal survival and mHTT toxicity. Neuron. 106 (1), 76-89.e8 (2020).
  49. Xu, C., et al. piggyBac mediates efficient in vivo CRISPR library screening for tumorigenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (4), 722-727 (2017).
  50. Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of Cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. J Vis Exp. (148), e59502(2019).
  51. Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), e50692(2013).
  52. Wangensteen, K. J., et al. Combinatorial genetics in liver repopulation and carcinogenesis with a in vivo CRISPR activation platform. Hepatology. 68 (2), 663-676 (2018).
  53. Jia, Y., et al. In vivo CRISPR screening identifies BAZ2 chromatin remodelers as druggable regulators of mammalian liver regeneration. Cell Stem Cell. 29 (3), 372-385.e8 (2022).
  54. Borrelli, C., et al. In vivo interaction screening reveals liver-derived constraints to metastasis. Nature. 632 (8024), 411-418 (2024).
  55. Al-Zahrani, K. N., Langille, E. R., Nurtanto, J., et al. Aneuploidy selects for the acquisition of driver genes in breast cancer. Nature. , Available from: https://doi.org/10.1038/s41586-026-10752-9 (2026).
  56. Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes Dev. 30 (12), 1470-1480 (2016).
  57. Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nat Commun. 10 (1), 397(2019).
  58. Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO J. 39 (5), embj.2019102169(2020).
  59. Dahlman, J. E., et al. Orthogonal gene knockout and activation with a catalytically active Cas9 nuclease. Nat Biotechnol. 33 (11), 1159-1161 (2015).
  60. Kiani, S., et al. Cas9 gRNA engineering for genome editing, activation and repression. Nat Methods. 12 (11), 1051-1054 (2015).
  61. Liao, H. K., et al. In vivo target gene activation via CRISPR/Cas9-mediated trans-epigenetic modulation. Cell. 171 (7), 1495-1507.e15 (2017).
  62. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nat Commun. 9 (1), 5416(2018).
  63. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  64. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  65. Michlits, G., et al. Multilayered VBC score predicts sgRNAs that efficiently generate loss-of-function alleles. Nat Methods. 17 (7), 708-716 (2020).
  66. Lukasiak, S., et al. A benchmark comparison of CRISPRn guide-RNA design algorithms and generation of small single and dual-targeting libraries to boost screening efficiency. BMC Genomics. 26 (1), 198(2025).
  67. Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).
  68. Morgens, D. W., et al. Genome-scale measurement of off-target activity using Cas9 toxicity in high-throughput screens. Nat Commun. 8 (1), 15178(2017).
  69. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  70. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
  71. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biol. 15 (12), 554(2014).
  72. Veltmaat, J. M., Ramsdell, A. F., Sterneck, E. Positional variations in mammary gland development and cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 18 (2), 179-188 (2013).
  73. Esmaeili Anvar, N., et al. Efficient gene knockout and genetic interaction screening using the in4mer CRISPR/Cas12a multiplex knockout platform. Nat Commun. 15 (1), 3577(2024).
  74. Griffith, A. L., et al. Optimization of Cas12a for multiplexed genome-scale transcriptional activation. Cell Genomics. 3 (9), 100387(2023).
  75. Sack, L. M., et al. Profound tissue specificity in proliferation control underlies cancer drivers and aneuploidy patterns. Cell. 173 (2), 499-514.e23 (2018).
  76. Yanchus, C., et al. A noncoding single-nucleotide polymorphism at 8q24 drives IDH1-mutant glioma formation. Science. 378 (6615), 68-78 (2022).
  77. Martinez, S., et al. In vivo CRISPR screens reveal SCAF1 and USP15 as drivers of pancreatic cancer. Nat Commun. 15 (1), 5266(2024).
  78. Lü, Y., et al. Genome-wide CRISPR screens identify novel regulators of wildtype and mutant p53 stability. Mol Syst Biol. 20 (6), 719-740 (2024).
  79. Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils Myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343 (6168), 309-313 (2014).
  80. Bu, W., Li, Y. Advances in immunocompetent mouse and rat models. Cold Spring Harb Perspect Med. 14 (3), a041328(2024).
  81. Ben-Jonathan, N., LaPensee, C. R., LaPensee, E. W. What can we learn from rodents about prolactin in humans? Endocr Rev. 29 (1), 1-41 (2008).
  82. Sánchez-Criado, J. E., et al. Biological role of pituitary estrogen receptors ERα and ERβ on progesterone receptor expression and action and on gonadotropin and prolactin secretion in the rat. Neuroendocrinology. 79 (5), 247-258 (2004).
  83. LaPensee, C. R., et al. The prolactin-deficient mouse has an unaltered metabolic phenotype. Endocrinology. 147 (10), 4638-4645 (2006).
  84. Kinoshita, Y., et al. Similarity of GATA-3 expression between rat and human mammary glands. J Toxicol Pathol. 27 (2), 159-162 (2014).
  85. Nicotra, R., Lutz, C., Messal, H. A., Jonkers, J. Rat models of hormone receptor-positive breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 12(2024).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

GenetykaNumer 233Numer 233WszystkieNumerWszystkieNumerWarto pustaNumer
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły