Metoda kolorymetryczna Anthrone do ilościowego oznaczania glikogenu w wątrobie i mięśniach szkieletowych szczurów

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę kolorymetryczną z użyciem antronu do ilościowego oznaczania glikogenu w wątrobie i mięśniach szkieletowych szczurów w różnych stanach metabolicznych.

Streszczenie

Glikogen jest głównym wewnątrzkomórkowym rezerwuarem glukozy w wątrobie i mięśniach szkieletowych oraz odgrywa fundamentalną rolę w metabolizmie węglowodanów. Glikogen wątroby jest niezbędny do utrzymania ogólnoustrojowej homeostazy glikemii, podczas gdy glikogen mięśni szkieletowych wspiera aktywność fizyczną i wydajność ćwiczeń. Dokładne określenie ilości glikogenu w tkankach jest zatem kluczowe dla badań, w których metabolizm glikogenu jest dynamicznie regulowany lub patologicznie zmieniony. Przedstawiamy tu niezawodną i czułą metodę kolorymetryczną z antronem do ilościowego określania zawartości glikogenu w wątrobie i mięśniach szczurów. Protokół składa się z kolejnych kroków, w tym trawienia alkalicznego, deproteinizacji, opadania glikogenu, płukania alkoholem i wykształcania koloru za pomocą odczynnika antronowego. Zastosowanie tej metody jest demonstrowane na szczurach poddanych trzem fizjologicznie istotnym warunkom: karmieniu ad libitum, kilkugodzinnym poście i krótkotrwałym ponownym karmieniu. Te eksperymentalne paradygmaty uchwytują kluczowe stany metaboliczne związane z magazynowaniem, wyczerpywaniem i ponowną syntezą glikogenu. Ortogonalna analiza Western blot kluczowych enzymów, glikogen syntazy i glikogen fosforylazy, zapewnia wsparcie mechanizmu obserwowanych zmian metabolicznych. Zastosowanie tej metody jest ponadto demonstrowane na zwierzętach traktowanych epinefryną w celu modelowania ostrego stresu indukowanego rozkładem glikogenu. Łącznie, ta metoda zapewnia szeroki zakres dynamiczny i wystarczającą czułość do ilościowego określania glikogenu tkankowego w znacznie różnych stanach fizjologicznych. Oferuje niezawodne narzędzie do badania metabolizmu glikogenu in vivo i może być również zastosowana do in vitro modeli hodowli komórkowych.

Wprowadzenie

Glikogenom jest wysoce rozgałęzionym polisacharydem, który pełni funkcję głównego zbiornika energii w mięśniach szkieletowych i wątrobie ssaków, a w mniejszym stopniu w innych narządach, takich jak mózg, nerki, serce i tkanka tłuszczowa¹. Podczas żywienia, nadwyżka glukozy ulega polimeryzacji lub de novo lipogenezie i jest magazynowana jako glikogen lub lipidy. Jednak podczas postu lub wysiłku fizycznego glikogen ulega enzymatycznemu rozkładowi, zapewniając stałe i szybkie dostarczanie glukozy, aby zaspokoić zapotrzebowanie energetyczne. Ta buforująca zdolność glikogenu jest niezbędna do utrzymania homeostazy glukozy we krwi podczas fizjologicznych cykli postu i ponownego żywienia².

Synteza glikogenu jest katalizowana przez glikogen syntazę (GYS), która występuje w dwóch izoformach u ssaków: GYS1 i GYS2. GYS1 jest wyrażana głównie w mięśniach szkieletowych, podczas gdy GYS2 jest izoformą wątroby. Aktywność katalityczna GYS jest hamowania przez fosforylację w wielu miejscach, w tym w Ser641, w warunkach postu, podczas gdy jej aktywność jest stymulowana po defosforylacji w warunkach karmienia. Rozkład glikogenu jest katalizowany przez glikogen fosforylazę. Izoforma wątroby to PYGL, a izoforma mięśni to PYGM. W przeciwieństwie do GYS, ich aktywność katalityczna jest stymulowana po fosforylacji w Ser15 podczas postu i hamowania po defosforylacji po pokarmie³.

Właściwa regulacja metabolizmu glikogenu jest fundamentalna dla wielu procesów biologicznych, a dysregulacja metabolizmu glikogenu została zidentyfikowana jako czynnik przyczynowy wielu chorób. W szczególności, zaburzony metabolizm glikogenu w wątrobie jest związany z różnymi zaburzeniami metabolicznymi, w tym chorobami spichrzeniowymi glikogenu⁴, cukrzycą typu 2⁵, chorobą wątroby związaną z dysfunkcją metaboliczną i otyłością^6,7 oraz upośledzoną reakcją przeciwdziałania hipoglikemii⁸. Ponadto, glikogen mózgu jest niezbędny dla tworzenia długotrwałych wspomnień⁹, podczas gdy glikogen mięśni szkieletowych jest kluczowym regulatorem zdolności wytrzymałościowych¹⁰. Dlatego dokładne określenie ilości glikogenu w tkankach jest kluczowe dla badań, w których metabolizm glikogenu jest dynamicznie regulowany lub patologicznie zmieniony, umożliwiając badanie mechanizmów chorobowych i ocenę interwencji modyfikujących glikogen.

Zostało zgłoszonych kilka metod ilościowego oznaczania glikogenu, w tym metoda antronowa^11,12, metoda amyloglukozydazowa¹³, metoda fenolowo-siarkowo-kwasowa¹⁴ i nieinwazyjna metoda spektroskopii rezonansu magnetycznego (MRS)¹⁵, przy czym każda metoda ma pewne zalety i ograniczenia. Przedstawiamy szczegółowy protokół metody kolorymetrycznej antronowej do ilościowego oznaczania glikogenu w wątrobie i mięśniach szczurów (Rysunek 1). Ten protokół obejmuje sekwencyjne kroki trawienia zasadowego, deproteinizacji, osadzania glikogenu, płukania alkoholem i tworzenia koloru przy użyciu odczynnika antronowego. Ta metoda jest prosta, ekonomiczna i wymaga minimalnego specjalistycznego sprzętu. Aby wykazać jej czułość i powtarzalność, obliczyliśmy limit wykrywalności (LOD), limit ilościowania (LOQ), a także współczynnik zmienności wewnątrz- i między-testową (CV%), korzystając z serii standardów glikogenu. Aby wykazać jej przydatność, poziomy glikogenu w wątrobie i mięśniach oceniano w trzech fizjologicznie istotnych warunkach: karmienie ad libitum, 16-godzinny post w nocy i krótkotrwała re-feeding. Ponadto, metoda została zademonstrowana na zwierzętach poddanych działaniu adrenaliny, aby zamodelować ostry stres-indukowany rozkład glikogenu. Ortogonalna analiza western blot kluczowych enzymów zaangażowanych w metabolizm glikogenu została przeprowadzona, aby potwierdzić obserwowane zmiany metaboliczne.

Rysunek 1: Przegląd przepływu pracy ilościowego oznaczania glikogenu. Schematyczne przedstawienie przepływu eksperymentalnego do ilościowego oznaczania glikogenu w wątrobie i mięśniach szkieletowych. Procedura obejmuje pobieranie tkanek, trawienie zasadowe, wytrącanie białek, izolację glikogenu i kolorymetryczne wykrywanie oparte na antronie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki nad Zwierzętami i ich Zastosowania (IACUC; #1905019) na Uniwersytecie Medycznym w Nanjing.

1. Przygotowanie reagentów

1. Zobacz Tabelę materiałów dla wszystkich reagentów użytych w tym badaniu.
2. Przygotuj wszystkie roztwory przed rozpoczęciem eksperymentów.
3. Skaluj objętości roztworów według potrzeb.
4. Przygotuj 1 M roztwór wodorotlenku sodu (NaOH)
   1. Waż 40 g pelletów NaOH.
   2. Dodaj pellety NaOH do 800 mL wody destylowanej.
   3. Mieszaj roztwór za pomocą szklanej pałeczki aż do całkowitego rozpuszczenia pelletów na dnie naczynia.
   4. Przelej roztwór do kolby miareczkowej o pojemności 1 L.
   5. Uprowadnij objętość do dokładnie 1 L wodą destylowaną.
   6. Przechowywaj roztwór w szczelnie zamkniętym słoju w temperaturze pokojowej (RT; 18°C–23°C).
      ​OSTRZEŻENIE: NaOH jest żrądźcem. Noś okulary ochronne, rękawiczki i fartuch laboratoryjny. Komercyjne pellety NaOH nie są w 100% czyste i pochłaniają wodę. Unikaj długotrwałego narażenia pelletów na działanie powietrza.
5. Przygotuj 20% roztwór stężony chlorku litu (LiCl)
   1. Waż 20 g bezwodnego proszku LiCl.
   2. Dodaj proszek LiCl do 80 mL wody destylowanej.
   3. Mieszaj roztwór aż do całkowitego rozpuszczenia pelletów na dnie naczynia.
   4. Przelej roztwór do kolby miareczkowej o pojemności 100 mL.
   5. Uprowadnij objętość do dokładnie 100 mL wodą destylowaną.
   6. Przechowywaj roztwór w szczelnie zamkniętym słoju w temperaturze pokojowej.
      ​UWAGA: LiCl może podrażniać skórę, oczy i drogi oddechowe. Noś okulary ochronne, rękawiczki i fartuch laboratoryjny. LiCl jest bardzo higroskopiczny. Minimalizuj narażenie na działanie powietrza, aby zapobiec absorpcji wody.
6. Przygotuj roztwór reakcji antronowej
   1. Włóż 28 mL wody destylowanej do 1 L becherka.
   2. Dodaj 72 mL wysokiej czystości stężonego (98%) kwasu siarkowego (H₂SO₄) do wody.
   3. Pozwól mieszaninie ostygnąć do temperatury pokojowej.
   4. Dodaj 50 mg antronu do roztworu.
   5. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia antronu.
   6. Dodaj 3 g tiomomoczniku do roztworu.
   7. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia tiomooczniku.
   8. Przelej roztwór do bursztynowego lub zawijanego w folię szklanki.
   9. Przechowywaj roztwór w lodówce (2°C–8°C) przez maksymalnie jeden tydzień.
      ​OSTRZEŻENIE: Kwas siarkowy jest bardzo żrący, powoduje poważne chemiczne oparzenia i reaguje gwałtownie z wodą. Noś fartuch laboratoryjny, rękawiczki odporne na chemikalia i osłonę twarzy. Wykonuj wszystkie kroki w zaświadczonym komorze chemicznej. Rozcieńczanie wytwarza intensywne ciepło. Zawsze dodaj kwas do wody.
7. Przygotuj 95% etanol zawierający 0,1% LiCl
   1. Dodaj 95 mL bezwodnego etanolu do szklanki.
   2. Dodaj 4,5 mL wody destylowanej.
   3. Dodaj 0,5 mL 20% stężonego roztworu LiCl.
   4. Mieszaj dokładnie.
8. Przygotuj 80% metanol zawierający 0,1% LiCl
   1. Dodaj 80 mL bezwodnego metanolu do szklanki.
   2. Dodaj 19,5 mL wody destylowanej.
   3. Dodaj 0,5 mL 20% stężonego roztworu LiCl.
   4. Mieszaj dokładnie.
9. Przygotuj 100% (w/v) roztwór kwasu trichlorooctowego (TCA)
   1. Waż 100 g proszku TCA.
   2. Dodaj proszek TCA do 80 mL wody destylowanej.
   3. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.
   4. Przelej roztwór do kolby miareczkowej o pojemności 100 mL.
   5. Uprowadnij objętość do dokładnie 100 mL wodą destylowaną.
   6. Przechowywaj roztwór w szczelnie zamkniętym słoju w temperaturze pokojowej.
10. Przygotuj nasycony roztwór kwasu benzoesowego
    1. Dodaj 0,5 g kryształków kwasu benzoesowego do 100 mL wody destylowanej w 250 mL szkłanym beczerniku.
    2. Podgrzej mieszaninę do 90°C na płycie grzewczej z ciągłym mieszaniem magnetycznym.
    3. Kontynuuj podgrzewanie aż do całkowitego rozpuszczenia wszystkich kryształków na dnie naczynia.
    4. Pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej.
    5. As

Wyniki

Poziomy glikogenu w wątrobie i mięśniach szkieletowych w różnych stanach żywieniowych

Nocne posty znacząco obniżyły poziom glukozy we krwi (średnia ± błąd standardowy średniej [SEM]) z 7,9 ± 0,4 mM u szczurów karmionych ad libitum do 5,4 ± 0,3 mM. Poziom glukozy we krwi został przywrócony do 8,3 ± 0,1 mM po 2 godzinach ponownego karmienia (Rysunek 3D). Zgodnie z tymi zmianami, poziomy glikogenu w wątrobie (średnia ± SEM) wynosiły 45,05 ± ...

Dyskusja

W tym artykule opisujemy zmodyfikowaną metodę kolorymetryczną antronu do ilościowego określania glikogenu w tkankach zwierząt. Oprócz konwencjonalnych kroków sekwencyjnych takich jak pobieranie tkanki, trawienie zasadowe, osadzanie glikogenu, płukanie alkoholem i kolorystyczne wybarwienie na podstawie antronu, wdrożyliśmy krok deproteinizacji, aby zmniejszyć interferencję tła (Rysunek 1). Następnie zastosowaliśmy tę metodę do oceny zmian w zawartości glikogenu w wątrobie i mięśniu prostownik...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1.5 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-15-M	Stosowane do przetwarzania próbek i konfiguracji reakcji
15 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-150-M-S	Stosowane do obsługi lizatu i etapów osadzania
20X TBST	Solarbio Life Sciences	T1082	Bufor do mycia błony w western blot
37 oC Incubator	Shanghai Jinghong Instrument	HWS-150	Inkubacja płytki do pomiaru BCA
50 mL centrifuge tubes	LABGIC	CT-112-50A	Stosowane do trawienia tkanek i ekstrakcji
96-well plate	LABGIC	BS-MP-96W-CL	Pomiar absorbancji na płytce
Analytical balance	Changzhou Xingyun	FA2204N	Waga chemiczna
Anthrone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	A108571	Reagent do kolorymetrycznego wykrywania glikogenu
Anti-GYS1 antibody	Proteintech	10566-1-AP	Wykrywanie syntazy glikogenu 1
Anti-GYS2 antibody	Proteintech	22371-1-AP	Wykrywanie syntazy glikogenu 2
Anti-phospho-GYS1/2 (Ser641) antibody	Cell Signaling Technology	47043S	Wykrywanie fosforylowanego GYS
Anti-phospho-PYGL (Ser15) antibody	Abcam	ab227043	Wykrywanie fosforylowanej glikogenofosforylazy
Anti-PYGL antibody	Proteintech	15851-1-AP	Wykrywanie glikogenofosforylazy wątroby
Anti-PYGM antibody	Novus Biologicals	NBP2-16689	Wykrywanie glikogenofosforylazy mięśniowej
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Ilościowe określenie białek
Benzoic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	B116255	Przygotowanie nasyconej substancji dla standardów
Blunt forcepts	Shanghai Jinzhong	J42010	Szczypce do ściskania palców; rozcinanie tkanek
BSA Fraction V	Beyotime	ST023	Środek blokujący w western blot
Chemiluminescent imager	Tanon	Tanon 5200 Multi	Wykrywanie sygnałów western blot
Chemiluminescent substrate (ECL)	Beyotime	P0018S	Rozwój sygnału w western blot
Distilled water	Beyotime	ST872	Rozpuszczalnik do przygotowania reagentów
Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642	Indukcja rozkładu glikogenu in vivo
Ethanol	Macklin	E809065	Osadzanie i mycie glikogenu
Fine surgical scissors	Shanghai Jinzhong	JA2601	Rozcinanie tkanek
Fresco 17 centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	Centryfugacja próbek
Glucometer	i-SENS	CareSens N	Pomiar poziomu glukozy we krwi
Glucometer	i-SENS	CareSens N	Pomiar poziomu glukozy we krwi z żyły ogonowej
Glucometer strips	i-SENS	CareSens N Strips	Pomiar poziomu glukozy we krwi z żyły ogonowej
Glucose	Macklin	G6172	Przygotowanie krzywej standardowej
Glycogen stock	Beyotime	D0812	Przygotowanie serii standardów glikogenowych
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31462	Wykrywanie przeciwciał pierwotnych
Handheld homogenizer	GreenPrima	PB100	Homogenizacja tkanek
India ink	Sigma-Aldrich	198285	Barwienie białek dla normalizacji
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	Eutanazja zwierząt
Laboratory heating block	Changzhou Guowang	GWJ300-1	Grzenie próbek podczas analiz
Lithium chloride	Macklin	767397	Zwiększa osadzanie glikogenu
Methanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	M116115	Krok mycia glikogenu
Microplate reader	BioTek	ELx800	Pomiar absorbancji na 620 nm
Nitrocellulose membrane	Millipore	HATF04700	Membranę do transferu białka
Orbital shaker	DLAB SCIENTIFIC CO.,LTD	SK-O180-S	Inkubacja substancji chemiluminescencyjnej
P1000 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641100N	Transfer roztworu
P200 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641080N	Usuwanie pozostałej cieczy
Phosphatase inhibitors (PhosSTOP)	Roche	4906845001	Zachowanie fosforylacji białek
Plastic containers (for tissue storage)	Thermo Fisher Scientific	6A0008	Przechowywanie zebranych tkanek
Protease inhibitors cocktail	MCE	HY-K0011	Zapobieganie degradacji białek
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013B	Ekstrakcja białek
SDS-PAGE gel kit	Beyotime	P0012A	Oddzielanie białek
SDS-PAGE loading buffer (6X)	Beyotime	P0015F	Mieszanie próbek białek przed załadowaniem do dołków żelu SDS-PAGE
SDS-PAGE running buffer (5x)	Beyotime	P0014D	Elektroforeza SDS-PAGE
Small Animal Anesthesia Machine	RWD Life Science	R500	Eutanazja zwierząt
Sodium hydroxide	Macklin	S817977	Trawienie tkanek i ekstrakcja glikogenu
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories	Crl: CD(SD)	Model zwierzęcy do eksperymentów
Spray bottle	Beyotime	TB6310	Nakładanie 75% etanolu na futro zwierząt do nawilżenia i dezynfekcji
Standard chow diet	Jiangsu-Xie