Olej mikroalg poprawia metabolizm lipidów wątrobowych w modelu myszy indukowanym dietą wysokotłuszczową

Podsumowanie

Wykorzystując myszy model choroby steatotycznej związanej z zaburzeniami metabolicznymi wywołanymi dietą tłuszczową, badanie ocenia efekty suplementacji oleju mikroalg bogatym w kwas dokosaheksaen (DHA) i wykazuje, że interwencja poprawia profil lipidowy wątroby i wiąże się ze zmianami w składzie mikrobioty jelitowej.

Streszczenie

Metabolicznie dysfunkcjonalna steatotyczna choroba wątroby jest powszechnym zaburzeniem metabolicznym związanym z dysbiozą mikrobioty jelitowej oraz zaburzeniami lipidów wątrobowych. W tym badaniu opracowano model myszy indukowany dietą wysokotłuszczową, aby ocenić efekty suplementacji olejem mikroalgowym bogatym w DHA. Myszy (n = 4 na grupę) były karmione dietą wysokotłuszczową przez 8 tygodni i codziennie podawano doustnie olej z mikroalg, probiotyki lub połączenie oleju mikroalg bogatego w DHA i probiotyków. Oceniono parametry metaboliczne (skład mikrobioty jelitowej (sekwencjonowanie 16S rRNA), funkcjonalne szlaki mikroorganizmów oraz profile metabolomiczne wątroby. Wyniki wykazały, że olej z mikroalg bogaty w DHA poprawił homeostazę lipidów, co wskazywały obniżone poziomy LDL-c i trójglicerydów wątroby w surowicy oraz wzrost lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL-c), co wiązało się ze złagodzeniem uszkodzenia wątroby i stresu oksydacyjnego. Analiza mikrobiomu ujawniła selektywne zmiany w składzie mikroorganizmów jelitowych, w tym wzbogacenie Lactobacillus i Bifidobacterium oraz redukcję taksonów związanych z dietą wysokotłuszczową, takich jak Clostridium i Ruminococcus. Profilowanie funkcjonalne wskazywało na zmiany w szlakach metabolicznych mikroorganizmów, w tym cykl ratunkowy L-metioniny oraz degradację fenyloetylaminy. Zintegrowana analiza mikrobiomu i metabolizmu dodatkowo zidentyfikowała powiązania między taksonami mikroorganizmów a metabolitami wątrobowymi zaangażowanymi w metabolizm kwasów tłuszczowych, odmianę kwasów żółciowych oraz szlaki aminokwasowe. Wyniki te wskazują, że suplementacja oleju mikroalg bogatym w DHA wiąże się z poprawą metabolizmu lipidów wątrobowych i składu mikrobioty jelitowej w tym modelu, bez bezpośredniego mechanizmu przyczynowego.

Wprowadzenie

Steatotyczna choroba wątroby związana z zaburzeniami metabolicznymi (MASLD) to bardzo powszechna choroba na świecie, dotykająca około 32,4^{% światowej} populacji. MASLD charakteryzuje się nadmiarem tłuszczu w wątrobie, który przyczynia się do różnych związanych z tym problemów zdrowotnych. Ludzki przewód pokarmowy zawiera zaawansowaną i zrównoważoną społeczność mikroorganizmów, obejmującą bakterie, wirusy, grzyby i pasożyty². Ze względu na interakcję między tą społecznością drobnoustrojową a wątrobą, probiotyki są postrzegane jako obiecująca metoda zapobiegania i leczenia MASLD poprzez modulację^tego kluczowego połączenia. Nowe badania wskazują, że probiotyki mogą pozytywnie wpływać na MASLD poprzez modulację mikrobiomu jelitowego i redukcję stanu zapalnego. Konkretnie, podawanie probiotyków wykazało, że przywraca równowagę mikrobioty jelitowej i zmniejsza stan zapalny wątroby⁴. Ponadto wykazano, że niektóre probiotyki, zwłaszcza te, które mogą przyspieszać metabolizm kwasów żółciowych, łagodzą steatozą wątroby (stłuszczoną wątrobę) i wspierają ogólny stan metaboliczny u osób cierpiących na MASLD ^5,6. Ponadto mocne dowody wskazują, że pacjenci z MASLD wykazują istotne zmiany w środowisku jelitowym, co jest schorzeniem znanym jako dysbioza ^7,8. Kluczowym odkryciem było zmniejszenie różnorodności alfa, co oznacza, że całkowita liczba i różnorodność gatunków drobnoustrojów jest zmniejszona. Ponadto mikrobiota jelitowa pacjentów z MASLD często charakteryzuje się dominacją typu bakteryjnego Firmicutes ^9,10,11. Osoby z MASLD często spożywają niekorzystne diety, zazwyczaj obejmujące wysokie spożycie tłuszczów nasyconych i niskie spożycie niezbędnych mikroskładników^12,13. Te niezdrowe wzorce żywieniowe, często obserwowane w populacjach miejskich, korelują ze zwiększonym stosunkiem Firmicutes do Bacteroidetes w porównaniu z osobami mieszkającymi na terenach wiejskich¹⁴. Ponadto diety wysokotłuszczowe były bezpośrednio powiązane z pogłębianiem nierównowagi jelitowej. Konkretnie, zarówno badania na modelach zwierzęcych, jak i badania na pacjentach z zaawansowaną chorobą wątroby (MASLD) wykazały, że spożycie wysokiego spożycia tłuszczu było powiązane ze zmianą wirusomu jelit. Zmiany te obejmowały wzrost aktywności fagów litycznych, co ostatecznie pogorszyło istniejącą dysbiozę jelitową^15,16.

Wielonienasycone kwasy tłuszczowe omega-3 (PUFA), powszechnie występujące w oleju rybim, mogą poprawić metabolizm lipidów i regulować mikrobiotę jelitową. Olej z mikroalg stał się obiecującym i zrównoważonym źródłem omega-3 PUFA. Konkretnie, olej mikroalg Schizochytrium jest obiecującym źródłem komercyjnym, ponieważ zawiera wysokie stężenie czystego kwasu dokozaheksaenowego (DHA). Wcześniejsze badania tej grupy wykazały, że w modelu myszy wywołanego otyłością wywołaną wysokotłuszczową dietą (HFD) skuteczność oleju mikroalg w wspomaganiu utraty wagi była porównywalna z olejem rybim i lekiem odchudzającym Orlistat. Co istotne, olej mikroalg wykazywał te efekty odchudzania wcześniej niż olej rybi lub Orlistat¹⁷. Wcześniejsze ustalenia wykazały również, że olej z mikroalg wywierał wyraźne i korzystne działanie na mikrobiotę jelitową w porównaniu z komercyjnym olejem rybim i Orlistatem. Chociaż olej mikroalg nie zmieniał znacząco ogólnej różnorodności bakterii, wiązał się ze zwiększoną liczebnością korzystnych bakterii produkujących krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA) oraz zmniejszeniem liczby taksonów patogennych, w tym rodzaju Desulfovibrio powiązanego z otyłością. Ponadto olej mikroalg w niezwykły sposób przywrócił metaboliczne zdolności mikrobioty jelitowej, wzmacniając szlaki związane z aminokwasami, SCFA i metabolizmem kwasów żółciowych, jednocześnie znacząco zmniejszając biosyntezę lipopolisacharydów (LPS). Te modulacje prawdopodobnie przyczyniły się do poprawy metabolizmu lipidów oraz wzmocnienia bariery śluzowej okrężnicy, co sugeruje, że olej z mikroalg był lepszym suplementem diety łagodzącym otyłość¹⁷.

Pomimo postępów w łączeniu dysbiozy mikrobioty jelitowej z rozwojem MASLD, specyficzne zależności między składem mikroorganizmów, funkcjami metabolicznymi mikroorganizmów a metabolizmem lipidów wątrobowych pozostają niedo w pełni poznane. W szczególności niejasne pozostają niejasne związki przyczynowe między zmianami w mikrobiocie a postępem choroby, a nie zostało systematycznie zbadane, czy interwencje dietetyczne, takie jak olej mikroalg bogaty w DHA, są powiązane ze skoordynowanymi zmianami w społecznościach mikrobiologicznych jelitowych i profilach metabolicznych gospodarzy. Olej mikroalg bogaty w DHA to zrównoważone i wydajne źródło kwasów tłuszczowych omega-3, z zawartością oleju mikroalg bogatą w DHA porównywalną z suplementami pochodzącymi z ryb. Wcześniejsze badania sugerowały, że suplementacja oleju mikroalg bogatym w DHA może poprawić steatozę wątroby i parametry metaboliczne^18,19. Jednak jego powiązania ze składem mikrobioty jelitowej oraz funkcją metabolicznym mikroorganizmów w kontekście MASLD pozostają niejasne.

Dlatego w niniejszym badaniu zastosowano model myszy indukowany dietą wysokotłuszczową do oceny wpływu suplementacji oleju mikroalg bogatego w DHA na parametry metabolyczne, skład mikrobioty jelitowej oraz profile metabolomiczne wątroby. Postawiono hipotezę, że suplementacja oleju mikroalg bogatym w DHA będzie wiązana z poprawą metabolizmu lipidów wątrobowych oraz równoczesnymi zmianami w składzie mikrobioty jelitowej i szlakach metabolicznych mikroorganizmów.

Protokół

Szczegóły dotyczące wszystkich zwierząt, diet, odczynników, zestawów, instrumentów, oprogramowania i dostawców usług wykorzystywanych w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów. Wszystkie badania na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) dotyczących opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i uzyskały zgodę Komitetu ds. Zwierząt Eksperymentalnych Szpitala Prowincjonalnego Shandong (etyczna akceptacja nr 2022–007, zatwierdzona 24 stycznia 2022 r.).

UWAGA: Krew zwierzęca, próbki kału i tkanki należy traktować jako potencjalnie niebezpieczne substancje biologiczne. Wszystkie procedury z udziałem żywych zwierząt, próbek biologicznych, ostrych przedmiotów, rozpuszczalników organicznych oraz odczynników do testów chemicznych powinny być wykonywane zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi biobezpieczeństwa, opieki nad zwierzętami oraz bezpieczeństwa chemicznego. Zwłoki zwierząt, tkanki, materiały skażone krwią oraz próbki kału powinny być zbierane w wyznaczonych pojemnikach na odpady biologiczne i utylizowane przez instytucjonalny obiekt zwierzęcy lub biuro ds. bezpieczeństwa biologicznego. Igły, igły gavage, rurki kapilarne i inne ostre przedmioty powinny być wyrzucane natychmiast po użyciu w zatwierdzonych pojemnikach na ostre przedmioty. Organiczne odpady rozpuszczalnikowe, w tym metanol, acetonitryl i roztwory zawierające kwasy mrówkowe, powinny być zbierane w oznaczonych pojemnikach na odpady chemiczne i utylizowane w ramach instytucjonalnego programu niebezpiecznych odpadów chemicznych. Odpady z testów biochemicznych i stresu oksydacyjnego powinny być zbierane i utylizowane zgodnie z kartami bezpieczeństwa producenta oraz instytucjonalnymi przepisami bezpieczeństwa chemicznego.

Zwierzęta doświadczalne

Sześciotygodniowe samce myszy C57BL/6J (n = 4 w grupie) były utrzymywane w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF) z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności przy temperaturze 22 ± 2 °C i wilgotności względnej 50–60%. Zwierzęta miały ad libitum dostęp do jedzenia i wody, maksymalnie pięć myszy w klatce. Myszy kontrolne były karmione standardową dietą chow składającą się z 70% węglowodanów, 20% białka i 10% tłuszczu (kcal). Aby ustalić model MASLD na myszy, myszy były karmione dietą wysokotłuszczową przez 8 tygodni, zawierającą 20% węglowodanów, 20% białka i 60% tłuszczu (kcal). Wszystkie diety były przechowywane w temperaturze 4 °C i uzupełniane dwa razy w tygodniu. Myszy zostały przydzielone losowo do grup eksperymentalnych za pomocą generatora liczb losowych, a wielkość próby (n = 4 na grupę) została określona na podstawie wcześniejszych badań z wykorzystaniem podobnych modeli myszy indukowanych dietą wysokotłuszczową oraz eksperymentów wstępnych. Wszystkie terapie podawano codziennie o tej samej porze, aby zminimalizować zmienność dobową.

Olej mikroalg był wydobywany i oczyszczany przez Akademię Nauk Rolniczych w Shandong, o czystości około 99%. Olej mikroalg przechowywano w temperaturze −30 °C, chronionym przed światłem. Przed podaniem olej przygotowywano emulgatorem i dokładnie mieszano, aby zapewnić jednorodność. Konkretnie, bogaty w DHA olej mikroalg był emulgowany w sterylnej soli soli fizjologicznej o stężeniu 0,5% karboksymetylocelulozy zawierającej 0,5% Tween-80. Mikroalgiowy olej i emulgator były mieszane w proporcji 1:9 (v/v) i wirowane przez 2 minuty tuż przed gavage, aby uzyskać równomierne zawieszenie. Myszy z grupy poddawanej mikroalgom olejem otrzymywały preparat raz dziennie za pomocą doustnego gavage'u sterylnym igłą do karmienia w dawce 10 μL/g masy ciała. Objętość gavage była codziennie dostosowywana do masy ciała, aby zapewnić spójność dawki. Myszy w grupie kontrolnej otrzymały równoważną objętość bezpłodnej soli fizjologicznej w tych samych warunkach. Użyta sól fizjologiczna to zastrzyk z chlorku sodu o stężeniu 0,9%.

Leczenie probiotyczne polegało na złożonej formulacji zawierającej Lactobacillus plantarum (DY-1), Lactobacillus acidophilus (KDB-03), Lactobacillus casei (KDB-LC) oraz Bacillus coagulans (GIM 1,645). Cztery szczepy zostały wymieszane z równym stosunkiem żywotnych komórek 1:1:1:1. Każdy szczep wniósł 2,5 × 10⁷ CFU/mL do ostatecznej formuły, co dało łączne stężenie bakteryjne 1 × 10⁸ CFU/mL. Mieszanka probiotyczna została zsyntetyzowana przez Akademię Nauk Rolniczych w Shandong i nie jest dostępna komercyjnie. Leczenie probiotyczne polegało na złożonym bulionie z fermentacją probiotyczną zawierającą Lactobacillus plantarum DY-1, Lactobacillus acidophilus KDB-03, Lactobacillus casei KDB-LC oraz Bacillus coagulans GIM 1,645. Stężenie bakterii w formulacji wyniosło 1 × 10,8 CFU/mL. Bulion fermentacji probiotycznej przechowywano przed użyciem w temperaturze 4 °C. Myszy w grupie leczonej probiotykami otrzymywały formułę probiotyczną raz dziennie poprzez doustne dawkowanie w dawce 0,01 mL/g masy ciała przez cały okres eksperymentalny.

Poszczególne szczepy były hodowane w odpowiednich warunkach i zbierane w fazie środkowej fazy wzrostu (OD₆₀₀ ≈ 0,6), a następnie łączone w wskazanym stosunku. Kultury bakteryjne były wirowane, aby usunąć supernatant, a pellety zostały ponownie zawieszone w sterylnej soli fosforanowej (PBS). Świeżo przygotowana zawiesina bakteryjna była przechowywana w lodzie przed podaniem, aby zachować żywotność. Ostateczne stężenie bakteryjne zostało przed podaniem dostosowane do 1× 10⁸ CFU/mL. Myszy z grupy przyjmującej probiotyki otrzymywały formułę doustnie w dawce 0,01 mL/g masy ciała raz dziennie przez cały okres eksperymentalny. Przed podaniem probiotyków nie zastosowano żadnego wstępnego leczenia antybiotykiem. Aby zmniejszyć błędy eksperymentalne, ocena wyników była przeprowadzana przez ślepych badaczy, jeśli było to stosowne. MASLD zostało potwierdzone analizą biochemiczną krwi.

Analiza krwi

Pod koniec okresu eksperymentalnego myszy były głodzone na czczo przez noc (12 godzin) z dostępem do wody przed pomiarem glukozy i końcowym pobraniem krwi. Myszy były głęboko znieczulone izofluranem za pomocą waporyzatora znieczulenia, aż potwierdzono utratę odruchu pedałowego. Próbki krwi końcowej pobrano przez krwawienie retroorbitalne. Po pobraniu krwi myszy zostały uśpione przez zwichnięcie szyjki podczas głębokiej anestezji, a śmierć potwierdzono przez zatrzymanie oddechu i bicia serca. Krew została pozostawiona do zakrzepnięcia w temperaturze pokojowej, a następnie przez 10 minut odwirowana w 3 000 × g , aby uzyskać surowicę. Próbki surowicy były alicytowane i przechowywane w temperaturze −80 °C do czasu analizy. Glukoza w surowicy, całkowity cholesterol (TC), trójglicerydy (TG), cholesterol lipoproteinowy o niskiej gęstości (LDL-c), cholesterol lipoproteinowy o wysokiej gęstości (HDL-c), aminotransferaza asparagianowa (AST) oraz aminotransferaza alaninowa (ALT) były mierzone za pomocą automatycznego analizatora biochemicznego, zgodnie z instrukcjami producenta. Parametry te były ilościowe za pomocą enzymatycznych kolorymetrycznych testów z wbudowanymi standardowymi zestawami odczynnikowymi w systemie analizatora. Wszystkie parametry biochemiczne zostały znormalizowane do objętości surowicy i wyrażone w jednostkach określonych przez producenta.

Testy stresu oksydacyjnego

Biomarkery stresu oksydacyjnego mierzono za pomocą zestawów, w tym tych dotyczących malondialdehydu, dismutazy nadtlenkowej i katalazy. Badania przeprowadzano zgodnie z zaleceniami producenta. Krótko mówiąc, tkanki wątroby były homogenizowane w lodowatym buforze i wirowane, aby uzyskać supernatanty do analizy. Poziomy malondialdehydu (MDA) zmierzono za pomocą testu z użyciem substancji reaktywnych kwasem tiobarbiturowym (TBARS); Aktywność dismutazy nadtlenkowej (SOD) mierzono jej zdolnością do hamowania reakcji podtlenkowych; a aktywność katalazy (CAT) była ilościowana, monitorując tempo rozkładu nadtlenku wodoru. Pomiary wykonywano za pomocą czytnika mikropłyt, a wartości obliczano na podstawie standardowych krzywych lub wzorów dostępnych w zestawach. Markery stresu oksydacyjnego zostały znormalizowane do masy tkanki wątroby i wyrażane zgodnie ze specyfikacjami producenta.

Sekwencjonowanie rRNA 16S i analiza mikrobiomu

Próbki kału pobierano pod koniec okresu eksperymentalnego bezpośrednio od pojedynczych myszy w warunkach sterylnych, natychmiast zamrażano w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze −80 °C do czasu ekstrakcji DNA. DNA mikrobiologiczne zostało wyodrębnione za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta. Obszar V3–V4 bakteryjnego genu 16S rRNA został amplifikowany za pomocą starterów 341F/806R. Amplifikacja PCR została przeprowadzona w systemie reakcji 25 μL zawierającym DNA szablonowe, 2x mieszankę PCR master oraz 0,2 μM każdego primeru. Program wzmacniania obejmował początkową denaturację w 95 °C przez 3 minuty, następnie 25 cykli 95 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 45 s, a na końcu wydłużenie na 72 °C przez 10 minut. Biblioteki Amplicon zostały zbudowane i sekwencjonowane na platformie Illumina MiSeq, stosując strategię pary 2 × 250 bp przez komercyjnego dostawcę usług sekwencjonowania. Jakość biblioteki była oceniana przed sekwencjonowaniem, a biblioteki w grupach ładowano z zalecaną przez producenta gęstością klastrów. Odczyty niskiej jakości z niejednoznacznymi podstawami, niewystarczającą długością lub średnią jakością poniżej Q20 zostały usunięte przed analizą dalszą.

Surowe odczyty sekwencjonowania były przetwarzane przy użyciu QIIME 2 wersja 2019.4²⁰. W skrócie, odczyty parowane były demultipleksowane, filtrowane jakościowo, odszumiane, scalane i filtrowane chimerą za pomocą DADA2 z domyślnymi parametrami, chyba że zaznaczono inaczej. Do analizy dalszej zachowano warianty sekwencji amplikonu (ASV) bez pojedynczych tonów. Przypisanie taksonomiczne przeprowadzono przy użyciu bazy danych Greengenes w wersji 13_8 zaimplementowanej w QIIME2²¹. Ze względu na wrodzone ograniczenia rozdzielczości sekwencjonowania genów 16S rRNA, szczególnie przy korzystaniu z bazy danych Greengenes, adnotacje taksonomiczne interpretowano wyłącznie na poziomie rodzaju. Klasyfikacja na poziomie gatunku nie była uznawana za wiarygodną i dlatego nie była stosowana w żadnych dalszych analizach, porównaniach statystycznych ani interpretacjach biologicznych. Wszystkie cechy drobnoustrojowe zostały zredukowane do poziomu rodzaju przed wizualizacją i analizą.

Zastosowano metryki różnorodności alfa (Chao1, obserwowane gatunki, Shannon, Simpson, PD Faith oraz równomierność Pielou). Statystyczne porównania różnorodności alfa między grupami przeprowadzono przy użyciu odpowiednich testów nieparametrycznych (np. test Kruskal–Wallis). Odległość Jaccarda i różnica Bray-Curtisa zostały wykorzystane jako metryki różnorodności beta. Do zilustrowania zmian w społecznościach mikrobiomowych użyto wykresów analizy głównych współrzędnych (PCoA), niemetrycznego skalowania wielowymiarowego (NMDS) oraz rozmiaru efektu analizy liniowej dyskryminacyjnej (LEfSe), z progiem wyniku LDA 2,0. Do oceny istotności statystycznej w różnorodności beta zastosowano permutacyjną wielowariantową analizę wariancji (PERMANOVA). Wizualizacja danych i analizy statystyczne były wykonywane za pomocą platformy GenesCloud (https://www.genescloud.cn).

Profile funkcjonalne mikroorganizmów były wnioskowane na podstawie danych sekwencjonowania 16S rRNA, a nie bezpośrednio mierzonych za pomocą metagenomicznego czy transkryptomicznego sekwencjonowania shotgun. Na podstawie tabeli znormalizowanej ścieżki lub liczebności grup funkcyjnych, przewidywane jednostki funkcjonalne zostały mapowane na powszechnie używane bazy danych, w tym KEGG, MetaCyc i COG. Obfitość szlaków KEGG została podsumowana według hierarchicznych kategorii funkcjonalnych, przy czym klasyfikacje szlaków poziomu 2 służyły do porównań dalszych. Średnia obfitość każdej kategorii szlaku została obliczona za pomocą oprogramowania R.

Analiza metabolomiki nieukierunkowanej próbek wątroby

Tkanki wątroby były szybko usuwane bezpośrednio po potwierdzeniu zgonu, natychmiast zamrażane w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze −80 °C przed analizą. Około 50 mg zamrożonej tkanki wątroby zostało ujednolicone w lodowato zimnej wodzie metanolu i wody (4:1, v/v) uzupełnionej standardami wewnętrznymi. Stosunek rozpuszczalnika tkanki do ekstrakcji wynosił 1:10 (w/v). Próbki były wirowane przez 1 minutę, sonakowane na lodzie przez 10 minut, a następnie inkubowane w temperaturze −20 °C przez 30 minut, aby poprawić wytrącanie białek. Homogenity zostały dokładnie wymieszane, poddane sonikacji na lodzie i wirowane w 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Supernatanty były starannie zbierane, odparowywane pod łagodnym przepływem azotu i rekonstytuowane w 50% metanolu do dalszej analizy.

Próbki kontroli jakości (QC) były generowane przez łączenie równych objętości z każdej próbki i analizowane przerywanie w trakcie procesu w celu oceny stabilności analitycznej i powtarzalności. Analiza metabolomiki nieukierunkowanej przeprowadzono za pomocą ultrawydajnego systemu chromatografii cieczowej sprzężonej z wysokorozdzielczą spektrometrią mas, obsługiwanego przez komercyjnego dostawcę usług. Metabolity były rozdzielane w kolumnie C18 w odwróconej fazie za pomocą układu rozpuszczalnika binarnego składającego się z wody o stężeniu 0,1% kwasu mrówkowego oraz acetonitrylu z 0,1% kwasu mrówkowego. Objętość wtrysku wynosiła 2 μL, temperatura kolumny była utrzymywana na poziomie 40 °C, a przepływ ustawiono na 0,30 mL/min. Zastosowano program elucii gradientowej, aby osiągnąć szeroką separację metabolitów. Detekcja spektrometryczna mas była przeprowadzana zarówno w dodatnim, jak i ujemnym trybie jonizacji elektrosprayowej w zakresie m/z od 70 do 1 000, aby osiągnąć szerokie pokrycie metabolitów. Napięcie natrysku jonowego ustawiono na 3,5 kV w trybie dodatnim i −2,5 kV w trybie ujemnym. Temperatura kapilar była utrzymwana na poziomie 320 °C, a dane pozyskiwano w trybie pełnego badania MS z zależnym od danych pozyskiwaniem MS/MS do adnotacji metabolitów. Surowe dane były przetwarzane za pomocą dedykowanego oprogramowania metabolomiki (MassLynx v4.1) do wykrywania cech, wyrównywania i normalizacji. Identyfikacja metabolitów została przeprowadzona na podstawie dokładnej masy, czasu retencji oraz wzorców fragmentacji SM/MS, porównując je z publicznymi bazami danych, w tym Human Metabolome Database (HMDB) oraz Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (v2023), gdzie było to stosowne.

Analiza wieloczynnikowa i ścieżek

Przetworzone dane metabolomiczne poddawano wielowymiarowym analizom statystycznym, w tym analizie głównych składników (PCA) oraz analizie różnicyfikującej metodą nieregularnych najmniejszych kwadratów (PLS-DA), aby zobrazować różnice metaboliczne między grupami eksperymentalnymi. Różnice metabolitów zidentyfikowano na podstawie kombinacji zmiennej ważności w wynikach projekcji (VIP) (>1,0) oraz istotności statystycznej (s. < 0,05). Zidentyfikowane metabolity zostały dodatkowo zmapowane na szlaki metaboliczne za pomocą analizy wzbogacenia szlaków KEGG, aby wyjaśnić procesy biologiczne związane z suplementacją oleju mikroalg bogatym w DHA.

Analiza statystyczna

Dane przedstawiono jako średnią ± SEM i przeanalizowano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnego porównania Tukeya. Istotność statystyczna została zdefiniowana jako p < 0,05. Analiza wzbogacenia metabolitów wątroby została przeprowadzona przy użyciu R (wersja 4.4.1). Analizowano parowe powiązania między rodzajami mikroorganizmów a metabolitami wątroby za pomocą korelacji rangowych Spearmana. Tylko istotne korelacje (wskaźnik fałszywych odkryć, FDR < 0,05) z |ρ| ≥ 0,6 zostało uwzględnionych w analizach sieci integracyjnych. Przetwarzanie danych mikrobiomu i metabolomiki zostało przeprowadzone zgodnie z opisaniem powyżej, w tym z wykorzystaniem platformy GenesCloud oraz procedur kontroli jakości.

Wyniki

Olej mikroalg bogaty w DHA poprawia metabolizm lipidów, uszkodzenia wątroby oraz stres oksydacyjny wątroby u myszy MASLD indukowanych HFD

Aby ocenić wpływ suplementów diety na homeostazę glukozy i lipidów, parametry biochemiczne oceniono w pięciu grupach: regularna dieta (RC), dieta wysokotłuszczowa (HFD), bogata w mikroalgi z olejem uzupełnionym w DHA, probiotykami oraz mieszana bogata w DHA mikroalgiowy olej + myszy z suplementacją probiotyków. Ponieważ głównym celem tego ba...

Dyskusja

W ostatnich latach kilka badań badało zmiany w mikrobiomie związane z MASLD. Jednak większość tych badań koncentrowała się na porównywaniu zdrowych osób z pacjentami z MASLD lub badaniu różnych stopni steatozy²⁴. W związku z tym wciąż istnieją ograniczone dowody na szczegółowe szczegóły specyficznych zmian mikrobioty jelitowej związanych z włóknieniem wątroby w MASLD, mimo że włóknienie jest najważniejszym czynnikiem przewidującym wyniki leczenia pacjentów. W niniejszym badaniu wykazujemy, że olej...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2x PCR Master Mix	Takara Bio Inc., Japonia	RR902A	Wykorzystywane do amplifikacji PCR rRNA 16S
Acetonitryl	Merck, Niemcy	100030	Rozpuszczalnik stosowany w fazie mobilnej UHPLC
Paporyzator znieczulony	Nauki o życiu z napędem na tylne koła	R580	Stosowane do podawania znieczulenia izofluranowym myszom
Automatyczny analizator biochemiczny	Instytut Inżynierii Biologicznej im. Jian Chenga, Nankin, Chiny	A110-1 & A111-1	Mierzy parametry surowicy (glukoza, TC, TG, LDL-c, HDL-c, AST, ALT) oraz poziom lipidów w wątrobie
Bacillus coagulans (GIM 1,645)	Centrum Zbiorów Kultury Mikrobiologicznej Guangdong, Chiny	GIM 1.645	Szczep składnikowy formuły probiotyków
Karboksymetyloceluloza sodu (CMC-Na)	Sigma-Aldrich, USA	C4888	Stosowany jako składnik emulgatora do przygotowania oleju mikroalg bogatego w DHA
Zestaw do testowania katalazy (CAT)	Nanjing Construction Ltd.	A007-1-1	Wykrywa aktywność CAT (wskaźnik zdolności antyoksydacyjnej) w tkance wątroby
Pakiet oprogramowania DADA2	Zespół Deweloperski DADA2	Zawarte w QIIME 2 v2019.4	Używany do odzumiania i chimerycznego filtrowania odczytów sekwencjonowania
Olej mikroalg bogaty w DHA (pochodzący ze Schizochytrium sp.)	-	-	Bogaty w kwas dokozaheksaenowy (DHA); Codziennie podawane przez gavage w 10&mikro; L/g jako interwencja eksperymentalna
Zwierzęta doświadczalne (samce myszy C57BL/6J)	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	-	6 tygodni, n = 4 na grupę; Używany do ustanowienia modelu MASLD za pomocą zasilania HFD
Kwas mrówkowy	Sigma-Aldrich, USA	F0507	Addytywność fazy ruchomej do analizy metabolomiki
Baza danych Greengenes	Greengenes	Wersja 13_8	Wykorzystywane do klasyfikacji taksonomicznej mikroorganizmów
Dieta wysokotłuszczowa (HFD)	Research Diets Inc., USA	D12492	Składa się z 20% węglowodanów, 20% białka, 60% tłuszczu (kcal); Karmiłem przez 8 tygodni, aby wywołać masld.
Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości	Thermo Fisher Scientific, USA	Q Exactive Orbitrap	Wykorzystywany do wykrywania metabolitów w modach jonów dodatnich i ujemnych
Baza danych metabolomu człowieka (HMDB)	Uniwersytet Alberty, Kanada	Premiera w 2024 roku	Publiczna baza danych adnotacji metabolitów
Platforma Illumina MiSeq	Illumina, Inc., USA	MiSeq System	Używane do parowanych 2 &; Sekwencjonowanie 250 bp
Izofluran	Merck, Niemcy	PHR2874	Stosowane do znieczulenia inhalacyjnego u myszy
Encyklopedia Genów i Genomów w Kioto (KEGG)	Kanehisa Laboratories, Japonia	Wersja 2023	Baza danych używana do wzbogacania szlaków i adnotacji metabolitów
Lactobacillus acidophilus (KDB-03)	Akademia Nauk Rolniczych w Shandong, Chiny	-	Szczep składnikowy formuły probiotyków
Lactobacillus casei (KDB-LC)	Akademia Nauk Rolniczych w Shandong, Chiny	-	Szczep składnikowy formuły probiotyków
Lactobacillus plantarum (DY-1)	Akademia Nauk Rolniczych w Shandong, Chiny	-	Szczep składnikowy formuły probiotyków
Ciekły azot	Air Liquide	-	Wykorzystywany do szybkiego mrażania i przechowywania próbek kału i wątroby
Zestaw do badania malondialdehydu (MDA)	Nanjing Construction Ltd.	A003-1	Wykrywa MDA (marker peroksydacji/uszkodzenia oksydacyjnego lipidów) w tkance wątroby
Oprogramowanie MassLynx	Waters Corporation, USA	Wersja 4.1	Wykorzystywane do przetwarzania surowych danych w metabolomice, ekstrakcji cech i normalizacji
Metanol	Merck, Niemcy	106035	Rozpuszczalnik używany do ekstrakcji metabolitów
Platforma analizy danych mikrobiomu	Genescloud	V1	Platforma online: https://www.genescloud.cn/home; wykorzystywane do wizualizacji PCoA, NMDS, LEfSe i innych analiz mikrobiomu
OMEGA Soil DNA Kit & nbsp;	Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA)	(M5635-02)	Izolacja DNA
Sekwencje referencyjne OTU	Genescloud		Cytowanie z McDonald i in. 2012; wykorzystywane do klasyfikacji wariantów sekwencji ampliconowych (ASV)
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA	10010023	Stosowane do ponownej suspensji granulatów bakteryjnych
Primer 341F/806R	Tsingke Biotechnology Co., Ltd., Chiny	-	Używany do wzmacniania 16S rRNA V3– Region V4. 341F: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′; 806R: 5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′
Probiotyki	-	-	Konkretne szczepy, niewymienione wprost; Stosowany jako interwencja porównawcza (głównie poprawia homeostazę glukozy)
Oprogramowanie QIIME 2	-	2019.4	Wykorzystywane do analizy bioinformatycznej mikrobiomu (przetwarzanie ASV, obliczanie różnorodności alfa/beta)
Oprogramowanie R	-	4.4.1	Wykorzystywane do analizy wzbogacania metabolitów wątroby oraz analizy korelacji Spearmana związanych z powiązańmi mikroorganizmów z metabolitami
Wirówka chłodzona	Eppendorf, Niemcy	5810R	Wykorzystywane do wirowania próbek w surowicy i metabolomice
Kolumna C18 z odwróconą fazą	Waters Corporation, USA	186002350	Wykorzystywane do chromatograficznego rozdzielania metabolitów
Sól fizjologiczna	Shijiazhuang No.4 Pharmaceutical	2211112304	Codziennie podawane przez gavage grupie kontrolnej (w przeciwieństwie do mikroalgowego oleju)
Standardowa dieta chow	Keao Xieli Feed Ltd., Chiny	1016706714625204224	Składa się z 70% węglowodanów, 20% białka, 10% tłuszczu (kcal); przekazywane do grupy sterującej (RC)
Sterylna igła karmienia	Instech Laboratories, USA	FTP-20-38	Stosowane do podawania gavage doustnej
Zestaw do testowania dismutazy nadtlenkowej (SOD)	Nanjing Construction Ltd.	A001-3	Wykrywa aktywność SOD (wskaźnik zdolności antyoksydacyjnej) w tkance wątroby
Tween-80	Sigma-Aldrich, USA	P4780	Stosowany jako składnik emulgatora do przygotowania oleju mikroalg bogatego w DHA
Homogenizator ultradźwiękowy	Scientz Biotechnology, Chiny	JY92-IIN	Stosowany do sonikacji tkanki wątroby podczas ekstrakcji metabolitów
Nieukierunkowana metabolomika wątrobowa	Metabo-Profile Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.	Kod projektu: P035Y23A13_SFMU_MJWang_SH
Mieszacz wirowy	Thermo Fisher Scientific, USA	Mikser Vortex LP	Wykorzystywane do homogenizacji i emulgacji próbek