Protokół różnicowania wielopotencjalnych komórek macierzystych w komórki podobne do pierwotnych komórek zarodkowych

Summary

Szczegółowa instrukcja krok po kroku, jak wygenerować komórki podobne do komórek zarodkowych pierwotnych z ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych indukowanych w sposób niezawodny, z wykorzystaniem metody opartej na 2D monowarstwie z nałożeniem ekstraktu błony podstawnej.

Abstract

Zastosowanie różnicowania ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych in vitro znacznie poszerzyło zrozumienie procesów specyfikacji linii komórkowych, które zachodzą podczas wczesnego rozwoju in vivo, okresu, który jest niezwykle trudny do zbadania. Jedną z pierwszych określonych linii zarodkowych w ludzkim zarodku jest linia komórek zarodkowych, oznakowana przez indukcję pierwotnych komórek zarodkowych (PGC). PGC są jedyną populacją założycielską gamet w późniejszym życiu, a ich specyfikacja jest krytycznym pierwszym krokiem w kierunku płodności organizmu. W artykule opisano solidny protokół wytwarzania komórek przypominających PGC (PGCLC) z ludzkich indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (hiPSC), zaczynając od początkowej oceny stanu pluripotencji i cech komórkowych hiPSC w celu zapewnienia skutecznego różnicowania PGCLC. W tym celu omówiono wpływ różnych gęstości komórek, powłok płytek i hiPSC stosowanych do różnicowania PGCLC. Na koniec przedstawiono przepływ charakteryzacji i ilościowego określenia hPGCLC, z wykorzystaniem immunofluorescencji i cytometrii przepływowej. Protokół różnicowania koncentruje się na warunkach, które są łatwe do ustalenia i przetestowania w większości laboratoriów i można je dostosować w miarę potrzeb. Ponadto protokół ten jest szybki, umożliwiając ustalenie, czy hiPSC są odpowiednie do różnicowania PGCLC. Protokół ma na celu promowanie spójności i zgodności wyników hPGCLC w różnych liniach hiPSC i platformach hodowlanych, zapewniając solidne plony, które wspierają wiarygodną charakteryzację i dalszą optymalizację dalszych etapów różnicowania w kierunku udanego in vitro gametogenezy u ludzi.

Introduction

Rozwój komórek linii zarodkowej u ludzi jest wysoce skoordynowanym procesem, który rozpoczyna się wcześnie w rozwoju zarodkowym i zaczyna się od specyfikacji komórek zarodkowych pierwotnych (PGC), populacji, która ostatecznie daje początek komórkom jajowym i plemnikom¹. In vivo, specyfikacja PGC zachodzi wkrótce po implantacji^2,3 w odpowiedzi na sygnały indukcyjne pochodzące od sąsiednich komórek^4,5. Rozwój PGC był szczegółowo badany u gryzoni, szczególnie poprzez badania genetyczne, które wykazały zaangażowanie szlaków sygnalizacyjnych, takich jak BMP, WNT i TGFβ^6,7,8,9. Po specyfikacji, PGC przechodzą reprogramowanie epigenetyczne, charakteryzujące się demetylacją DNA na skalę genomu i remodelacją chromatyny, aby później ustalić (specyficzną dla płci) tożsamość linii zarodkowej^{10,11,12,13,14}.

U ssaków, specyfikacja PGC jest sterowana koordynowaną wymianą sygnałów między szlakami sygnalizacyjnymi, a niektóre aspekty są zachowane ewolucyjnie u ludzi, nieludzkich naczelnych, świń i myszy, w tym zaangażowanie czynników pluripotencji takich jak POU5F1 i NANOG^{9,15,16,17,18}. Mimo wspólnych cech, gatunkowe różnice w mechanizmach różnicowania PGC i sieciach regulacji genów ograniczają bezpośrednie zastosowanie wyników z modeli zwierzęcych na ludzi^9,19,20,21.

Aby zrozumieć gametogenezę u ludzi, konieczne są badania z wykorzystaniem ludzkiego materiału, ale są one nadal wyzwaniem ze względu na ograniczony dostęp do wczesnych ludzkich zarodków. Ciągłe postępy w protokołach umożliwiających in vitro różnicowanie ludzkich komórek zarodkowych pierwotnych podobnych do komórek (hPGCLC) z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, takich jak indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), zmniejszają zależność od ludzkiego tkanki gonadalnej, jednocześnie umożliwiając skalowanie i badania genetyczne^18,22. Większość ustabilizowanych strategii różnicowania hPGCLC opiera się na trójwymiarowych (3D) agregatach lub ciałach zarodkowych¹⁸. Za pomocą tych platform wiele badań wykazało, że hPGCLC naśladują kluczowe cechy epigenetyczne wczesnych ludzkich PGC, w tym programy transkrypcyjne linii zarodkowej^23,24 i reprogramowanie metylacji DNA na skalę genomu²⁵. Razem, te platformy in vitro znacznie poszerzyły wiedzę na temat biologii ludzkich PGC, w tym na temat zobowiązania linii i resetowania epigenetycznego. Jednak protokoły różnicowania hPGCLC oparte na agregacji nadal są wyzwaniem, ponieważ są czasochłonne, a całkowita wydajność hPGCLC dla charakteryzacji epigenetycznej, dalszych assayów różnicowania lub zastosowań w eksperymentach przepływowych pozostaje niska.

Ostatnio, metoda bez podłoża oparta na 2D monowarstwie z wykorzystaniem rozcieńczonego ekstraktu błony podstawnej (BMEx) w połączeniu z niskimi poziomiami BMP4 do różnicowania hiPSC w hPGCLC okazała się stosunkowo łatwa do skalowania na płytkach hodowlanych tkanek i osiągnęła wysokie wydajności (około 55%) w krótkim oknie różnicowania (5 dni)²⁶. W porównaniu z innymi systemami 2D, które wymagały pośredniego etapu stymulacji Activin A przed indukcją i wykorzystywały wyższe stężenia BMP4 (40–50 ng/mL)^27,28, to podejście BMEx nie wymagało etapu przedindukcyjnego i wykorzystywało niższe poziomy BMP4 (10 ng/mL), przy zachowaniu porównywalnej wydajności i poprawionej skalowalności.

Poniżej znajduje się szczegółowy, krok po kroku przewodnik po protokołach różnicowania hPGCLC 2D BMEx, zaczynając od początkowej oceny utrzymania hiPSC, w tym pluripotencji i cech komórkowych, a następnie testowania wpływu różnych powłok płytek hiPSC i gęstości komórek na różnicowanie hPGCLC. Opisano również charakteryzację dółstrumienia przez analizę przepływową i immunofluorescencję. Podano kluczowe punkty dotyczące obsługi oraz wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów, aby zmniejszyć odchylenia laboratoryjne, umożliwiając badaczom konsekwentne odtwarzanie różnicowania hPGCLC w tym formacie 2D.

Protocol

Ten protokół stosuje się wskazówki i przepisy Leidschen Universitair Medisch Centrum (LUMC), LUMC Biobank i Biomaterials (TCBio) oraz LUMC Leiden hiPSC Center (pod BB24.037). Wszystkie materiały oraz kontrolne linie hiPSC (XY) (M54 i M199) użyte w tym protokołach są wymienione w Tabeli materiałów. Wszystkie procedury hodowli tkankowej przeprowadzono w dedykowanym laboratorium kultury tkankowej o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2, wyposażonym w wilgotnik normoksyczny (37 °C, 5% CO₂), uniwersalną wirówkę stołową (obrotowy koszyk) i szafę bezpieczeństwa klasy II z mikroskopem stereoskopowym.

UWAGA: Nie wszystkie linie hiPSC mogą różnicować się w hPGCLC^26,29. Jednakże, jeśli inne hiPSC zostały użyte do różnicowania PGCLC i PGCLC zostały zaobserwowane, opisana tutaj metoda (Rysunek 1A) pozwoli na zwiększenie produkcji hPGCLC.

1. Pokrywanie płytek do hodowli tkankowej dla hiPSC

Ten protokół opisuje pokrywanie płytek do hodowli tkankowej zarówno rozcieńczonym BMEx, jak i vitronektyną.

1. Pokrywanie ekstrakcji błony podstawowej (BMEx)
   1. Roztapiaj alikwotę BMEx na lodzie. Może to być Geltrex, Cultrex lub Matrigel.
   2. Rozcieńcz alikwotę ekstrakcji błony podstawowej w zimnym DMEM/F12 do stężenia końcowego 1% (v/v) i delikatnie resuspenduj.
   3. Pokryj żądaną liczbę dołek płytki 6-dołkowej 1 ml rozcieńczonego BMEx na dołek.
   4. Inkubator pokrytej płytki przez co najmniej 30 min w 37 °C.
      UWAGA: Pokryte płytki można przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez okres do 1 tygodnia. W przypadku używania pokrytych płytek przechowywanych w temperaturze 2-8 °C, inkubować płytkę przez co najmniej 10 min w 37 °C przed dalszym użyciem.
2. Pokrywanie vitronektyną
   1. Roztapiaj alikwotę vitronektyny w temperaturze pokojowej (RT) przez 10-15 min.
   2. Rozcieńcz vitronektynę do końcowego stężenia 5 μg/ml w DPBS bez wapnia i magnezu (DPBS -/-) i delikatnie resuspenduj.
   3. Pokryj żądaną liczbę dołek płytki 6-dołkowej 1 ml rozcieńczonej vitronektyny na dołek.
   4. Inkubator pokrytej płytki 6-dołkowej przez 1 godzinę w RT.

2. Przelewanie na utrzymanie hiPSC

1. Przygotuj medium kulturowe: wolne od surowicy medium kultury komórkowej mTeSR Plus uzupełnione o roztwór zapobiegający zanieczyszczeniom mykoplazmą (MycoZap (1:1000)).
2. Odpompuj medium kulturowe z komórek, które są gotowe do przelewania.
3. Dodaj 0,5 ml ludzkiego środka selekcji i przelewania PSC (ReLeSR) do każdego dołka i odpompuję to w ciągu 1 min. Upewnij się, że pozostaje bardzo cienka warstwa na komórkach.
4. Inkubator komórek przez 6 min w 37 °C.
5. Delikatnie stuknij boki płytki 6-dołkowej kilka razy.
6. Odłącz komórki delikatnie za pomocą 1 ml medium kulturowego, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety p1000, i upewnij się, że regularnie sprawdzasz wielkość fragmentów kolonii, aby utrzymać ich wielkość między 50-200 μm.
7. Weź pokryte płytki 6-dołkowe i usuń roztwór pokrywający (krok 1).
8. Dodaj 2 ml medium kulturowego do każdego dołka.
9. Przenieś medium kulturowe zawierające odłączone fragmenty kolonii hiPSC do nowego dołka w pożądanym stosunku.
   UWAGA: Idealny stosunek do podziału fragmentów kolonii hiPSC wynosi 1:6-1:50, co pozwala na przelewanie co 4-7 dni.
10. Umieść płytkę kultury komórkowej z przelewanymi fragmentami kolonii hiPSC w wilgotnym inkubatorze normoksycznym (37 °C, 5% CO₂).
11. Co drugi dzień odświeżaj medium kulturowe o 2 ml medium kulturowego, aż hiPSC będą gotowe do ponownego przelewania.
    UWAGA: Dodaj 4 ml medium kulturowego zamiast 2 ml do każdej 6-dołkowej, aby uniknąć konieczności odświeżania w weekend.
    UWAGA: Nie przelewaj hiPSC, gdy konfluencja jest zbyt niska i wyrzuć kulturę, gdy konfluencja jest zbyt wysoka, aby utrzymać zdrową kulturę hiPSC i uniknąć samoistnej różnicowania.

3. Różnicowanie hPGCLC

1. Przygotowanie przed różnicowaniem hPGCLC (Dzień 0).
   1. Odśwież medium kulturowe hiPSC 1 godzinę przed rozpoczęciem różnicowania hPGCLC.
   2. Przygotuj roztwór pokrywający: 1% roztwór BMEx rozcieńczony v/v w zimnym DMEM/F12.
   3. Pokryj żądaną liczbę dołek płytki 12-dołkowej 0,5 ml roztworu pokrywającego.
   4. Inkubator pokrytej p

Results

Jakość i stabilny stan hiPSCs są ważne dla dalszej różnicowania
hiPSCs były utrzymywane na 6-dołkowych płytkach przez co najmniej 3 przejścia (w różnych powłokach) przed eksperymentami różnicowania i analizą. hiPSCs były przejściowe, gdy kolonie komórek osiągnęły 70–80% pokrycie (Rysunek 1B), co jest również optymalnym pokryciem hiPSCs do inicjacji różnicowania hPGCLC. Zdrowe kultury hiPSC wykazywały jednolitą morfologię kolonii bez ciemnych lub zróżnicowanych obszarów, widocznych na obrazach w polu jasnym (Rysunek 1B). Jednak jakość hiPSC została naruszona, gdy kolonie komórek nie były utrzymywane na ich optymalnym pokryciu lub wykazywały oznaki różnicowania (Rysunek 1B). Przy niskiej konfluencji, hiPSC nadal się namnażały, a potrzeba więcej czasu na formowanie kolonii, aż pokrycie było odpowiednie do przejścia lub eksperymentów różnicowania. Przy wysokiej konfluencji, hiPSC rosły na sobie nawzajem, podczas gdy pojawiały się zróżnicowane regiony. Stan pluripotencji hiPSC został potwierdzony przez ekspresję SOX2 lub POU5F1, oba czynniki transkrypcyjne niezbędne do utrzymania pluripotencji i samoodnawianiu się w hiPSC³⁰, a co najważniejsze, SOX2 nie jest ekspresowany przez hPGCLC³¹. Barwienie falityną zostało użyte do oceny organizacji cytoszkieletu i morfologii kolonii, wskazującej na jakość hiPSCs. Należy zauważyć, że różnice w morfologii komórek są związane ze zmniejszeniem SOX2 lub POU5F1 (Rysunek 1B).

Wpływ podłoża utrzymania hiPSC na różnicowanie hPGCLC
Aby ocenić, czy utrzymywanie hiPSC na różnych podłożach powłokowych wpłynęło na różnicowanie na hPGCLC, hiPSC były hodowane na różnych podłożach (Geltrex, Matrigel, Cultrex i wiktronektyna) (Rysunek 2). Na wszystkich podłożach, hiPSC wykazywały mocne i jednolite poziomy SOX2 lub POU5F1 w jądrach, co wskazuje na ich pluripotentny stan. Kolonie hiPSC utrzymywane na Geltrex, Matrigel i Cultrex miały porównywalną morfologię, w tym dobrze określone granice kolonii i nieregularne ogólne kształty kolonii, w porównaniu z okrągłymi koloniami na wiktronektynie (Rysunek 2). hiPSC, które osiągnęły 70–80% konfluencję, były hodowane z gęstością 40 tys. komórek/cm² i różnicowały się na hPGCLC na Geltrex²⁶. W dniu 5, obrazy w polu jasnym wykazywały charakterystyczne kolonie hPGCLC we wszystkich warunkach (Rysunek 3). Co więcej, trój-dodatnie SOX17/TFAP2C/PDPN lub podwójnie dodatnie SOX17/POUF51 hPGCLC zostały zidentyfikowane we wszystkich warunkach (Rysunek 3). Sugeruje to, że protokół różnicowania można zastosować z hiPSC hodowane w różnych warunkach.

Wpływ początkowej gęstości komórek hiPSC na różnicowanie hPGCLC
Ważne jest, aby sprawdzić optymalną gęstość siewu dla optymalnego różnicowania hPGCLC (na Geltrex), ponieważ różne hiPSC mają różne tempo namnażania. Co więcej, jeśli wydajność różnicowania hPGCLC spada, gdy hiPSC są ciągle przejściowe, zaleca się dostosowanie gęstości siewu komórek hiPSC. Aby ocenić wpływ gęstości siewu komórek na wydajność różnicowania hPGCLC, hiPSC były siane z różnymi gęstościami, od 10 tys. do 100 tys. komórek/cm² (Rysunek 4A). W dniu 5, procent hPGCLC był oceniany za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu dwóch różnych sprzężonych przeciwciał dla ludzkich markerów PGC, EPCAM i integriny α6 (ITGA6)³². Analiza cytometrii przepływowej przebiegała zgodnie ze standardową sekwencyjną strategią wyznaczania bram, przedstawioną dla hiPSC M199 wysiewanych z gęstością 40 tys. komórek/cm² (Rysunek 4B). Krótko mówiąc, cała populacja komórek (wszystkie zdarzenia) była ograniczony, aby wykluczyć szczątki (obszar cząstek), następnie pojedyncze komórki były wybierane na podstawie wielkości (FSC) i ziarnistości (SSC), a wreszcie martwe komórki były wyłączone na podstawie barwienia 7AAD. Następnie brama do ilościowego określania komórek ekspresujących EPCAM-cy7 i ITGA6-BV421 została ustalona za pomocą próbek barwionych i niebarwionych (Rysunek 4B).

Porównanie wydajności różnicowania hPGCLC przy użyciu różnych gęstości siewu komórek i hiPSC hodowanych na różnych podłożach ujawniło trend zależny od gęstości (Rysunek 4C). Przy gęstości siewu 20–40 tys. komórek/cm², hiPSC M54 i M199 wykazywały najwyższy udział podwójnie dodatnich hPGCLC EPCAM+/ITGA6+, osiągnięty z hiPSC utrzymywanych na Geltrex i Cultrex. Co ciekawe, wyższe gęstości skutkowały ni

Discussion

In vitro gametogeneza stanowi potężną platformę eksperymentalną do badania rozwoju komórek germinalnych człowieka, toksykologii rozrodczej i niepłodności w kontrolowanych warunkach kultury i na poziomie indywidualnym dla pacjenta. Chociaż zgłoszono wiele protokołów dotyczących różnicowania hPGCLC z hiPSCS¹⁸, postęp w tej dziedzinie był utrudniony przez ograniczoną dostępność znormalizowanych, skalowalnych i możliwych do powtórzenia podejść w różnych laboratoriach. Ostatnie badania opisują uproszczone i wydajne podejścia do indukcji hPGCLC, w tym różnicowanie mikrofasonkowe oparte na BMP4²⁷, szybką platformę dwuwarstwową umożliwiającą generację hPGCLC w ciągu 3,5 dni²⁸ oraz system kultury 3D, który modeluje rozwój okołoimplantacyjny i parakrynowe sygnalizację niszy³³. Mimo że te protokoły skutecznie wspierały różnicowanie hPGCLC, nadal brakuje im możliwości służenia jako platformy wysokiego przepływu. Aby badania oparte na hPGCLC były szeroko stosowane, szczególnie w zakresie toksykologicznych badań rozrodczych, protokoły muszą być solidne, technicznie dostępne i kompatybilne z ilościowymi badaniami następczymi. Przedstawiono tutaj krok po kroku analizę protokołu BMEx-różnicowania hPGCLC, podkreślając kluczowe parametry techniczne, które decydują o możliwości powtórzenia i wydajności.

Kluczowym czynnikiem sukcesu różnicowania jest początkowy stan pluripotencji hiPSCS. Liczba przeszczepów, zdrowie komórkowe, cechy specyficzne dla linii i warunki kultury przed różnicowaniem mogą wpływać na wyniki różnicowania hPGCLC. Początkowo, podczas utrzymywania hiPSC, należy zwrócić uwagę na podłoże powlekające, gęstość siewu komórek i format płytki kulturalnej, które razem definiują architekturę kolonii i środowiska sygnałowe na początku różnicowania hPGCLC. Obecne badanie pokazuje wpływ stosowania hiPSC hodowanych na różnych powłokach i różnych gęstościach siewu na różnicowanie hPGCLC (na Geltrex). Obie linie hiPSC badane tutaj wykazały maksymalną efektywność różnicowania przy gęstości siewu 20 000-40 000 komórek/cm². Podkreśla to konieczność określenia optymalnych gęstości siewu przy wprowadzaniu nowych linii komórkowych, po przedłużonym przeszczepianiu lub zmianie układów eksperymentalnych lub formatów płytek kulturalnych. Nawet pozornie nieznaczne zmiany w stosunku powierzchni do objętości lub kinetyki wzrostu mogą wymagać optymalizacji, aby zachować wysoką efektywność różnicowania. W związku z tym zaleca się, aby użytkownicy przeprowadzali małe pilotażowe eksperymenty, aby wpierw określić optymalne warunki różnicowania hPGCLC.

Mimo swojej wytrzymałości, metoda ma ograniczenia, które należy uznać. Chociaż jest kompatybilna z wieloma powłokami i gęstościami, efektywność różnicowania pozostaje wrażliwa na właściwości wewnętrzne hiPSC, w tym stan epigenetyczny i historię przeszczepów, które nie są w pełni kontrolowalne. Kilka testowanych hiPSC zdawało się nie być w stanie różnicować się na hPGCLC²⁶. Co najważniejsze, w przeciwieństwie do witronektyny, która jest w pełni zdefiniowanym produktem, BMEx jest produktem pochodzenia zwierzęcego podatnym na różnice między partiami, co może wpłynąć na powtarzalność. Chociaż różne partie Matrigel, Cultrex i Geltrex były wcześniej testowane i dawały spójne wyniki²⁶, pozostaje to zagadnienie, i należy rozważyć w pełni zdefiniowane alternatywy dla BMEx, aby zapewnić przyszłą powtarzalność i możliwość transferu. Tutaj użyto dwóch męskich (XY) linii hiPSC, ale ten protokół został przetestowany zarówno na liniach żeńskich (XX), jak i męskich (XY)²⁶. Wreszcie, chociaż protokół zakończył się uzyskaniem hPGCLC, które wykazały się transkrypcyjną podobnością do hPGC i kompetencją do dalszego rozwoju^26,34, dalsze dojrzewanie do późniejszych etapów komórek germinalnych nie zostało tutaj omówione. Chociaż skalowalność została wykazana dla zastosowań typu przesiewowego, adaptacja oparta na automatyzacji i walidacja międzylaboratoryjna na szerszym panelu linii hiPSC wzmocni dalszą wartość translacyjną.

W porównaniu z istniejącymi strategiami różnicowania hPGCLC, ten protokół oferuje kilka zalet. W przeciwieństwie do wysoce specjalistycznych lub ograniczanych przez matrycę podejść, dostosowuje się do powszechnie stosowanych podłoży utrzymania hiPSC i formatów płytek kulturalnych, obniżając w ten sposób bariery techniczne. Nacisk na optymalizację gęstości i wczesną kontrolę jakości poprawia ponadto powtarzalność, będącą uporczywym wyzwaniem w dziedzinie in vitro gametogenezy.

Opisany tutaj ramowy opis metody jest szczególnie istotny dla toksykologii rozrodczej, modelowania niepłodności i biologii rozwoju. Jego kompatybilność ze skalowalnymi formatami umożliwia przesiewowe badania związków o średnim do wysokim przepływie, a jego powtarzalność wspiera porównania międzybadawcze i współpracę konsorcjum. Szersze ustandaryzowanie protokołów induk

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7AAD Viability Staining Solution	BioLegend	420403	Rozcieńczyć 1:200
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
Advanced RPMI 1640 Medium	Gibco	12633012
Alexa Flour 488 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A21202	Rozcieńczyć 1:500
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG	Invitrogen	A21207	Rozcieńczyć 1:500
Alexa Flour 647 donkey anti-goat IgG	Invitrogen	A21447	Rozcieńczyć 1:500
Alexa Fluor Phalloidin 594	Invitrogen	A12381	Rozcieńczyć 1:400
Alexa Fluor Phalloidin 647	Invitrogen	A30107	Rozcieńczyć 1:400
Antibody anti-CD49f (ITGA6), Brilliant Violet 421	Biolegend	313624	Rozcieńczyć 1:200
Antibody anti-CD326 (EPCAM1), PE/Cyanine7	Biolegend	324222	Rozcieńczyć 1:200
Antibody anti-SOX2, rabbit polyclonal	Merck	ab5603	Rozcieńczyć 1:200
Antibody anti-SOX17, goat polyclonal	R&D Systems	AF1924	Rozcieńczyć 1:500
Antibody anti-OCT3/4 (POU5F1), mouse monoclonal	Santa Cruz Biotechnology	SC-5279	Rozcieńczyć 1:200
Antibody anti-Podoplanin (PDPN), mouse monoclonal	Abcam	ab256561	Rozcieńczyć 1:200
Antibody anti-AP-2γ (TFAP2C), rabbit polyclonal	Cell Signaling Technology	2320S	Rozcieńczyć 1:300
B-27 Supplement, serum free	Gibco	17504044	Rozcieńczyć 1:100
BD FACSCanto	BD Biosciences		Urządzenie do cytometrii przepływowej
BD FACSDiva software version 9.0	BD Biosciences		Oprogramowanie
Bovine Serum Albumin (BSA), fractie V	Roche	10735086001	Rozpuścić w PBST
CELLSTAR 12 Well Cell Culture Plate	Greiner	665180
CELLSTAR 15 mL Tube	Greiner	188271
CELLSTAR 6 Well Cell Culture Plate	Greiner	657160
Corning 40 µm Cell Strainers	Corning	431750
Cultrex Stem Cell Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	R&D systems	3434-101-02	Rozcieńczyć do DMEM-F12 w zimnej wodzie
DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindole)	Invitrogen	D3571	Rozcieńczyć 1:500
DMEM:F12, GlutaMAX supplement	Gibco	31331028
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EVOS M5000	Invitrogen		Urządzenie do obrazowania
EVOS M5000 software version 1.3.660.548	Invitrogen		Oprogramowanie
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Oprogramowanie
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	Rozcieńczyć do DMEM-F12 w zimnej wodzie
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Rozcieńczyć 1:100
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Oprogramowanie
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	Rozcieńczyć do DMEM-F12 w zimnej wodzie
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Rozcieńczyć 1:100
hiPSCs M54	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0054iCTRL03	hiPSCs można udostępnić na żądanie z MTA
hiPSCs M199	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0199iCTRL01	hiPSCs można udostępnić na żądanie z MTA
LUNA-II Automated Cell Counter	Logos Biosystems		Urządzenie do liczenia komórek
LUNA-II software version 2.3.5	Logos Biosystems		Oprogramowanie
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free	Corning	354277	Rozcieńczyć do DMEM-F12 w zimnej wodzie
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050	Rozcieńczyć 1:100
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2011	Rozcieńczyć 1:1000
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	1040051000	Rozpuścić do 8% PFA w wodzie; następnie rozcieńczyć do 4% (1:1) z 0,2 M buforem fosforanowym
PIPETMAN P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector	Gilson	F144059M
PIPETMAN P200, 20–200 µL, Metal Ejector	Gilson	F144058M
PIPETMAN P10, 1–10 µL, Metal Ejector	Gilson	F144055M
Recombinant Human BMP4, CF	R&D Systems	314-BP-050	Stężenie początkowe 100 µg/mL w 4 mM HCL zawierającym 0,1% BSA
Recombinant Human EGF, CF	R&