Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zintegrowany Protokół Oceny Naczyń Chłonnych Opon Mózgowo-rdzeniowych: Wstrzyknięcie do Cisterny Magny, Wizualizowanie Węzłów Chłonnych, Sekcja Opon Mózgowo-rdzeniowych i Barwienie Całego Montażu

381 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71140

⸱

29 maja 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, School of Life Sciences, Shanghai University, 2Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University, 3Children's Hospital of Fudan University, National Children's Medical Center, 4First Clinical College, Fujian Medical University; Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian Key Laboratory of Laboratory Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono tutaj protokół do oceny naczyń limfatycznych oponowych myszy (MLV), które odgrywają ważną rolę w wielu chorobach neurologicznych. Celem tego protokołu jest zapewnienie zintegrowanej metody, która umożliwia zarówno funkcjonalną ocenę drenażu znacznika, jak i szczegółową charakteryzację morfologiczną sieci grzbietowych MLV.

Streszczenie

Naczynia limfatyczne oponowe (MLVs) stały się kluczowymi regulatorami homeostazy ośrodkowego układu nerwowego (OUN), a dysfunkcja MLVs została związana z różnymi zaburzeniami neurologicznymi. W związku z tym kompleksowa ocena morfologii i funkcji MLVs jest niezbędna do zrozumienia ich roli w fizjologii i chorobach OUN. Niniejszy protokół opisuje zintegrowaną metodę oceny MLVs u myszy z wykorzystaniem czterech kluczowych technik: wstrzyknięcia środków śledzących fluorescencyjnych do cysterny wielkiej (i.c.m.), obrazowania na żywo węzłów chłonnych szyjnych (CLNs), sekcji opon mózgowo-rdzeniowych i barwienia całościowego. Po pierwsze, igła 30 G jest podłączona do strzykawki i pompy infuzyjnej za pomocą polietylenowej (PE) kaniuli. Po znieczuleniu myszy, otrzewna jest eksponowana poprzez stępowanie mięśni szyi, a igła wstrzykująca jest wprowadzana do cysterny wielkiej (CM), aby dostarczyć środek śledzący do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) z precyzyjną kontrolą. Odpływ środka śledzącego do CLNs można wizualizować w czasie rzeczywistym, podczas gdy kolejna sekcja opon i barwienie całościowe umożliwiają szczegółową analizę morfologii grzbietowych MLVs. Cały proces można zakończyć w ciągu 3 h, obejmując wstrzyknięcie i.c.m., perfuzję tkanek, izolację czaszki i umieszczenie w roztworze fiksującym. Ten protokół można również dostosować do podawaniu leków do czaszki lub połączyć z analizami molekularnymi, ponieważ procedura sekcji opon jest kompatybilna ze świeżymi, niefiksowanymi tkankami nadającymi się do ekstrakcji RNA i białka.

Wprowadzenie

MLV są zlokalizowany w żyłach twardówkowych i są w stanie przenosić składniki mózgowo-rdzeniowego płynu otoczenia oraz komórki odpornościowe z OUN do WŁL1,2. Odkrycie MLV wyzwał tradycyjny koncept "uprzywilejowanej immunologicznie" strefy ośrodkowego układu nerwowego i stało się gorącym tematem badań w ostatnich latach3. Badania wykazały, że upośledzona funkcja MLV jest ściśle związana z różnymi chorobami, w tym chorobą Alzheimera, wiekiem związanym z pogorszeniem funkcji poznawczych, guzami mózgu oraz infekcjami OUN4,5,6,7. W miarę postępów badań w tej dziedzinie rośnie potrzeba zintegrowanych, powtarzalnych i dobrze standaryzowanych metod eksperymentalnych.

Większość istniejących protokołów badań nad naczyniami limfatycznymi koncentruje się na naczyniach limfatycznych obwodowych8,9,10. W badaniach dotyczących MLV, jedno z badań opisuje prostą procedurę kaniulacji CM, która umożliwia bezpośredni dostęp do płynu mózgowo-rdzeniowego bez uszkodzenia czaszki lub parenchymy mózgu11. W połączeniu z technikami obrazowania, ta metoda może skutecznie oceniać funkcjonowanie układu glymphatic i dynamiki płynu mózgowo-rdzeniowego. Jednak szczegółowe protokoły eksperymentalne do badania funkcji i morfologii MLV nie zostały dobrze udokumentowane.

Niniejszy protokół integruje obrazowanie funkcjonalne z analizą morfologiczną, umożliwiając jednoczesne uzyskiwanie danych dotyczących funkcji drenażowych i morfologii strukturalnej od tego samego zwierzęcia, zmniejszając tym samym liczbę stosowanych zwierząt i poprawiając porównywalność i spójność danych. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten może być wykorzystywany do badania zmian strukturalnych i funkcjonalnych MLV w różnych modelach chorobowych, a także do oceny wpływu interwencji farmakologicznych lub genetycznych na MLV. Protokół zawiera szczegółowe opisy etapów operacyjnych, kluczowych środków ostrożności oraz wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów. Ponadto opisana w protokole technika wstrzyknięcia i.c.m. może być niezależnie stosowana do podaży leków do czaszki, a procedura sekcji oponowej jest zgodna ze świeżymi tkankami do dalszej ekstrakcji RNA lub białek, oferując znaczną elastyczność i skalowalność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisane w tym protokoła procedury dotyczące myszy były wykonywane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu w Szanghaju (Numer zatwierdzenia ECSHU 2023-099). 

1. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych i buforów

UWAGA: Wykonuj czynności w kapturze chemicznym i stosuj rękawiczki, aby zminimalizować potencjalne ryzyko podczas pracy z PFA, substancją umiarkowanie toksyczną i rakotwórczą. Wszystkie operacje z użyciem alkoholu izoamylowego muszą być przeprowadzane w kapturze chemicznym, z dala od źródeł zapłonu, stosując rękawiczki i maskę, aby zmniejszyć ryzyko narażenia.

  1. Przygotuj narzędzia chirurgiczne, takie jak jedna para prostej nożyczki, dwie pary zakrzywionych nożyczek o ostrych końcach, dwie pary tępych nożyczek, jedna para mikroskopu i jedna para prostych mikroskopu o gładkich (bez ząbków) końcach.
    UWAGA: Przetrzyj narzędzia chirurgiczne 75% alkoholem i utrzymuj je w suchości zarówno przed, jak i po eksperymencie.
  2. Przygotuj bufory.
    1. 1x PBS.
    2. 4% roztwór fiksujący paraformaldehydu (4% PFA).
    3. Roztwór blokujący (1x PBS zawierający 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5% Triton X-100 i 2% surowicy bydlęcej).
    4. Bufor do rozcieńczania przeciwciał (1x PBS zawierający 3% BSA i 0,5% Triton X-100).
    5. Środek montujący Antifade.
      ​UWAGA: Przygotowaną substancję można przechowywać w temperaturze 4 °C przez miesiąc.
  3. Przygotuj roztwór znieczulający 2,2,2-Tribromoetanol (Avertin, 1,25%, 50 ml)
    1. Waż 0,625 g tribromoetanolu do 2 ml rury, dodaj 1,25 ml alkoholu izoamylowego i dokładnie rozpuść (37 °C w szyjce).
    2. Przenieś całkowicie rozpuszczony roztwór tribromoetanolu-alkoholu izoamylowego do 50 ml stożkowej probówki, dodaj 1x PBS, aby uzyskać całkowitą objętość 50 ml i dokładnie wymieszaj.
    3. Przefiltruj roztwór przez filtr o średnicy 0,22 μm w biologicznej szafie bezpieczeństwa.
  4. Przygotuj roztwór owalbuminy, koniugatu Alexa Fluor 647 (OVA-647) (2 mg/ml). Rozpuść 2 mg OVA-647 w 1 ml sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF).

2. Złożenie igły wstrzykiwania i podłączenie do pompy mikroiniekcyjnej

  1. Użyj tępych nożyczek, aby oderwać igłę 30 G i zachować końcówkę11 (średnica zewnętrzna 0,30 mm, średnica wewnętrzna 0,15 mm, długość 8 mm).
  2. Użyj 30 cm rury PE-10 (średnica zewnętrzna 0,64 mm, średnica wewnętrzna 0,28 mm), aby połączyć oderwaną igłę 30 G z igłą mikroiniekcyjną zawierającą igłę 30 G (Rysunek 1).
  3. Zamontuj igłę mikroiniekcyjną, z przymocowanym wężem i igłą 30 G, na pompie mikroiniekcyjnej.

3. Wstrzyknięcie i.c.m. i obrazowanie na żywo

UWAGA: Jeśli igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko i przebije miąższ mózgu, substancja wstrzyknięta zostanie wprowadzona do tkanki mózgowej, a nie do komory CSF, co skutkuje niedokładnymi wynikami i potencjalnie prowadzi do śmierci myszy. Podczas zabiegu chirurgicznego wymagane jest ciągłe monitorowanie fizjologiczne myszy. Głębokość znieczulenia należy oceniać co 15 min za pomocą odruchu ściskającego palce, aby upewnić się, że zwierzę pozostaje wolne od bólu. Temperaturę ciała należy utrzymywać na poziomie 37 °C ± 0,5 °C za pomocą podgrzewanej podkładki, aby zapobiec hipotermii i powiązanym z nią wpływom na funkcje fizjologiczne. Ponadto co 30 min należy rejestrować oddech i częstość akcji serca, oceniając ruchy klatki piersiowej i palpując wierzchołek serca. Podczas wstrzyknięcia i.c.m., jeśli igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko i spowoduje krwawienie, oznacza to nieudane wstrzyknięcie. Zakończ eksperyment i wykonaj eutanazję zwierzęcia.

  1. Waż mysz i podaj 200 mg/kg Avertin drogą dootrzewnowej, aby znieczulić mysz.
    UWAGA: Można stosować alternatywne leki znieczulające (np. ketamina/ksylazina).
  2. Nanieś maść okulistyczną, aby zapobiec wysychaniu rogówki.
  3. Nanieś krem do depilacji na szyję, aby usunąć włosy nad węzłami chłonnymi, gdy odruch ściskającego palce przestanie występować, a oddech stanie się powolny i regularny.
  4. Ogol szyję.
  5. Umieść mysz w ramie stereotaktycznej na podkładce grzewczej z głową nachyloną pod kątem 120° do tułowia (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po wstrzyknięciu OVA-647 drogą i.c.m., obrazowanie in vivo małych zwierząt wykazało wyraźne, owalne sygnały fluorescencyjne rozłożone obustronnie w okolicy szyjnej (Rysunek 6A). W przypadku prawidłowych wstrzyknięć marker był wyraźnie widoczny w CLN po podaniu, a intensywność fluorescencji osiągnęła szczyt po około 60 min (Rysunek 6B). Dodatkowo sygnały fluorescencyjne zaobserwowano w wyizolowanych powierzchownych i głębokich węzłach chłonnych szyjnych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

To protokoll zapewnia kompleksową metodę oceny funkcji i morfologii MLV poprzez integrację iniekcji i.c.m., in vivo obrazowanie CLN, sekcje oponą twardą i barwienie całego preparatu. Kluczowa zaletą tego zintegrowanego podejścia w porównaniu z konwencjonalnymi metodami jest to, że umożliwia jednoczesną ocenę funkcji drenażu limfatycznego i morfologii naczyń w jednym i tym samym zwierzęciu, eliminując potrzebę osobnych grup doświadczalnych, a tym samym zmniejszając zmienność eksperymentalną i poprawiając porównyw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To dzieło było wspierane przez fundusze z Narodowego Kluczowego Programu Badań i Rozwoju Chin (2023YFC2306500), Narodowej Fundacji Nauki Przyrodniczej Chin (82502108) oraz Chińskiej Fundacji Naukowej dla Doktorantów (2024M760542).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ACSF (Artificial Cerebrospinal Fluid)Tocris  Cat# 3525
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (1:1000 dilution)InvitrogenCat# A-21208
Antifade Mounting MediumBeyotimeCat# P0126
Blunt-tipped forcepsRWD Life ScienceCat# F12011-10
BSABeyotimeCat# ST023
CoverslipsCITOTESTCat# 80312-3161
Curved sharp forcepsRWD Life ScienceCat# F11003-11
DAPISigma-AldrichCat# D9542
Depilatory creamVeetN/A
Dish-10 cmThermo Fisher ScientificCat# 150464
Disposable intravenous (IV) infusion needleZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Ethanol-75%Sinopharm Chemical Reagent Cat# 80176961
Fetal Bovine SerumExcellCat# FSD500
Filter-0.22 µmMerck Millipore Cat# SLGPR33RB
Glass slidesCITOTESTCat# 80340-3610
Isoamyl alcoholSinopharm Chemical Reagent Cat# 10003218
IVIS SpectrumPerkinElmerN/A
Micro forcepsShinva Medical Instrument Cat# ZD372RB 
Micro scissorsShinva Medical Instrument Cat# ZO13056R
Microinjection needle (25 µL)Shanghai Gaoge Industry & Trade N/A
Microinjection pumpVoyage PowerCat# QHZS-001A
Mouse: C57BL/6 wild-type, 8 weeks old, male CavensN/A
Needle-30GZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Normal SalineBeyotimeCat# ST341
Ovalbumin, Alexa Fluor™ 647 ConjugateThermo Fisher ScientificCat# O34784
Paraformaldehyde Fix Solution-4%BeyotimeCat# P0099
PE-10 tubingShanghai Qiujing Biochemical Reagent and InstrumentN/A
Phosphate-buffered saline (1x PBS)BeyotimeCat# ST447
Rat anti-LYVE-1 (1:200 dilution)Santa CruzCat# sc-65647
StereomicroscopeJonecCat# JSZ6
Stereotaxic frameRWD Life ScienceCat# 68030
Straight scissorsRWD Life ScienceCat# S12007-10
Syringe-1-mL Zhejiang Kindly Medical Devices N/A
Tissue Adhesive I3M VetbondCat# 1469SB
TribromoethanolSigma-AldrichCat# T48402
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# T8787
VS120 High-throughput fluorescence imaging systemOlympusN/A

Bibliografia

  1. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
  2. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J Exp Med. 212, 991-999 (2015).
  3. Sandrone, S., Moreno-Zambrano, D., Kipnis, J., Van Gijn, J. A (delayed) history of the brain lymphatic system. Nat Med. 25, 538-540 (2019).
  4. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and alzheimer's disease. Nature. 560, 185-191 (2018).
  5. Hu, X., et al. Meningeal lymphatic vessels regulate brain tumor drainage and immunity. Cell Res. 30, 229-243 (2020).
  6. Li, X., et al. Meningeal lymphatic vessels mediate neurotropic viral drainage from the central nervous system. Nat Neurosci. 25, 577-587 (2022).
  7. Rustenhoven, J., et al. Age-related alterations in meningeal immunity drive impaired cns lymphatic drainage. J Exp Med. 220, (2023).
  8. Kodama, T., Hatakeyama, Y., Kato, S., Mori, S. Visualization of fluid drainage pathways in lymphatic vessels and lymph nodes using a mouse model to test a lymphatic drug delivery system. Biomed Opt Express. 6, 124-134 (2015).
  9. Banerjee, R., Knauer, L. A., Yang, Y. Protocol for in vivo and in vitro study of lymphatic valve formation driven by shear stress signaling pathway. STAR Protoc. 4, 102141 (2023).
  10. Akwii, R. G., et al. Murine dermal lymphatic endothelial cell isolation. J Vis Exp. (197), e65393 (2023).
  11. Xavier, A. L. R., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. (135), e57378 (2018).
  12. Hsieh, Y. T., Chen, S. L. Visualization and analysis of neuromuscular junctions using immunofluorescence. Bio Protoc. 14, e5076 (2024).
  13. Banerji, S., et al. Lyve-1, a new homologue of the cd44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144, 789-801 (1999).
  14. Da Mesquita, S., et al. Meningeal lymphatics affect microglia responses and anti-abeta immunotherapy. Nature. 593, 255-260 (2021).
  15. Betsholtz, C., et al. Advances and controversies in meningeal biology. Nat Neurosci. 27, 2056-2072 (2024).
  16. Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathol. 137, 151-165 (2019).
  17. Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high eeg delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Sci Adv. 5, eaav5447 (2019).
  18. Lee, H., et al. The effect of body posture on brain glymphatic transport. J Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oponowe naczynia limfatycznewstrzykiwanie znacznika fluorescencyjnegoszyjne w z y ch onneopona twardao rodkowy uk ad nerwowyperfuzja tkankowa
Zintegrowany Protokół Oceny Naczyń Chłonnych Opon Mózgowo-rdzeniowych: Wstrzyknięcie do Cisterny Magny, Wizualizowanie Węzłów Chłonnych, Sekcja Opon Mózgowo-rdzeniowych i Barwienie Całego Montażu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.