Znormalizowana augmentacja pęcherza za pomocą jelita krętego dla enterocystoplastyki u szczurów poprzez laparotomię w linii środkowej ciała

Podsumowanie

Ten protokół opisuje standaryzowany model enterocystoplastyki u szczurów z użyciem przeszczepu jelita krętego, przesiewanego i zdetubularyzowanego z trzonkiem unaczynnionem, z tymczasowym zewnętrznym odbiórem moczu przez kaniulę w celu uzyskania powtarzalnej ekspansji pęcherza.

Streszczenie

Aumentacja pęcherza za pomocą segmentów jelita pozostaje podstawową procedurą rekonstrukcyjną dla pacjentów z pęcherzami o małej pojemności lub słabo elastycznymi, gdy terapie zachowawcze nie przynoszą efektu. Pomimo jego klinicznego znaczenia, postęp eksperymentalny i dogłębne badania są ograniczone przez brak znormalizowanych, powtarzalnych protokołów, które w sposób niezawodny modelowałyby zasady chirurgiczne w kontrolowanym środowisku przedklinicznym. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół enterocystoplastyki u szczurów, który wykorzystuje naczyniowiejący, rozdęty fragment jelita krętego jako brodawkę z trzonkiem do powiększenia rodzimego pęcherza. Procedura obejmuje środkową laparotomię, kontrolowane narażenie i stabilizację pęcherza za pomocą szwów podtrzymujących, przekierowanie moczu przez zezwodzicioną zewnętrzną kaniulę Foley, izolację krótkiego odcinka jelita krętego z zachowanym trzonkiem naczyniowym, rozdęcie i bez napięcia połączenie ze ścianą pęcherza. Nacisk kładziony jest na utrzymanie perfuzji trzonka naczyniowego, zapobieganie jego skręceniu, zapewnienie szczelności szwów i zabezpieczenie drożności cewnika, co jest kluczowe dla sukcesu procedury i jej powtarzalności. Reprezentatywna walidacja intraoperacyjna za pomocą hiperspektralnego obrazowania (HSI) u ośmiu szczurów, które nie przeżyły pokazuje zachowanie tkankowego natlenienia i perfuzji odcinka jelita po kluczowych krokach operacyjnych, co potwierdza żywotność tkanek pod koniec tej procedury. Dlatego ten protokół zapewnia standaryzowany eksperymentalny podejście do powtarzalnej chirurgicznej implementacji enterocystoplastyki u szczurów. Potencjalne zastosowania modelu w dalszej perspektywie obejmują badania nad zmianami metabolicznymi i elektrolitowymi, podatnością na infekcje, produkcją śluzu oraz indukowanie dysplazji lub nowotworów, które należy zbadać w przyszłych badaniach na przeżywalności.

Wprowadzenie

Fizjologiczne funkcjonowanie pęcherza moczowego jest zasadnicze dla utrzymania wysokiej jakości życia, ponieważ efektywne przechowywanie i opróżnianie moczu są kluczowe dla czynności służących kontroli oddawania moczu, samopoczucia społecznego i ogólnego zdrowia. Zaburzenia wpływające na funkcję pęcherza mogą prowadzić do znacznej morbidytetu, w tym do nietrzymania moczu, nawracających infekcji, upośledzenia czynności nerek i głębokiego negatywnego wpływu na codzienne życie.

Zatoki wrodzone i nabyte mogą powodować znaczne upośledzenie funkcji, często wymagając zabiegów chirurgicznych, gdy leczenie konserwatywne i farmakologiczne okażą się niewystarczające. Wrodzone anomalie, takie jak tylne zawory cewki moczowej¹, ekstrofia pęcherza i kloaki oraz epispacja^2,3, są często związane z pęcherzami o małej pojemności, słabo sprężystymi, co zwiększa ryzyko pogorszenia się funkcji górnych dróg moczowych. Podobnie, stany neurologiczne, w tym mielodysplazja⁴, stwardnienie rozsiane⁵ i urazy rdzenia kręgowego⁶, często prowadzą do neurogennego dysfunkcjonowania pęcherza, upośledzającego zarówno mechanizmy przechowywania, jak i opróżniania. Ponadto, etiologia zakaźna, taka jak gruźlica⁷ i przewlekła choroba wywołana przez przywrę⁸, może wywoływać zwłóknienie ściany pęcherza, zmniejszając sprężystość i predysponując do powikłań wtórnych. W przypadkach refraktarnych plastyka pęcherza służy jako skuteczna strategia poprawiająca pojemność przechowującą, zmniejszająca ciśnienie wewnątrzmięśniowe i zachowująca czynność nerek, ostatecznie poprawiając jakość życia i łagodząc powikłania długoterminowe.

Zgodnie z wytycznymi Amerykańskiego Towarzystwa Urologicznego (AUA) dotyczącymi nadczynności pęcherza, plastyka pęcherza (enterocystoplastyka) jest wskazana u pacjentów z wyczerpaną pojemnością pęcherza, złą sprężystością lub nadczynnością detruzora odpornym na leczenie konserwatywne⁹. Po raz pierwszy opisana przez Tizzoniego i Foggiego w 1888 roku przy użyciu modelu psa¹⁰, a później zaadaptowana do zastosowania u ludzi przez von Mikulicza w 1899 roku¹¹, enterocystoplastyka pozostaje standardowym podejściem chirurgicznym do zmniejszania ciśnienia magazynowania moczu i zmniejszania ryzyka uszkodzenia nerek i nietrzymania związanego z różnymi dysfunkcjami pęcherza, w tym z neurogennym nadczynnością pęcherza, ekstropią pęcherza i tylnymi zaworami cewki moczowej^12,13.

Konwencjonalna technika enterocystoplastyki polega na rozszczepieniu pęcherza w płaszczyźnie koronnej lub strzałkowej aż do trójkąta, a następnie włączeniu odtrzewnowionego odcinka jelita¹². Najczęściej stosowanym odcinkiem jelita jest jelito kręte, zazwyczaj pobrane 25-40 cm powyżej zastawki krętniczo-kątniczej¹². Gdy jelito kręte nie nadaje się do zastosowania, preferowanym alternatywnym rozwiązaniem jest okrężnica¹².

Chociaż ta procedura oferuje długotrwałą trwałość i wysokie wskaźniki zadowolenia pacjentów¹⁴, wprowadzanie tkanki przewodu pokarmowego do dróg moczowych ma znaczne wady, w tym zaburzenia metaboliczne, tworzenie kamieni pęcherzowych i podwyższone ryzyko złośliwości^15,16,17.

Mając na uwadze te potencjalne komplikacje, istnieje pilna potrzeba przeprowadzenia kontrolowanych badań, aby zbadać podstawowe mechanizmy, udoskonalić techniki chirurgiczne i ocenić alternatywne materiały do plastyki. Model gryzoni zapewnia strukturalne i powtarzalne środowisko do zbadania tych aspektów, umożliwiając badaczom analizę adaptacji metabolicznych po plastyce, w tym równowagi kwasowo-zasadowej i zaburzeń elektrolitowych. Ponadto, umożliwia badanie przemian tkanki pęcherza w czasie, dając wgląd w zwłóknienie, regenerację nabłonka pęcherza i integrację uzupełnionych segmentów. Dodatkowo, biorąc pod uwagę zwiększone ryzyko złośliwości związane z enterocystoplastyką, model gryzoni umożliwia badanie zmian histopatologicznych w czasie i identyfikację wczesnych markerów rakotwórczości. Co ważne, taki model ułatwia również badania nad zastosowaniami materiałów biokompatybilnych i inżynierii tkankowej, potencjalnie otworzywszy drogę dla alternatywnych materiałów do plastyki o niższym ryzyku rakotwórczym i immunogennym¹².

Chociaż eksperymentalne modele plastyki pęcherza u gryzoni i innych gatunków zostały opisane, brakuje bezpośrednio porównywalnego, zstandardyzowanego protokołu krok po kroku dla enterocystoplastyki jelitowej u szczurów przez laparotomię środkową. Wcześniejsze badania na szczurach ustanowiły klasyczną enterocystoplastykę jako model eksperymentalny

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt opisane w tym dokumencie zostały przeprowadzone w akredytowanych obiektach i otrzymały aprobatę komitetu opieki nad zwierzętami i ich użytkowania (IACUC) Baden-Württemberg Regional Council w Karlsruhe, Niemcy (35-9185.81/G-62/23). Zwierzęta eksperymentalne były obsługiwane zgodnie z protokołami instytucjonalnymi i zgodnie z niemieckim prawodawstwem dotyczącym opieki nad zwierzętami, a także zgodnie z wytycznymi Europejskiej Rady Wspólnotowej (2010/63/UE) oraz wytycznymi ARRIVE. Użyto samców szczurów Sprague-Dawley (n = 8), w wieku 8–12 tygodni i ważących 400 g, uzyskanych od Janvier Labs po okresie aklimatyzacji jednego tygodnia.

1. Znieczulenie i przeciwból

1. Wprowadzić znieczulenie poprzez umieszczenie zwierzęcia w komorze indukcyjnej i stosowanie 4 vol% izofluranu rozcieńczonego w 100% tlenie z szybkością przepływu 5 L/min.
2. Do znieczulenia dysocjacyjnego, przeciwbolu i sedacji podać podskórnie wstrzyknięcie 100 mg/kg ketaminy (10% roztwór; równy 0,35 mL na 400 g masy ciała) i 4 mg/kg ksylazyny (1:10 roztwór 2% roztworu; równy 0,75 mL na 400 g)^28,29,30,31 przy utracie odruchu prawienia. Podawać wszystkie środki znieczulające i przeciwbólowe na podstawie mg/kg masy ciała.
   UWAGA: Wszystkie podawane objętości wstrzyknięć są przybliżonymi przykładami dla szczurów o masie ciała 400 g i muszą być obliczone indywidualnie dla każdego zwierzęcia.
3. Potwierdzić głębokość przeciwbólu poprzez brak twardej reakcji na ściśnięcie palców za pomocą kleszczy i nałożyć maść rogówkową, aby zapobiec wysychaniu rogówki.
4. Osiągnąć dodatkowe przeciwbólowe działanie poprzez podskórne wstrzyknięcie 5 mg/kg karprofenu (1:10 roztwór 5% roztworu; równy 0,35 mL na 400 g).
5. Utrzymywać narkę za pomocą uzupełniającego izofluranu przez maskę dziecięcą, jak to wymagane w trakcie operacji.
6. Wykonywać zarządzanie temperaturą w czasie operacji, umieszczając zwierzę na podgrzewanej poduszce ustawionej na 40°C. Dodatkowo umieść sondę temperatury prostokątnej, ale nie jest to obowiązkowe.
7. Zapewnić wsparcie płynowe w okresie pooperacyjnym i pooperacyjnym poprzez podskórne wstrzyknięcie izotonicznego roztworu chlorku sodu o temperaturze 37°C o sile 25 mL/kg na godzinę (równy 10 mL na 400 g) podzielone na wstrzyknięcia co 20 min. Powinno to obejmować ostatnie wstrzyknięcie po zamknięciu jamy brzusznej, obliczone na pozostałą narkę, zwykle 30 minut.

2. Przygotowanie miejsca operacji i instrumentów

1. Przygotuj stół skubujący z instrumentami i materiałami, w tym:
   Atraumatyczne kleszcze do przygotowania
   Tępe kleszcze Overholt
   Nożyczki do przygotowania
   Podwójne uzbrojone 6-0 szycie monofilamentowe nieresorbujące
   Pojedyncze uzbrojone 4-0 szycie polifilamentowe szybko resorbujące
   20-gwoździowy cewnik jako improwizowany cewnik Foley
   Zwilżone waciki bawełniane
   Waciory gazowe
   Roztwór izotoniczny chlorku sodu
2. Umieść zwierzę na urządzeniu do ekspozycji chirurgicznej gryzoni, jak opisano w poprzednich publikacjach^30,31. Ogolić obszar dostępu do jamy brzusznej i wysterylizować go, wykonując naprzemienny potrójny srub z 70% alkoholem i watkami antyseptycznymi na bazie powidenu jodowego lub chlorheksydyny, pracując w strefowych kołach od miejsca nacięcia na zewnątrz. Powtórzyć trzy razy.
3. Pokryć zwierzę sterylnymi prześcieradłami, pozostawiając narażone tylko pole chirurgiczne.

3. Dostęp chirurgiczny przez środkową laparotomię

1. Wykonaj medianną laparotomię brzuszną o długości około 5 cm za pomocą drobnych nożyczek i przetnij wzdłuż linii białej w środkowej linii, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej.
2. Użyj hakowych uchwytów i wilgotnych okładów do cofnięcia ściany brzusznej i eksponowania jamy otrzewnej.

4. Identyfikacja i przygotowanie jelita cienkiego oraz pęcherza moczowego (Rysunek 1)

1. Zidentyfikuj jelito cienkie i delikatnie zmobilizuj pętlę za pomocą atraumatycznych kleszczy do przygotowania i zwilżonych wacików (Rysunek 1A.1).
2. Zbliżyć pętlę jelita cienkiego do pęcherza, aby zidentyfikować odpowiednio umiejscowiony
3. odcinek jelita cienkiego o długości około 12 mm na potrzeby powiększenia (Rysunek 1A.2). Powinien to być pierwszy mechanicznie odpowiedni od

Wyniki

Aby potwierdzić żywotność tkanki po tym protokole, oksygenację i perfuzję tkanki oceniono podczas zabiegu na ośmiu szczurach (Tabela 1). Przed enterocystoplastyką wykonano hiperspektralne obrazowanie (HSI) jelita cienkiego, aby wizualizować nasycenie tkanki tlenem (StO₂) i perfuzję (NIR) (Rysunek 5A.1). Jako kontrola negatywna wywołano maksymalną niedokrwienie przez zaciśnięcie aorty (Rysunek 5A.2). HSI reprezen...

Dyskusja

To dzieło przedstawia reproduktybilny protokół chirurgiczny do przeprowadzenia enterocystoplastyki u szczurów z wykorzystaniem laparotomii środkowej, ekstrakorporealnej kanulacji i włączenia detubulizowanego odcinka jelita krętego. Technika ta naśladuje zasady opisane przez Tizzoniego i Foggiego dotyczące powiększania pęcherza i dostosowuje je do modelu gryzoni poprzez połączenie precyzyjnej anestezji, przygotowania aseptycznego, kanulacji z zewnątrz do odprowadzania moczu i pobierania naczyniowionego płata jelita kręteg...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Atraumatic preparation forceps	Aesculap	FB395R	DE BAKEY ATRAUMATA atraumatic forceps, straight
Blunt overholt clamps	Aesculap	BJ012R	BABY-MIXTER preparation and ligature clamp, bent, 180 mm
Cannula tube foley for flushing and diversion	Mdk Mart	23-CA-CD-UL-CD	Cannula G18 (only the tube is used to flush the diversion cannula)
Carprofen	cp pharma	115	Carprofen 0,5% (5% with 50 mg/mL diluted 1:10) (Carprosol)
Cotton wool swabs	Amazon	ASIN: B0FPDB8ZGS	Non-sterile cotton wool swabs (autoclave for survival experiments)
Fast resorbable polyfilament 4-0 sutures	COVIDIEN	SV-494	Single-armed polyfilament surgical suture from resorbable polyglactin with one P-13 needle
Fixation rods	legefirm	‎500343896	Tuning forks used as y-shaped metal fixation rods
Foley catheter	B. Braun	4242010-02	20 Gauge 50 mm Introcan Safety 2 Catheter as diversion cannula
Gauze swabs	Medrull	ASIN: B09164D1JG	Sterile gauze swabs
Heating pad	Royal Gardineer	IP67	Royal Gardineer Heating Pad Size S, 20 Watt
Hyperspectral imaging camera system	Diaspective Vision	TIVITA Tissue Halogen	HSI system for validation
Isoflurane	Piramal Critical Care	PZN / EAN 09714675 / 4150097146757	100% isoflurane 250 mL
Isoflurane vaporizer	UNO ROESTVASTSTAAL BV	180000002	Isoflurane vaporizer
Isotonic sodium chloride solution	B. Braun	ASIN: B007PZJOQ4	0,9% sodium chloride solution
Ketamine	cp pharma	1202	Ketamine 10% (100 mg/mL)
Metal cannula	BD (Beckton, Dickinson)	301300	BD Microlance 3 cannula 20 Gauge as preparation hooks
Neonatal face mask	asia connection	ME03016-0	Neonatal face mask size #0 for neonate
Non-resorbable monofilament 4-0 sutures	COVIDIEN	SP-670	Single-armed monofilament surgical suture from non-resorbable poly-propylene with one C-16 needle
Non-resorbable monofilament 6-0 sutures	COVIDIEN	VP-733-X	Double-armed monofilament surgical suture from non-resorbable poly-propylene with two CV-22 needles
Ophthalmic ointment	Bayer Vital GmbH	1578681	5% dexpanthenol
Plastic perfusor tube	M. Schilling GmbH	S702NC150	Connecting tube COEX 150 cm
Preparation scissors	Aesculap	BC177R	JAMESON preparation scissors, bent, fine model, blunt/blunt, 150 mm (6")
Rat induction chamber	wpiinc	EZ-1785	Induction chamber for narcosis
Steel plate	Maschinenbau Feld GmbH	C010206	Galvanized sheet plate, 40 x 50 cm, thickness 4.0 mm
Xylazine	cp pharma	1206	Xylazine 0,2% (2% with 20 mg/mL diluted 1:10) (Xylavet)