Klinicznie istotne modele nowotworów nadających się do przeszczepiania do badania przerzutowego raka jajnika i odpowiedzi terapeutycznej u myszy

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj krok po kroku protokół określający modele nowotworów wewnątrzotrzewnowych i wewnątrzburzowych, aby badać postęp raka jajnika, przerzuty oraz odpowiedź terapeutyczną. Ponadto opisujemy, jak stosować nieinwazyjne obrazowanie in vivo oparte na lucyferazzie w tych modelach do monitorowania postępu guza u myszy.

Streszczenie

Przerzutowy rak jajnika to niezwykle śmiertelny nowotwor ginekologiczny, który nie posiada skutecznych opcji leczenia. Opracowanie klinicznie przekładalnych metod terapeutycznych dla pacjentek z rakiem jajnika zależy od zrozumienia czynników wywołujących przerzuty raka jajnika. Podczas gdy większość guzów litych wykazuje przerzuty hematogenne, komórki raka jajnika rozprzestrzeniają się głównie drogą dootrzewną. Proces ten polega na odłączeniu i usuwaniu komórek nowotworowych z pierwotnego guza do jamy otrzewnej, które następnie zyskują właściwości pozwalające im opierać się anoikis i tworzyć wielokomórkowe agregaty. Agregaty te następnie przyczepiają się do i wnikają do międzybłonowej wyściółki otrzewnej, tworząc zmiany przerzutowe. Klinicznie istotne modele in vivo są niezbędne do zrozumienia, jak czynniki komórkowe i mikrośrodowisko guza wpływają na różne etapy procesu przerzutowego oraz do testowania nowych strategii terapeutycznych. Dwa modele myszy do przeszczepiania szeroko stosowane do badania przerzutów i odpowiedzi terapeutycznej raka jajnika to modele dootrzewnowkowe i intrabursalne. W tym raporcie opisujemy krok po kroku metodologię ustalania tych modeli oraz podkreślamy ich zalety i ograniczenia. Dodatkowo opisujemy, jak stosować obrazowanie bioluminescencyjne do nieinwazyjnego monitorowania progresji guza za pomocą tych modeli.

Wprowadzenie

Pomimo znaczącego postępu w naszym rozumieniu czynników wpływających na postęp raka jajnika, rak jajnika pozostaje drugim najbardziej śmiertelnym nowotworem ginekologicznym w Stanach^{Zjednoczonych1}. Z powodu braku widocznych objawów oraz braku wiarygodnych wczesnych markerów diagnostycznych, ponad 70 procent pacjentek z rakiem jajnika ma zaawansowaną chorobę przerzutową w wieku^{rozpoznania 2,3}. Obecne terapie nie są skuteczne w leczeniu przerzutowego raka jajnika, w związku z czym 5-letnie wskaźniki przeżycia u pacjentów z chorobą w zaawansowanym stadium pozostają poniżej 30^procent. Główną przyczyną braku sukcesów terapeutycznych jest pojawienie się chemiooporności⁵. Dlatego pilnie potrzebne jest zidentyfikowanie czynników napędzających przerzuty i chemiooporność w raku jajnika. Wypełnienie tej luki wiedzy będzie kluczowe dla opracowania skuteczniejszych strategii terapeutycznych ukierunkowanych na tę chorobę. Aby osiągnąć te cele, potrzebujemy modeli in vivo, które wiernie naśladują kluczowe etapy postępu raka jajnika.

Chociaż linie komórkowe raka jajnika oraz trójwymiarowe modele in vitro znacząco przyczyniły się do zrozumienia czynników wpływających na przerzuty i odpowiedź terapeutyczną, modele te mają kilka ograniczeń ^6,7,8. Na przykład modele te nie uwzględniają różnych komórek nienowotworowych będących częścią mikrośrodowiska guza, ani nie rejestrują złożonych interakcji zachodzących w mikrośrodowisku guza ^6,7,8. Ponadto niezwykle trudne jest badanie czynników systemowych i ich wpływu na postęp guza oraz odpowiedź na leki za pomocą modeli in vitro ^6,7,8. Te ograniczenia modeli in vitro podkreślają potrzebę stosowania modeli in vivo, które wiernie naśladują różne etapy przerzutów raka jajnika, w tym złożone interakcje z innymi typami komórek i czynnikami w jego mikrośrodowisku.

Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) oferują platformę in vivo, w której guzy powstają spontanicznie w naturalnym mikrośrodowisku z nienaruszonym układem odpornościowym⁹. Jednak są czasochłonne, wymagające i kosztowne w produkcji i utrzymaniu¹⁰. Większość GEMM raka jajnika ma również długi okres opóźnienia rozwoju guza, co sprawia, że praca z nimi jest czasochłonna i kosztowna, nawet po wygenerowaniu¹⁰ mgieł. Modele do przeszczepów, takie jak modele ksenoprzeszczepu i allograftu, oferują dobrą równowagę między istotnością biologiczną a łatwością eksperymentalną i często są znacznie tańsze w produkcji niż^{GEMMs 11}. Oprócz niższego opóźnienia niż GEMM, łatwość genetycznej modyfikacji komórek nowotworowych in vitro sprawia, że modele te są wygodne i odpowiednie do badania wpływu różnych czynników genetycznych na postęp guza¹⁰. Dzięki tym korzyściom modele nowotworów nadających się do przeszczepu stały się cennymi narzędziami zarówno do badań podstawowych, jak i translacyjnych w raku jajnika.

W niniejszym raporcie opisujemy protokół ustanowienia dwóch różnych modeli myszych guzów do przeszczepów, które są szeroko stosowane do badania przerzutowego raka jajnika: (1) model dootrzewnowkowy oraz (2) model ortotopowy lub wewnątrzbursalny. Oba modele można ustalić jako modele ksenoprzeszczepu lub allotransplantu. W modelu dootrzewnowym komórki nowotworowe są wstrzykiwane do jamy otrzewnej myszy. Wprowadzenie komórek raka jajnika do przestrzeni wewnątrzotrzewnowej odzwierciedla etap przerzutów raka jajnika, w którym przerzutowe komórki raka jajnika są usuwane z pierwotnego guza do jamy otrzewnej. Podobnie jak proces przerzutowy u ludzi, te przeszczepione komórki nowotworowe jajnika będą musiały dostosować się do wrogiego mikrośrodowiska otrzewnej, przyczepić się i napastować warstwę międzybłonową wyściełającą jamę otrzewną oraz tworzyć zmiany przerzutowe na narządach i tkankach wewnątrzotrzewnejowych, takich jak omentum, krezka, wątroba i przepona. W zależności od linii komórkowej nowotworowej użytej do wygenerowania modelu wewnątrzotrzewnego, guzom przerzutowym mogą towarzyszyć wodobrzusza, co jest obserwowane w zaawansowanych stadiach chorób u ludzi. Dlatego model dootrzewnowkowy jest szeroko stosowany do zrozumienia czynników napędzających przerzuty w raka jajnika i ich postęp w zaawansowane stadium choroby¹². Modele te są również przydatne do określenia skuteczności nowych strategii terapeutycznych w leczeniu przerzutowego raka jajnika¹². W modelu intrabursalnym lub ortotopowym komórki nowotworowe są wszczepiane do kaletki, błoniastej struktury otaczającej jajnik myszy. Model ten naśladuje wczesne stadia nowotworów jajnika i przerzutów. Na tym etapie komórki nowotworowe są nadal ograniczone do jajowodu i jajnika. To właśnie z tych miejsc komórki nowotworowe są wyrzucane do jamy otrzewnej, ostatecznie przerzutując do innych narządów. Dlatego model intrabursalny jest przydatny zarówno do badania wczesnych stadiów nowotworów jajnika, jak i zdarzeń prowadzących do późniejszych przerzutów przezkowelomowych przez jamę otrzewną¹².

Tak więc, choć zarówno modele otrzewnej, jak i dookołourkowy są doskonałymi narzędziami do badania przerzutów i odpowiedzi terapeutycznej na raka jajnika, różnią się one konkretnym etapem procesu przerzutowego, który naśladują. Chociaż modele intrabursalne mogą naśladować postęp raka jajnika od wczesnych do późniejszych etapów procesu przerzutowego, ze względu na latencję związaną z tym procesem, są zwykle wykorzystywane do badania wczesnych przerzutów raka jajnika. W badaniach skupiających się na późniejszych stadiach przerzutów raka jajnika bardziej odpowiedni jest model dootrzewnowkowy. Ponadto model intrabursalny jest technicznie trudniejszy do ustalenia w porównaniu do modelu intraperitonealnego¹². Ustanowienie modelu intrabursalnego wymaga dostępu do sali chirurgicznej wyposażonej w mikrochirurgiczny sprzęt, który pozwoli na precyzyjne wstrzykiwanie komórek nowotworowych do kaletki jajnika. Zdolność komórek nowotworowych do tworzenia guzów ("tempo pobierania" lub "tempo przeszczepu") jest również zazwyczaj niższa w modelach intrabursalnych niż w modelach dootrzewnych. Ponadto, ponieważ guzy nie są łatwo obserwowane po podaniu ortotopowych lub wewnątrzotrzewnowych zastrzyków, zazwyczaj stosuje się nieinwazyjną technikę obrazowania bioluminescencyjnego do monitorowania postępu guza. Dlatego zarówno modele dootrzewnowkowe, jak i dookołourkowe wymagają dodatkowego sprzętu umożliwiającego nieinwazyjne obrazowanie guzów¹². Ostatecznie wybór modelu dla każdego badania zdecydują cele eksperymentalne, dostępność zasobów oraz umiejętności techniczne.

Niniejszy raport opisuje krok po kroku protokół ustalania modeli myszego ksenoprzeszczepu wewnątrzotrzewnowego i wewnątrzbursalnego z wykorzystaniem ludzkich linii komórkowych raka jajnika. Modele te można ustanowić poprzez przeszczepienie komórek do immunokompromitowanych szczepów myszy, takich jak NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ) lub Foxn1 nago (B6). Cg-Foxn1 nu/J). Ta sama metoda może być dostosowana do generowania modeli przeszczepów (syngeneicznych). Podczas tworzenia modeli alloczowych komórki nowotworowe jajnika myszy są wszczepiane do immunokompetentnych myszy o tym samym tle genetycznym. Ponieważ modele allotransplanttu są opracowywane z użyciem immunokompetentnych myszy, są one przydatne do badania, jak różne czynniki regulują mikrośrodowisko guza jajnika, rolę układu odpornościowego w postępie raka jajnika oraz skuteczność immunoterapii. Oprócz ustalenia modeli myszy z ksenograftem wewnątrzotrzewnowkowym i wewnątrzbursalnym, raport ten opisuje również, jak wykorzystać obrazowanie bioluminescencyjne do nieinwazyjnego monitorowania progresji guza w tych modelach.

Protokół

Wszystkie procedury zwierzęce opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC) na Uniwersytecie Maryland w hrabstwie Baltimore (główny badacz - Achuth Padmanabhan; Numer protokołu – 1947). Pełna lista materiałów i sprzętu używanego w tym protokole oraz ich numery katalogowe znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie linii komórek raka jajnika do przeszczepu u myszy

Uwaga: Dla wszystkich opisanych w tym protokole modeli in vivo komórki nowotworowe jajnika powinny być przygotowane do przeszczepienia do myszy. Komórki raka jajnika powinny być przygotowywane w laminarnym przepływie do hodowli tkankowej, opisanej poniżej, w temperaturze pokojowej, chyba że jest to zaznaczone:

1. Hodować komórki raka jajnika w temperaturze 37 ^°C w inkubatorze_CO2 z wodną płaszczyczką, utrzymywanym na poziomie 5%_CO2 , używając standardowych mediów zgodnie z zaleceniami w literaturze. Jeśli pożądane jest nieinwazyjne obrazowanie in vivo guza, komórki nowotworowe jajnika muszą zostać zaprojektowane tak, aby stabilnie ekspresywały lucyferazę przed przeszczepem.
2. Gdy komórki osiągną około 80%–85% konfluentności, pobieraj je w warunkach sterylnych, jak opisano poniżej:
   1. Aspiruj podłoże z płytki do hodowli tkanek.
   2. Dwukrotnie myj komórki przylegające sterylną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) bez wapnia i magnezu. Obecność wapnia i magnezu w PBS może zakłócać aktywność trypsyny i sprzyjać przyczepności komórek. Aspiruj PBS z płytki do hodowli tkanek.
   3. Dodaj 0,05% trypsyny-EDTA do płytki hodowli tkankowej. Ilość trypsyny, którą należy zastosować, zależy od wielkości płytki do hodowli tkankowej oraz linii komórkowej, nad którą się pracuje. Dla większości linii komórkowych rosnących na płycie 100 mm użyj 1 mL 0,05% trypsyny-EDTA. Dla silnie przylegających linii komórek raka jajnika, takich jak OVCA420, zaleca się 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA.
   4. Przenieś płytkę z komórkami z powrotem do inkubatora_CO2 z wodą w kształcie 37 ^°C, używanego do hodowli tkanek, i inkubuj przez 1–5 minut. Dokładny czas inkubacji zależy od linii komórkowej. Niektóre linie komórkowe, takie jak TYK-Nu i HEYA8, odłączają się bardzo szybko (1–2 min), podczas gdy inne, jak OVCA420, potrzebują więcej czasu (4–5 min).
   5. Po odłączeniu komórek dodaj podłoże zawierające FBS, aby zatrzymać działanie trypsyny. Dodaj 6 mL nośników zawierających FBS na 1 mL trypsyny. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby usunąć komórki z płytki hodowli tkankowej i rozłożyć je na zawiesinę pojedynczą.
      Uwaga: Pod mikroskopem odwróconym w jasnym polu odłączone komórki będą wyglądać zaokrąglone (zamiast płaskie/wydłużone) i unoszą się swobodnie, zamiast być przyklejone do dolnej części płytki.
   6. Zbierz komórki do stożkowej rurki i wiruj w 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Usuń supernatant zawierający trypsynę i ponownie zawiesij osad komórkowy w świeżym nośniku hodowlanym zawierającym FBS.
3. Policz komórki za pomocą barwnika żywotnościowego, takiego jak trypanowy niebieski, oraz hemocytometru. Alternatywnie, do liczenia komórek można użyć automatycznego licznika komórek.
4. Rekonfunduj komórki w określonej objętości bezpłodnego 1X PBS (pH 7,4), tak aby osiągnąć pożądane stężenie komórek na jednostkę objętości. Zalecana liczba komórek do wstrzykiwania w powszechnie stosowanych liniach komórek raka jajnika u ludzi przedstawiona jest w Tabeli 1¹³.
   Uwaga: Maksymalna objętość, którą można bezpiecznie wstrzyknąć do myszy, zależy od modelu. Dla modelu wewnątrzotrzewnego maksymalna zalecana objętość wynosi 500 μL (patrz sekcja 2.1). W modelu intrabursalnym maksymalna zalecana objętość wynosi 5 μL (patrz sekcja 2.2).
5. Trzymaj zawiesinę komórkową na lodzie aż do momentu wstrzyknięcia jej myszom. Wstrzyknij komórki myszom tak szybko, jak to możliwe, najlepiej w ciągu 30–45 minut od przygotowania komórek.

2. Ustanowienie modeli raka jajnika podlegających przeszczepom u myszy

1. Ustanowienie modelu raka jajnika wewnątrzotrzewnowego
   Uwaga: W tym procesie komórki nowotworowe jajnika stabilnie wyrażające lucyferazę są wstrzykiwane do jamy otrzewnej dorosłej samicy myszy. Wykorzystanie komórek stabilnie ekspresjonujących lucyferazę umożliwi podłużne, nieinwazyjne monitorowanie postępu guza za pomocą systemu obrazowania in vivo (IVIS).
   1. Przygotuj komórki zgodnie z opisem w sekcji 1. Delikatnie zawiesz komórki za pomocą mikropipety 1000 μL i upewnij się, że komórki pozostaną rozłączone.
      Uwaga: Brak usunięcia grudek spowoduje zatykanie się igieł.
   2. Nabierz 500 μL zawiesiny komórkowej do strzykawki o pojemności 1 mL i podłącz igłę o wymiarach 21G x 1 cal. Upewnij się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.
      Uwaga: Maksymalna objętość, którą można podać dookołootrzewnej dorosłej samicy myszy (25–30 g), wynosi 500 μL. Dlatego należy ponownie zawieszać komórki w objętości takiej, że wymagana liczba komórek mieści się w maksymalnej objętości 500 μL. Zalecana liczba komórek do wstrzykiwania w powszechnie stosowanych liniach komórek raka jajnika u ludzi przedstawiona jest w Tabeli 1¹³.
      Uwaga: Jeśli mysz waży od 20 do 25 g, zaleca się wstrzyknięcie mniejszej objętości (mniej niż 400 μL).
   3. Wyjmij zwierzę z klatki i połóż je na szorstkiej lub drutowej powierzchni, aby je unieruchomić.
   4. Unieruchom mysz, delikatnie łapiąc luźną skórę u nasady szyi ręką niedominującą, jak pokazano na rysunku 1A.
   5. Delikatnie podnieś mysz i obróć ją tak, aby jej brzuszna strona była skierowana do góry. Zabezpiecz ogon zwierzęcia palcami, jak pokazano na Rysunku 1B.
   6. Narysuj wyimaginowaną linię na środku brzucha. Aby zlokalizować miejsce wstrzyknięcia, wyobraź sobie trójkąt między linią środkową a dwoma sutkami w prawym dolnym kwadrancie. Upewnij się, że miejsce wstrzyknięcia znajduje się w środku tego wyimaginowanego trójkąta. Zobacz Rysunek 1B.
   7. Przechyl głowę myszy lekko w stronę ziemi, by była niżej niż tylna część. Unieruchomienie myszy w tej pozycji pomaga przesunąć zawartość brzucha w czaszkę. Zmniejsza to ryzyko przebicia narządów wewnętrznych podczas wstrzyknięcia.
   8. Użyj wymazu ze sterylnym alkoholem, aby oczyścić miejsce wstrzyku.
   9. Używając ręki dominującej, wprowadź igłę w miejsce wkłucia pod kątem 45° lub niżej. Przesuwaj tylko o 0,5 cala i nie więcej niż połowę długości drutu. Upewnij się, że igła pozostaje stabilna, ponieważ ruch w jamie brzusznej może spowodować uszkodzenie narządów wewnętrznych.
   10. Rozprowadzaj komórki powoli i równomiernie do jamy brzusznej myszy.
   11. Wyciągnij igłę z myszy pod tym samym kątem włożenia. Natychmiast umieść sterylny manometr nad miejscem wstrzyknięcia, aby zapobiec wyciekowi.
   12. Utyluj igłę i strzykawkę w odpowiednim pojemniku na ostre przedmioty.
   13. Przed umieszczeniem myszy w klatce należy ją oznaczać uchem w preferowaną metodę. Znakowanie uszu pozwoli później zidentyfikować wstrzykniętą mysz.
2. Ustanowienie modelu śródburzowego raka jajnika
   Uwaga: W modelu śródburzowym komórki nowotworowe jajnika, które stabilnie ekspresują lucyferazę, są wstrzykiwane bezpośrednio do kaletki jajnika dorosłej samicy myszy. Karsa to błoniasty worek otaczający jajniki myszy. Stabilna ekspresja lucyferazy w komórkach nowotworowych jajnika pozwoli na nieinwazyjne, podłużne monitorowanie postępu guza za pomocą IVIS.
   1. Dzień 1 – Przygotowanie sprzętu i myszy do operacji przeszczepu wewnątrz burzy
      1. Autoklawuj narzędzia potrzebne do operacji. Lista instrumentów przedstawia się (Rysunek 2A):
         Nożyczki z cienkim końcówką, 5-calowe zakrzywione kleszcze cienkopunktowe, uchwyt na igły Mayo-Heger, mikrokleszcze do rozcinania jubilerów, drobna końcówka, Instrumenty do rozcinania kleszczy z cienkimi końcówkami
      2. Podawaj przedoperacyjne środki przeciwbólowe karprofenu (15 mg/kg) co 24 godziny poprzez podskórne zastrzyki myszy.
         Uwaga: Podawaj karprofen przeciwbólowy podskórnie co 24 godziny, zaczynając 1 dzień przed operacją i kontynuując przez 3 dni po zabiegu.
   2. Dzień 2 – Przeszczep wewnątrzburzowy komórek nowotworowych jajnika u myszy
      1. Przygotuj komórki raka jajnika do zastrzyków, jak opisano w sekcji I. Maksymalna objętość, którą można bezpiecznie wstrzyknąć dośródburzkowo u myszy, wynosi 5 μL. Dlatego lepiej mieć komórki w stężeniu 10⁴ komórek/μL. Pozwoli to na przeszczepienie 5 x 10^{4 komórek} .
         Uwaga: Zalecana liczba komórek do wstrzykiwania w powszechnie stosowanych liniach komórek raka jajnika u człowieka przedstawiona jest w Tabeli 1¹³.
      2. Trzymaj komórki na lodzie do czasu użycia. Po pobraniu zaleca się jak najszybsze wstrzykiwanie komórek, najlepiej w ciągu 30–45 minut.
      3. Wprowadź znieczulenie, umieszczając mysz w komorze izofluranowej o przepływie izofluranu 4 procent i przepływie tlenu 3,5 L/min. Potwierdź, że mysz jest znieczulona, sprawdzając unieruchomienie i brak odruchu szczypania palców.
      4. Przenieś znieczuloną mysz na sterylną zasłonę chirurgiczną, która jest umieszczona na grzewcy gryzoni utrzymywanej w temperaturze 37 °C. Szybko załóż stożek nosowy i utrzymuj znieczulenie z 1,5% izofluranu i 98,5% tlenu. Upewnij się, że mysz jest znieczulona, potwierdzając brak odruchu szczypania palców.
      5. Upewnij się, że mysz pozostaje znieczulona przez cały zabieg, potwierdzając brak odruchu szczypania palców co 15 minut. Monitoruj tempo oddychania myszy podczas znieczulenia, aby upewnić się, że jest powolne i płynne. Jeśli tempo oddechu się zmieni, dostosuj dawkę izofluranu. Jeśli mysz wykazuje ciężkie oddychanie lub łapanie powietrza, należy zmniejszyć dawkę. Natomiast jeśli mysz wykazuje zwiększoną częstość oddychania, nieznacznie zwiększyć dawkę izofluranu.
         Uwaga: Unikaj trzymania myszy pod znieczuleniem dłużej niż 40 minut. Aby to osiągnąć, ważne jest, aby być efektywnym i szybkim podczas zabiegu chirurgicznego.
      6. Ustaw mysz tak, aby strona komórek raka jajnika była przeszczepiana dośrodkowo, skierowana do góry, jak pokazano na Rysunku 2B.
      7. Nałóż maść na oba oczy myszy, aby chronić je przed wysuszeniem (wysuszeniem rogówki).
      8. Jeśli mysz ma futro, ogol włosy na dolnej połowie po stronie skierowanej do góry. Dokładnie wyczyść ogolony obszar i połóż mysz na nowej, sterylnej podkładce. Jeśli pracuję z nagą Foxn1 (B6. Cg-Foxn1 nu/J) przeciąganie myszy, pomiń ten krok.
      9. Użyj sterylnej chirurgicznej zasłony, aby przykryć mysz tak, aby odsłonić tylko dolną połowę ciała myszy.
      10. Przed rozpoczęciem operacji dokładnie umyj ręce mydłem i załóż świeże sterylne rękawice chirurgiczne. Unikaj dotykania niesterylnych miejsc lub przedmiotów po założeniu rękawiczek chirurgicznych.
      11. Użyj sterylnego aplikatora bawełnianego do nakładania płynu betadynowego na miejscu operacji ruchem zgodnym z ruchem wskazówek zegara od środka na zewnątrz. Następnie użyj sterylnego wymazu alkoholowego, aby oczyścić ten sam obszar w podobny sposób. Powtórz tę procedurę jeszcze dwa razy.
          Uwaga: Nie dotykaj niesterylnych przedmiotów ani miejsc podczas zabiegu chirurgicznego. Rękawiczki natychmiast wymień, jeśli nastąpi kontakt z powierzchnią niesterylną. Zaleca się, aby podczas wykonywania iniekcji wewnątrz płatności pomogła jeszcze jedna osoba. Taka osoba może pomóc w obsłudze niesterylnych przedmiotów podczas operacji.
      12. Poczekaj minutę, aż alkohol wyschnie.
      13. Zlokalizuj miejsce położone około 1,5 cm nad tylną nogą i 5 mm od klatki piersiowej myszy, jak pokazano na Rysunku 2B. Podnieś skórę w tym miejscu zakrzywionymi kleszczemi, a następnie wykonaj pionowe nacięcie o szerokości 5 mm nożyczkami o cienkim końcówce.
          Uwaga: Przed wykonaniem nacięcia upewnij się, że mysz jest całkowicie pod wpływem znieczulenia, potwierdzając brak odruchu szczypania palców.
      14. Trzymaj skórę po jednej stronie mikrokleszczemi o cienkiej końcówce i wykonaj nacięcie w tkance podskórnej w tym samym miejscu.
      15. W tym momencie warstwa otrzewna pod tkanką podskórną stanie się widoczna. Użyj cienkokońcowych, zakrzywionych, ząbkowanych kleszczy do utrzymania warstwy otrzewnej i wykonaj nacięcie o długości około 2,5 mm nożyczkami z cienkim końcówką.
      16. Trzymaj bok płata nacięcia otrzewnego ząbkowatymi kleszczemi i zlokalizuj poduszkę tłuszczową jajnika za pomocą cienkich kleszczy. Jajnik znajduje się pod poduszką tłuszczową.
      17. Delikatnie wyciągnij trochę poduszki tłuszczowej jajnika wraz z jajnikiem przez nacięcie.
      18. Użyj kleszczy do rozcinania, aby utrzymać poduszkę tłuszczową tak, aby jajnik był skierowany do góry i był nieruchomy.
          Uwaga: Nie trzymaj jajnika kleszczami. Zawsze używaj ząbkowanych kleszczy do trzymania poduszki tłuszczowej, ponieważ tkanka jest śliska.
      19. Poproś osobę pomagającą, aby przygotowała strzykawkę z zawiesiną komórkową. Zaleca się używanie strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 mL.
      20. Delikatnie włóż igłę z fazą skierowaną do góry do kaletki jajnika od styku jajowodu i jajnika. Upewnij się, że cała faza wejdzie do środka kaletki, zanim naciskasz na tłok.
          Uwaga: Uważaj, aby nie przebić kaletki na przeciwległym końcu miejsca wszczepienia.
      21. Delikatnie naciśnij tłok i przelej zawartość strzykawki do kaletki jajnika. Szybko usuń igłę.
      22. Obrzęk kaletki otaczającej jajnik wskazuje na pomyślne zaszczepienie komórek.
      23. Poczekaj 5 sekund i delikatnie włóż jajnik z powrotem do jamy otrzewnej.
      24. Zamknąć otrzewną za pomocą wchłaniającego się szwu monofilamentowego 6-0 z jednym lub dwoma prostymi przerwanymi szwami chirurgicznymi.
      25. Zamknąć nacięcie skóry za pomocą wchłaniającego się szwu monofilamentowego 6-0 za pomocą prostego chirurgicznego stehu chirurgicznego biegającego. Upewnij się, że nie ma krwawienia z miejsca nacięcia.
      26. Po zamknięciu nałóż potrójną maść antybiotykową (Bacitracin, Neomycyna i Polimyksyna B) w miejscu nacięcia.
      27. Podaj myszy karprofen 15 mg/kg podskórnie dla złagodzenia bólu.
      28. Oznacz mysz uchem preferowaną metodą. Znakowanie uszu pozwoli później zidentyfikować wstrzykniętą mysz.
      29. Przenieś mysz do nowej klatki. Umieść tę klatkę z połową na podkładce grzewczo na co najmniej 60 minut. Upewnij się, że działanie znieczulenia całkowicie minęło do tego czasu, a mysz jest obudzona i aktywna.
          Uwaga: Myszy są podatne na hipotermię pod narkozą. Dlatego ważne jest, aby zapewnić zewnętrzne ciepło w celu regulacji temperatury ciała.
      30. Sprawdź myszy po 4-5 godzinach po operacji pod kątem oznak krwawienia z miejsca nacięcia lub innych dyskomfortów.
      31. Podawaj myszom karprofen 15 mg/kg podskórnie co 24 godziny przez kolejne 3 dni.
      32. Jeśli zaszczepione komórki są genetycznie modyfikowane do stabilnej ekspresji lucyferazy, obciążenie guzemotworem można zmierzyć za pomocą IVIS od pierwszego dnia po podaniu iniekcji, jak opisano w sekcji 3.

3. Nieinwazyjne obrazowanie guza myszy z użyciem systemu obrazowania in vivo (IVIS)

Ważnym celem w kilku badaniach z wykorzystaniem modeli nowotworów do przeszczepiania opisanych w tym raporcie jest uzyskanie danych podłużnych dotyczących postępu guza. Chociaż objętość guzów podskórnych można oszacować za pomocą zacisku werniera, nie jest to realna opcja dla guzów powstałych przy użyciu modeli wewnątrzotrzewnkowych i wewnątrzburzowych. Aby pokonać to wyzwanie i określić obciążenie guza wewnątrzotrzewnego, większość laboratoriów stosuje nieinwazyjne obrazowanie bioluminescencyjne oparte na lucyferazie. Aby to umożliwić, przeszczepione komórki nowotworowe są projektowane tak, aby stabilnie ekspresyjnie wyrażały lucyferazę, która powoduje bioluminescencję po podaniu substratu, D-lucyferyny. Bioluminescencja jest wykrywana nieinwazyjnie za pomocą systemu obrazowania in vivo (IVIS). Ten sygnał jest następnie ilościowy, aby śledzić obciążenie nowotworami i ujawniać informacje o przerzutach oraz skuteczności terapii leków. Poniżej opisujemy protokół monitorowania obciążenia guza za pomocą lucyferazowego, nieinwazyjnego obrazowania bioluminescencyjnego za pomocą IVIS u myszy.

1. Przygotowanie substratu z D-lucyferyny
   1. Przygotuj roztwór D-lucyferyny 15 mg/mL w 1X PBS (pH 7,4) w warunkach sterylnych.
   2. Roztwór sterylizuj filtrem filtrem 0,22 μm.
   3. Owiń roztwór folią aluminiową, aby chronić go przed światłem do czasu użycia.
2. Inicjalizacja obrazownika IVIS do akwizycji obrazu
   1. Otwórz oprogramowanie "living Image" na komputerze podłączonym do IVIS i zaloguj się.
   2. Obrazowanie musi być inicjalizowane do akwizycji obrazu. Robi się to następująco:
      1. Po zalogowaniu otworzy się okno panelu sterowania IVIS, jak pokazano na rysunku 3A.
      2. Kliknij przycisk "inicjalizuj" znajdujący się po prawej dolnej stronie okna (rysunek 3A). System zainicjalizuje się po kilku minutach.
         Uwaga: Początkowo pasek temperatury na dole okna zmienia się na czerwony, co oznacza, że kamera obrazująca jest w trakcie osiągania docelowej temperatury -90 °C (Rysunek 3B).
      3. Gdy kamera obrazująca osiągnie docelową temperaturę (-90 °C), pasek temperatury zmieni się na zielony, a status systemu będzie oznaczony jako "Gotowy do użycia" (Rysunek 3C). Teraz obrazownik jest gotowy do obrazowania myszy.
         Uwaga: czas ekspozycji, binning oraz f/stop można dostosować do wymagań użytkownika.
3. Przygotowanie myszy do obrazowania IVIS
   Przed zobrazowaniem myszy D-lucyferyna musi być wstrzyknięta dootrzewnowkowa.
   1. Wyjmij mysz z klatki i połóż ją na szorstkiej lub drutowej powierzchni. Delikatnie stuknij myszy za kark, aby odpowiednio je unieruchomić, jak opisano w sekcji 2.1.
   2. Podnieś mysz i obróć ją tak, by jej brzuszna strona była skierowana do góry.
      Uwaga: Jeśli mysz jest prawidłowo unieruchomiona, wszystkie cztery nogi wysuwają się na zewnątrz podczas podnoszenia, jak pokazano na Rysunku 1B. Trzymaj jego ogon między palcami jako dodatkowy mechanizm unieruchamiania podczas zabiegu.
   3. Użyj wymazu z alkoholem sterylnym do oczyszczenia miejsca wstrzyknięcia, zgodnie z protokołem iniekcji wewnątrzotrzewnowej w sekcji 2.1.
   4. Użyj strzykawki TB o pojemności 1 ml oraz igły 30 G, 1/2 cala, aby wewnątrzotrzewno wstrzyknąć odpowiednią ilość D-lucyferyny z roztworu zapasowego, aby uzyskać ostateczną dawkę 150 mg/kg D-lucyferyny.
      Uwaga: Zapoznaj się z protokołem iniekcji wewnątrzotrzewnowej w sekcji 2.1, aby uzyskać instrukcje dotyczące przeprowadzenia iniekcji wewnątrzotrzewnejowej. Jeśli używamy myszy C57BL/6 (dla modeli allograftu syngenicznego), zdecydowanie zaleca się usunięcie sierści przed wykonaniem obrazowania bioluminescencyjnego za pomocą IVIS. Czarne futro i pigmentowana skóra znacznie tłumią światło, zmniejszając intensywność sygnału.
   5. Delikatnie włóż mysz z powrotem do klatki. Dokładny czas oczekiwania i ekspozycji będzie musiał zostać empirycznie określony. Można to określić w następujący sposób.
      1. Znieczulaj mysz natychmiast po wstrzyknięciu D-lucyferyny i obrazuj ją zgodnie z Sekcją 3.4 co 2 minuty przez 20 minut.
         Uwaga: Podczas pierwszego przeprowadzania tego eksperymentu zaleca się określenie, jak sygnał lucyferazy zmienia się w czasie po podaniu D-lucyferyny. To pomoże określić najbardziej odpowiedni moment na zdjęcie myszy po podaniu D-lucyferyny w kolejnych eksperymentach. Sygnał bioluminescencyjny może się różnić w zależności od kilku czynników, w tym linii komórkowej, modelu ksenotransplanttu myszy, poziomu ekspresji lucyferazy itp.
      2. W każdym odstępie czasu zrób ekspoury po 5, 10 i 15 sekund.
      3. Wykorzystaj te dane do narysowania standardowej krzywej. Na podstawie krzywej wybierz czas oczekiwania i ekspozycji, przy którym sygnał osiąga plateau, zachowując przy tym najwyższą intensywność.
         Uwaga: Zazwyczaj ten czas trwa od 5 do 10 minut, ale może się różnić w zależności od modelu.
4. Nieinwazyjne obrazowanie guzów myszy za pomocą IVIS
   1. Po okresie oczekiwania umieść mysz w komorze izofluranowej o przepływie izofluranu 4% i przepływie tlenu 3,5%.
   2. Potwierdź, że mysz jest znieczulona, sprawdzając brak odruchu szczypania palców.
   3. Umieść mysz na scenie wewnątrz obrazownika IVIS i wsuń jej nos do stożka nosa w celu utrzymania znieczulenia podczas obrazowania. Upewnij się, że pozostają w wyznaczonych liniach ostrości aparatu i zamknij drzwi obrazowca.
      Uwaga: Wewnątrz obrazowca na scenie będzie pięć pozycji. Każda pozycja będzie miała także swoje charakterystyczne czopki nosowe do znieczulenia. Pozwala to na jednoczesne obrazowanie 5 myszy. W zależności od liczby myszy do zdjęcia, zmień pole widzenia aparatu w panelu sterowania z "D" (szersze pole) na "A" (wąskie ostrzenie). Mysz można umieścić w dowolnym miejscu na scenie, pod warunkiem, że nosy pozostają wewnątrz stożków znieczulających przez cały czas trwania obrazowania. Zaleca się zdjęcie myszy kolejno najpierw po stronie grzbietowej, a następnie po brzusznej.
   4. Dostosuj czas ekspozycji i kliknij "Uzyskaj" na panelu sterowania (rysunek 3C).
      Uwaga: Upewnij się, że luminescencja, zdjęcia i nakładka są "WŁĄCZONE" w panelu sterowania.
      Po zrobieniu obrazu na ekranie pojawi się obraz myszy z sygnałem lucyferazy.
   5. Otwórz obrazownik i obróć myszkę tak, aby strona brzuszna była skierowana do góry, a po zamknięciu drzwi obrazownika kliknij "Zdobyć".
      Uwaga: Upewnij się, że nos myszy znajduje się wewnątrz stożka nosa, aby zapewnić utrzymanie znieczulenia podczas obrazowania.
   6. Gdy zostaną uzyskane zarówno obrazy grzbietowe, jak i brzuszne, otwórz drzwi obrazującej i umieść mysz z powrotem w klatce.
   7. Poczekaj 5-10 minut, aby mysz odzyskała przytomność.
5. Analiza obrazu IVIS w celu określenia obciążenia guzem u myszy
   1. Regulacja skali kolorów obrazów
      1. Zapisz obrazy RAW do odpowiedniego folderu, klikając "file" i "Save as".
         Uwaga: Obrazownik automatycznie dostosowuje skalę kolorów w zależności od natężenia sygnału. Zaleca się utrzymywanie stałej skali kolorów na wszystkich zdjęciach wykonanych w trakcie eksperymentu. Skalę kolorów można również później regulować, otwierając obraz raw za pomocą tego oprogramowania.
      2. Do ręcznej regulacji w prawym górnym rogu ekranu (Rysunek 3D) pojawia się kolejne okno palety narzędzi, przejdź do "Image adjust" i wybierz "manual" dla skalowania. Wprowadź minimalną i maksymalną wartość dla wartości skali i kliknij "Enter" (rysunek 3E).
         Uwaga: Podczas regulacji skali kolorów wcześniej pobranego obrazu, najpierw otwórz zapisany plik raw infoclick.txt z odpowiedniego folderu, używając "file", a następnie "open".
         3.5.1.3. Zapisz ten obraz osobno od obrazu raw w odpowiednim folderze.
   2. Analiza obciążenia guzami u myszy
      Uwaga: Do ilościowego pomiaru obciążenia guzem można mierzyć intensywność sygnału każdej myszy na obrazach wykonanych przez cały okres. Możesz umieścić te wartości w Excelu lub GraphPad Prism do analizy statystycznej oraz do generowania liniowych wykresów postępu guza.
      1. Otwórz zapisany plik raw infoclick.txt z odpowiedniego folderu.
      2. Przejdź do sekcji ROI (Region of Interest) w oknie palety narzędzi, która pojawia się w prawym górnym rogu (rysunek 3F).
      3. Narysuj obszar zwrotu z inwestycji na każdej myszy ręcznie lub automatycznie za pomocą funkcji "rysuj", używając dowolnego kształtu, który najlepiej ci odpowiada. Aby zrobić to ręcznie, zachowaj jednolity obszar dla wszystkich obrazów wszystkich myszy, które są porównywane.
         Uwaga: Przy inokulacji wewnątrzotrzewnowej najlepiej sprawdza się ręczny wybór ROI dla całej klatki piersiowej i brzusznej na brzusznym obrazie myszy. Przy inokulacji wewnątrzburzowej najlepiej sprawdza się ręczny wybór ROI w obszarze obrazu grzbietowego z sygnałem.
         Uwaga: Automatyczny wybór zwrotu z inwestycji wybierze tylko obszary o wyższej intensywności sygnału obrazu.
      4. Kliknij "Mierz ROI" (rysunek 3F). To otworzy kolejne okno z danymi o całkowitej i średniej liczbie dla każdego wybranego ROI.
      5. Zapisz ten plik w odpowiednim folderze, aby mógł być dostępny później. Wykorzystaj te dane do wyrysowania wykresu w MS Excel lub GraphPad Prism.

Wyniki

Reprezentatywne dane z modelu raka jajnika wewnątrzotrzewnego, wykorzystującego komórki OVCAR8 oznaczone lucyferazą u nagich myszy Foxn1 z obniżoną odpornością, przedstawiono na Rysunku 4. Stabilna ekspresja lucyferazy w tych komórkach umożliwiła podłużne monitorowanie postępu guza za pomocą nieinwazyjnego obrazowania bioluminescencyjnego za pomocą obrazowania IVIS, jak opisano w sekcji III. Iniekcja wewnątrzotrzewnowkowa 5 milionów komórek OVCAR8-lucyferazy u myszy Foxn1 spowodowała powstan...

Dyskusja

Zdolność do naśladowania złożonych interakcji między komórkami nowotworowymi, mikrośrodowiskiem i czynnikami ogólnoustrojowymi sprawia, że modele myszy są doskonałym źródłem do badania postępu raka jajnika¹². Oprócz poszerzania wiedzy o czynnikach wpływających na postęp raka jajnika i przerzuty, modele mysie in vivo odgrywają również ważną rolę w przedklinicznej ocenie małych cząsteczek oraz strategiach leczenia przerzutowego raka jajnika^12,15

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,22 um sterylny filtr strzykawkowy, 33mm	Fisher Scientific	09-720-004
1 ml strzykawki TB	BD	309659
21G, igła 1 cal	BD	305167
30G, ½ igła calowa	BD	305106
5-calowe zakrzywione kleszcze cienkie	Fisher Scientific	1631
6-0 Szew monofilamentowy chłonny	MaxonTM  < tam>	6532-11
Gaz alkoholowy (70% izoprolyl alkohol)	Dukal Corp	80003156
Betadyna (1% roztwór jodu)	Produkty Purdue	367618150085
Carprofen Inj, 50 mg/ml	Levafen	RXLEVA50-20INJ
Wirówka	Eppendorf	5702
D-lucyferyna	Syd Labs	MB000102-R70170
Mikrokleszcze rozcięte jubilerskie, cienka końcówka	Fisher Scientific	08-953E
Maść do oczu	Medvet	11897
Nożyczki z cienkim końcem	Fisher Scientific	8940
Podkładka grzewcza	Sunbeam	731-500
Instrumenty rozcinające kleszcze z drobnymi punktami	Fisher Scientific	S08096
Strzykawka insulinowa 3/10ml	BD	328438
Izofurane	Fluriso	Fluriso250
IVIS	Perkin Elmer	IVISLMIII
Mayo – uchwyt na proste igły Heger	Fisher Scientific	08-966
Sterylny 1X PBS, bez wapnia i magnezu	Corning	21-040-CV
Sterylne końcówki bawełniane	McKeesson	24-106-1S
Sterylny wskaźnik	Kendall	3033
Sterylna podpaska/ręcznik/osłona, bez efektów	Henry-Schein	100-9687
Potrójna maść antybiotykowa	Globe	4006-4SL
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa	Gibco	25200-056