Opis przypadku

Sekwencjonowanie całego eksomu identyfikuje nowe warianty kandydujące w genie PCNT u dziecka z nakładającymi się cechami MOPD II: opis przypadku

34 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71153

⸱

14 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  , 
1Hunan Provincial Key Laboratory of Regional Hereditary Birth Defects Prevention and Control, Changsha Hospital for Maternal & Child Health Care Affiliated to Hunan Normal University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

U 7-letniego chłopca z ciężkim zahamowaniem wzrostu, opóźnieniem rozwoju i cechami dysmorficznymi zidentyfikowano dwa nowe warianty kandydujące genu PCNT (c.5675A>G oraz c.9734G>T). Wyniki te są zgodne z nietypowym, podejrzanym fenotypem pierwotnego karłowactwa związanego z PCNT. Oba warianty pozostają zaklasyfikowane jako warianty o niepewnym znaczeniu do czasu dalszej walidacji

Streszczenie

7-letni chłopiec z Chin zgłosił się z ciężkim postnatalnym zahamowaniem wzrostu (wzrost <3. percentyla w wieku 7 lat), globalnym opóźnieniem rozwoju, umiarkowaną niepełnosprawnością intelektualną oraz charakterystycznymi cechami dysmorficznymi, w tym hiperteloryzmem, krótkimi szczelinami powiekowymi, nisko osadzonymi małżowinami usznymi i szerokim nasadą nosa. Pojedyncze badanie EKG wykazało graniczną wartość skorygowanego odstępu QT (QTc = 450 ms). Nie stwierdzono arytmii, stosowania leków wydłużających odstęp QT, zaburzeń elektrolitowych ani istotnego wywiadu kardiologicznego w rodzinie. Znalezisko to uzasadnia długoterminową opiekę kardiologiczną i nie powinno być interpretowane jako definitywny zespół wydłużonego QT. Sekwencjonowanie całego egzomu wykazało dwa nowe warianty missense w genie PCNT (NM_006031.5): c.5675A>G (p.Glu1892Gly) w eksonie 28 oraz c.9734G>T (p.Arg3245Ile) w eksonie 45. Oba warianty nie występowały w gnomAD, ExAC, bazie danych projektu 1000 Genomes ani w chińskich bazach danych populacyjnych, co spełnia kryterium PM2 ACMG. Choć zostały one zaklasyfikowane jako warianty o niepewnym znaczeniu (VUS) ze względu na ograniczone dowody funkcjonalne i sprzeczne przewidywania in silico, warianty te występują w genie powiązanym z pierwotnym karłowatością i towarzyszy im częściowe pokrycie fenotypowe z mikrogłowską osteodysplastyczną pierwotną karłowatością typu II (MOPD II). Jednak analiza segregacji u rodziców nie była dostępna, w związku z czym nie można było potwierdzić fazy wariantów ani ustanowić recesywnego mechanizmu choroby. Wyniki te wspierają obecność kandydackich wariantów PCNT w nietypowym fenotypie pierwotnej karłowatości i ilustrują użyteczność sekwencjonowania całego egzomu w generowaniu sprawdzalnych hipotez molekularnych w genetycznie heterogenicznych zaburzeniach wzrostu. Obecnie nie można postawić ostatecznej diagnozy molekularnej, a izolowane znalezisko granicznej wartości QTc wymaga dalszej oceny klinicznej.

Wprowadzenie

Zespół mikrocefalii osteodysplastycznej pierwotnej karłowatości typu II (MOPD II) to wyjątkowo rzadka choroba recesywna autosomalna (szacowana częstość <1:1 000 000), charakteryzująca się ciężkim niedorozwojem wewnątrzmacicznym i poporodowym, postępującą mikrocefalią, dysplazją szkieletową oraz charakterystycznymi cechami twarzoczaszki1,2. W 2008 roku MOPD II zostało powiązane molekularnie z dwoma allelicznymi wariantami patogennymi w genie PCNT (perycentryn)3. Pomimo charakterystyki genetycznej rozpoznanie kliniczne pozostaje trudne ze względu na znaczną heterogeniczność fenotypową, zależność ekspresji od wieku oraz duże pokrywanie się z innymi zespołami pierwotnej karłowatości, w tym zespołem Seckela i zespołem Meiera-Gorlina4. Konwencjonalne podejścia diagnostyczne oparte wyłącznie na kryteriach klinicznych często prowadzą do niejednoznacznych wyników, szczególnie u młodych pacjentów, którzy jeszcze nie wykazują pełnego spektrum fenotypowego5.

Sekwencjonowanie egzomów (WES) stało się wartościowym podejściem diagnostycznym w przypadku chorób o zróżnicowanej podłożu genetycznym, oferując wyraźne zalety w porównaniu z sekwencyjnym testowaniem pojedynczych genów. WES umożliwia jednoczesne analizowanie ponad 20 000 genów kodujących białka. Podejście to pozwala na ustalenie definitywnej diagnostyki molekularnej w około 25–40% przypadków niezdiagnozowanych wcześniej zaburzeń wzrastania, skracając tym samym czas oczekiwania na rozpoznanie6. W przeciwieństwie do kariotypowania lub analizy mikromacierzy chromosomowych, które wykrywają głównie duże warianty strukturalne, WES skutecznie identyfikuje pojedyncze nukleotydowe warianty (SNVs) oraz małe insercje/delecje (InDels), które mogą leżeć u podłoża chorób monogenowych7. W przypadkach klinicznie niejednoznacznych, WES pozwala na wyselekcjonowanie kandydujących wariantów do dalszych badań segregacji i weryfikacji funkcjonalnej, zamiast dostarczać samodzielnego definitywnego rozpoznania molekularnego. Takie podejście jest szczególnie istotne ze względu na szeroki spektrum mutacji genu PCNT, obejmujący liczne warianty rozmieszczone w jego 47 egzonach oraz niepełne korelacje między genotypem a fenotypem3.

W niniejszym raporcie przypadku opisano 7-letniego chłopca pochodzenia chińskiego, u którego za pomocą WES zidentyfikowano dwie nowe kandydujące warianty punktowe genu PCNT (c.5675A>G i c.9734G>T). Pacjent wykazywał nasilone zaburzenia wzrostu poporodowego, ogólny opóźniony rozwój psychoruchowy oraz charakterystyczne dysmorfizmy czaszkowo-twarzowe, jednakże istotnie nie stwierdzono u niego wyraźnej mikrocefalii podczas wstępnego badania – cechy typowej dla klasycznego zespołu MOPD II. Niemniej jednak, MOPD II pozostawało głównym rozpoznaniem różnicowym, ponieważ mikrocefalia w zaburzeniach związanych z PCNT często rozwija się zależnie od wieku, a u niektórych chorych znaczące spowolnienie wzrostu głowy pojawia się dopiero w późnym dzieciństwie lub okresie dojrzewania4. Ponadto, połączenie nasilonego karłowstwa, charakterystycznych cech czaszkowo-twarzowych, niepełnosprawności intelektualnej oraz opóźnionego dojrzewania szkieletowego ściśle odpowiada podstawowemu spektrum fenotypowemu karłowstwa pierwotnego związanego z PCNT. Przypadek ten podkreśla przydatność WES w formułowaniu weryfikowalnych hipotez molekularnych w przypadku nietypowych objawów klinicznych oraz znaczenie długoterminowego monitorowania fenotypu w rozstrzyganiu niepewności diagnostycznej.

Prezentacja przypadku:

Siedmioletni chłopiec został skierowany w kwietniu 2019 roku do Oddziału Genetyki w szpitalu opieki zdrowotnej dla matek i dzieci w Changsha z powodu nasilonego zaburzenia wzrastania oraz ogólnego opóźnienia rozwojowego. Urodził się w zdrowej rodzinie z rodzicami niespokrewnionymi (wzrost ojca: 173 cm; wzrost matki: 160 cm). Nie stwierdzono przypadków podobnych schorzeń w rodzinie ani małżeństw między krewnymi, choć babcia po linii matki cierpiała na cukrzycę.

Wywiad okołoporodowy wykazał poród w 38. tygodniu ciąży przy masie urodzeniowej 2,5 kg. Choć wstępny opis kliniczny zakwalifikował tę masę urodzeniową jako normalną, odpowiada ona mniej więcej 10. percentylowi dla wieku ciążowego, co wskazuje na niską masę urodzeniową w stosunku do wieku ciążowego (SGA), a nie na ciężką ograniczoną wzrostem wewnątrzmacicznym, typową dla klasycznego MOPD II. Od wczesnego dzieciństwa pacjent wykazywał znaczną niedowagę wzrostową z prędkością wzrostu wynoszącą jedynie 2–3 cm/rok. W wieku 7 lat (kwiecień 2019 r.) wzrost wynosił 103,5 cm (–4,04 SD), masa ciała 16,7 kg (<3. percentyl), a obwód głowy (OFC) 51,5 cm (wynik Z: –1,2), zgodnie z chińskimi krajowymi standardami wzrostu z 2009 r. oraz wykresami wzrostu OFC zależnymi od wieku i płci.

Wykonano rentgenowskie badanie szkieletu, w tym zdjęcia w projekcji przodnio-tylnej lewej ręki i nadgarstka, w kwietniu 2019 roku. Ocena obrazów przez radiologa pediatrę z wykorzystaniem atlasu Greulicha–Pyle’a wykazała wiek kostny wynoszący 6 lat przy rzeczywistym wieku 7 lat i 1 miesiąc. Badanie szkieletu nie ujawniło cech charakterystycznych dla zaburzeń kostnych typowych dla MOPD II, takich jak displazja szyjki kości udowej, poszerzenie metafizów lub przyspieszony wiek kostny kości nadgarstka. Obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) głowy wykazało prawidłową strukturę mózgu i proces mielinizacji bez widocznych wad rozwojowych, co pomogło wykluczyć inne zespołowe przyczyny ciężkiego niedorostu oraz opóźnienia w rozwoju nerwowym.

U pacjenta stwierdzono opóźnienie w osiąganiu kamieni milowych ruchowych i językowych. Formalna ocena poznawcza za pomocą Skali Inteligencji Wechslera dla Dzieci (WISC), przeprowadzona w wieku rzeczywistym 7 lat i 1 miesiąc, wykazała pełny iloraz inteligencji (FSIQ) wynoszący 50. Zgodnie z Kryteriami Diagnostycznymi i Statystycznym Podręcznikiem Zaburzeń Psychicznych, wydanie piąte (DSM-5), ten wynik odpowiada łagodnemu do umiarkowanego upośledzeniu intelektualnemu (łagodne: 50–69; umiarkowane: 35–49). Badanie fizykalne ujawniło hipertelorizm, krótkie szpary powiekowe, nisko osadzone uszy oraz szeroki mostek nosa. Jawna mikrocefalia nie została stwierdzona podczas wstępnego badania. Podstawowy 12-odprowadzeniowy elektrokardiogram wykazał pogranicznie wydłużony interwał QT skorygowany (QTc) wynoszący 450 ms (Rycina 1A, B). Pacjent nie miał historii omdleń, kołatania serca ani potwierdzonych arytmii. Nie stwierdzono narażenia na leki wydłużające QT, stężenia elektrolitów surowicy były w granicach normy, a wywiad rodzinny nie wykazał przypadków nagłej śmierci sercowej ani dziedzicznych arytmii. Zalecono powtórne elektrokardiograficzne badanie oraz konsultację z pediatrycznym kardiologiem.

analiza krzywej EKG, wyniki elektrokardiogramu, dane rytmu serca, wykres diagnostyczny
Rycina 1: Reprezentatywny elektrokardiogram (EKG) uzyskany u pacjenta podczas pierwszej oceny klinicznej. (A) Standardowy 12-odprowadzeniowy EKG zarejestrowany przy prędkości papieru 25 mm/s i kalibracji 10 mm/mV. Zapis wykazuje prawidłowy rytm zatokowy z częstością serca 97 uderzeń/min. Odcinek PR wynosi 116 ms, czas trwania zespołu QRS wynosi 78 ms, a skorygowany odcinek QT (QTc), obliczony według wzoru Bazetta, wynosi 450 ms. (B) Powiększony widok odprowadzeń II, V5 i V6, z uwypukleniem morfologii fali T oraz odcinka QT. Uwaga: EKG przedstawia pojedynczy zapis podstawowy uzyskany podczas pierwszej oceny klinicznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Ocena endokrynologiczna potwierdziła opóźniony wiek kostny. Test pobudzenia wydzielania hormonu wzrostu wykazał prawidłową maksymalną odpowiedź hormonu wzrostu (12,39 ng/mL), wykluczając niedobór hormonu wzrostu jako główną przyczynę niskiego wzrostu. Funkcja tarczycy była prawidłowa (TSH: 1,76 mIU/L; FT4: 21,93 pmol/L), a rezonans magnetyczny przysadki wykazał prawidłową morfologię (4,5 × 9,1 × 3,1 mm). Po przeprowadzeniu tej oceny, 28 lipca 2019 roku zainicjowano leczenie rekombinowanym ludzkim hormonem wzrostu (rhGH) w połączeniu z interwencjami dotyczącymi stylu życia, w tym optymalizacją spożycia białka w diecie oraz regularnymi ćwiczeniami skakanianp. skakanie przez skakankę) oraz poprawę higieny snu.

Sekwencjonowanie egzomu całego (WES) wykonane z wykorzystaniem DNA z krwi obwodowej wykazało dwa nowe warianty nienaruszające znaczenia w genie PCNT (NM_006031.5): c.5675A>G (p.Glu1892Gly) w egzonie 28 oraz c.9734G>T (p.Arg3245Ile) w egzonie 45. Oba warianty nie występowały w głównych bazach danych populacyjnych (gnomAD, ExAC, baza danych projektu 1000 Genomów oraz specyficzna dla Chin baza danych Shenzhou Genome Database). In silico narzędzia predykcyjne dały rozbieżne wyniki. Wariant c.5675A>G zakwalifikowano jako szkodliwy według SIFT oraz potencjalnie szkodliwy według PolyPhen-2 (wynik CADD PHRED: 18,82), podczas gdy wariant c.9734G>T uznano za tolerowany lub łagodny (wynik CADD: 7,87). Analiza CNV-seq nie wykazała żadnych patogennych wariantów liczby kopii (Rycina 2). Zgodnie z wytycznymi ACMG/AMP oba warianty sklasyfikowano jako warianty o niepewnym znaczeniu klinicznym (VUS). Nie udało się uzyskać próbek DNA od rodziców; w związku z tym analiza segregacji mająca na celu określenie fazy obu wariantów nie mogła zostać przeprowadzona.

Wyniki analizy CNV-seq na poziomie całego genomu; analiza wariacji liczby kopii chromosomów.
Rycina 2: Analiza sekwencjonowania wariacji liczby kopii (CNV-seq). Wykres CNV-seq na poziomie całego genomu wygenerowany z DNA pochodzącego z krwi obwodowej pacjenta. Oś X reprezentuje współrzędne genomowe (chromosomy 1–22, X i Y), a oś Y przedstawia stosunek głębokości odczytu w skali log2. Poziome przerywane linie wskazują progi dla zysku liczby kopii (>0,3) i utraty liczby kopii (<–0,3). Nie stwierdzono żadnych aneuploidii chromosomowych ani patogennych wariacji liczby kopii powyżej progu wykrywalności 100 kb. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Diagnoza, ocena i plan:

Kompleksowa ocena kliniczna, radiologiczna, endokrynologiczna, kardiologiczna oraz genomowa wskazała na podejrzenie karłowatości pierwotnej związaną z genem PCNT, wykazującą cechy wspólne z mikrocefalijną osteodysplastyczną karłowatością pierwotną typu II (MOPD II). Ocena diagnostyczna obejmowała standaryzowane pomiary antropometryczne, ocenę rozwoju neurologicznego, która ujawniła ogólny opóźniony rozwój oraz umiarkowane upośledzenie intelektualne, podstawowe 12-odprowadzeniowe elektrokardiogramy, przegląd szkieletu, badanie endokrynologiczne, obrazowanie rezonansem magnetycznym mózgu (MRI), sekwencjonowanie wariantów liczby kopii (CNV-seq) oraz sekwencjonowanie egzomowe (WES) (Rycina 3). Analiza CNV-seq wykluczyła obecność patogennych wariantów liczby kopii oraz dużych nieprawidłowości chromosomowych, natomiast WES wykazało dwa warianty punktowe w genie PCNT. Zgodnie z wytycznymi ACMG/AMP oba warianty sklasyfikowano jako warianty o niepewnym znaczeniu (VUS). Ze względu na brak dostępności próbek DNA rodziców nie przeprowadzono analizy segregacji, aby określić, czy warianty występują w trans, co uniemożliwiło potwierdzenie recesywnej diagnostyki molekularnej.

Przekroje mózgu w obrazowaniu metodą rezonansu magnetycznego (MRI), widok strzałkowy i czołowy, obrazowanie medyczne do analizy diagnostycznej.
Rycina 3: Obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) mózgu pokazujące prawidłowe wyniki w obrębie czaszki. (A) Przekrój strzałkowy T1 z kontrastem wykazujący prawidłowe struktury śródliniowe w obrębie czaszki oraz pień mózgu bez nieprawidłowego wzmocnienia sygnału. (B) Przekrój czołowy T1 z kontrastem wykazujący prawidłową tkankę mózgową oraz okolice siodła tureckiego bez cech obecności masy nowotworowej w obrębie czaszki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Po wstępnym badaniu 28 lipca 2019 roku rozpoczęto terapię rekombinowanym ludzkim hormonem wzrostu (rhGH) w połączeniu z interwencjami dotyczącymi stylu życia, w tym optymalizacją białka w diecie, regularnymi ćwiczeniami skakania (np. skakaniem na skakance) oraz poprawą higieny snu. Rodzinie udzielono poradnictwa genetycznego w zakresie obecnej klasyfikacji wariantu o niepewnym znaczeniu (VUS), teoretycznego ryzyka nawrotu związanego z chorobą recesywną autosomalną oraz dostępnych opcji rozrodczych, w tym diagnostyki przedurodzeniowej i preimplantacyjnego testowania genetycznego.

Ponieważ obecnie nie istnieje terapia wyleczająca zaburzenia związane z PCNT, długoterminowa opieka koncentruje się na nadzorze multidyscyplinarnym. Pacjentom z MOPD II zaleca się coroczne badanie angio-MR mózgu, rozpoczynające się w wieku 5 lat, ze względu na znane ryzyko powikłań naczyniowych mózgu, w tym choroby moyamoya, zgodnie z opublikowanymi wytycznymi dotyczącymi nadzoru naczyniowego. Zalecono powtórne wykonanie 12-odprowadzeniowego EKG oraz kompleksową ocenę kardiologiczną pediatryczną, aby ustalić, czy graniczne przedłużenie interwału QTc można powtórzyć. Interwencja farmakologiczna nie była wskazana w momencie oceny, jednak należy ją ponownie rozważyć w przypadku trwałego przedłużenia QTc (>460 ms) lub wystąpienia objawowych arytmii. Zalecono również kontynuację opieki endokrynologicznej, oceny rozwoju, terapii mowy, terapii zajęciowej oraz indywidualnego wsparcia edukacyjnego. Terapię hormonem wzrostu należy nadal ostrożnie oceniać ze względu na niepewną skuteczność oraz teoretyczne ryzyko powikłań naczyniowych opisywane w zaburzeniach związanych z PCNT.

Dane dotyczące długoterminowego monitorowania nie były dostępne, ponieważ pacjent został utracony podczas dalszej obserwacji po wstępnym badaniu w 2019 roku. W konsekwencji nie udało się udokumentować dalszego monitorowania endokrynologicznego, w tym oceny skuteczności rhGH i stężenia insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGF-1), postępów rozwojowych, powtórnego badania kardiologicznego oraz dodatkowej konsultacji genetycznej. Długoterminowy przebieg kliniczny i odpowiedź na leczenie pozostają zatem nieznane.

Ocena diagnostyczna była ograniczona ze względu na brak dostępności próbek DNA rodziców do analizy segregacji oraz brak badań funkcjonalnych pozwalających określić skutki biologiczne zidentyfikowanych wariantów genu PCNT. W konsekwencji nie można było ustalić fazy występowania dwóch wariantów (cis czy trans), nie można potwierdzić złożonej heterozygotyczności, a oba warianty pozostają sklasyfikowane jako warianty o niepewnym znaczeniu (VUS). Dodatkowo sekwencjonowanie egzomowe całego genomu nie pozwala wykluczyć wariantów patogennych położonych w głębokich regionach intronowych lub regulacyjnych; dlatego w przyszłych badaniach można rozważyć sekwencjonowanie całego genomu. Biorąc pod uwagę znane ryzyko powikłań naczyniowo-mózgowych i metabolicznych związanych z chorobami związanymi z PCNT, długoterminowa opieka multidyscyplinarna pozostaje uzasadniona.

Protokół

Badanie to zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z Deklaracją Helsińską i zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Changsha Hospital for Maternal & Opieka nad zdrowiem dziecka (nr zatwierdzenia CSSFYBJYEC-SOP-005-F07V2.0). Od rodziców pacjenta uzyskano pisemną świadomą zgodę zarówno na udział w niniejszym badaniu, jak i na publikację danych klinicznych oraz towarzyszących im obrazów. Wszystkie dane pacjenta i obrazy przedstawione w niniejszym manuskrypcie zostały poddane rygorystycznej anonimizacji w celu ochrony prywatności pacjenta. Narzędzia badawcze wykorzystane w niniejszym protokole wymieniono w Tabela materiałów.

1. Wstępna ocena kliniczna i charakterystyka fenotypowa

  1. Pomiary antropometryczne wykonano u pacjenta stojącego boso w pozycji wyprostowanej, przy użyciu skalibrowanych cyfrowych stadiometrów oraz wag elektronicznych.
  2. Wzrost i masę ciała naniesiono na chińskie krajowe standardy wzrostu z 2009 roku (Chinese National Growth Standards) w celu oceny stanu rozwoju. Obwód głowy (OFC) zmierzono za pomocą nierozciągliwej taśmy mierniczej i naniesiono na wykresy wzrostu specyficzne dla wieku i płci, aby ocenić występowanie mikrocefalii, definiowanej jako OFC poniżej –2 SD lub poniżej 3rd percentyla.
  3. Kompleksowe badanie dysmorfologii przeprowadził certyfikowany genetyk kliniczny w celu udokumentowania cech kraniofacjalnych. Ocenę neurorozwojową przeprowadzono przy użyciu Skali Inteligencji Wechslera dla Dzieci (WISC).
  4. Obliczono pełny iloraz inteligencji (FSIQ) i zinterpretowano go zgodnie z kryteriami diagnostycznymi niepełnosprawności intelektualnej zawartymi w podręczniku Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition (DSM-5) (stopień lekki: 50–69; umiarkowany: 35–49; ciężki: 20–34; głęboki: <20).

2. Ocena układu sercowo-naczyniowego i szkieletowego

  1. Wykonano standardowe 12-odprowadzeniowe badanie elektrokardiograficzne (EKG) przy prędkości przesuwu papieru 25 mm/s i kalibracji 10 mm/mV. Odcinek QT zmierzono ręcznie w odprowadzeniach II i V5, a skorygowany odstęp QT (QTc) obliczono według wzoru Bazetta (QTc = QT/√RR). Wydłużenie QTc zdefiniowano zgodnie z wartościami referencyjnymi dla dzieci jako >440 ms u chłopców.
  2. Wykonano zdjęcia rentgenowskie całego szkieletu, w tym projekcje przednio-tylne i boczne lewej dłoni i nadgarstka. Wiek kostny został oceniony przez radiologa pediatrycznego z wykorzystaniem atlasu Greulicha-Pyle’a w celu oceny dojrzewania szkieletowego oraz wykluczenia dysplazji szkieletowej.

3. Diagnostyka genetyczna

  1. Sekwencjonowanie wariantów liczby kopii chromosomów (CNV-seq) przeprowadzono z wykorzystaniem DNA z krwi obwodowej. Wykonano niskokryjące sekwencjonowanie całego genomu w celu oceny aneuploidii chromosomalnych oraz patogennych wariantów liczby kopii z rozdzielczością detekcji powyżej 100 kb.
  2. Sekwencjonowanie całego eksomu (WES) przeprowadzono na DNA genomicznym wyekstrahowanym z leukocytów krwi obwodowej przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA. Wychwyt eksomu wykonano za pomocą komercyjnego zestawu do wychwytu eksomu, a następnie przeprowadzono sekwencjonowanie na platformie sekwencjonowania nowej generacji, generując odczyty par końcowych 2 × 150 bp.
  3. Odczyty sekwencji dopasowano do genomu referencyjnego GRCh38/hg38 przy użyciu zwalidowanego algorytmu dopasowania, a identyfikację wariantów (variant calling) przeprowadzono za pomocą zwalidowanej potoki bioinformatycznej.
  4. Metryki kontroli jakości wykazały średnią głębokość sekwencjonowania powyżej 100×, przy czym ponad 98% docelowych eksonów osiągnęło pokrycie co najmniej 20×, a pokrycie eksonów PCNT przekroczyło 99%.
  5. Przeprowadzono sekwencjonowanie metodą Sangera, aby potwierdzić obecność i zygotyczność zidentyfikowanych wariantów PCNT u probanda. Ze względu na długi odstęp czasu od pierwotnej oceny klinicznej, oryginalne chromatogramy sekwencjonowania metodą Sangera nie były już dostępne w archiwach instytucjonalnych.
  6. Próbki DNA rodziców były niedostępne, w związku z czym nie można było przeprowadzić analizy segregacji w celu określenia fazy zidentyfikowanych wariantów.
  7. Interpretację wariantów przeprowadzono zgodnie z wytycznymi ACMG/AMP z 2015 roku. Protokół bioinformatyczny obejmował adnotację wariantów, ocenę częstości populacyjnej z wykorzystaniem gnomAD (v2.1.1), ExAC oraz chińskiej bazy danych Shenzhou Genome Database, przewidywanie patogenności in silico za pomocą SIFT, PolyPhen-2 oraz CADD (v1.6), analizę konserwacji ewolucyjnej za pomocą PhyloP i dopasowania wielokrotnego (UCSC Genome Browser) oraz mapowanie domen białkowych przy użyciu UniProt i bazy danych AlphaFold Protein Structure Database.
  8. Przejrzano również opublikowaną literaturę oraz bazę danych ClinVar w celu przypisania końcowych klasyfikacji wariantów.

4. Schemat diagnostyki różnicowej

  1. Mikrocefaliczny pierwotny karłowatość osteodysplastyczny typu II (MOPD II; OMIM #210720) został uznany za priorytetowy ze względu na ciężkie zahamowanie wzrostu o początku prenatalnym, niepełnosprawność intelektualną i charakterystyczne cechy kraniofacialne, mimo braku wyraźnej mikrocefalii podczas wstępnej oceny (Z-score obwodu głowy skorygowany o wiek i płeć > –2 SD).
  2. Rozważano zespół Seckela (OMIM #210600), lecz go wykluczono ze względu na brak profilu twarzy przypominającego głowę ptaka oraz brak wariantów patogennych lub prawdopodobnie patogennych w powiązanych genach (np. ATR i CEP152) zidentyfikowanych podczas analizy zestawu danych WES.
  3. Zespół Meiera-Gorlina (OMIM #224690) został wykluczony z powodu braku aplazji lub hipoplazji rzepek oraz braku wariantów patogennych lub prawdopodobnie patogennych w genach kompleksu przedreplikacyjnego (np. ORC1, ORC4, ORC6, CDC6, CDC45, GMNN i MCM5) podczas analizy zestawu danych WES.

Wyniki

Kompleksowa ocena kliniczna oraz analiza genomiczna pozwoliły na zidentyfikowanie profilu molekularnego i fenotypowego zgodnego z podejrzeniem karłowatości pierwotnej związanej z genem PCNT. Sekwencjonowanie całego eksomu (WES) ujawniło dwa nowe warianty missense w genie PCNT (NM_006031.5): c.5675A>G (p.Glu1892Gly) w eksonie 28 oraz c.9734G>T (p.Arg3245Ile) w eksonie 45. Sekwencjonowanie wariantów liczby kopii (CNV-seq) nie wykazało patogennych wariantów liczby kopii ani aneuploidii chromosomalnych powyżej progu detekcji 100 kb (Rysunek 2).

Oznaczenie tych wariantów jako „nowe” oparto na ich braku w głównych bazach danych populacyjnych (gnomAD, ExAC, bazie danych projektu 1000 Genomes oraz chińskiej bazie danych Shenzhou Genome Database), bazie ClinVar, repozytoriach specyficznych dla danej choroby (np. LOVD dla PCNT) oraz w literaturze opublikowanej w czasie przeprowadzania analizy. Analizy in silico przyniosły rozbieżne wyniki. Wariant c.5675A>G otrzymał wynik CADD PHRED równy 18,82 i został uznany przez SIFT za szkodliwy, podczas gdy wariant c.9734G>T otrzymał wynik CADD 7,87 i został uznany za tolerowany lub łagodny. Analizy PhyloP i dopasowania multiz wykonane przy użyciu przeglądarki UCSC Genome Browser wykazały odmienne wzorce konserwacji ewolucyjnej. Pozostały Glu1892 był silnie konserwowany u 100 gatunków kręgowców (wynik PhyloP: 4,88), natomiast pozostały Arg3245 był ściśle konserwowany u naczelnych, lecz wykazywał większą zmienność w innych liniach ssaków. Mapowanie domen białkowych z wykorzystaniem UniProt zlokalizowało oba warianty w centralnej domenie prętowej typu coiled-coil pericentryny.

Klinicznie u pacjenta stwierdzono głęboką niewydolność wzrostu po urodzeniu; podczas wstępnej oceny wzrost wynosił 103,5 cm (–4,04 SD), co odpowiadało wartości poniżej 3rd percentyla dla danego wieku. Ocena neurorozwojowa wykazała globalne opóźnienie rozwoju oraz iloraz inteligencji w skali pełnej (FSIQ) na poziomie 50. Badanie fizykalne ujawniło hiperteloryzm, krótkie szczeliny powiekowe, nisko osadzone małżowiny uszne oraz szeroki nasada nosa. Ocena elektrokardiograficzna wykazała pojedynczy graniczny skorygowany odstęp QT (QTc) wynoszący 450 ms (Rycina 1A, B).

Zgodnie z wytycznymi ACMG/AMP oraz dowodami podsumowanymi w Tabeli 1, oba warianty PCNT zostały zaklasyfikowane jako warianty o nieznanym znaczeniu (VUS).

Wariantnotacja HGVSzastosowano kryteria ACMGPodsumowanie dowodówKlasyfikacja końcowa
Wariant 1NM_006031.5:c.5675A>G p.(Glu1892Gly)PM2, PP3PM2: Nieobecne w bazach danych populacyjnych (gnomAD, ExAC, bazie danych projektu 1000 Genomes oraz specyficznej dla Chin bazie Shenzhou Genome Database). PP3: Analiza obliczeniowa wykazała szkodliwy efekt w oparciu o SIFT oraz wynik CADD PHRED wynoszący 18,82. Analizy PhyloP i dopasowania multiz wykazały silną konserwację ewolucyjną reszty Glu1892 (wynik PhyloP: 4,88).VUS (wariant o nieokreślonym znaczeniu)
Wariant 2NM_006031.5:c.9734G>T p.(Arg3245Ile)PM2, PP3PM2: Brak w bazach danych populacyjnych (gnomAD, ExAC, bazie danych projektu 1000 Genomes Project oraz specyficznej dla Chin bazie Shenzhou Genome Database). PP3: Analizy obliczeniowe dostarczyły ograniczonych dowodów. Chociaż konserwacja ewolucyjna u naczelnych oraz ocena strukturalna sugerowały możliwy wpływ na centralną domenę zwiniętego zwilściania (coiled-coil), wynik CADD (7,87) oraz przewidywania in silico nie dostarczyły wystarczających dowodów, aby potwierdzić patogenność poza klasyfikacją VUS.VUS (warianty o nieznanym znaczeniu)
Skróty: ACMG, Amerykańskie Kolegium Genetyki Medycznej i Genomiki; CADD, Combined Annotation Dependent Depletion; HGVS, Towarzystwo Wariacji Genomu Ludzkiego; PM2, brak w bazach danych populacyjnych; PP3, dowody obliczeniowe; VUS, wariant o niepewnym znaczeniu.

Tabela 1: Klasyfikacja ACMG/AMP zidentyfikowanych wariantów PCNT. Podsumowanie dwóch wariantów missense PCNT zidentyfikowanych za pomocą sekwencjonowania całego egzomu, obejmujące nomenklaturę HGVS, zastosowane kryteria ACMG/AMP, dowody wspierające oraz końcową klasyfikację wariantu.

Dyskusja

Niniejszy raport przypadkowy opisuje 7-letniego chłopca pochodzenia chińskiego z dwoma nowymi wariantami missense w genie PCNT (c.5675A>G/p.Glu1892Gly oraz c.9734G>T/p.Arg3245Ile), u którego wystąpiło głębokie zahamowanie wzrostu postnatalnego (wzrost 103,5 cm, –4,04 SD w wieku 7 lat), globalne opóźnienie rozwoju, niepełnosprawność intelektualna (IQ ogólne = 50 w skali inteligencji Wechslera) oraz charakterystyczny dysmorfizm kraniofacjalny, przy jednoczesnym braku kilku kanonicznych cech klasycznego MOPD II. W porównaniu z klasycznym fenotypem diagnostycznym, u pacjenta nie stwierdzono ciężkiego ograniczenia wzrostu wewnątrzmaciczego (masa urodzeniowa 2,5 kg, zaklasyfikowana jako mała w stosunku do wieku ciążowego), charakterystycznej dysplazji kostnej ani jawnej mikrocefalii. Ocena szkieletu wykazała opóźnienie wieku kostnego (6 lat) bez charakterystycznych nieprawidłowości radiologicznych, a obwód głowy w wymiarze potyliczno-czołowym, skorygowany o wiek i płeć, pozostał powyżej progu diagnostycznego dla mikrocefalii (Z-score: –1,2) podczas wstępnej oceny. Ponadto analiza CNV-seq nie wykazała patogennych wariantów liczby kopii ani aneuploidii chromosomalnych przekraczających 100 kb, co wsparło dalszą ocenę w kierunku etiologii monogenicznej.

Choć fenotyp różni się od klasycznych kryteriów diagnostycznych MOPD II, zaburzenia związane z PCNT wykazują znaczną heterogeniczność fenotypową i ekspresywność zależną od wieku. Wcześniejsze badania kohortowe wykazały, że mikrocefalia i manifestacje szkieletowe mogą być łagodne lub stać się bardziej widoczne w późnym dzieciństwie lub okresie dojrzewania, a niektóre osoby dotknięte tym schorzeniem wykazują przede wszystkim ciężkie postnatalne zahamowanie wzrostu i charakterystyczne cechy kraniofacjalne, bez klasycznego wewnątrzmacicznego ograniczenia wzrostu lub dysplazji szkieletowej3,4. W związku z tym wyniki te należy interpretować jako atypowy, podejrzewany fenotyp prymordialnego karłowactwa związanego z PCNT z cechami nakładającymi się na MOPD II, a nie jako definitywną diagnozę klasycznego MOPD II.

Normalna maksymalna odpowiedź hormonu wzrostu (12,39 ng/mL), zaobserwowana mimo znacznego niskorosłości, jest zgodna z aktualnym stanem wiedzy, według którego zaburzenia wzrostu w schorzeniach związanych z PCNT wiążą się przede wszystkim z nieprawidłowościami w rozwoju szkieletu i funkcjonowaniu płytek wzrostowych, a nie z niedoborem hormonów przysadkowych. Obserwacja ta dodatkowo podkreśla znaczenie kompleksowej oceny genomicznej u pacjentów z ciężką niskorosłością i prawidłowymi wynikami badań endokrynologicznych.

Rozbieżne przewidywania in silico uzyskane dla dwóch wariantów PCNT ilustrują ograniczenia komputerowej oceny patogenności wariantów typu missense w dużych białkach wielodomenowych. Wariant c.5675A>G otrzymał silniejsze wsparcie komputerowe dla patogenności (wynik CADD PHRED 18.82; SIFT: szkodliwy), podczas gdy c.9734G>T był konsekwentnie przewidywany jako tolerowany lub łagodny (wynik CADD 7,87). Wyniki te pokazują, że sama analiza komputerowa jest niewystarczająca do klasyfikacji wariantów, szczególnie w przypadku dużych białek rusztowaniowych o złożonych domenach strukturalnych i funkcjonalnych. Pericentryna, kodowana przez PCNT, jest niezbędnym białkiem rusztowaniowym centrosomalnym zaangażowanym w organizację wrzeciona mitotycznego, odpowiedź na uszkodzenia DNA oraz regulację cyklu komórkowego8. Badania eksperymentalne wykazały ponadto, że utrata pericentryny zaburza asocjację centriolów w biegunach wrzeciona, co prowadzi do przedwczesnej separacji centriolów i nieprawidłowości centrosomów9.

Pojedyncze badanie elektrokardiograficzne wykazało graniczną wartość skorygowanego odstępu QT wynoszącą 450 ms. Znalezisko to nie wiązało się z objawami, zaburzeniami elektrolitowymi, stosowaniem leków wydłużających odstęp QT ani rodzinnym wywiadem w kierunku dziedzicznych arytmii10. Chociaż badania eksperymentalne sugerowały potencjalną rolę białek centrosomalnych w biologii układu sercowo-naczyniowego, w tym w regulacji komórek mięśni gładkich naczyń oraz w kontroli cyklu komórkowego kardiomiocytów, znaczenie kliniczne granicznego QTc zaobserwowanego u tego pacjenta pozostaje niepewne11. Do ustalenia, czy wynik ten jest powtarzalny i istotny klinicznie, wymagane byłyby powtórne badanie EKG, monitorowanie ambulatoryjne oraz formalna ocena kardiologiczna w zakresie pediatrii12.

Podczas interpretacji tego przypadku należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń. Jako opis pojedynczego pacjenta, wyniki te nie mogą ustanowić definitywnych relacji genotyp-fenotyp. Próbki DNA rodziców były niedostępne, co uniemożliwiło analizę segregacji oraz potwierdzenie konfiguracji trans dwóch wariantów PCNT. W konsekwencji nie można było potwierdzić heterozygotyczności złożonej, a oba warianty pozostają sklasyfikowane jako warianty o niepewnym znaczeniu (VUS). Nie przeprowadzono badań funkcjonalnych oceniających biologiczne efekty tych wariantów, przez co ich konsekwencje molekularne nie zostały rozstrzygnięte. Chociaż WES zapewnia szerokie pokrycie regionów kodujących, nie można wykluczyć obecności wariantów patogennych zlokalizowanych w głębokich regionach intronowych lub regulacyjnych. Ponadto niedostępne były dane z długoterminowej obserwacji, ponieważ pacjent nie zgłosił się na kolejne wizyty po wstępnej ocenie, co uniemożliwiło ocenę odpowiedzi na leczenie, wyników rozwoju oraz ponowną ocenę kardiologiczną.

Pomimo tych ograniczeń, identyfikacja wariantów kandydujących w egzonach 28 i 45 dostarcza dodatkowych informacji klinicznych i molekularnych do rozszerzającego się spektrum zaburzeń związanych z PCNT i podkreśla wartość kompleksowych badań genomicznych u pacjentów z ciężkim zahamowaniem wzrostu i opóźnieniem rozwoju4. Wyniki te wspierają również wielodyscyplinarne podejście terapeutyczne, w tym nadzór w kierunku powikłań naczyniowych zgodnie z opublikowanymi zaleceniami dotyczącymi monitorowania naczyń10 oraz dalszą opiekę kardiologiczną ze względu na zaobserwowany graniczny odstęp QTc. Poradnictwo genetyczne powinno jasno komunikować obecną klasyfikację jako VUS oraz niepewność dotyczącą związku z chorobą, dopóki nie pojawią się dodatkowe dowody z analizy segregacji lub badania funkcjonalne. Przyszłe badania powinny skupić się na charakterystyce funkcjonalnej tych wariantów z wykorzystaniem fibroblastów pochodzących od pacjentów w celu oceny lokalizacji centrosomalnej i defektów wrzeciona mitotycznego13, systematycznej ocenie kardiologicznej w większych kohortach PCNT oraz dalszej wymianie danych poprzez repozytoria takie jak ClinVar, aby ułatwić przyszłą klasyfikację wariantów.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują pacjentowi oraz jego rodzinie za udział w niniejszym badaniu i wyrażenie zgody na publikację tego opisu przypadku. Autorzy pragną również podziękować zespołowi genetyki klinicznej w Szpitalu Opieki nad Matką i Dzieckiem w Changsha za wkład w opiekę nad pacjentem i charakterystykę fenotypową, a także personelowi laboratorium w Centrum Genetyki Medycznej za wsparcie techniczne przy sekwencjonowaniu całego egzomu. Praca ta była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Naturalnych Chin (Grant nr 82301845) oraz Prowincjonalną Fundację Nauk Naturalnych Hunan (Grant nr 2024JJ40187). Agencje finansujące nie brały udziału w projektowaniu badania, gromadzeniu danych, analizie danych, decyzji o publikacji ani w przygotowaniu rękopisu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Elektrokardiograf 12-odprowadzeniowyGE HealthcareMAC 5500 HD (Software v2.0)Ocena stanu serca i pomiar odstępu QT
Analizator genetyczny ABI 3730xlApplied BiosystemsFirmware v3.0Walidacja sekwencjonowania metodą Sangera
ANNOVARChildren's Hospital of Philadelphia (CHOP)v2021-02-01Adnotacja wariantów
Zestaw do sekwencjonowania cyklicznego BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing KitThermo Fisher ScientificKat. nr 4337456Reakcje sekwencjonowania metodą Sangera
BWA-MEMBroad Institutev0.7.17Mapowanie sekwencji
ClinVarNational Center for Biotechnology Information (NCBI)Dostęp w czerwcu 2026Kliniczna baza danych wariantów
Combined Annotation Dependent Depletion (CADD)University of Washingtonv1.6Przewidywanie patogeniczności in silico
System cyfrowej radiografii (DR)Siemens HealthineersYsio Max (syngo.via v4.0)Przegląd szkieletu i ocena wieku kostnego
Ensembl Variant Effect Predictor (VEP)EMBL-EBIv104Adnotacja wariantów
GATK HaplotypeCallerBroad Institutev4.2.6.1Wywoływanie wariantów (variant calling)
Genome Aggregation Database (gnomAD)Broad Institutev2.1.1 / v3.1.2Baza danych częstości populacyjnych
Genom referencyjny GRCh38/hg38Genome Reference ConsortiumBuild 38, Patch 13Referencja do mapowania sekwencji
Zestaw do przygotowania bibliotek do niskoprzenakowego sekwencjonowania całego genomuBerry GenomicsDostępny komercyjniePrzygotowanie bibliotek CNV-seq
System sekwencjonowania NovaSeq 6000IlluminaReagent Kit v1.5 (300 cykli)Sekwencjonowanie całego egzomu
PolyPhen-2Harvard Medical Schoolv2.3.10Przewidywanie patogeniczności in silico
Zestaw QIAamp DNA Blood Mini KitQIAGENKat. nr 51104Ekstrakcja genomowego DNA
SIFTJ. Craig Venter Institutev5.2.2Przewidywanie patogeniczności in silico
Zestaw SureSelect Human All Exon V6 KitAgilent TechnologiesKat. nr G9904BWychwytywanie egzomów i przygotowanie bibliotek

Bibliografia

  1. Gharehdaghi EE, et al. Novel mutation in patients with microcephalic osteodysplastic primordial dwarfism type II (MOPD II). Metab Brain Dis. 2024;40(1):18.
  2. Bober MB, Jackson AP. Microcephalic osteodysplastic primordial dwarfism, type II: a clinical review. Curr Osteoporos Rep. 2017;15(2):61-69.
  3. Rauch A, et al. Mutations in the pericentrin (PCNT) gene cause primordial dwarfism. Science. 2008;319(5864):816-19.
  4. Willems M, et al. Molecular analysis of pericentrin gene (PCNT) in a series of 24 Seckel/microcephalic osteodysplastic primordial dwarfism type II (MOPD II) families. J Med Genet. 2010;47(12):797-802.
  5. Jurca AD, et al. Clinical challenges in diagnosing primordial dwarfism: insights from a MOPD II case study. Medicina (Kaunas). 2024;60(11):1906.
  6. Retterer K, et al. Clinical application of whole-exome sequencing across clinical indications. Genet Med. 2016;18(7):696-704.
  7. Miller DT, et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am J Hum Genet. 2010;86(5):749-64.
  8. Watanabe S, et al. Centriole-independent mitotic spindle assembly relies on the PCNT-CDK5RAP2 pericentriolar matrix. J Cell Biol. 2020;219(12):e202006010.
  9. Kim J, Kim J, Rhee K. PCNT is critical for the association and conversion of centrioles to centrosomes during mitosis. J Cell Sci. 2019;132(6):jcs225789.
  10. Duker AL, et al. Microcephalic osteodysplastic primordial dwarfism type II is associated with global vascular disease. Orphanet J Rare Dis. 2021;16(1):231.
  11. Majumder S, et al. Pericentrin deficiency in smooth muscle cells augments atherosclerosis through HSF1-driven cholesterol biosynthesis and PERK activation. JCI Insight. 2023;8(21):e173247.
  12. Steinfeldt J, Becker R, Vergarajauregui S, Engel FB. Alternative splicing of pericentrin contributes to cell-cycle control in cardiomyocytes. J Cardiovasc Dev Dis. 2021;8(8):87.
  13. Waich S, et al. Novel PCNT variants in MOPD II with attenuated growth restriction and pachygyria. Clin Genet. 2020;98(3):282-7.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pierwotny kar owatowarianty missenseop nienie rozwojuniepe nosprawno intelektualnacechy dysmorficzneheterogenno genetycznawariant o niepewnym znaczeniu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.