Artykuł metodologiczny

Platforma internetowa do zautomatyzowanej, obrazowej ilościowej oceny izolowanych wysepek trzustkowych u ludzi i gryzoni

DOI:

10.3791/71124

⸱

28 lipca 2026

 ,  ,  , 
1Laboratory for Pancreatic Islets, Experimental Medicine Center, Institute for Clinical and Experimental Medicine, 2Department of Cell Biology, Faculty of Science, Charles University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje standaryzowane pobieranie próbek, barwienie, akwizycję obrazu oraz zautomatyzowane, internetowe ilościowe określenie izolowanych ludzkich i gryzoniowych wysp trzustkowych z użyciem analizy obrazu wspomaganej przez głębokie uczenie oraz kontrolę jakości wizualnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem niniejszej publikacji jest przedstawienie pisemnego i wideo z krokiem po kroku protokołu do standaryzowanego użycia IsletNet, platformy internetowej do zautomatyzowanej ilościowej analizy obrazów wyspy trzustkowej, począwszy od pobierania próbek i akwizycji obrazu, aż do przesyłania obrazów, walidacji wizualnej i automatycznego generowania raportów. Platforma została opracowana do standaryzowanej, zautomatyzowanej oceny dwuwymiarowych mikroskopowych obrazów wysp trzustkowych w celu wsparcia klinicznych i eksperymentalnych przepływów pracy izolacji wysepek. Do identyfikacji wysepek i tkanki exokrynycznej służy segmentacja obrazu oparta na głębokim uczeniu, z której ekstraktowane są kontury do analizy obrazu. Algorytmy obliczeniowe następnie ilościowo oceniają liczbę wysepek, objętość i czystość. Narzędzie kontroli jakości wizualnej wspiera ekspertyzę walidacji automatycznych analiz obrazów, umożliwiając użytkownikom akceptację, ręczne korekty lub wykluczenie nieważnych obrazów. Moduł Klinicznej Izolacji Wysepki wspiera analizę wsadową frakcji czystości i generuje automatyczne raporty PDF wraz z plikanemi danych obrazu i tabelami do zapisywania i analizy. Moduł Prostego Porównania porównuje zautomatyzowane estymacje z lokalnie uzyskanymi wynikami referencyjnymi przesłanymi wraz z odpowiadającymi im obrazami próbek w celu oceny przydatności lokalnie standaryzowanych obrazów do automatycznej analizy. Protokół zawiera również zalecenia dotyczące ponownego treningu przy użyciu lokalnie wygenerowanych standaryzowanych obrazów, jeśli jest to konieczne. Reprezentatywne dane z izolacji wysepek u gryzoni i ludzi, w tym trudne przykłady, pokazują poprawę wydajności zautomatyzowanej analizy po odpowiednim treningu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transplantacja izolowanych wysepek trzustkowych u biorców z cukrzycą zmniejsza lub eliminuje potrzebę zewnętrznego podawania insuliny1. Proces izolacji wysepek z ciaał zmarłych lub żywych dawców podlega biologicznej i proceduralnej heterogeniczności, co przekłada się na różnice w wydajności i jakości. Całkowita objętość wysepek stanowi podstawową informację do określenia dawki i podejmowania decyzji klinicznych dotyczących przydatności do przeszczepu2. histogram wielkości wysepek oraz indeks wysepek uwzględniają różnice w efektywności związanej z wielkością3. Dlatego oprócz całkowitej objętości zwraca się uwagę na pojedyncze wysepki, które obecnie służą jako wskaźnik zastępczy zawartości komórek beta. Izolowane ludzkie wysepki są mniej gęste niż wysepki gryzoni i często nie są dobrze oddzielone od tkanki zewnątrzwydzielniczej. W rezultacie są trudniejsze do rozróżnienia, chyba że są wybarwione. Zastosowano szybki i prosty sposób barwienia cynkiem z użyciem ditizonem, w którym intensywne czerwone światło jest odbijane od wzbogaconych w cynk ziaren insuliny4. Biorąc pod uwagę nieprzezroczystość tkanki, zbierane jest tylko światło odbija się od powierzchni, co pozwala na użycie prostych mikroskopów stereoskopowych lub odwróconych, wyposażonych w źródło światła i kamerę.

Przeprowadzono wiele prób zmniejszenia różnic między laboratoriami poprzez zastosowanie narzędzi do analizy obrazów cyfrowych5,6,7,8,9,10,11,12, jednak podejścia te mają kilka ograniczeń. W tych metodach segmentacja wysepek i tkanki zewnątrzwydzielniczej opiera się albo na ręcznym ustalaniu progów, które są podatne na subiektywne błędy5,6,7,8,9,10, albo na całkowicie zautomatyzowanych podejściach do segmentacji11,12. Ponadto często wymagane jest instalowanie oprogramowania lokalnego5,6,7,8,9,10,11 i może być ograniczone do określonego sprzętu10,11, co ogranicza ogólną dostępność i standaryzację.

Głównym celem niniejszej publikacji jest przedstawienie standaryzowanego procesu zautomatyzowanego ilościowego określenia izolowanych wysepek trzustkowych na obrazach za pomocą platformy internetowej opartej na głębokim uczeniu się z nadzorem ekspertów ludzkich. IsletNet radzi sobie z ograniczeniami związanymi zarówno z dostępnością, jak i niezawodnością analizy obrazów wysepek. W tym artykule przedstawiamy zalecane wytyczne dotyczące pobierania próbek wysepek przeszczepianych, generowania odpowiednich obrazów mikroskopicznych oraz prawidłowego korzystania z narzędzi IsletNet. Protokół wprowadza koncepcję nadzoru ludzkiego nad automatycznie generowanymi wynikami i przedstawia procesy dla potencjalnych i doświadczonych użytkowników (Rysunek 1). Narzędzie Simple Comparison umożliwia potencjalnym użytkownikom bezpośrednie porównanie wyników IsletNet z lokalnie uzyskanymi metodami referencyjnymi (Rysunek 1A). Ponieważ lokalnie generowane zstandardizowane obrazy mogą znacznie się różnić między centrami, IsletNet może wymagać ponownego trenowania przed osiągnięciem niezawodnej analizy (Rysunek 1B). Aby ułatwić ten proces, podane są zalecenia dotyczące standaryzowanego barwienia i akwizycji obrazów. Dla doświadczonych użytkowników narzędzie Clinical Islet Isolation jest zaprojektowane tak, aby wspierać proces izolacji ludzkich wysepek (Rysunek 1C). Opisane są pliki wyników do pobrania wraz z dodatkowymi tabelami i wizualizacjami generowanymi przez IsletNet w Tabeli 1, podczas gdy kluczowe parametry obliczone są podsumowanie w Tabeli 2.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Proces dla potencjalnych i doświadczonych użytkowników platformy. (A) Lokalny proces walidacji za pomocą modułu Simple Comparison. (B) Ponowne trenowanie wymaga zestawu reprezentującego zstandardizowane lokalnie obrazy. (C) Proces rutynowego użytkowania z wykorzystaniem modułu Clinical Islet Isolation. Kluczowe kroki procesu są podsumowane dla przesyłania obrazów, analizy, kontroli jakości wizualnej (vQC) i generowania raportów. Słupki skal nie mają zastosowania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Ministerstwo Zdrowia Republiki Czeskiej (numer zgody 49/2023) zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich 86/609/EWG. Procedury izolacji wysp ludzkich i ich wykorzystywania zostały zatwierdzone przez Państwowy Instytut Kontroli Leków (numer zgody sukls111286/2023). Zstandardyzowane mikroskopowe obrazy preparatów wysp szczurów i ludzkich zostały przeanalizowane za pomocą narzędzi Simple Comparison i Clinical Islet Isolation w celu porównania analizy zautomatyzowanej z liczeniem manualnym. Do obliczeń zrównoważonych wartości wysp użyto standardowej tabeli konwersji (krótkiej)13 zarówno do obliczeń manualnych, jak i zautomatyzowanych.

1. Nadzór ludzki

  1. Początkowy widok wyników podstawowych (Rysunek 2)
    1. Poczekaj na automatycznie generowane wartości liczby wysp, objętości i czystości, wraz z graficzną wizualizacją odpowiednich automatycznych adnotacji (np. konturów lub segmentacji), które pojawią się w oknie Wyniki wsadu.
    2. Zobacz podsumowane wyniki dla bieżącego obrazu próbki na lewym panelu informacji (Rysunek 2A).
    3. Zobacz wartości powtórzeń (Rysunek 2B) i średnie wsadu (Rysunek 2C) w prawej tabeli.
    4. Przeglądaj na podglądzie obrazu (Rysunek 2D,E) za pomocą linków (Rysunek 2F). Kliknij prawym przyciskiem myszy na podglądzie obrazu i postępuj zgodnie z wyskakującym menu, aby pobrać pojedynczy obraz, jeśli to konieczne.
    5. Przeglądaj obrazy próbki za pomocą strzałek nawigacyjnych (Rysunek 2G) lub wybierz bezpośrednio z tabeli.
    6. Otwórz okno Inspekcji klikając wewnątrz bieżącego podglądu obrazu (Rysunek 2D), aby ocenić jakość automatycznie wygenerowanych konturów i zweryfikować wyniki.
  2. Kontrola jakości wizualnej
    1. Porusz się po obrazie i powiększ (Rysunek 3A) lub pomniejsz, aby sprawdzić kontury pod kątem potencjalnych błędów.
    2. Przełączaj między Konturu (mają ją tylko zliczone wyspy), Obraz oryginalny i dodatkowe widoki wizualizacji.
      UWAGA: Dostępne widoki są wymienione w Legendzie po prawej stronie okna (Rysunek 3B) i można uzyskać do nich dostęp za pomocą skrótów klawiszowych lub linków w górnym pasku nawigacyjnym (Rysunek 3C; Tabela 3).
    3. Przejdź do następnego obrazu, naciskając klawisz strzałki w dół, jeśli kontury są akceptowalne (Tabela 3).
    4. Poprawiaj błędy konturowania manualnie, gdy to możliwe. Jeśli pozostaną wykryte, częściowo wykryte lub fałszywe wyspy, sklasyfikuj obraz jako nieważny i wyklucz go z analizy.
      UWAGA: Wykluczone obrazy są zaznaczone w oknie Wyniki wsadu (Rysunek 2J) i we wszystkich pobranech plikach.
  3. Poprawialne błędy: Nierozdzielone sąsiednie wyspy
    1. Rozdzielaj sąsiednie wyspy manualnie, jeśli to konieczne.
    2. Kliknij lewym przyciskiem myszy poza wyspami, aby rozpocząć linię rozdzielania (Rysunek 3D).
    3. Dodaj pośrednie kliknięcia lewym przyciskiem, aby przekierować linię rozdzielania między sąsiednimi wyspami (Rysunek 3E).
    4. Kliknij prawym przyciskiem myszy poza wyspami, aby zakończyć linię rozdzielania (Rysunek 3F).
    5. Prześlij linię rozdzielania, aby zaktualizować wynik (Rysunek 3G).
      ​UWAGA: Przełączaj wizualizację dodanych linii rozdzielania włącz/wyłącz według potrzeb (Rysunek 3H).
  4. Poprawialne błędy: Fałszywe wyspy
    1. Użyj narzędzia do rozdzielania, aby podzielić fałszywą wyspę na wiele obiektów mniejszych niż próg wielkości wyspy.
    2. Unikaj liczenia małych fragmentów wysp, ustawiając wstępnie zdefiniowany minimalny próg wielkości wyspy (konwencjonalnie 50 µm). Dostosuj próg zgodnie z lokalną praktyką laboratoryjną, jeśli to konieczne.
    3. Kliknij prawym przyciskiem myszy dowolny punkt na linii i wybierz odpowiednią opcję z wyskakującego menu, aby usunąć jedną lub wszystkie ręcznie dodane linie rozdzielania (Rysunek 3I).
  5. Niepoprawialne błędy: Brakujące, częściowo zsegmentowane lub fałszywe wyspy
    1. Przełącz widok Segmentacji, aby zweryfikować, czy wyspy zostały wykry

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czyste wyspy szczura

W pierwszym eksperymencie 36 obrazów reprezentujących 12 próbek zawierających łącznie 249 oczyszczonych wysp szczura zostało pozyskano podczas czterech niezależnych sesji obrazowania. Obrazy zostały wygenerowane za pomocą stereomikroskopu w trzech znormalizowanych, ale odrębnych warunkach oświetlenia, stosując źródła światła halogenowego i diody elektroluminescencyjnej (LED) wraz z różnymi ustawieniami aparatu. Segmencje odniesienia (GT) zostały wygenerowane ręcznie dla trzech reprezentatywnych obrazów przez eksperta szkolonego w IsletNet.

Kiedy obrazy zostały przeanalizowane za pomocą publicznie dostępnej wersji narzędzia Simple Comparison, żaden z automatycznie wygenerowanych konturów nie przeszedł kontroli jakości wizualnej (vQC, Rycina 5F). Platforma została następnie ponownie przeszkolona za pomocą reprezentatywnych lokalnych obrazów, a wszystkie kontury wygenerowane przez przeszkoloną wersję eksperymentalną przeszły vQC (Rycina 5C).

Współczynnik automatycznych do ręcznych oszacowań objętości wyspy wykazał spójną wydajność w trzech warunkach obrazowania po ponownym przeszkoleniu, z wartościami mediany 1,03, 0,98 i 0,94 dla warunków oświetlenia A, B i C, odpowiednio (Rycina 5A). Wyniki te reprezentowały znaczną poprawę w porównaniu z oryginalnym modelem szkoleniowym (Rycina 5B).

Porównanie pikselowe z segmentacjami odniesienia wykazało bliskie zgodności między zautomatyzowanymi i ręcznie generowanymi konturami po ponownym przeszkoleniu (Rycina 5D), co odpowiadało dokładnemu umieszczeniu konturów w reprezentatywnych obrazach (Rycina 5C). W przeciwieństwie do tego, oryginalny model szkoleniowy wykazał zwiększoną proporcję fałszywie ujemnych pikseli (Rycina 5G) oraz niewłaściwe umieszczenie konturów (Rycina 5F), co skutkowało przesunięciem ku mniejszym kategoriom wysp w odpowiednich histogramach wielkości wysp (Rycina 5E vs 5H).

figure-results-1
Rycina 5. Ocena ponownego szkolenia platformy przy użyciu trzech zestawów do obrazowania i preparatów wysp szczura. (A) Porównanie oszacowań IsletNet i ręcznych wyników równoważników wysp (IEQ) po ponownym przeszkoleniu przy użyciu trzech zestawów do obrazowania. (B) Porównanie oszacowań IsletNet i ręcznych IEQ przy użyciu oryginalnego publicznego modelu szkoleniowego. (C, F) Reprezentatywne umieszczenie konturów za pomocą narzędzia vQC po i przed przeszkoleniem modelu, odpowiednio. Białe strzałki wskazują poprawne umieszczenie konturów, a magenta strzałki wskazują niewłaściwe umieszczenie konturów. (D, G) Porównanie pikselowe z prawdą odniesienia po ponownym przeszkoleniu i przy użyciu oryginalnego modelu szkoleniowego, odpowiednio. Prawdziwie dodatnie, fałszywie dodatnie, fałszywie ujemne i prawdziwie ujemne regiony są wskazane w legendzie. (E, H) Reprezentatywne histogramy wielkości wysp po ponownym przeszkoleniu i przy użyciu oryginalnego modelu szkoleniowego, odpowiednio, w porównaniu z ręcznym liczeniem. Zestaw do obrazowania 1 = oświetlenie LED; zestaw do obrazowania 2 = oświetlenie halogenowe; zestaw do obrazowania 3 = oświetlenie LED dark-field. Słupki = 100 µm. Boxploty są pokazane zgodnie z konwencją Tukey; wąsy sięgają do punktów danych w obrębie 1,5 × zakresu międzykwartylowym od pierwszego i trzeciego kwartyla. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

Kliniczne preparaty ludzkich wysp

W drugim eksperymencie 17 obrazów reprezentujących pojedynczy proces izolacji ludzkiej wyspy z trzema parami czystości zostało przeanalizowanych przy użyciu publicznie dostępnej wersji platformy. Jedna próbka została zgubiona. Po vQC, wszystkie obrazy reprezentujące frakcje średniej i niskiej czystości zostały wykluczone z powodu fałszywego wykrywania wysp (dane nie są przedstawione). Platforma została następnie ponownie przeszkolona za pomocą reprezentatywnych lokalnych obrazów.

Po ponownym przeszkoleniu wszystkie obrazy przeszły vQC po dodaniu trzech ręcznych linii separacji. Porównanie wsadowe z ręcznym liczeniem wykazało ogólne niedocenianie ≤5% dla szacowanych liczby i objętości wysp. Próbki rozcieńczone między 2000- a 4000-krotnie zawierały od 80 do 4 wysp w zależności od

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół opisuje praktyczny przepływ pracy dla potencjalnych i obecnych użytkowników IsletNet, ze szczególnym uwzględnieniem dwóch kluczowych funkcji platformy: ekspertyzowej walidacji jakości i ponownego trenowania sieci neuronowych. Wyniki reprezentatywne pokazują, że dokładne automatyczne ilościowe określenie zależy nie tylko od wydajności segmentacji obrazu, ale także od umiejętności użytkownika do krytycznej oceny umiejscowienia konturów i przydatności obrazu przed zaakceptowaniem wyników. Dwa dodatkowe zaawansowane narzędzia, Porównanie Pixel do Pixel i Moje Segmenatacje, zostały użyte do wygenerowania wybranych wyników walidacji; jednakże, narzędzia te są przeznaczone głównie na wsparcie trenowania sieci neuronowych i dlatego nie są zawarte w przepływie pracy protokołu.

IsletNet został opracowany jako współpracowniczy i powszechnie dostępny narzędzie referencyjne do standaryzowanej analizy obrazów wysp w różnych laboratoriach. Sieć neuronowa została przeszkolona i zweryfikowana przy użyciu ręcznie zaznaczonych segmentacji GT oryginalnych dwuwymiarowych mikroskopowych obrazów izolowanych ludzkich i szczurzych wysp14,15,16. Zostały wygenerowane dwa oddzielne modele dla preparatów zabarwionych ditizonem oraz dodatkowy model badawczy dla niezabarwionych wysp szczurzych, z dostępem dostępnym na żądanie. Wersja platformy i data trenowania są wyświetlane w interfejsie użytkownika. IsletNet automatycznie segmentuje wyspy i tkankę zewnątrzwydzielniczą, a następnie oblicza liczbę, objętość i czystość wysp używając wielkości pikseli określonych przez użytkownika i minimalnej progu wielkości wyspy. Wybór progu wielkości wyspy zależy od jakości obrazu i celu analizy (porównanie bok po boku z ręcznym liczeniem vs. badanie małych wysp) raczej niż od gatunku. Biorąc pod uwagę rozdzielczość konwencjonalnej mikroskopii, znacząca minimalna wielkość wyspy wynosi 50 µm7,8,9,12, ale może być zmniejszona do 10 µm dla obrazów uzyskiwanych z odpowiedniego instrumentu10. Estymacje objętości wysp są generowane przy użyciu standardowej tabeli konwersji opartej na sferze13, jak również alternatywnych tabel konwersji7,18,19, włączając aproksymacje elipsy5,6 oraz modele oparte na konturach Spinacle i Sphiracle17. Wynikowe wartości są raportowane w ekwiwalenta wysp i nanolitrach, podczas gdy czystość jest obliczana na podstawie albo obszaru tkanki albo oszacowanej objętości tkanki. Kluczowym krokiem w protokole jest pozyskiwanie zstandaryzowanych mikroskopowych obrazów nadających się do automatycznej segmentacji. IsletNet został przeszkolony przy użyciu obrazów uzyskiwanych za pomocą mikroskopów stereo i inwertowanych wyposażonych w zakres uzupełniających kamer półprzewodnikowych i systemów iluminacji. Obiektywy o małej powiększeniu (1-2x) są korzystne, ponieważ pozwalają na utrzymanie całej próbki w polu widzenia przy jednoczesnym utrzymaniu wielkości pikseli kompatybilnej z niezawodnym wykrywaniem małych wysp. Stała iluminacja, stabilna biała równowaga i uniknięcie prześwietlenia obrazów są niezbędne do niezawodnego generowania konturów. Wyniki reprezentatywne pokazują, że ponowne trenowanie przy użyciu reprezentatywnych lokalnych obrazów może znacząco poprawić wydajność segmentacji w różnorodnych warunkach obrazowań. Jako praktyczne wytyczne, obrazy są ogólnie nadające się do trenowania IsletNet, kiedy granice wysp i tkanki zewnątrzwydzielniczej są wyraźnie rozróżnialne dla doświadczonego obserwatora. Obrazów zawierających skupione lub mocno nakładające się wyspy należy unikać, jeśli to możliwe.

Protokół podkreśla również kilka ograniczeń i kwestii rozwiązywania problemów związanych z automatyczną analizą obrazów. Podczas gdy IsletNet znacząco zwiększa przepustowość, obiektywność i powtarzalność w porównaniu z całkowicie ręcznym liczeniem, metoda nadal jest wrażliwa na jakość obrazu. Nieprawidłowe umiejscowienie konturów (fałszywe wykrywanie wysp i brak rozdzielenia sąsiednich wysp) może czasami wystąpić i może wpływać na ilościową analizę następczą. Rutynowa vQC nadal jest niezbędna przed zaakceptowaniem automatycznych wyników. Natychmiastowe zastosowanie IsletNet jest korzystne, ponieważ nieodpowiednie obrazy mogą być ponownie pozyskane z dostosowanymi parametrami obrazowań. Ręczne korygowanie automatycznych konturów jest możliwe w oknie Inspekcji, z wyjątkiem brakujących wysp lub wielu fałszywych wysp. Ponadto, automatyczny algorytm rozdzielania jest oparty na geometrii konturu i statystykach rozkładu wielkości wysp i może zatem różnić się od początkowej interpretacji indywidualnego eksperta, podczas gdy wciąż pozostaje analitycznie akceptowalny.

Wiarygodność IsletNet jest określana przede wszystkim przez spójność pomiędzy lokalną jakością obrazu a zbiorem treningowym raczej

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że badania przeprowadzono bez żadnych komercyjnych lub finansowych relacji, które mogłyby być uznane za potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Publiczna wersja IsletNet została opracowana i przeszkolona przez Filipa Matznera, Jana Belohlaveka i Adama Blazeka (Iterait a.s., Praga, Czechy). Wersja eksperymentalna została przeszkolona przez Jakuba Monharta, Petrę Curdovą i Jana Kubanta (Mild Blue s.r.o., Praga, Czechy).

Autorzy dziękują poniższym osobom i instytucjom za dostarczenie mikroskopijnych obrazów użytych do szkolenia sieci IsletNet: Andrew Friberg (Department of Immunology, Genetics and Pathology, Uppsala University, Szwecja); Hanne Scholz (Institute for Surgical Research, Oslo University Hospital, Norwegia); Valérie Gmyr (Translational Research in Diabetes, University of Lille, INSERM, Francja); Josh Wilhelm (Schulze Diabetes Institute, University of Minnesota, Minneapolis, USA); Domenico Bosco (Department of Surgery, University of Geneva and Geneva University Hospitals, Szwajcaria); Jason Doppenberg (Department of Internal Medicine, Leiden University Medical Center, Holandia); Karolina Golab (Transplant Institute, Biological Sciences, University of Chicago, USA); Minna Honkanen-Scott (Newcastle University, UK); Hirotake Komatsu (City of Hope, USA); Rebecca Spiers (Oxford University, UK); oraz Zuzana Berkova, Jan Kriz i Peter Girman (Institute for Clinical and Experimental Medicine [IKEM], Praga, Czechy).

Autorzy z wdzięcznością wyrażają również uznanie dla Zuzany Berkovej i Klary Zacharovovej za wsparcie techniczne podczas procedur izolacją wysp trzustkowych u szczurów stosowanych w niniejszym badaniu.

Praca ta była wspierana przez Ministerstwo Zdrowia Republiki Czeskiej (granty nr NU22-01-00141/ NW25-01-00221), przez Narodowy Instytut Badań nad Chorobami Metabolicznymi i Sercowo-Naczyniowymi (Program EXCELES, projekt nr LX22NPO5104), finansowany przez Unię Europejską – Next Generation EU, oraz przez Ministerstwo Zdrowia Republiki Czeskiej – rozwój koncepcyjny organizacji badawczej („Institute for Clinical and Experimental Medicine – IKEM, IN 00023001”).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
35 mm Petri dishesSigma-AldrichP5481Unsterile
200 µL pipette tips, wide-boreSigma-AldrichAXYT205WBCRSFor islet suspension dispensing before staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650GC grade or cell culture grade
Dithizone (DTZ)Sigma-AldrichD5130Powder
Ethanol, 70%Local supplierN/A(v/v) in H2O; for DTZ preparation
Fetal bovine serum (FBS)Gibco10270106Heat-inactivated, qualified
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)Sigma-AldrichH6648With or without phenol red (specify based on assay)
Human albuminGrifols61953-0001-2High-concentration solution (200 g/L)
Infinity 1-3CLumenera3-1URCCMOS, 3 MP
Infinity CaptureLumeneraN/AStandard image acquisition software
Inverted microscope CKX41OlympusN/A1.25x and 2x objectives
LED-High-Power-Spots (2-arm)Photonics10068LED light source; dual gooseneck guide
Light source Highlight 2000Olympus5-HL2000Halogen light source (14.5 V, 90 W); manual intensity control; dual gooseneck guide
Laboratory essentialsVariousN/APipettes, tubes, needles, syringes, laboratory timers, standard PPE
MicroCam softwareBresserN/AStandard image acquisition software
MikroCam 3.0MBresser86000180CMOS, 3.1 MP camera
Millex-MP filter unitMilliporeSigmaSLMP025SS0.22 µm pore size, PES membrane
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco10010023pH 7.4
Promicam Pro 3-5 CPPromicamE61MPR937CMOS, 5 MP, high-dynamic-range camera
QuickPHOTOPromicraN/AStandard image acquisition software
Sodium hydroxide (1 M NaOH)Local supplierN/AFor pH adjustment and solubilization during DTZ preparation
Stage micrometerThorlabsR1L3S1P10 mm length; 50 µm divisions for calibration
Stereo microscope SZH10OlympusN/A1x apochromat objective

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

BiologiaWydanie 233Wydanie 233Warto pustaWydanie IsletNet Izolacja wysepek trzustkowych Automatyczna kwantyfikacja Analiza obrazu G bokie uczenie
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły