Znormalizowana Preparacja Izolowanego Gładkiego Mięśnia Dwunastnicy Królika Do In Vitro Oceny Farmakologicznej Aktywności Skurtczowej

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół standaryzujący przygotowanie izolowanego mięśnia gładkiego dwunastnicy królika do in vitro oceny farmakologicznej, z wykorzystaniem Horyzontalnego Systemu Eksperymentów na Mięśniach Gładkich o Stałej Temperaturze do rejestracji danych w czasie rzeczywistym dotyczących aktywności skurczu.

Streszczenie

Zskoordynowana aktywność skurczową mięśni gładkich przewodu pokarmowego stanowi fizjologiczną podstawę utrzymania normalnych funkcji trawienia, wchłaniania i transportu, a jej dysfunkcja jest ściśle związana z zaburzeniami motoryki. Technika perfuzji izolowanych narządów eliminuje złożone czynniki in vivo—takie jak czynniki nerwowe, hormonalne i krążeniowe—służąc jako klasyczny model do badań farmakologicznych. W tym celu niniejsze badanie szczegółowo opisuje stopniowy protokół standaryzowanej przygotowania izolowanych mięśni gładkich dwunastnicy królika. Przepływ proceduralny podkreśla krytyczne kroki przygotowywania roztworów, uśmiercania królika, wykonywania precyzyjnej środkowej laparotomii śródbrzusznej w warunkach aseptycznych dla szybkiego wycięcia tkanki, zawieszania pasm mięśni gładkich oraz kalibracji przetworników do rejestracji naprężeń w czasie rzeczywistym. Na podstawie tej platformy technicznej zweryfikowaliśmy dalszą metodę oceniając wpływ Huoxiang Zhengqi Oral Liquid (HXZQ-OL) na mimowolne skurcze oraz skurcze tętniczne wywołane acetylocholiną/chlorkiem baru. Podsumowując, niniejszy protokół zapewnia solidną i wysoce reproduktywalną ramę metodologiczną, dostarczając szeroko stosowanej in vitro platformy do przesiewowego oceniania farmakologicznego środków terapeutycznych ukierunkowanych na motorykę przewodu pokarmowego.

Wprowadzenie

Zskoordynowana czynność skurczową mięśni gładkich przewodu pokarmowego służy jako fizjologiczne podstawa utrzymania normalnych funkcji trawienia, wchłaniania i transportu¹. Jego dysfunkcja jest ściśle związana z różnymi powszechnymi zaburzeniami klinicznymi, w tym zespołem jelita drażliwego², dyspepsją funkcjonalną³ oraz zaburzeniami ruchliwości przewodu pokarmowego po operacji⁴. Wyjaśnienie mechanizmów molekularnych i farmakologicznych regulujących czynność mięśni gładkich jest kluczowe dla opracowania nowych terapii prokinetycznych lub przeciwskurczowych. W tej dziedzinie badań technika izolowanej perfuzji narządów służy jako klasyczny model. Oferuje praktyczną wartość poprzez wyeliminowanie złożonych interferencji in vivo, takich jak czynniki nerwowe, hormonalne i krążeniowe, umożliwiając tym samym bezpośrednią i precyzyjną ocenę wpływu leków lub substancji czynnych na napięcie mięśni gładkich^5,6.

Ustanowienie stabilnych i niezawodnych protokołów do in vitro przygotowania tkanek i rejestracji danych jest istotne dla uzyskania wyników wysokiej jakości i powtarzalnych. Istniejące metody eksperymentów in vitro na mięśniach jelit wymagają dalszej optymalizacji i standaryzacji w kilku obszarach: standaryzowanego zarządzania zwierzętami doświadczalnymi, starannej techniki chirurgicznej do pobierania tkanek, spójnej kontroli środowiska systemów perfuzji oraz zautomatyzowanego nabywania danych w połączeniu ze standaryzowaną analizą. Na przykład temperatura płynu perfuzyjnego i poziomy pH, uszkodzenia mechaniczne podczas pobierania tkanek oraz ustawienia preload tkanek mogą znacząco wpływać na żywotność tkanek i wprowadzać błędy eksperymentalne. Czynniki te obniżają wiarygodność wyników i utrudniają porównywalność różnych badań^7,8.

Dlatego niniejsze badanie ma na celu ustanowienie i dopracowanie zstandardyzowanego protokołu przygotowania izolowanych próbek mięśni gładkich dwunastnicy królików oraz wykonywania rejestracji napięcia w czasie rzeczywistym. Protokół ten systematycznie opisuje cały proces, od etyki i opieki nad zwierzętami doświadczalnymi, aseptycznego otworu brzusznego i precyzyjnego izolowania odcinka jelita, aż do osiągnięcia kontroli środowiska, standaryzowanych ustawień preload napięcia i wysokiej wierności akwizycji danych przy użyciu zintegrowanego poziomego systemu perfuzji o stałej temperaturze i wielokanałowego systemu akwizycji sygnałów fizjologicznych. Na podstawie tej zstandardyzowanej platformy technicznej zastosowaliśmy ponadto metody kumulacyjnego dawkowania do ilościowej oceny wpływu Huoxiang Zhengqi Oral Liquid (HXZQ-OL), spełniającego normy jakości Farmakopei Chińskiej (wydanie 2025)⁹, na spontaniczne skurcze i skurcze tętniące wywołane przez acetylocholinę i chlorek baru w izolowanych mięśniach gładkich dwunastnicy. Huoxiang Zhengqi Oral Liquid (HXZQ-OL), doustna forma dawkowania klasycznej tradycyjnej chińskiej formuły leczniczej Huoxiang Zhengqi, jest powszechnie stosowany w Chinach w zaburzeniach przewodu pokarmowego, co stanowi uzasadnienie dla oceny jego bezpośrednich wpływów na izolowane mięśnie gładkie jelit. To badanie nie tylko dostarcza bezpośrednich dowodów farmakologicznych wyjaśniających wpływ regulacji mięśni gładkich przewodu pokarmowego przez HXZQ-OL, ale protokół eksperymentalny służy również jako zstandardyzowany, powtarzalny model metodologiczny do farmakologicznego przesiewania i badań in vitro tkanek mięśni gładkich przewodu pokarmowego.

Protokół

W niniejszym badaniu wykorzystano zdrowe dorosłe króliki Nowej Zelandii, rasy White, o dowolnej płci (waga 2,0–2,5 kg). Wszystkie procedury eksperymentów na zwierzętach przeprowadzano zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Medycyny Tradycyjnej w Chengdu (Numer zgody: [2026070]). Podjęto wszelkie możliwe kroki, aby zminimalizować cierpienie zwierząt i zmniejszyć liczbę użytych zwierząt. Schemat przepływu pracy przedstawiono na Rysunku 1.

1. Przygotowanie roztworów

UWAGA: Wszystkie roztwory robocze, w tym roztwór Tyrode'a, acetylocholinę (ACh), chlorek baru, atropinę i werapamil, należy przygotować świeżo bezpośrednio przed eksperymentem.

1. Przygotować 1 L roztworu Tyrode'a poprzez rozpuszczenie 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 1,0 mM MgCl₂, 12 mM NaHCO₃, i 5,6 mM D-glukozy. Przed użyciem nasycić mieszaniną 95% O₂ / 5% CO₂ przez 15–30 min, dostosowując pH do 7,3–7,4 (patrz Tabela Materiałów).
2. Przygotować 1 mM roztwór acetylocholiny (ACh). Zabrać 20 µL i dodać do 20 mL roztworu Tyrode'a. Dobrze wymieszać, aby uzyskać 1 µM roztwór ACh.
3. Przygotować 1 M roztwór chlorku baru (BaCl₂). Zabrać 20 µL i dodać do 20 mL roztworu Tyrode'a. Dobrze wymieszać, aby uzyskać 1 mM roztwór BaCl₂.
   UWAGA: BaCl₂ jest wysoce toksyczny i drażniący. Podczas obsługi nosić sprzęt ochronny w komorze odpylającej i usuwać odpady zgodnie z regulacjami.
4. Przygotować 10 mM roztwór siarczanu atropiny. Zabrać 20 µL i dodać do 20 mL roztworu Tyrode'a. Dobrze wymieszać, aby uzyskać 10 µM roztwór siarczanu atropiny.
5. Przygotować 1 mM roztwór chlorowodorku werapamilu. Zabrać 2 µL i dodać do 20 mL roztworu Tyrode'a. Dobrze wymieszać, aby uzyskać 0,1 µM roztwór chlorowodorku werapamilu.
   UWAGA: Stężenia przygotowanych roztworów określono na podstawie poprzednich badań^6,10,11 i zostały dodatkowo zoptymalizowane na podstawie naszych wstępnych eksperymentów, aby zapewnić optymalne warunki eksperymentalne.

2. Przygotowanie in vitro preparatów gładkiego mięśnia dwunastnicy królika

1. Eutanazja królika
   1. Umocować królika w urządzeniu do unieruchamiania królika (Rysunek 2A,B i Rysunek 3A). Przeprowadzić eutanazję poprzez podanie przedawkowania pentobarbitalu sodowego (120 mg/kg) przez żyłę uszną u królików (Rysunek 2C i Rysunek 3B).
      UWAGA: Potwierdzenie całkowitej śmierci musi nastąpić na podstawie następujących kryteriów: rozszerzone źrenice, brak odruchu źrenicowego na światło, zaprzestanie oddychania i bicia serca oraz utrata odruchu podeszwowego.
2. Przygotowanie i dezynfekcja miejsca operacji
   1. Umocować królika w pozycji na plecach na stole operacyjnym (Rysunek 2D i Rysunek 3C). Przy użyciu nożyczek chirurgicznych (Rysunek 2E) lub elektrycznej maszynki do golenia całkowicie usunąć wszystkie włosy brzuszne, aby odsłonić skórę w wyznaczonym obszarze operacyjnym (Rysunek 3D).
   2. Używając szczypiec do opatrunków (Rysunek 2E), chwycić bawełnianą kulkę nasączoną jodem (Rysunek 2F,G). Rozpoczynając od środka planowanego nacięcia chirurgicznego, nakładać środek dezynfekujący w koncentrycznym, okrągłym wzorze od wewnątrz na zewnątrz (Rysunek 3E).
      UWAGA: Obszar dezynfekcji powinien sięgać poza krawędzie nacięcia, aby zapewnić całkowitą pokrycie całej skóry pola operacyjnego. Po zdezynfekowaniu należy odczekać co najmniej 3 min, aby pozwolić na naturalne wysuszenie środka dezynfekującego na powierzchni skóry.
   3. Nałożyć sterylną narzutę (Rysunek

Wyniki

Niniejszy protokół eksperymentalny opisuje standaryzowaną metodę przygotowania izolowanych pasków mięśnia dwunastnicy królika oraz proces rejestracji ich dynamicznych zmian napięcia i częstotliwości w czasie rzeczywistym za pomocą układu perfuzji izolowanego narządu. Zgodnie z tym protokołem, HXZQ-OL był sekwencyjnie dodawany poprzez kumulatywne dawkowanie do 20 mL kąpieli roztworu Tyrode'a, osiągając końcowe stężenia objętościowe 10, 20, 30, 40 i 50 µL/mL w kąpieli. Odwołując się do standardów Chińskiej Farmakopei (wyda...

Dyskusja

Izolowana perfuzja narządów i techniki rejestracji naprężeń reprezentują klasyczne metody badania fizjologii i farmakologii mięśni gładkich. Ich wyniki mają znaczące znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów patofizjologicznych leżących u podstaw zaburzeń motoryki przewodu pokarmowego, chorób naczyń i dysfunkcji macicy^12,13,14,15. Wykorzystując standaryzowany ex vivo model dwunastnicy król...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0.5-10 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101004
10 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-10
10 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043804
100 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043807
100-1000 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101014
1250 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-1250
20 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-010105
200 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-200
50 mL Conical centrifuge tube	LABSELECT	CT-002-50A
5-50 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101006
Acetylcholine chloride	Supelco	PHR1546
All-in-One Lab Computer	Lenovo	R5-3500U
Atropine sulfate	Macklin	A822893
Barium chloride	Sigma-Aldrich	342920
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	499609
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
Freezing point osmometer	Shanghai Precision Instruments Co., Ltd.	BS100
Horizontal Constant-Temperature Smooth Muscle Experiment System	Chengdu Instrument Factory	DSQG-1
Huoxiang Zhengqi Oral Liquid	Taiji Group Co., Ltd.	Z50020409
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Multi-Channel Physiological Recording and Processing System	Chengdu Instrument Factory	RM6240XC
New Zealand White rabbits	Pizhou Dongfang Breeding Co., Ltd. (License No.: SCXK[Su]2022-0004)	either sex (weighing 2.0–2.5 kg)
pH meter	Shanghai Leici	PHS-25
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Povidone-iodine	H&H Medical Co., Ltd.	3180132
Precision balance (0.1 mg)	Sartorius	BCE64i
Saline solution	H&H Medical Co., Ltd.	100014438029
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium dihydrogen phosphate	Supelco	1063700250
Sodium Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Verapamil Hydrochloride	Macklin	V820460
Vortex mixer	Kylin-Bell	XW-80A