Artykuł metodologiczny

Wykrywanie i przypisywanie ultradźwiękowych wokalizacji do pojedynczych myszy podczas interakcji społecznych

196 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71121

⸱

7 lipca 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychological and Brain Sciences, University of Delaware, 2Interdisciplinary Neuroscience Graduate Program, University of Delaware, 3Center for Bioinformatics and Computational Biology, Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę rejestracji zsynchronizowanych danych wideo i audio podczas interakcji społecznych wielu myszy. Metoda wykorzystuje tablicę mikrofonów i lokalizacje źródła dźwięku, aby przypisać ultradźwiękowe wokalizacje (USV) do poszczególnych myszy, umożliwiając ilościową analizę zachowania wokalnego wśród zwierząt i kontekstów społecznych.

Streszczenie

Myszy (Mus musculus) komunikują się za pomocą ultradźwiękowych wokalizacji (USV) podczas interakcji społecznych. Jednak ponieważ mysie USV nie są związane z wyraźnymi wskaźnikami wizualnymi i występują na częstotliwościach poza ludzkim zakresem słuchu, nadal wymaga to wysiłku, aby zidentyfikować pojedyncze wokalizujące myszy w grupie. W tym protokole opisano metodę rejestracji zsynchronizowanych danych wideo i ultradźwiękowych danych audio podczas interakcji społecznych wielu zwierząt, umożliwiającą jednoczesne rejestrowanie zachowania i aktywności wokalnej. Przedstawiono opis komputerowego potoku, który integruje wielozwierzęce śledzenie, wykrywanie wokalizacji, lokalizację źródła dźwięku i przypisywanie wokalizacji do poszczególnych zwierząt. Przedstawiono również procedury walidacji użyte do oceny dokładności śledzenia, ekstrakcji wokalizacji, precyzji lokalizacji i pewności przypisania na każdym etapie potoku. Zastosowanie tego protokołu do czterozwierzęcowego zestawu demonstracyjnego danych wyników wokalizujących poszczególnych osobników, przestrzennie precyzyjne oszacowania źródła dźwięku oraz ilościowe miary wyjścia głosowego i cech akustycznych. Razem, te podejścia zapewniają solidny rama dla łączenia komunikacji wokalnej z indywidualnym zachowaniem i umożliwiają dalszą analizę różnic płciowych, zmienności indywidualnej i komunikacji społecznej u swobodnie współdziałających myszy.

Wprowadzenie

Komunikacja społeczna w królestwie zwierząt jest istotnym elementem dynamiki zachowań, wspierającą procesy takie jak przetrwanie i rozmnażanie1,2. Wśród ssaków myszy komunikują się akustycznie za pomocą USV, które obejmują częstotliwości od 35 do 110 kHz3. USV wykazują złożone cechy, przekazując informacje w zależności od kontekstu behawioralnego4. Samice myszy wykazują preferencję dla USV samców5,6, a samce i samice myszy komunikują się wokalnie podczas zachowań godowych7, co wskazuje, że USV pełnią funkcję kluczowych sygnałów społecznych. Ponieważ określone cechy USV są związane z różnymi stanami behawioralnymi myszy8, dokładne przypisywanie wokalizacji do poszczególnych osobników jest niezbędne do zrozumienia interakcji społecznych.

Mimo ogromnych wysiłków w celu wyjaśnienia funkcji USV i ich związku z zachowaniami społecznymi8, ciągłym wyzwaniem w tej dziedzinie było przypisywanie USV do poszczególnych myszy podczas interakcji grupowych. Trudności wynikają zarówno z braku widocznych ruchów ust podczas produkcji USV4, jak i z faktu, że zakres częstotliwości USV jest niedosłyszalny dla ludzkiego ucha3. W rezultacie, poprzednie badania nad związkiem między USV a zachowaniami społecznymi były ograniczone do uproszczonych testów lub ograniczonych środowisk, które ograniczają zakres obserwowalnych zachowań grupowych9, zapewniając jedynie częściową wiedzę na temat tego, jak zachowania wokalne rozwijają się u swobodnie działających zwierząt.

Aby doprecyzować zrozumienie związku między komunikacją słuchową a zachowaniami społecznymi, konieczne jest uchwycenie pełnego zakresu zachowań myszy i przypisanie wokalizacji do poszczególnych osobników w grupie. Rozpoznanie tożsamości wokalizujących jest niezbędne do określenia zakresów wokalnych zależnych od płci i kontekstu u poszczególnych osobników8, testowania hipotez przyczynowych dotyczących tego, jak określone cechy wokalne wpływają na zachowania innych osobników tego samego gatunku10,11,12, oraz, tam gdzie to ma zastosowanie, korelacji emisji wokalnej z jednocześnie mierzonymi sygnałami mózgowymi (np. elektrofizjologia)13. Historycznie uważano, że samce myszy są jedynymi wokalizującymi; jednak lokalizacja źródła dźwięku wykazała, że samice myszy również produkują USV w ustawieniach grupowych7 lub w parach z samcami14. Bez określenia, który zwierzę emituje USV, łączenie cech wokalnych z indywidualnymi zachowaniami i wynikami społecznymi w swobodnie działających grupach pozostaje ograniczone. Dlatego konieczne jest wykorzystanie systemu lokalizacji źródła dźwięku, który umożliwia przypisanie wokalizacji do poszczególnych zwierząt przy zachowaniu naturalnej dynamiki interakcji.

Opisany tu system lokalizacji źródła dźwięku z mikrofonowym zespołem antenowym, który został wcześniej opublikowany7,15, szacuje przestrzenny początek USV w obrębie aren i śledzi pozycje wszystkich zwierząt obecnych w momencie wydawania dźwięku, umożliwiając przypisanie wokalizacji do emitenta. Estymacje źródła dźwięku i śledzone pozycje zwierząt są następnie integrowane za pomocą metryki opartej na prawdopodobieństwie, aby wspomóc przypisanie USV do poszczególnych zwierząt. Przypisywanie wokalizacji zamienia wcześniej niejednoznaczne nagraniowe zapisy grupowe na oznakowane dane wokalne zwierząt7,15, umożliwiając ilościowe analizy łączące typ wokalizacji i jej czas z zachowaniem i następczymi działaniami innych osobników tego samego gatunku. Celem obecnej pracy jest dostarczenie szczegółowego protokołu implementacji tej metody, która została wcześniej zmierzona i zweryfikowana15. Poniższy protokół opisuje konfigurację, kalibrację i wdrożenie tego systemu, w tym geometrię mikrofonowego zespołu antenowego, synchronizację audio-wideo, zautomatyzowane wykrywanie dźwięku i prawdopodobieństwową estymację źródła, śledzenie pozycji wielu zwierząt oraz procedurę przypisywania stosowaną do przypisywania USV do zwierzęcia emitującego7,15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Delaware (numer protokołu: 1275) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health. Reagenty i użyte sprzęty są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Budowanie zestawu do lokalizowania źródeł dźwięku

  1. Przygotuj komorę rejestrującą.
    1. Zmontuj ramową bryłę sześcienną (76,2 cm × 76,2 cm × 61 cm; szerokość × długość × wysokość), która służy jako arena rejestracji, i umieść ją w dźwiękoszczelnej obudowie.
    2. Użyj siatki nylonowej do stworzenia ścian i wyłóż zewnętrzną stronę obudowy pianką akustyczną, aby zmniejszyć odbicia dźwięku.
    3. Umieść termometr na zewnątrz, ale blisko komory rejestrującej, aby monitorować temperaturę otoczenia podczas nagrań.
    4. Przeprowadzaj wszystkie nagrania w warunkach ciemności.
      UWAGA: Utrzymuj stabilne warunki środowiskowe w trakcie sesji rejestracji i rejestruj parametry środowiskowe.
  2. Skonfiguruj systemy nagrywania wideo i audio.
    1. Zainstaluj podczerwone oświetlenie nad arenę, aby umożliwić nagrywanie wideo w ciemności.
    2. Umieść kamerę wideo nad arenę i skonfiguruj ją do ciągłego nagrywania z częstotliwością 30 Hz.
    3. Skonfiguruj system akwizycji audio do nagrywania sygnałów ultradźwiękowych z osiem-kanałowego zestawu mikrofonów z częstotliwością próbkowania 250 kHz.
      UWAGA: W tym systemie użyto ośmiu mikrofonów, ale liczbę mikrofonów można dostosować w zależności od potrzeb eksperymentalnych.
    4. Synchronizuj nagrania wideo i audio za pomocą wspólnego zewnętrznego wyzwalacza, aby zapewnić czasową korespondencję.
    5. Upewnij się, że dane wideo i audio są rejestrowane jednocześnie i przechowywane dla każdej sesji.
      ​UWAGA: Sprzęt i oprogramowanie do akwizycji są wymienione w Tabeli Materiałów i Tabeli 1, odpowiednio.
  3. Ułóż mikrofony i arenę.
    1. Równomiernie rozmieść mikrofony wzdłuż ścian areny (dwa na ścianach).
    2. Umieść centra mikrofonów w odległości 38,1 cm od siebie, 19,05 cm od każdego rogu i 10,8 cm nad podłogą areny.
    3. Zaznacz wizualnie położenia mikrofonów, aby ułatwić późniejszą kalibrację i walidację.
      UWAGA: Do zaznaczenia pozycji mikrofonów można użyć diod LED.

2. Przygotowania do rejestracji zachowania społecznego

  1. Ustaw eksperymentalne zwierzęta.
    1. Wybierz myszy do rejestracji. Tutaj użyto grup po 2 samce i 2 samice myszy C57BL/6J w wieku 8 do 12 tygodni w momencie rejestracji.
      UWAGA: Szczod, stosunek płci, zakres wiekowy myszy i liczba dni rejestracji w obecnym paradygmacie eksperymentalnym są dostosowywane do różnych celów eksperymentalnych. W celu demonstracji tej metody podzbiór myszy eksperymentalnych został ponownie użyty przez dwa dni rejestracji. Myszy C57BL/6J starsze niż 12 tygodni mogą wykazywać zmniejszoną wrażliwość na dźwięki wysokotonowe16.
  2. Umieść zwierzęta.
    1. Umieść każdego szczura indywidualnie na 14 dni przed rejestracją.
      UWAGA: Indywidualne hodowlę minimalizuje wpływ wcześniejszego doświadczenia społecznego na interakcje grupowe.
    2. Dostarcz każdej klatce ściółki, wzbogacenia i ad libitum dostęp do jedzenia i wody.
  3. Zaznacz zwierzęta w celu wizualnej identyfikacji.
    1. Dwa dni przed rejestracją, znieczulić każdą mysz za pomocą 2,5% izofluranu w tlenie o szybkości przepływu 1 L/min za pomocą precyzyjnego parownika w zamkniętej komorze. Gdy każda mysz zostanie znieczuliona, przenieś ją z komory, ułożoną płasko plecami w dół, z dostępem do znieczulenia z rurką nosową przez czas trwania procedury zaznaczania.
      UWAGA: Opisany w obecnym paradygmacie eksperymentalnym protokół znieczulenia jest zatwierdzony w naszym protokole dotyczącym zwierząt i został zastosowany do każdej myszy w sposób ciągły, ale można go dostosować dla różnych zwierząt lub celów eksperymentalnych.
    2. Podczas znieczulenia każdej myszy, zastosuj unikalny wzór na jej grzbiecie za pomocą nietoksycznej farby do włosów, aby umożliwić wizualną identyfikację podczas śledzenia.
    3. Ciągle monitoruj każde zwierzę podczas wysychania farby, utrzymując znieczulenie przez około 15 min i rejestruj czas trwania znieczulenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki przedstawione w niniejszym artykule pochodzą z pomiarów przeprowadzonych w ciągu 2 dni i mają na celu zilustrowanie efektów protokołu, pierwotnie opublikowanego w pracy Warren et al.15. Dane te nie służą do wyciągania wniosków statystycznych ani sformułowania uogólnionych konkluzji.

Ekstrakcja i przypisanie USV
USV były rejestrowane podczas sesji interakcji społecznych, zarówno indywidualnych, jak i grupowych, przy użyciu systemu lokalizacji ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wiarygodne przypisywanie dźwięków USV poszczególnym zwierzętom podczas interakcji grupowych było główną trudnością techniczną w badaniach nad komunikacją głosową myszy. Chociaż myszy są szeroko stosowane do badania komunikacji społecznej, brak możliwości przypisania dźwięków do konkretnych osobników ograniczył ilościową analizę zachowań głosowych w naturalnych warunkach społecznych. Metoda umożliwiająca śledzenie dźwięków specyficznych dla poszczególnych zwierząt podczas interakcji społecznych jest zatem niezbędna do bad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy personelowi University of Delaware Life and Science Research Facility za opiekę nad zwierzętami, Jimowi Farmerowi i Jamie Quesenberry za pomoc w budowie sprzętu laboratoryjnego oraz Grupie Obliczeniowej Wysokiej Klasy Uniwersytetu Delaware za wsparcie w utrzymaniu klastra komputerowego. Dziękujemy Andre Yichong Ma za pomoc w zbieraniu danych. Praca została sfinansowana przez NIH, numery grantów R01MH122752 i T32GM142603.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alpha-Dri BeddingShepherd Specialty PapersALPHA-driPotrzebne do systemu lokalizacji źródeł dźwięku
Aluminum Extrusion8020Custom built to match recording arenaPotrzebne do systemu lokalizacji źródeł dźwięku
BNC-2110National Instruments777643-01Potrzebne do systemu lokalizacji źródeł dźwięku
Clear Acrylic PanelHome DepotMC-24Potrzebne do systemu lokalizacji źródeł dźwięku
CM16/CMPA40-5VAvisoft40014Potrzebne do systemu lokalizacji źródeł dźwięku
ComputerHewlett–PackardZ620Potrzebne do systemu lokalizacji źródeł dźwięku
Grasshopper 3FLIRGS3-U3-41C6M-CPotrzebne do systemu lokalizacji źródeł dźwięku
IR lightsGANZIR-LT30Potrzebne do systemu lokalizacji źródeł dźwięku
NI PXIe-1073National Instruments781161-01Potrzebne do systemu lokalizacji źródeł dźwięku
NI PXIe-6356National Instruments781053-01Potrzebne do systemu lokalizacji źródeł dźwięku
Nice ‘N Easy, Born Blonde MaxiClairol 2523721Potrzebne do systemu lokalizacji źródeł dźwięku
Nylon mesh for cage wallsMcMaster-Carr9318T25Potrzebne do systemu lokalizacji źródeł dźwięku
Power CordNational Instruments763000-01Potrzebne do systemu lokalizacji źródeł dźwięku
SCHC68-68-EPMNational Instruments192061-02Potrzebne do systemu lokalizacji źródeł dźwięku
Sonex foamPinta AcousticVLW-35Potrzebne do systemu lokalizacji źródeł dźwięku

Bibliografia

  1. Barfield, R. J., Thomas, D. A. The role of ultrasonic vocalizations in the regulation of reproduction in rats. Ann N Y Acad Sci. 474 (1), 33-43 (1986).
  2. Placer, J., Slobodchikoff, C. N. A fuzzy-neural system for identification of species-specific alarm calls of Gunnison's prairie dogs. Behav Processes. 52 (1), 1-9 (2000).
  3. Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3 (12), e386 (2005).
  4. Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PLoS One. 7 (1), e29401 (2012).
  5. Shepard, K. N., Liu, R. C. Experience restores innate female preference for male ultrasonic vocalizations. Genes Brain Behav. 10 (1), 28-34 (2011).
  6. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic songs with approach behaviour. Biol Lett. 5 (5), 589-592 (2009).
  7. Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. E. R. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. Elife. 4, e06203 (2015).
  8. Sangiamo, D. T., Warren, M. R., Neunuebel, J. P. Ultrasonic signals associated with different types of social behavior of mice. Nat Neurosci. 23 (3), 411-422 (2020).
  9. Zala, S. M., Reitschmidt, D., Noll, A., Balazs, P., Penn, D. J. Sex-dependent modulation of ultrasonic vocalizations in house mice (Mus musculus musculus). PLoS One. 12 (12), e0188647 (2017).
  10. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. The structure and usage of female and male mouse ultrasonic vocalizations reveal only minor differences. PLoS One. 7 (7), e41133 (2012).
  11. Musolf, K., Hoffmann, F., Penn, D. J. Ultrasonic courtship vocalizations in wild house mice Mus musculus musculus. Anim Behav. 79 (3), 757-764 (2010).
  12. Warburton, V. L., Sales, G. D., Milligan, S. R. The emission and elicitation of mouse ultrasonic vocalizations the effects of age sex and gonadal status. Physiol Behav. 45 (1), 41-47 (1989).
  13. Chen, P., Hong, W. Neural circuit mechanisms of social behavior. Neuron. 98 (1), 16-30 (2018).
  14. Heckman, J. J., et al. High-precision spatial localization of mouse vocalizations during social interaction. Sci Rep. 7 (1), 3017 (2017).
  15. Warren, M. R., Sangiamo, D. T., Neunuebel, J. P. High channel count microphone array accurately and precisely localizes ultrasonic signals from freely moving mice. J Neurosci Methods. 297, 44-60 (2018).
  16. Johnson, K. R., Erway, L. C., Cook, S. A., Willott, J. F., Zheng, Q. Y. A major gene affecting age-related hearing loss in C57BL/6J mice. Hear Res. 114 (1), 83-92 (1997).
  17. Zala, S. M., et al. Primed to vocalize wild-derived male house mice increase vocalization rate and diversity after a previous encounter with a female. PLoS One. 15 (12), e0242959 (2020).
  18. Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
  19. Floody, O. R., Pfaff, D. W., Lewis, C. D. Communication among hamsters by high-frequency acoustic signals II determinants of calling by females and males. J Comp Physiol Psychol. 91 (4), 807-819 (1977).
  20. McIntosh, T. K., Barfield, R. J., Geyer, L. A. Ultrasonic vocalisations facilitate sexual behaviour of female rats. Nature. 272 (5649), 163-164 (1978).
  21. Ohayon, S., Avni, O., Taylor, A. L., Perona, P., Egnor, S. E. R. Automated multi-day tracking of marked mice for the analysis of social behaviour. J Neurosci Methods. 219 (1), 10-19 (2013).
  22. Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nat Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
  23. Mathis, A., et al. DeepLabCut markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 21 (9), 1281-1289 (2018).
  24. Peña, D., Prieto, F. J. Multivariate outlier detection and robust covariance matrix estimation. Technometrics. 43 (3), 286-310 (2001).
  25. Matsumoto, J., et al. Acoustic camera system for measuring ultrasound communication in mice. iScience. 25 (8), 104812 (2022).
  26. Waidmann, E. N., Yang, V. H. Y., Luo, E., Doyle, W. C., Jarvis, E. D. Mountable miniature microphones to identify and assign mouse ultrasonic vocalizations. Cell Rep Methods. 5 (6), 101081 (2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

BehaviorNumer 233Numer 233Ten miesi c w JoVENumerzachowania spo ecznelokalizacja r d a d wi kumacierz mikrofonowaprzypisywanie wokalizacjir nice mi dzy p ciamiparametry akustyczneledzenie wielu zwierz t
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły