Artykuł metodologiczny

Platforma internetowa do zautomatyzowanej, obrazowej ilościowej oceny izolowanych wysepek trzustkowych u ludzi i gryzoni

155 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71124

⸱

28 lipca 2026

 ,  ,  , 
1Laboratory for Pancreatic Islets, Experimental Medicine Center, Institute for Clinical and Experimental Medicine, 2Department of Cell Biology, Faculty of Science, Charles University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje standaryzowane pobieranie próbek, barwienie, akwizycję obrazu oraz zautomatyzowane, internetowe ilościowe określenie izolowanych ludzkich i gryzoniowych wysp trzustkowych z użyciem analizy obrazu wspomaganej przez głębokie uczenie oraz kontrolę jakości wizualnej.

Streszczenie

Celem niniejszej publikacji jest przedstawienie pisemnego i wideo z krokiem po kroku protokołu do standaryzowanego użycia IsletNet, platformy internetowej do zautomatyzowanej ilościowej analizy obrazów wyspy trzustkowej, począwszy od pobierania próbek i akwizycji obrazu, aż do przesyłania obrazów, walidacji wizualnej i automatycznego generowania raportów. Platforma została opracowana do standaryzowanej, zautomatyzowanej oceny dwuwymiarowych mikroskopowych obrazów wysp trzustkowych w celu wsparcia klinicznych i eksperymentalnych przepływów pracy izolacji wysepek. Do identyfikacji wysepek i tkanki exokrynycznej służy segmentacja obrazu oparta na głębokim uczeniu, z której ekstraktowane są kontury do analizy obrazu. Algorytmy obliczeniowe następnie ilościowo oceniają liczbę wysepek, objętość i czystość. Narzędzie kontroli jakości wizualnej wspiera ekspertyzę walidacji automatycznych analiz obrazów, umożliwiając użytkownikom akceptację, ręczne korekty lub wykluczenie nieważnych obrazów. Moduł Klinicznej Izolacji Wysepki wspiera analizę wsadową frakcji czystości i generuje automatyczne raporty PDF wraz z plikanemi danych obrazu i tabelami do zapisywania i analizy. Moduł Prostego Porównania porównuje zautomatyzowane estymacje z lokalnie uzyskanymi wynikami referencyjnymi przesłanymi wraz z odpowiadającymi im obrazami próbek w celu oceny przydatności lokalnie standaryzowanych obrazów do automatycznej analizy. Protokół zawiera również zalecenia dotyczące ponownego treningu przy użyciu lokalnie wygenerowanych standaryzowanych obrazów, jeśli jest to konieczne. Reprezentatywne dane z izolacji wysepek u gryzoni i ludzi, w tym trudne przykłady, pokazują poprawę wydajności zautomatyzowanej analizy po odpowiednim treningu.

Wprowadzenie

Przeszczepienie wyizolowanych wysepek trzustkowych biorcom z cukrzycą zmniejsza lub eliminuje konieczność zewnętrznego podawania insuliny1. Proces izolacji wysepek od dawców pośmiertnych lub żywych podlega heterogeniczności biologicznej i proceduralnej, co przejawia się w zmienności wydajności i jakości. Całkowita objętość wysepek stanowi główny parametr w określaniu dawki i podejmowaniu decyzji klinicznych dotyczących przydatności do przeszczepu2. Histogram wielkości wysepek oraz wskaźnik wysepek uwzględniają różnice w skuteczności związanej z ich rozmiarem3. Dlatego, poza całkowitą objętością, która obecnie służy jako marker zastępczy dla zawartości komórek beta, zwraca się uwagę na poszczególne wysepki. Wyizolowane ludzkie wysepki są mniej gęste niż wysepki gryzoni i często nie są dobrze oddzielone od tkanki egzokrynnej. W konsekwencji trudniej je rozróżnić, o ile nie zostaną zabarwione. Przyjęto szybką i prostą metodę barwienia cynkiem z użyciem ditiizonu, w której intensywne czerwone światło odbija się od wzbogaconych w cynk ziarnulek insuliny4. Ze względu na nieprzezroczystość tkanki, gromadzone jest tylko światło odbite od powierzchni, co umożliwia zastosowanie prostych instrumentów do mikroskopii stereoskopowej lub odwróconej, wyposażonych w źródło światła i kamerę.

Podjęto liczne próby ograniczenia zmienności międzylaboratoryjnej poprzez zastosowanie narzędzi cyfrowej analizy obrazu5,6,7,8,9,10,11,12, jednak podejścia te obarczone są kilkoma ograniczeniami. W metodach tych segmentacja wysepek i tkanki egzokrynnej opiera się albo na manualnym ustalaniu progów, co jest podatne na błędy subiektywne5,6,7,8,9,10, albo wykorzystuje w pełni zautomatyzowane podejścia do segmentacji11,12. Ponadto często wymagana jest lokalna instalacja oprogramowania5,6,7,8,9,10,11, która może być ograniczona do konkretnego sprzętu10,11, co ogranicza powszechną dostępność i standaryzację.

Ogólnym celem niniejszej publikacji jest przedstawienie zestandaryzowanego procesu automatycznej kwantyfikacji wyizolowanych wysepek trzustkowych na obrazach z wykorzystaniem internetowej platformy głębokiego uczenia z nadzorem eksperckim. IsletNet rozwiązuje problemy związane zarówno z dostępnością, jak i niezawodnością analizy obrazów wysepek. W niniejszym artykule przedstawiamy zalecane wytyczne dotyczące pobierania próbek przeszczepów wysepek, generowania odpowiednich obrazów mikroskopowych oraz właściwego korzystania z narzędzi IsletNet. Protokół wprowadza koncepcję nadzoru człowieka nad automatycznie generowanymi wynikami oraz przedstawia procesy pracy dla nowych i doświadczonych użytkowników (Rycina 1). Narzędzie Simple Comparison umożliwia nowym użytkownikom bezpośrednie porównanie wyników z IsletNet z lokalnie stosowanymi metodami referencyjnymi (Rycina 1A). Ponieważ lokalnie generowane zestandaryzowane obrazy mogą się znacznie różnić między ośrodkami, IsletNet może wymagać ponownego uczenia przed osiągnięciem niezawodnej analizy (Rycina 1B). Aby ułatwić ten proces, przedstawiono zalecenia dotyczące zestandaryzowanego barwienia i akwizycji obrazów. Dla doświadczonych użytkowników narzędzie Clinical Islet Isolation zostało zaprojektowane w celu wsparcia procesu izolacji wysepek u ludzi (Rycina 1C). Raporty do pobrania wraz z dodatkowymi tabelami i wizualizacjami generowanymi przez IsletNet opisano w Tabeli 1, natomiast kluczowe obliczone parametry podsumowano w Tabeli 2.

Schemat modułu IsletNet dla klinicznej izolacji wysepek i walidacji treningu danych, diagram procesu.
Rycina 1: Przebieg pracy dla nowych i stałych użytkowników platformy. (A) Przebieg walidacji lokalnej z wykorzystaniem modułu Simple Comparison. (B) Ponowny trening wymaga zestawu reprezentującego zlokalizowane, zestandaryzowane obrazy. (C) Przebieg rutynowego użytkowania z wykorzystaniem modułu Clinical Islet Isolation. Kluczowe etapy procesu zostały podsumowane dla przesyłania obrazów, analizy, wizualnej kontroli jakości (vQC) oraz generowania raportów. Paski skali nie mają zastosowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Tabela 1: Pliki z wynikami do pobrania generowane przez platformę. Lista plików wyjściowych do pobrania, generowanych przez narzędzia Clinical Islet Isolation oraz Simple Comparison, pogrupowana według formatu pliku i kategorii wyników. Tabela obejmuje pliki raportów, wyjścia w postaci obrazów segmentowanych, pliki wizualizacji oraz eksporty do arkuszy kalkulacyjnych dla analiz liczby wysp, objętości, czystości oraz analiz histogramów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Kluczowe parametry zawarte w raportach do pobrania i plikach arkusza kalkulacyjnego. Szczegółowa lista metadanych, ustawień zdefiniowanych przez użytkownika oraz parametrów analizy ilościowej zawartych w plikach XLSX i CSV do pobrania, generowanych przez narzędzia Clinical Islet Isolation i Simple Comparison. Parametry obejmują metadane sesji, ustawienia akwizycji obrazów oraz wskaźniki ilościowe wysp dla obrazów i poszczególnych wysp. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Protokół

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Ministerstwo Zdrowia Republiki Czeskiej (Zatwierdzenie nr 49/2023) zgodnie z dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich 86/609/EWG. Procedury izolacji i wykorzystania ludzkich wysepek zostały zatwierdzone przez Państwowy Instytut Kontroli Leków (Zatwierdzenie nr sukls111286/2023). Zestandaryzowane obrazy mikroskopowe preparatów wysepek szczurzych i ludzkich przeanalizowano przy użyciu narzędzi Simple Comparison oraz Clinical Islet Isolation w celu porównania analizy automatycznej z liczeniem manualnym. Standardowa (krótka) tabela konwersji13 została wykorzystana zarówno do manualnych, jak i automatycznych obliczeń ekwiwalentu wysepek.

1. Nadzór człowieka

  1. Wstępny podgląd głównych wyników (Rycina 2)
    1. Należy odczekać, aż w oknie Wyniki Partii (Batch Results) pojawią się automatycznie wygenerowane wartości liczby wysp, objętości i czystości, wraz z graficzną wizualizacją odpowiadających im automatycznych adnotacji (np. konturów lub segmentacji).
    2. Podsumowane wyniki dla bieżącego obrazu próbki znajdują się w lewym panelu informacji (Rycina 2A).
    3. Wartości powtórzeń (Rycina 2B) oraz średnie dla partii (Rycina 2C) są widoczne w prawym panelu tabeli.
    4. Przeglądanie podglądu obrazu (Rycina 2D,E) odbywa się za pomocą łączy (Rycina 2F). Aby pobrać pojedynczy obraz, należy kliknąć prawym przyciskiem myszy na podgląd obrazu i wybrać odpowiednią opcję z menu rozwijanego.
    5. Przeglądanie obrazów próbek odbywa się za pomocą strzałek nawigacyjnych (Rycina 2G) lub poprzez bezpośredni wybór z tabeli.
    6. Aby ocenić jakość automatycznie wygenerowanych konturów i zweryfikować wyniki, należy otworzyć okno Inspekcji (Inspection), klikając w obszarze bieżącego podglądu obrazu (Rycina 2D).
  2. Wizualna kontrola jakości
    1. Należy przesuwać się po obrazie i stosować przybliżanie (Rycina 3A) lub oddalanie, aby sprawdzić kontury pod kątem potencjalnych błędów.
    2. Należy przełączać się między widokiem Konturu (dostępny tylko dla policzonych wysp), obrazem Oryginałem a dodatkowymi widokami wizualizacji.
      UWAGA: Dostępne widoki są wymienione w Legendzie po prawej stronie okna (Rycina 3B) i można do nich uzyskać dostęp za pomocą skrótów klawiaturowych lub łączy w górnym pasku nawigacyjnym (Rycina 3C; Tabela 3).
    3. Jeśli kontury są poprawne, należy przejść do następnego obrazu, naciskając klawisz strzałki w dół (Tabela 3).
    4. Błędy konturowania należy w miarę możliwości korygować ręcznie. Jeśli w obrazie pozostają niewykryte, częściowo wykryte lub fałszywie zidentyfikowane wyspy, należy zakwalifikować obraz jako nieważny i wykluczyć go z analizy.
      UWAGA: Wykluczone obrazy są oznaczone w oknie Wyniki Partii (Rycina 2J) oraz we wszystkich pobranych plikach.
  3. Błędy korygowalne: Nierozdzielone wyspy sąsiadujące
    1. W razie potrzeby należy ręcznie rozdzielić sąsiadujące wyspy.
    2. Należy kliknąć lewym przyciskiem myszy poza obszarem wysp, aby rozpocząć rysowanie linii rozdzielającej (Rycina 3D).
    3. Należy dodawać kolejne kliknięcia lewym przyciskiem myszy, aby poprowadzić linię rozdzielającą pomiędzy sąsiadującymi wyspami (Rycina 3E).
    4. Należy kliknąć prawym przyciskiem myszy poza obszarem wysp, aby zakończyć rysowanie linii rozdzielającej (Rycina 3F).
    5. Należy zatwierdzić (Submit) linię rozdzielającą, aby zaktualizować wynik (Rycina 3G).
      UWAGA: Wizualizację dodanych linii rozdzielających można włączyć lub wyłączyć w zależności od potrzeb (Rycina 3H).
  4. Błędy korygowalne: Fałszywe wyspy
    1. Należy użyć narzędzia rozdzielającego, aby podzielić fałszywą wyspę na wiele obiektów mniejszych niż ustalony próg wielkości wyspy.
    2. Aby uniknąć liczenia małych fragmentów wysp, należy ustawić zdefiniowany próg minimalnej wielkości wyspy (konwencjonalnie 50 µm). W razie potrzeby próg ten należy dostosować do lokalnej praktyki laboratoryjnej.
    3. Aby usunąć jedną lub wszystkie ręcznie dodane linie rozdzielające, należy kliknąć prawym przyciskiem myszy w dowolnym punkcie linii i wybrać odpowiednią opcję z menu rozwijanego (Rycina 3I).
  5. Błędy niekorygowalne: Brakujące, częściowo segmentowane lub fałszywe wyspy
    1. Należy przełączyć widok Segmentacji, aby zweryfikować, czy wyspy zostały wykryte.
    2. Z obliczeń średniej dla partii należy wykluczyć każdy nieważny obraz zawierający niewykryte, częściowo wykryte lub liczne fałszywe wyspy (Rycina 3J).
  6. Błędy niekorygowalne: Błędnie sklasyfikowane obiekty
    1. Obraz należy wykluczyć z oceny, jeśli tkanka egzokrynna, artefakty tła lub pęcherzyki powietrza zostały błędnie sklasyfikowane jako wyspy (Rycina 3J).

Analiza oczyszczania wysepek; dane mikroskopowe, użyto CKX41; podsumowanie partii; ocena czystości medium.
Rycina 2. Okno Wyników partii (Batch Results). (A) Podsumowanie wyników bieżącej próbki. (B) Wyniki dla powtórnych obrazów próbki. (C) Średnie wartości partii obliczone wyłącznie z zaakceptowanych obrazów. (D, E, F) Graficzne podglądy wyników z linkami. (G) Strzałki nawigacji po próbkach. (H, I, J) Obrazy zmodyfikowane, zaakceptowane i wykluczone. (K) Górny pasek nawigacji IsletNet. (L, M) Nagłówek i stopka okna Wyników partii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza obrazu mikroskopowego z interfejsem konturowania do segmentacji komórkowej, z zaznaczonymi wysepkami.
Rysunek 3. Okno inspekcji dla vQC i ręcznej korekty konturów. (A) Wyświetlanie powiększenia obrazu. (B) Legenda i wskazówki nawigacyjne. (C) Górny pasek nawigacyjny okna inspekcji. (D–G) Tworzenie i przesyłanie ręcznej linii separacyjnej dla sąsiadujących wysepek. (H) Przełącznik wyświetlania lub ukrywania ręcznych linii separacyjnych. (I) Usuwanie ręcznych linii separacyjnych. (J) Przełącznik wykluczania obrazu ze statystyk. Paski skali nie są wyświetlane w tym widoku interfejsu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 3: Tryby widoku, skróty klawiszowe i elementy sterujące nawigacją dostępne w oknie Inspekcji. Podsumowanie trybów wizualizacji obrazów, skrótów klawiszowych i funkcji nawigacyjnych dostępnych podczas vQC oraz manualnej weryfikacji wyników segmentacji w oknie Inspekcji. Tabela zawiera nakładki konturów, wyświetlanie segmentacji, wizualizację histogramu oraz elementy sterujące nawigacją obrazem stosowane w narzędziach Clinical Islet Isolation i Simple Comparison. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

2. Korzystanie z platformy

  1. Wyświetlanie wersji i informacji technicznych
    1. Sprawdź aktualną wersję oprogramowania oraz datę ostatniego szkolenia wyświetlone na górnym pasku nawigacyjnym (Rycina 2K).
    2. Otwórz sekcję Home, aby uzyskać dostęp do opisu technicznego i powiązanych informacji referencyjnych.
  2.  Wstępna ocena obrazów lokalnych
    1. Ustal, czy lokalnie generowane obrazy zestandaryzowane mogą być już prawidłowo analizowane przez platformę, w oparciu o kryteria błędów opisane w krokach 1.2.4 i 1.5.2, czy też wymagane jest ponowne przeszkolenie dla lokalnych obrazów zestandaryzowanych (Rycina 1A i 1B).

3. Proste porównanie i trenowanie zewnętrzne z wykorzystaniem lokalnych obrazów

  1. Proste porównanie (Simple Comparison)
    UWAGA: Narzędzia Simple Comparison należy używać do porównywania wyników analizy zautomatyzowanej z lokalnie ustaloną metodą referencyjną, zazwyczaj standardowym liczeniem manualnym13, alternatywnymi tabelami7,11,18 lub modelami5,6. Należy przesłać lokalnie wygenerowane znormalizowane obrazy wraz z odpowiadającymi im wartościami referencyjnymi i typem metody referencyjnej. Wynik obejmuje tabele do pobrania, obrazy oraz raporty w formacie PDF (Tabela 1).
    1. Otwórz panel Simple Comparison z górnego paska nawigacyjnego (Rycina 4A i 4B).
    2. Zapoznaj się z sekcją Wskazówek (Hints) dotyczącą wymaganych właściwości obrazów (Rycina 4C).
    3. Pobierz szablon form.xlsx (Rycina 4D).
    4. Policz wyspy w wielu próbkach, korzystając z lokalnie ustalonej metody referencyjnej.
    5. Pozyskaj znormalizowane obrazy mikroskopowe odpowiadające policzonym próbkom.
    6. Upewnij się, że wszystkie policzone wyspy są w całości zawarte w ramce obrazu.
    7. Wpisz dokładne nazwy plików obrazów i odpowiadające im wartości parametrów do szablonu form.xlsx, używając angielskich kropek dziesiętnych (Rycina 4E).
    8. Prześlij wypełniony arkusz oraz odpowiadające mu pliki obrazów metodą przeciągnij i upuść lub korzystając z przycisków przesyłania (Rycina 4F).
    9. Wybierz tabelę konwersji lub model użyty do szacowania objętości wysp (Rycina 4G).
    10. Kliknij Submit batch, aby wygenerować porównanie zestawione obok siebie.
    11. Zaczekaj na pojawienie się wyników analizy.
    12. Otwórz okno Inspekcji (Inspection), aby przeprowadzić wizualną walidację konturów.
    13. Wyklucz obrazy z analizy, jeśli kontury są niepoprawne (Rycina 3J).
      UWAGA: Ręczna edycja konturów nie jest dostępna w narzędziu Simple Comparison.
    14. Pobierz wyniki w formie tabel, obrazów i raportów PDF (Tabela 1).
  2. Trenowanie IsletNet dla obrazów znormalizowanych lokalnie
    1. Skontaktuj się z zespołem programistycznym w Instytucie Medycyny Eksperymentalnej (IKEM) pod adresem info@isletnet.com.
    2. Udostępnij reprezentatywne obrazy obejmujące zakres jakości obrazów obecnie uzyskiwanych lokalnie.
    3. Omów z zespołem programistycznym wymagania dotyczące jakości obrazu.
      UWAGA: Kluczowe parametry jakości obrazu obejmują wystarczający kontrast, całkowite zawarcie wysp w ramce obrazu oraz minimalne nakładanie się sąsiednich wysp. Kolorystyka wysp może być zróżnicowana od czerwonej do różowej lub fioletowej, pod warunkiem, że odróżnienie od tkanki egzokrynnej pozostaje wyraźne.
    4. Utwórz zestaw obrazów treningowych obejmujący przewidywany zakres czystości wysp, powiększeń i wariacji kolorystycznych.

Interfejs obliczania objętości wysepek, przesyłanie i wprowadzanie parametrów, tabela danych oraz metody konwersji.
Rycina 4. Narzędzie Simple Comparison, pulpit nawigacyjny i przebieg pracy. (A) Górny pasek nawigacji. (B) Pulpit nawigacyjny Simple Comparison. (C) Wskazówki i instrukcje dotyczące przesyłania plików. (D, E) Pobieranie szablonu form.xlsx i wizualizacja przesłanych parametrów. (F) Obszar przesyłania obrazów i arkuszy kalkulacyjnych metodą przeciągnij i upuść. (G) Wybór konwersji rozmiaru wysepki na objętość. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Pobieranie próbek

UWAGA: Wyspy opaczek sedymentują szybko i w stopniu zależnym od ich wielkości i kształtu, co może prowadzić do błędów w wynikach próbkowania.

UWAGA: Wszystkie procedury związane z obchodzeniem się z wyspami należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej.

  1. Do zawiesiny wysepek należy użyć probówek o pojemności 50 mL lub 250 mL.
  2. Należy określić wymaganą frakcję próbkowania na podstawie zaobserwowanej objętości i czystości osadu, zgodnie z lokalnymi standardowymi procedurami operacyjnymi.
  3. Bezpośrednio przed pobraniem próbki należy dokładnie wymieszać zawiesinę wysepek, delikatnie odwracając probówkę pięć razy.
  4. Próbkę należy pobrać niezwłocznie, używając końcówki do pipety o dużej średnicy otworu, aby zapobiec zatykaniu przez tkankę egzokrynną i zminimalizować uszkodzenia wysepek.

5. Optymalizacja akwizycji obrazów wysepek

  1. Przygotowanie ditiizonu
    UWAGA: Spójne barwienie ditiizonem jest niezbędne, aby zapewnić odpowiedni kontrast między wysepkami a tkanką egzokrynną. Poniżej opisano dwie powszechnie stosowane metody przygotowania.
    OSTROŻNIE: Ditiizon jest podejrzewany o działanie toksyczne na rozrodczość. Dimetylosulfoksyd (DMSO) jest toksyczny i przenika przez skórę. Wodorotlenek sodu jest silnie żrący i może powodować ciężkie oparzenia chemiczne. Wszystkie odczynniki należy obsługiwać w odpowiednim osobistym sprzęcie ochronnym, unikając kontaktu ze skórą, a odpady utylizować zgodnie z instytucjonalnymi procedurami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych.
    1. Resuspensja w DMSO13
      1. Odważyć 50 mg proszku ditiizonu.
      2. Rozpuścić ditiizon w 5 mL DMSO.
      3. Inkubować roztwór w temperaturze 37°C i intensywnie mieszać na vortexie przez 1 min co 5 min, aż do całkowitego rozpuszczenia.
      4. Aby przygotować roztwór roboczy, 1 mL roztworu stokowego rozcieńczyć 20 mL zrównoważonego roztworu soli Hank’a zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej.
      5. Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy 0,22 µm.
      6. Owiąć probówkę folią aluminiową, aby chronić roztwór przed światłem.
        ​UWAGA: Roztwór roboczy należy zużyć w ciągu około 12 h.
    2. Resuspensja w alkalicznym roztworze alkoholowym (alternatywa dla Ref. 8)
      1. Odważyć 50 mg proszku ditiizonu.
        UWAGA: W razie potrzeby można wcześniej przygotować alikwoty.
      2. Dodać 800 µL 70% etanolu do ditiizonu.
      3. Dodać 400 µL 1 M roztworu wodorotlenku sodu i dokładnie mieszać na vortexie do całkowitego rozpuszczenia.
      4. Rozcieńczyć roztwór fosforanem buforowanym solą fizjologiczną zawierającą 0,2 mg/mL albuminy ludzkiej do końcowej objętości 20 mL.
      5. Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy 0,22 µm.
      6. Owiąć probówkę folią aluminiową, aby chronić roztwór przed światłem.
        UWAGA: Roztwór roboczy należy zużyć w ciągu około 12 h.
  2. Barwienie wysepek
    1. Nanieść 25 µL roboczego roztworu ditiizonu na środek szalki 35 mm.
    2. Dodać 50 µL wysepek zawieszonych w zrównoważonym roztworze soli Hank’a zawierającym albuminę, pełnej pożywce hodowlanej lub pożywce transplantacyjnej.
      UWAGA: Rzeczywista objętość próbki mieści się w zakresie 20-50 µL w zależności od osadu frakcji czystości, przy końcowym stężeniu ditiizonu od 0,85 mg/mL do 1,37 mg/mL.
    3. Trzykrotnie i powoli pipetować zawiesinę (do pierwszego stopnia), aby delikatnie wymieszać roztwory, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.
    4. Inkubować próbkę w temperaturze 20°C–25°C przez 1–2 min, monitorując wizualnie barwienie pod mikroskopem, aż wysepki staną się jaskrawoczerwone. Niektóre preparaty mogą zawierać słabo zabarwione wysepki, do których program IsletNet jest również wytrenowany.
    5. Za pomocą strzykawki 10 mL szybko wstrzyknąć 4 mL fosforanu buforowanego solą fizjologiczną uzupełnionego o 0,2 mg/mL albuminy bezpośrednio do zabarwionej próbki, unikając pęcherzyków powietrza i rozpryskiwania.
    6. Natychmiast energicznie zakręcić szalką w ruchu okrężnym, aby wymieszać roztwory, przesuwając wysepki w stronę środka przed ich opadnięciem.
      OPCJA 1: Ostrożnie dodać 4 mL PBS/albuminy wokół, pozostawiając wysepki w ditiizonie niezakłócone. Następnie delikatnie zakręcić szalką w ruchu okrężnym, aby wymieszać roztwory, utrzymując wysepki w centrum. Odczekać, aż ditiizon rozprzestrzeni się w szalce.
      OPCJA 2 (odpowiednia dla stereomikroskopu): Zamiast rozcieńczać wysepki, rozprowadzić kroplę ditiizonu z wysepkami w cienką warstwę za pomocą końcówki pipety lub igły, aby zredukować odblaski.
    7. Obejrzeć próbkę pod mikroskopem i natychmiast przywrócić wszelkie przesunięte wysepki do pola widzenia kamery, delikatnie mieszając otaczający roztwór końcówką pipety.
    8. Niezwłocznie rozpocząć akwizycję obrazu, aby zminimalizować cytotoksyczność i zmiany objętości wysepek.
  3. Akwizycja obrazu
    UWAGA: Należy użyć mikroskopu stereo lub odwróconego wyposażonego w obiektyw o małym powiększeniu i stabilne źródło światła. Zasłonić szalkę przed dodatkowymi źródłami światła, np. oświetleniem pomieszczenia.
    1. Włączyć źródło światła i pozwolić żarówce halogenowej rozgrzać się przez 5 min.
    2. Ustawić znormalizowane natężenie światła, aby uniknąć odblasków i niedoświetlenia. Dokładny zakres zależy od użytego sprzętu do obrazowania.
      UWAGA: Optymalne natężenie światła może się różnić w zależności od powiększenia i czystości próbki.
    3. Wybrać obiektyw i ustawienie zoomu, które pozwolą wszystkim wysepkom pozostać w polu widzenia kamery.
    4. Zachować to samo powiększenie dla wszystkich próbek w jednej partii, a najlepiej dla wszystkich partii o różnej czystości.
    5. W razie potrzeby skalibrować balans bieli za pomocą znormalizowanego białego preparatu. Jeśli jakość obrazu pozostaje niezadowalająca ze względu na specyficzne cechy preparatu wysepek, dostosować wartości RGB i/lub ustawienia gamma.
    6. Dostosować czas ekspozycji a w razie potrzeby natężenie oświetlenia lub wzmocnienie (gain), korzystając z histogramu kolorów, aby uniknąć prześwietlenia.
      UWAGA: Próbki zawierające dużo tkanki egzokrynnej mogą wymagać innych ustawień kamery lub oświetlenia ze względu na światło odbite od tkanki niebędącej wysepkami. Aby zapewnić powtarzalność, należy zapisać te parametry w osobnym pliku konfiguracyjnym do późniejszego wykorzystania.
    7. Uchwycić obraz i zapisać plik w obsługiwanym formacie, takim jak JPG, PNG, TIFF lub BMP.
      UWAGA: W nazwie pliku należy zawrzeć datę, frakcję czystości, powiększenie lub rozmiar piksela oraz rozcieńczenie, aby ułatwić późniejszą reanalizę (np. iz260105_H1_obj1.25x_1000x.jpg).
    8. Wykonać obraz mikrometru przedmiotowego przy użyciu identycznych ustawień powiększenia i zoomu, jakich użyto do obrazowania próbki.

6. Narzędzie do klinicznej izolacji wysepek

UWAGA: Kluczowe etapy procesu przedstawiono w podsumowaniu na Rysunku 1C. Analizuj obrazy w partiach frakcji czystości w miarę udostępniania próbek.

  1. Ustawianie rozmiaru piksela
    UWAGA: Obliczona wielkość piksela pozostaje aktualna tylko wtedy, gdy obraz mikrometru przedmiotowego został pozyskany przy zastosowaniu tych samych ustawień powiększenia i zoomu, co w przypadku analizowanych próbek.
    1. Otwórz Kliniczna izolacja wysepek trzustkowych panel sterowania
    2. Kliknij Prześlij mikrometr przedmiotowy i wybierz obraz mikrometru przedmiotowego.
    3. Narysuj końce czerwonej linii pomiarowej wzdłuż znanego dystansu na cyfrowej linijce.
      UWAGA: W celu zwiększenia dokładności pomiaru należy, w miarę możliwości, zastosować większą odległość kalibracji.
    4. Wprowadź znaną odległość w mikrometrach (µm).
    5. Prześlij obliczona wielkość piksela.
      UWAGA: Platforma przechowuje obliczoną wielkość piksela do czasu jej ręcznej zmiany.
  2. Masowe przesyłanie obrazów frakcji czystości
    UWAGA: Należy użyć 3–4 próbek powtórzeń, aby zapewnić wiarygodne obliczenie średniej i odchylenia standardowego dla danej serii. Dla wszystkich próbek w obrębie jednej serii należy zastosować to samo rozcieńczenie.
    1. Przeciągnij i upuść obrazy reprezentujące powtórzenia próbek z tej samej frakcji czystości do obszaru przesyłania.
      UWAGA: Platforma zapobiega wielokrotnemu wykorzystaniu tego samego obrazu na podstawie rozpoznawania nazw plików.
    2. W razie potrzeby zmień rozmiar piksela.
    3. Wprowadź minimalny próg wielkości wysepek.
    4. Wprowadź wartość rozcieńczenia próbki (np. 1000).
    5. Wprowadź objętość osadu w mililitrach, odnotowaną z oryginalnej kolby.
    6. Wprowadź inicjały operatora.
      UWAGA: Inicjały operatora pojawiają się w wygenerowanym raporcie.
    7. Wprowadź identyfikator sesji (Session ID) odpowiadający aktualnej procedurze izolacji.
    8. Wprowadź identyfikator partii (np. 1 High Purity).
      UWAGA: Platforma porządkuje frakcje alfanumerycznie według identyfikatora partii (Batch ID).
    9. Kliknij Prześlij partię aby rozpocząć analizę.
  3. Przegląd i zatwierdzenie wyników partii
    UWAGA: W razie potrzeby zamknij poprzednie okno Batch Results, klikając nagłówek (Rysunek 2L).
    1. Należy poczekać, aż wyniki liczbowe i graficzne pojawią się w sekcji Batch Results. okno
    2. Otwórz okno Inspekcji (Inspection), dwukrotnie klikając podgląd obrazu w oknie Wyników wsadowych (Batch Results).
    3. Należy przejrzeć i w razie potrzeby skorygować kontury zgodnie z opisem w kroku 1.
    4. Jeśli kontury są poprawne, przejdź do następnego obrazu, używając klawisza strzałki w dół.
    5. Dodaj kolejną partię lub przejdź do podsumowania sesji, korzystając z przycisków znajdujących się w dolnej części okna (Rycina 2M).
  4. Edycja zbiorcza
    UWAGA: Platforma przechowuje nazwy plików obrazów przez całą sesję, aby zapobiec przypadkowemu, powtórnemu użyciu tego samego obrazu. Dotyczy to również usuniętych obrazów. W razie potrzeby zmień nazwy obrazów przed ich ponownym wykorzystaniem.
    1. Kliknij Edycja partii aby dodać lub usunąć obrazy, poprawić specyfikacje próbek lub zmienić nazwę serii (Rysunek 2L).
      UWAGA: Przed zmodyfikowaniem partii należy zapisać nazwy plików obrazów, jeśli przewidywane jest ponowne wykorzystanie obrazów.
    2. Kliknij Usuń partię aby całkowicie usunąć partię (Rysunek 2L).
  5. Przeglądanie podsumowania i generowanie raportów
    1. Kliknij Wyświetl podsumowanie aby wyświetlić przegląd sesji (Rycina 2M).
      UWAGA: Wróć do poprzednich partii i edytuj je w razie potrzeby.
    2. Wyświetl całkowitą liczbę wysepek, objętość oraz objętość osadu dla danej sesji wraz z odpowiadającymi im średnimi wartościami dla partii.
  6. Pobierz raport.
    UWAGA: Skrócony raport zawiera całkowitą liczbę wysepek, objętość, czystość, wartości osadu, histogramy oraz podsumowania frakcji czystości. Pełny raport zawiera dodatkowo informacje graficzne dla każdego obrazu próbki, w którym wartości zaakceptowane są wyświetlane na czerwono, a wartości odrzucone na czarno.

Wyniki

Czyste wysepki szczura

W pierwszym eksperymencie, podczas czterech niezależnych sesji obrazowania, pozyskano 36 obrazów reprezentujących 12 próbek zawierających łącznie 249 oczyszczonych wysepek szczura. Obrazy zostały wykonane za pomocą stereomikroskopu w trzech ustandaryzowanych, lecz odmiennych warunkach oświetlenia, z wykorzystaniem halogenowych i diodowych (LED) źródeł światła oraz różnych ustawień kamery. Segmentacje wzorcowe (GT) dla trzech reprezentatywnych obrazów zostały wykonane ręcznie przez eksperta szkolącego IsletNet.

Kiedy obrazy analizowano przy użyciu publicznie dostępnej wersji narzędzia Simple Comparison, żadne z automatycznie wygenerowanych konturów nie przeszło wizualnej kontroli jakości (vQC, Rycina 5F). Następnie platformę przeszkolono ponownie, wykorzystując reprezentatywne obrazy lokalne, i wszystkie kontury wygenerowane przez przeszkoloną wersję eksperymentalną przeszły vQC (Rycina 5C).

Stosunek zautomatyzowanych do manualnych szacunków objętości wysepek wykazał spójną wydajność w trzech warunkach obrazowania po ponownym przeszkoleniu, z wartościami mediany wynoszącymi odpowiednio 1,03, 0,98 i 0,94 dla warunków oświetlenia A, B i C (Rysunek 5A). Wyniki te stanowiły znaczną poprawę w porównaniu z pierwotnym modelem szkoleniowym (Rysunek 5B).

Porównanie na poziomie pojedynczych pikseli z segmentacjami GT wykazało bliską zgodność między konturami generowanymi automatycznie a ręcznie po ponownym przeszkoleniu modelu (Rycina 5D), co odpowiadało dokładnemu rozmieszczeniu konturów na reprezentatywnych obrazach (Rycina 5C). W przeciwieństwie do tego, pierwotny model treningowy wykazał zwiększony odsetek fałszywie negatywnych pikseli (Rycina 5G) oraz błędne rozmieszczenie konturów (Rycina 5F), co skutkowało przesunięciem w stronę mniejszych kategorii wysepek na odpowiadających im histogramach wielkości wysepek (Rycina 5E vs 5H).

Porównanie IsletNet, wykresy pudełkowe i analiza obrazu; schemat przedstawiający dokładność segmentacji wysepek i dane.
Rycina 5. Ocena ponownego uczenia platformy z wykorzystaniem trzech konfiguracji obrazowania i preparatów wysepek szczura. (A) Porównanie szacunków ekwiwalentu wysepek (IEQ) uzyskanych za pomocą IsletNet oraz ręcznie po ponownym uczeniu z wykorzystaniem trzech konfiguracji obrazowania. (B) Porównanie szacunków IsletNet i ręcznych szacunków IEQ z wykorzystaniem oryginalnego publicznego modelu treningowego. (C, F) Reprezentatywne rozmieszczenie konturów przy użyciu narzędzia vQC odpowiednio po i przed ponownym uczeniem modelu. Białe groty strzałek wskazują prawidłowe rozmieszczenie konturów, a purpurowe groty strzałek wskazują nieprawidłowe rozmieszczenie konturów. (D, G) Porównanie piksel po pikselu z prawdą terenową (ground truth) odpowiednio po ponownym uczeniu i z oryginalnym modelem treningowym. Obszary prawdziwie dodatnie, fałszywie dodatnie, fałszywie ujemne i prawdziwie ujemne są wskazane w legendzie. (E, H) Reprezentatywne histogramy wielkości wysepek odpowiednio po ponownym uczeniu i z oryginalnym modelem treningowym w porównaniu z liczeniem ręcznym. Konfiguracja obrazowania 1 = oświetlenie LED; konfiguracja obrazowania 2 = oświetlenie halogenowe; konfiguracja obrazowania 3 = oświetlenie LED w ciemnym polu. Paski skali = 100 µm. Wykresy pudełkowe przedstawiono zgodnie z konwencją Tukeya; wąsy rozciągają się do punktów danych w obrębie 1,5 × rozstępu międzykwartylowego od pierwszego i trzeciego kwartyla. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Kliniczne preparaty wysepek ludzkich

W drugim eksperymencie przeanalizowano 17 obrazów reprezentujących pojedynczą procedurę izolacji wysepek trzustki człowieka z trzema parami frakcji czystości, korzystając z ogólnodostępnej wersji platformy. Jedna próbka została utracona. Po vQC wszystkie obrazy reprezentujące frakcje o średniej i niskiej czystości zostały wykluczone z powodu błędnego wykrywania wysepek (dane nie pokazano). Następnie platformę dotrenowano, wykorzystując reprezentatywne obrazy lokalne.

Po ponownym przeszkoleniu wszystkie obrazy przeszły vQC po dodaniu trzech manualnych linii separacyjnych. Porównanie partiami z liczeniem manualnym wykazało ogólną niedoszacowanie wynoszące ≤5% dla całkowitej liczby wysp oraz szacunków objętości. Próbki rozcieńczone od 2 000 do 4 000 razy zawierały od 80 do 4 wysp, w zależności od frakcji czystości. Względny wkład poszczególnych frakcji czystości do końcowego preparatu przedstawiono na Rysunku 6A. Frakcja o wysokiej czystości 1VC2 dostarczyła przeważnie mniejszych wysp w porównaniu do frakcji o średniej czystości 2SC1. Ogólny histogram wielkości wysp wygenerowany automatycznie przez platformę przedstawiono na Rysunku 6B.

Analiza segmentacji wysepek; wykres słupkowy, wykres rozrzutu i porównanie mikroskopowe z wykorzystaniem IsletNet oraz metod manualnych.
Rycina 6. Kwantyfikacja i analiza próbek izolacji ludzkich wysepek. (A) Szacunki liczby wysepek i objętości równoważnej wysepek z wykorzystaniem IsletNet oraz metod zliczania manualnego w obrębie frakcji czystości pełnego przeszczepu. (B) Końcowy histogram wielkości wysepek wygenerowany przez IsletNet z wykorzystaniem średnich wartości z partii. (C) Porównanie szacunków liczby i objętości uzyskanych za pomocą IsletNet oraz metod manualnych dla 17 poszczególnych obrazów. (D) Reprezentatywny szczegół obrazu z próbki 3NC1 pokazujący obraz oryginalny oraz rozmieszczenie konturów wygenerowane przez douczony model IsletNet. (E) Porównanie piksel po pikselu segmentacji IsletNet z prawdą obiektywną (ground truth) wygenerowaną przez eksperta zliczającego manualnie vs. eksperta trenującego IsletNet (GT1 vs. GT2). Obszary prawdziwie dodatnie, fałszywie dodatnie, fałszywie ujemne i prawdziwie ujemne są wskazane w legendzie. (F) Reprezentatywny histogram wielkości wysepek dla tego samego obrazu, porównujący wyniki IsletNet i wyniki manualne. Purpurowe groty strzałek wskazują przesunięcie konturu i kategorii wielkości wysepek. Paski skali = 100 µm. Wykresy pudełkowe przedstawiono zgodnie z konwencją Tukeya; wąsy sięgają punktów danych w odległości 1,5 × rozstępu międzykwartylowego od pierwszego i trzeciego kwartyla. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Następnie porównano automatyczne i manualne szacunki dla wszystkich poszczególnych obrazów (Ryc. 6C). Mediany stosunków między szacunkami automatycznymi a manualnymi wyniosły 1,00 dla liczby wysp oraz 0,93 dla objętości wysp, przy czym zaobserwowano kilka wartości odstających. W jednej reprezentatywnej próbce o niskiej czystości (3NC1) platforma zidentyfikowała taką samą liczbę wysp jak podczas liczenia manualnego (pięć wysp), ale oszacowała objętość wysp o 29% niższą. Punkty te są zaznaczone grotami strzałek na Ryc. 6C.

Największy wysepek, częściowo uwięziony w tkance egzokrynnej, z tego reprezentatywnego obrazu przedstawiono na Rysunku 6D, wraz z obrazem oryginalnym i automatycznie wygenerowaną nakładką konturową. Porównanie na poziomie pikseli z segmentacjami GT wygenerowanymi niezależnie przez dwóch ekspertów przedstawiono na Rysunku 6E. Odpowiadające im histogramy wielkości wysepków wykazały przesunięcie w rozkładzie wielkości pomiędzy segmentacją manualną a automatyczną (Rysunek 6F).

Wydajność operacyjna analizy zautomatyzowanej

Wydajność operacyjna narzędzi Simple Comparison oraz Clinical Islet Isolation została oceniona w standardowych warunkach internetowych przy średnich prędkościach pobierania i wysyłania danych wynoszących odpowiednio 50 Mbps i 30 Mbps. Przeanalizowano pięć partii obrazów, z których każda zawierała 12 zdjęć o rozmiarach od plików JPEG 0,5 MB do plików TIFF 20 MB. Czas pobierania mierzono dla kompletnych pakietów wyników w formacie ZIP.

Czas wizualizacji analizy oraz czas pobierania danych zwiększały się stopniowo wraz z rozmiarem obrazu w obu narzędziach (Tabela 4). Narzędzie Clinical Islet Isolation wymagało dłuższego czasu przetwarzania niż narzędzie Simple Comparison dla równoważnych zestawów obrazów. Wyniki te obrazują praktyczną zależność między rozdzielczością obrazu, formatem pliku a przepustowością analizy podczas rutynowego działania.

Tabela 4: Czas wizualizacji analizy oraz czas pobierania dla narzędzi Clinical Islet Isolation i Simple Comparison. Porównanie czasów przetwarzania wymaganych do wizualizacji wyników i pobierania plików przy użyciu partii obrazów o różnych rozmiarach i formatach plików. Pomiary uzyskano dla partii zawierających 12 obrazów; wyniki przedstawiono jako czas upływający od przesłania partii do wizualizacji wyników lub zakończenia pobierania. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół opisuje praktyczny przepływ pracy dla potencjalnych i obecnych użytkowników IsletNet, ze szczególnym uwzględnieniem dwóch kluczowych funkcji platformy: ekspertyzowej walidacji jakości i ponownego trenowania sieci neuronowych. Wyniki reprezentatywne pokazują, że dokładne automatyczne ilościowe określenie zależy nie tylko od wydajności segmentacji obrazu, ale także od umiejętności użytkownika do krytycznej oceny umiejscowienia konturów i przydatności obrazu przed zaakceptowaniem wyników. Dwa dodatkowe zaawansowane narzędzia, Porównanie Pixel do Pixel i Moje Segmenatacje, zostały użyte do wygenerowania wybranych wyników walidacji; jednakże, narzędzia te są przeznaczone głównie na wsparcie trenowania sieci neuronowych i dlatego nie są zawarte w przepływie pracy protokołu.

IsletNet został opracowany jako współpracowniczy i powszechnie dostępny narzędzie referencyjne do standaryzowanej analizy obrazów wysp w różnych laboratoriach. Sieć neuronowa została przeszkolona i zweryfikowana przy użyciu ręcznie zaznaczonych segmentacji GT oryginalnych dwuwymiarowych mikroskopowych obrazów izolowanych ludzkich i szczurzych wysp14,15,16. Zostały wygenerowane dwa oddzielne modele dla preparatów zabarwionych ditizonem oraz dodatkowy model badawczy dla niezabarwionych wysp szczurzych, z dostępem dostępnym na żądanie. Wersja platformy i data trenowania są wyświetlane w interfejsie użytkownika. IsletNet automatycznie segmentuje wyspy i tkankę zewnątrzwydzielniczą, a następnie oblicza liczbę, objętość i czystość wysp używając wielkości pikseli określonych przez użytkownika i minimalnej progu wielkości wyspy. Wybór progu wielkości wyspy zależy od jakości obrazu i celu analizy (porównanie bok po boku z ręcznym liczeniem vs. badanie małych wysp) raczej niż od gatunku. Biorąc pod uwagę rozdzielczość konwencjonalnej mikroskopii, znacząca minimalna wielkość wyspy wynosi 50 µm7,8,9,12, ale może być zmniejszona do 10 µm dla obrazów uzyskiwanych z odpowiedniego instrumentu10. Estymacje objętości wysp są generowane przy użyciu standardowej tabeli konwersji opartej na sferze13, jak również alternatywnych tabel konwersji7,18,19, włączając aproksymacje elipsy5,6 oraz modele oparte na konturach Spinacle i Sphiracle17. Wynikowe wartości są raportowane w ekwiwalenta wysp i nanolitrach, podczas gdy czystość jest obliczana na podstawie albo obszaru tkanki albo oszacowanej objętości tkanki. Kluczowym krokiem w protokole jest pozyskiwanie zstandaryzowanych mikroskopowych obrazów nadających się do automatycznej segmentacji. IsletNet został przeszkolony przy użyciu obrazów uzyskiwanych za pomocą mikroskopów stereo i inwertowanych wyposażonych w zakres uzupełniających kamer półprzewodnikowych i systemów iluminacji. Obiektywy o małej powiększeniu (1-2x) są korzystne, ponieważ pozwalają na utrzymanie całej próbki w polu widzenia przy jednoczesnym utrzymaniu wielkości pikseli kompatybilnej z niezawodnym wykrywaniem małych wysp. Stała iluminacja, stabilna biała równowaga i uniknięcie prześwietlenia obrazów są niezbędne do niezawodnego generowania konturów. Wyniki reprezentatywne pokazują, że ponowne trenowanie przy użyciu reprezentatywnych lokalnych obrazów może znacząco poprawić wydajność segmentacji w różnorodnych warunkach obrazowań. Jako praktyczne wytyczne, obrazy są ogólnie nadające się do trenowania IsletNet, kiedy granice wysp i tkanki zewnątrzwydzielniczej są wyraźnie rozróżnialne dla doświadczonego obserwatora. Obrazów zawierających skupione lub mocno nakładające się wyspy należy unikać, jeśli to możliwe.

Protokół podkreśla również kilka ograniczeń i kwestii rozwiązywania problemów związanych z automatyczną analizą obrazów. Podczas gdy IsletNet znacząco zwiększa przepustowość, obiektywność i powtarzalność w porównaniu z całkowicie ręcznym liczeniem, metoda nadal jest wrażliwa na jakość obrazu. Nieprawidłowe umiejscowienie konturów (fałszywe wykrywanie wysp i brak rozdzielenia sąsiednich wysp) może czasami wystąpić i może wpływać na ilościową analizę następczą. Rutynowa vQC nadal jest niezbędna przed zaakceptowaniem automatycznych wyników. Natychmiastowe zastosowanie IsletNet jest korzystne, ponieważ nieodpowiednie obrazy mogą być ponownie pozyskane z dostosowanymi parametrami obrazowań. Ręczne korygowanie automatycznych konturów jest możliwe w oknie Inspekcji, z wyjątkiem brakujących wysp lub wielu fałszywych wysp. Ponadto, automatyczny algorytm rozdzielania jest oparty na geometrii konturu i statystykach rozkładu wielkości wysp i może zatem różnić się od początkowej interpretacji indywidualnego eksperta, podczas gdy wciąż pozostaje analitycznie akceptowalny.

Wiarygodność IsletNet jest określana przede wszystkim przez spójność pomiędzy lokalną jakością obrazu a zbiorem treningowym raczej

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badania przeprowadzono bez żadnych komercyjnych lub finansowych relacji, które mogłyby być uznane za potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Publiczna wersja IsletNet została opracowana i przeszkolona przez Filipa Matznera, Jana Belohlaveka i Adama Blazeka (Iterait a.s., Praga, Czechy). Wersja eksperymentalna została przeszkolona przez Jakuba Monharta, Petrę Curdovą i Jana Kubanta (Mild Blue s.r.o., Praga, Czechy).

Autorzy dziękują poniższym osobom i instytucjom za dostarczenie mikroskopijnych obrazów użytych do szkolenia sieci IsletNet: Andrew Friberg (Department of Immunology, Genetics and Pathology, Uppsala University, Szwecja); Hanne Scholz (Institute for Surgical Research, Oslo University Hospital, Norwegia); Valérie Gmyr (Translational Research in Diabetes, University of Lille, INSERM, Francja); Josh Wilhelm (Schulze Diabetes Institute, University of Minnesota, Minneapolis, USA); Domenico Bosco (Department of Surgery, University of Geneva and Geneva University Hospitals, Szwajcaria); Jason Doppenberg (Department of Internal Medicine, Leiden University Medical Center, Holandia); Karolina Golab (Transplant Institute, Biological Sciences, University of Chicago, USA); Minna Honkanen-Scott (Newcastle University, UK); Hirotake Komatsu (City of Hope, USA); Rebecca Spiers (Oxford University, UK); oraz Zuzana Berkova, Jan Kriz i Peter Girman (Institute for Clinical and Experimental Medicine [IKEM], Praga, Czechy).

Autorzy z wdzięcznością wyrażają również uznanie dla Zuzany Berkovej i Klary Zacharovovej za wsparcie techniczne podczas procedur izolacją wysp trzustkowych u szczurów stosowanych w niniejszym badaniu.

Praca ta była wspierana przez Ministerstwo Zdrowia Republiki Czeskiej (granty nr NU22-01-00141/ NW25-01-00221), przez Narodowy Instytut Badań nad Chorobami Metabolicznymi i Sercowo-Naczyniowymi (Program EXCELES, projekt nr LX22NPO5104), finansowany przez Unię Europejską – Next Generation EU, oraz przez Ministerstwo Zdrowia Republiki Czeskiej – rozwój koncepcyjny organizacji badawczej („Institute for Clinical and Experimental Medicine – IKEM, IN 00023001”).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
35 mm Petri dishesSigma-AldrichP5481Unsterile
200 µL pipette tips, wide-boreSigma-AldrichAXYT205WBCRSFor islet suspension dispensing before staining
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650GC grade or cell culture grade
Dithizone (DTZ)Sigma-AldrichD5130Powder
Ethanol, 70%Local supplierN/A(v/v) in H2O; for DTZ preparation
Fetal bovine serum (FBS)Gibco10270106Heat-inactivated, qualified
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)Sigma-AldrichH6648With or without phenol red (specify based on assay)
Human albuminGrifols61953-0001-2High-concentration solution (200 g/L)
Infinity 1-3CLumenera3-1URCCMOS, 3 MP
Infinity CaptureLumeneraN/AStandard image acquisition software
Inverted microscope CKX41OlympusN/A1.25x and 2x objectives
LED-High-Power-Spots (2-arm)Photonics10068LED light source; dual gooseneck guide
Light source Highlight 2000Olympus5-HL2000Halogen light source (14.5 V, 90 W); manual intensity control; dual gooseneck guide
Laboratory essentialsVariousN/APipettes, tubes, needles, syringes, laboratory timers, standard PPE
MicroCam softwareBresserN/AStandard image acquisition software
MikroCam 3.0MBresser86000180CMOS, 3.1 MP camera
Millex-MP filter unitMilliporeSigmaSLMP025SS0.22 µm pore size, PES membrane
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco10010023pH 7.4
Promicam Pro 3-5 CPPromicamE61MPR937CMOS, 5 MP, high-dynamic-range camera
QuickPHOTOPromicraN/AStandard image acquisition software
Sodium hydroxide (1 M NaOH)Local supplierN/AFor pH adjustment and solubilization during DTZ preparation
Stage micrometerThorlabsR1L3S1P10 mm length; 50 µm divisions for calibration
Stereo microscope SZH10OlympusN/A1x apochromat objective

Bibliografia

  1. Shapiro AMJ, et al. International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. N Engl J Med. 2006;355:1318-30.
  2. Hering BJ, et al. Single-donor, marginal-dose islet transplantation in patients with type 1 diabetes. JAMA. 2005;293:830-5.
  3. Lehmann R, et al. Superiority of small islets in human islet transplantation. Diabetes. 2007;56:594-603.
  4. Latif ZA et al. A simple method of staining fresh and cultured islets. Transplantation. 1988 Apr;45(4):827-30. PMID: 2451869.
  5. Girman P, et al. Digital imaging as a possible approach in evaluation of islet yield. Cell Transplant. 2003;12:129-33.
  6. Niclauss N, et al. Computer-assisted digital image analysis to quantify the mass and purity of isolated human islets before transplantation. Transplantation. 2008;86:1603-9.
  7. Kissler HJ, et al. Validation of methodologies for quantifying isolated human islets: an islet cell resources study. Clin Transplant. 2010;24:236-42.
  8. Friberg AS, et al. Quantification of the islet product: presentation of a standardized current good manufacturing practices compliant system with minimal variability. Transplantation. 2011;91:677-83.
  9. Wang LJ, et al. Application of digital image analysis to determine pancreatic islet mass and purity in clinical islet isolation and transplantation. Cell Transplant. 2015;24:1195-204.
  10. Gmyr V, et al. Automated digital image analysis of islet cell mass using Nikon’s inverted Eclipse Ti microscope and software to improve engraftment may help to advance the therapeutic efficacy and accessibility of islet transplantation across centers. Cell Transplant. 2015;24:1-9.
  11. Buchwald P, et al. Fully automated islet cell counter (ICC) for the assessment of islet mass, purity, and size distribution by digital image analysis. Cell Transplant. 2016;25:1747-61.
  12. Habart D, et al. Automated analysis of microscopic images of isolated pancreatic islets. Cell Transplant. 2016;25:2145-56.
  13. Ricordi C, et al. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 1990;27:185-95.
  14. Ronneberger O, et al. U-Net: convolutional networks for biomedical image segmentation. In: Navab N, et al., editors. Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention – MICCAI 2015. Cham: Springer International Publishing; 2015. p. 234-41.
  15. Sudre CH, et al. Generalised Dice overlap as a deep learning loss function for highly unbalanced segmentations. Lect Notes Comput Sci. 2017;10553:240-8.
  16. Kingma DP, Ba J. Adam: a method for stochastic optimization. arXiv [Preprint]. 2017. Available from: https://doi.org/10.48550/arXiv.1412.6980
  17. Habart D, et al. IsletNet supports accurate volume estimation of isolated pancreatic islets. In: 14th EPITA Symposium Abstract Book; 2025 Jan 26–28; Innsbruck-Igls, Austria. Abstract OP11.
  18. Ricordi C. Quantitative and qualitative standards for islet isolation assessment in humans and large mammals. Pancreas. 1991;6:242-4.
  19. Buchwald P, et al. Quantitative assessment of islet cell products: estimating the accuracy of the existing protocol and accounting for islet size distribution. Cell Transplant. 2009;18:1223-35.
  20. Habart D, et al. IsletSwipe, a mobile platform for expert opinion exchange on islet graft images. Islets. 2023;15:2189873.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

BiologiaWydanie 233Wydanie 233Warto pustaWydanie IsletNet Izolacja wysepek trzustkowych Automatyczna kwantyfikacja Analiza obrazu G bokie uczenie
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.