Przesiewowe wyłączenia oparte na CRISPR-Cas9 na poziomie epigenomu w chemoopornych komórkach

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół do generowania komórek chemooroporniczych za pomocą podejścia o stopniowym zwiększaniu dawki, poprzedzony przez przesiewowe badanie oparte na CRISPR/Cas9 przy użyciu skupionej biblioteki sgRNA, która ma na celu modyfikatory epigenetyczne, w celu zidentyfikowania regulatorów nabytej chemooropornosci. Protokół oferuje również wiele punktów optymalizacji dostosowanych do modeli komórek chemooroporniczych, zapewniając solidne ramy dla badaczy zajmujących się mechanizmami oporu.

Streszczenie

Oporność na chemioterapię pozostaje głównym wyzwaniem w leczeniu raka, spowodowana zdolnością komórek nowotworowych do nabywania właściwości adaptacyjnych, przełączania ścieżek sygnałowych i modyfikacji struktury chromatyny w celu uniknięcia cytotoksyczności wywołanej lekami. Ponieważ procesy te w dużym stopniu opierają się na mechanizmach epigenetycznych, które regulują organizację chromatyny i elastyczność transkrypcyjną, regulatorzy epigenetyczni wyłonili się jako kluczowy czynnik oporu na chemioterapię. Aby zbadać oporność na paklitaksel, jeden z najczęściej stosowanych leków chemioterapeutycznych w raku piersi potrójnie ujemnym (TNBC), zastosowaliśmy bibliotekę knockoutową skupioną na epigenomiu (EPIKOL), bibliotekę opartą na CRISPR-Cas9, zaprojektowaną w celu systematycznego zakłócania genów zaangażowanych w regulację chromatyny. Linie komórek opornych na chemioterapię zostały wygenerowane poprzez stopniowe zwiększanie dawki, które odbija klinicznie istotną adaptację do leków. Jednak te odporne komórki wykazują fenotyp wielolekooporności (MDR), co stanowi znaczne wyzwanie dla efektywnej transdukcji wirusowej i selekcji stabilnych populacji komórek. W niniejszym badaniu opisano kluczowe kroki metodologiczne umożliwiające osiągnięcie wysokiej efektywności transdukcji lentiwirusowej i selekcji, co umożliwiło pomyślne zastosowanie ekranowania CRISPR EPIKOL w modelach opornych chemioterapii TNBC. Zgodnie z opisanym protokołem przeprowadzono ekranowanie CRISPR na poziomie epigenomicznym komórek TNBC opornych na chemioterapię i zidentyfikowano nowe regulatorzy epigenetyczne oporu na chemioterapię. Ten protokół zapewnia solidną ramę do identyfikacji regulatorów epigenetycznych, które przyczyniają się do nabytej oporu na paklitaksel, stosując podejście oparte na CRISPR oparte na utracie funkcji.

Wprowadzenie

Rak potrójnie ujemny piersi (TNBC) to podtyp raka piersi, który stanowi 12–17% wszystkich przypadków raka piersi¹. Charakteryzuje się upośledzoną ekspresją receptora estrogenowego (ER), receptora progesteronu (PR) i ludzkiego receptora czynnika wzrostu naskórka-2 (HER2), co poważnie ogranicza dostępność opcji terapii ukierunkowanej i pozostawia konwencjonalną chemioterapię jako główną modalność leczenia². W leczeniu TNBC powszechnie stosuje się taksany i antracykliny; jednak pacjenci zwykle rozwijają oporność^2,3. Nabycie oporności na chemioterapię jest złożonym i wielowymiarowym procesem, który obejmuje adaptacje genetyczne, metaboliczne, transkrypcyjne i epigenetyczne^2,4. Zmiany epigenetyczne stały się centralnymi regulatorami plastistyczności komórkowej, ułatwiając dynamiczne przeprogramowanie transkrypcyjne, które pozwala komórkom nowotworowym na tolerowanie toksyczności wywołanej chemioterapią⁵.

Taxol (paklitaksel) jest członkiem klasy taksanów, który powoduje śmierć komórki poprzez upośledzenie dynamiki mikrotubul i działa jako środek antymitotyczny⁶. Mimo że pacjenci z TNBC początkowo reagują na schematy chemioterapii obejmujące Taxol, z czasem zwykle rozwija się oporność². Zdobyta oporność na Taxol jest zwykle związana z nadmierną ekspresją białek transportujących należących do klasy ABC (ATP-binding cassette), szczególnie ABCB1 (MDR1, P-glikoproteina), które pośredniczą w wydalaniu leku Taxol z komórek, co prowadzi do zmniejszenia toksyczności leku wewnątrzkomórkowej⁷. Ponieważ szeroka gama leków chemioterapeutycznych są substratami tych transportowanych ABC, ich nadekspresja ogranicza stosowanie innych leków chemioterapeutycznych, powodując wielooporność na leki (MDR)⁸. Hamowanie transportowanych ABC okazało się w dużej mierze nieskuteczne jako strategia przeciwdziałania wielooporności na leki w warunkach klinicznych, głównie ze względu na ich powszechne występowanie i istotne role w transporcie szerokiej gamy endogennych i egzogennych substratów⁹. Mimo że werapamil, inhibitor ABCB1 pierwszej generacji, wykazał ograniczone lub żadne korzyści kliniczne i był związany z znaczącą toksycznością w badaniach klinicznych¹⁰, pozostaje on cennym narzędziem eksperymentalnym do zwiększania wydajności selekcji w in vitro modelach MDR.

Fenotyp MDR jest dynamicznym i adaptacyjnym procesem, który zwykle pojawia się w warunkach stresu². Ekspresja transportowanych ABC jest przede wszystkim kontrolowana przez mechanizmy regulacji transkrypcyjnych i epigenetycznych, a nie przez zdarzenia mutacyjne^5,11. Ograniczenie bezpośredniego kierowania na transportowane ABC podkreśla potrzebę zidentyfikowania regulatorów układowych tych białek jako słabości specyficznych dla komórek opornych. Dlatego też systematyczne badanie czynników epigenetycznych stało się ważną strategią identyfikacji nowych regulatorów oporności na chemioterapię i opracowania terapii skojarzonych, których celem są te słabości.

Screeningi funkcjonalne oparte na CRISPR-Cas9 umożliwiają bezstronne, systematyczne zaburzenia genomowe w skali genomu w celu badania efektów utraty genów w raku¹². Jednak biblioteki CRISPR w całym genomie oferują ograniczoną reprezentację pojedynczych RNA przewodnikowych (sgRNA) na gen, co zmniejsza czułość w porównaniu z bibliotekami skupionymi¹³. Co ważne, solidny screening nie tylko zależy od jakości zaburzeń, ale również od odpowiedniego modelu i zoptymalizowanego protokołu eksperymentalnego. W tym kontekście, badanie dynamicznego i złożonego procesu takiego jak oporność na leki może skorzystać na skupionym bibliotece z niestandardowym protokołem¹³. W poprzedniej pracy, stworzyliśmy bibliotekę knockout CRISPR-Cas9 skoncentrowaną na epigenomiu w celu kierowania na regulatorów chromatyny¹⁴. W porównaniu z innymi dostępnymi publicznie bibliotekami CRISPR skoncentrowanymi na epigenomiu, biblioteka knockout epigenomicznych (EPIKOL) zawiera 779 genów, składających się z czytaczy, pisarzy, mazańców chromatyny i związanych z nimi białek, każdy z nich ukierunkowany z 10 sgRNA, co umożliwia zwiększenie głębokości na gen i poprawę solidności i powtarzalności przesiewów funkcjonalnych skoncentrowanych na chromatynie¹⁴. EPIKOL jest dostępna zarówno w systemie LentiGuide, w którym Cas9 jest ekspresowany z różnego wektora, jak i w systemie LentiCRISPR, który zawiera Cas9, co zapewnia elastyczność w zależności od linii komórkowej. Osiągnięcie wystarczającego pokrycia biblioteki, zdefiniowanego jako średnia liczba komórek na sgRNA (np. 500×–1000×) jest łatwiejsze dla EPIKOL w porównaniu z bibliotekami w całym genomie, co daje przewagę podczas badania wolno rosnących chemooropornych linii komórkowych.

Chociaż przesiewy CRISPR oferują potężne podejście do badania mechanizmów oporności na chemioterapię, standardowe przesiewy zgrupowane nie są

Protokół

Wszystkie odczynniki i sprzęt użyte w niniejszym badaniu zostały wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Generowanie linii komórkowych raka piersi potrójnie ujemnego opornych na taksol

1. Aby określić wrażliwość komórek na lek, dostosuj gęstość przylegających komórek SUM159PT do poziomu 2 × 10³ komórek na studzienkę w czarnych płytkach 96-dołkowych z przezroczystym dnem, stosując mieszankę pożywek Ham's F12 uzupełnioną o 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny i streptomycyny, 5 µg/mL insuliny, 10 mM HEPES oraz 1 µL/mL hydrokortyzonu, a następnie inkubuj komórki przez 16 h w inkubatorze do hodowli komórek w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂.
2. Przygotuj roztwór zapasowy Taxolu rozpuszczony w dimetylosulfoksydzie (DMSO). W celu potraktowania komórek przygotuj rozcieńczenia seryjne Taxolu w medium hodowlanym w zakresie od 0,3 nM do 10 µM (np. 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 µM, 10 µM), stosując sam DMSO jako kontrolę nośnika.
3. Potraktuj komórki 200 µL rosnących dawek Taxolu (przygotowanych w kroku 1.2) w trzech powtórzeniach i pozostaw płytkę w inkubatorze do hodowli komórek na 72 h w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂.
4. Po 72 h traktowania lekiem zmierz żywotność komórek za pomocą luminescencyjnego testu ilościowego określania poziomu trifosforanu adenozyny (ATP). Użyj czytnika mikroplatek do pomiaru luminescencji i znormalizuj wartości względem kontroli z DMSO. Oblicz wartości stężenia hamującego 10% (IC10) oraz IC50 metodą regresji nieliniowej przy użyciu czteroparametrowego logistycznego modelu odpowiedzi na dawkę w odpowiednim oprogramowaniu statystycznym.
5. Aby rozpocząć generowanie komórek chemoopornych, wysiej 2 × 10⁵ komórek SUM159PT na studzienkę w płytkach 6-dołkowych. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂.
6. Następnego dnia potraktuj komórki dawkami Taxolu odpowiadającymi wartościom IC10 lub IC50 w 2 mL medium hodowlanego przez 72 h jako stężenia początkowe.
7. Jeśli komórki tolerują obecne stężenie leku, rozdziel je do dwóch studni. Jedną studnię zachowaj jako kontrolną w świeżym medium, a w drugiej zastąp medium pożywką zawierającą dwukrotnie większe poprzednie stężenie Taxolu.
   UWAGA: Jeśli komórki wymagają regeneracji z powodu stresowych zmian morfologicznych, takich jak nieprawidłowe wypustki komórkowe, znaczne zaokrąglenie i odrywanie się od podłoża lub wyraźne ograniczenie proliferacji, utrzymuj je w medium bez leku i czekaj, aż komórki odzyskają zdrowy stan i staną się konfluencyjne. Następnie powtórz kroki zaczynając od punktu 1.7.
8. Podczas generowania komórek opornych, pasażuj komórki macierzyste w medium zawierającym DMSO jako kontrolę. Dostosuj objętość DMSO tak, aby odpowiadała ilości DMSO obecnej w odpowiadającym traktowaniu Taxolem.
9. Zmierz żywotność komórek zgodnie z krokami 1.2–1.4 co 3–4 tygodnie i kontynuuj tę procedurę do momentu uzyskania istotnej różnicy (p < 0,05 lub 10–50 krotnej różnicy w zależności od zastosowanego leku) między wartościami IC50 linii komórkowych macierzystych i opornych. Procedura zwiększania dawki zazwyczaj trwa od 6 do 9 miesięcy, w zależności od użytego leku.
10. Po uzyskaniu stabilnych komórek opornych utrzymuj je w dawce podtrzymującej (ostatniej zastosowanej dawce) leku podczas hodowli, aby zachować fenotyp oporności.
    UWAGA: Generowanie komórek chemoopornych metodą eskalacji dawki jest procesem czasochłonnym, a jego czas trwania zależy od kilku czynników, w tym od linii komórkowej, wewnętrznej szybkości wzrostu oraz specyficznego zastosowanego środka chemioterapeutycznego. Zazwyczaj trwa to od 6 do 9 miesięcy, w zależności od klinicznie istotnego poziomu oporności. Alternatywnym podejściem do określenia istotnych różnic w poziomach oporności jest ocena minimalnego stężenia leku, przy którym komórki oporne przeżywają, natomiast komórki macierzyste giną.
11. Charakterystyka komórek opornych: Przeprowadź sekwencjonowanie RNA, western blotting, ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR) oraz testy żywotności komórek z traktowaniem lekiem (np. test tworzenia kolonii), aby scharakteryzować fenotyp opornych komórek. Pamiętaj o ponownej ocenie fenotypu opornego po kilku pasażach, aby wykazać, że podwyższony fenotyp IC50 jest stabilny w czasie.

2. Produkcja lentiwirusa

1. Dzień 0: Wysiać komórki HEK293T w zagęszczeniu 4 × 10⁶ na 100 mm szalkę hodowlaną w pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) uzupełnionej o 10% FBS i 1% penicyliny i streptomycyny, aby następnego dnia uzyskać 90% konfluencji.
2. Dzień 1: Przygotować mieszaniny polietyleniminy (PEI) i DNA w DMEM bez surowicy (-/-) oddzielnie dla każdego wirusa. Należy skorzystać z Tabeli 1 i Tabeli 2 w celu dostosowania objętości i stężeń PEI oraz DNA zgodnie z oczekiwaną wydajnością wirusa.
   UWAGA: PEI stosuje się w ilości czterokrotnie przekraczającej całkowitą masę DNA w µg (np. na szalce 100 mm należy użyć 30 µL PEI dla całkowitej ilości 7,5 µg DNA). W niniejszym protokole opisano produkcję wirusa w szalkach 100 mm; wirus otrzymany z 5–10 takich szalek pozwoli na przeprowadzenie wielu analiz screeningowych. W przypadku eksperymentów walidacyjnych lub infekcji na małą skalę wystarczy jedna studnia płytki 6-dołkowej lub szalka 60 mm. Ponieważ chlorowodorek liniowej polietyleniminy jest toksycznym czynnikiem transfekcyjnym, należy upewnić się, że w momencie transfekcji konfluencja komórek wynosi 90%.
   1. Po dokładnym wymieszaniu dodać mieszaninę DNA do probówki z PEI. Dobrze wymieszać i pozostawić kompleksy PEI-DNA na 30 min w temperaturze pokojowej.
   2. Następnie dodać kroplami 600 µL kompleksu PEI-DNA do komórek HEK293T. Umieścić szalki w inkubatorze do wirusów na 16 h w 37 °C przy 5% CO_2.
3. Dzień 2: Wymienić pożywkę z zainfekowanych komórek, odsysając pożywkę zawierającą PEI i wirusy, a następnie dodać 8 mL kompletnej pożywki DMEM na każdą 100 mm szalkę hodowlaną. Inkubować komórki, aby umożliwić produkcję wirusów.
4. Dzień 3: Przeprowadzić pierwszą zbiórkę wirusów, delikatnie przenosząc 8 mL supernatantu do odpowiedniej probówki wirówkowej i przechowując w 4 °C. W przypadku korzystania z wielu szalek do produkcji wirusa, połączyć supernatanty. Następnie dodać 8 mL świeżej kompletnej pożywki DMEM do każdej szalki i zwrócić szalki do inkubatora do wirusów.
5. Dzień 4: Powtórzyć etapy zbioru i połączyć z supernatantami z Dnia 3.
   1. Przygotować 50% (m/v) roztwór glikolu polietylenowego (PEG)-8000 w soli fosforanowo-buforowanej (PBS), aby uzyskać 5× roztwór zapasu PEG. Autoklawować w celu rozpuszczenia i sterylizacji.
   2. Wirować zebrane supernatanty wirusowe przy 300 x g przez 5 min, aby wytrącić pozostałe komórki, a następnie przejść do filtracji.
   3. Przefiltrować 16 mL supernatantu wirusowego przez filtr 0,45 µm (strzykawką lub filtrem próżniowym 50 mL) do probówki zawierającej 4 mL roztworu PEG, aby uzyskać końcowe stężenie 1× PEG i usunąć pozostałe zanieczyszczenia oraz komórki.
   4. Zamknąć probówkę i wymieszać przez odwracanie. Powtórzyć ten krok dla wszystkich preparatów wirusowych. Przechowywać przez noc w 4 °C w ciemności, opcjonalnie przy delikatnym wstrząsaniu.
   5. Następnego dnia powinny pojawić się widoczne osady. Wirować probówki przy 1400 x g przez 20 min w 4 °C.
      UWAGA: Osady wirusowe wytrącone przez PEG mogą być przechowywane w 4 °C do 5 dni przed wirowaniem; jednak dłuższa inkubacja może prowadzić do spadku miana wirusa.
   6. Po wirowaniu ostrożnie odrzucić supernatant, pozostawiając w probówce niewielką objętość (około 100 µL), aby nie naruszyć osadu.
   7. Wirować probówki przez 5 min przy 300 x g, aby zebrać jak najwięcej cieczy ze ścianek probówki. Następnie ostrożnie odrzucić pozostały supernatant.
   8. Aby skoncentrować wirusa 100-krotnie, dodać do osadu PBS w ilości 1/100 początkowej objętości supernatantu wirusowego i resuspender osad za pomocą pipetowania (np. rozpoczynając od 16 mL supernatantu wirusowego, dodać 120–140 µL PBS do osadu, aby osiągnąć końcową objętość 160 µL, uwzględniając objętość osadu). Unikać gwałtownego pipetowania; podzielić wirusa na alikwoty.
      UWAGA: Oczekiwane miano po koncentracji przez PEG wynosi >1 × 10⁸ cząstek infekcyjnych/mL (ip/mL) dla systemu LentiGuide i >1 × 10⁷ dla systemu LentiCRISPR. Miana niższe o rząd wielkości mogą być nadal akceptowalne, ale powinny zostać zweryfikowane pod kątem infekcyjności docelowej linii komórkowej i wymaganej objętości wirusa.
   9. Jeśli koncentracja wirusa nie jest wymagana, podzielić wirusa na alikwoty, aby zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania. Przechowywać wirusa skoncentrowanego lub nieskoncentrowanego w -80 °C. Zdezynfekować szalki wybielaczem i wyrzucić.
      UWAGA: Bardziej szczegółowy opis produkcji i postępowania z lentiwirusami znajduje się w uznanych protokołach²⁰. W przypadku typowych problemów występujących podczas produkcji lentiwirusów należy zapoznać się z Uzupełniającą Tabelą 1.

	1 dołek płytki 6-dołkowej	płytka 60 mm	płytka 100 mm	płytka 150 mm
Objętość PEI (roztwór stokowy 1 mg/mL)	6 µL	9 µL	30 µL	60 µL
Objętość DMEM (-/-)	54 µL	100 µL	270 µL	540 µL

Tabela 1: Wymagane objętości PEI i DMEM dla różnych płytek do przygotowania mieszaniny PEI.

	1 studzienka płytki 6-studzienkowej	płytka 60 mm	płytka 100 mm	szalka 150 mm
VSV-G	75 ng	150 ng	375 ng	750 ng
Gag-Pol	675 ng	1350 ng	3375 ng	6750 ng
Wektor docelowy	750 ng	1500 ng	3750 ng	7500 ng
DMEM (-/-), doprowadzić do końcowej objętości	60 µL	100 µL	300 µL	600 µL

Tabela 2: Wymagane objętości plazmidu i DMEM dla różnych płytek dla mieszaniny DNA.

3. Ustalenie zoptymalizowanej selekcji puromycyną dla komórek MDR

UWAGA: W komórkach chemoopornych wykazujących nadekspresję ABCB1 selekcja puromycyną zawodzi z powodu aktywnego efektu efflux puromycyny zapśredniczonego przez ABCB1, co uniemożliwia skuteczną selekcję komórek zainfekowanych sgRNA. Aby pokonać to ograniczenie, wraz z puromycyną podaje się werapamil w celu przejściowego zahamowania efektu efflux zapśredniczonego przez ABCB1, co pozwala na wewnątrzkomórkową akumulację puromycyny i efektywną eliminację komórek niezainfekowanych.

1. Wyznaczyć stężenie werapamilu, które blokuje zależny od ABCB1 odpływ leku, nie wpływając na żywotność komórek. W tym celu należy zastosować środek chemioterapeutyczny, w stosunku do którego nabyto oporność (w tym przypadku Taxol), w połączeniu z rosnącymi dawkami werapamilu.
   1. Zasiać oporne na Taxol oraz rodzime komórki SUM159PT na czarne płytki 96-dołkowe z przezroczystym dnem w zagęszczeniu 2 × 10³ komórek na dołek w trzech powtórzeniach. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO_2.
   2. Traktować komórki seryjnymi rozcieńczeniami werapamilu (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 i 80 µM), utrzymując stałe stężenie Taxolu (np. dawkę podtrzymującą) we wszystkich wariantach.
   3. Po 72 h traktowania ocenić żywotność komórek za pomocą luminescencyjnego testu żywotności opartego na ilościowym oznaczeniu ATP. Wyznaczyć stężenie werapamilu, które samo w sobie nie obniża żywotności (żywotność ≥90%–95% w porównaniu z nieleczoną kontrolą), ale przywraca wrażliwość w komórkach opornych.
2. Aby wyznaczyć stężenie puromycyny do zastosowania w połączeniu z werapamilem, zasiać oporne na Taxol komórki SUM159PT na płytkę 96-dołkową w zagęszczeniu 2 × 10³ komórek na dołek. Inkubować płytkę przez 16 h w temperaturze 37 °C przy 5% CO_2.
   1. Przygotować seryjne rozcieńczenia puromycyny (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 i 40 µg/mL) w medium zawierającym wcześniej wyznaczone stężenie werapamilu i odpowiednio traktować komórki.
   2. Po 72 h zmierzyć żywotność komórek za pomocą luminescencyjnego testu żywotności opartego na ilościowym oznaczeniu ATP i wyznaczyć minimalne stężenie puromycyny, które eliminuje wszystkie komórki (żywotność ≤5%) w obecności werapamilu. Stężenie to zostanie wykorzystane do selekcji podczas przesiewu CRISPR.
      UWAGA: Etapy optymalizacji stężeń leków są zależne od linii komórkowej i kontekstu. Czynniki takie jak wrodzona wrażliwość na lek, poziom ekspresji transporterów ABC oraz szybkość wzrostu mogą wpływać na stężenia efektywne. Należy zatem przeprowadzić tę optymalizację dla każdej nowej linii komórkowej i modelu oporności. (Dla referencji, dla komórek opornych na Taxol użytych w niniejszym badaniu stosowano 5 µg/mL puromycyny w połączeniu z 20 µM werapamilu¹⁷). W przypadku problemów z selekcją puromycyna + werapamil należy odnieść się do Tabeli uzupełniającej 1.

4. Miareczkowanie wirusa i obliczanie wielokrotności infekcji (MOI)

1. Dzień -1: Wysiać komórki SUM159PT oporne na Taxol w liczbie 2 × 10⁵  do każdego dołka płytki 6-dołkowej z pełną mieszaniną pożywki Ham's F12.
2. Dzień 0: Wykonać cztery rozcieńczenia seryjne wirusa w mieszaninie pożywki Ham's F12 zawierającej siarczan protaminy (PS) w stężeniu 8 µg/mL. (W przypadku wirusów skoncentrowanych zacząć od 1 µL i rozcieńczać dziesięciokrotnie w każdym kroku jako 1 > 10^-1 > 10^-2 > 10^-3. W przypadku wirusów nieskoncentrowanych dostosować objętości w stosowny sposób, np. 100 µL > 10 µL > 1 µL > 0,1 µL).
   1. Do każdego z czterech dołków dodać 1 mL pożywki zawierającej wirusa. Jeden dołek pozostawić jako kontrolę selekcji puromycyną, a jeden jako kontrolę niepoddaną działaniu wirusa.
3. Dzień 1: Wymienić pożywkę z wirusem na 2 mL świeżej pożywki 16 h po infekcji.
4. Dzień 2: Przenieść zawartość komórkową każdego dołka do 100-mm naczynia hodowlanego z mieszaniną pożywki Ham's F12 zawierającą puromycynę + werapamil w stężeniach określonych w kroku 3.2. Jeśli niepoddane selekcji komórki są zbyt gęste (nadmierna konfluencja), wysiać określoną frakcję (np. ½), co zostanie uwzględnione przy końcowych obliczeniach.
   UWAGA: W razie potrzeby uzupełniać pożywkę świeżą puromycyną + werapamilem w ciągu kolejnych 3-4 dni, aż do momentu obumarcia wszystkich komórek w płytce kontrolnej.
5. Dzień 4–5: Po obumarciu komórek w płytce kontrolnej wyznaczyć płytki, które zawierają wystarczającą liczbę komórek do zliczenia. Przeprowadzić trypsynizację komórek, zliczyć je i określić całkowitą liczbę komórek.
6. Po zliczeniu żywych komórek obliczyć wydajność transdukcji oraz wielokrotność infekcji (MOI) w następujący sposób (korzystając z Tabeli uzupełniającej 2 jako wzoru):
   1. Obliczyć stopień transdukcji (frakcję zainfekowanych komórek) za pomocą poniższego wzoru
      
      
      N_Selected: Całkowita liczba komórek po selekcji puromycyną w zainfekowanych dołkach
      N_Control: Całkowita liczba komórek w niezainfekowanym, niedopoddanym selekcji dołku kontrolnym
      p: Stopień transdukcji (frakcja zainfekowanych komórek).
      UWAGA: Jeśli wysiano tylko część komórek kontrolnych niepoddanych działaniu wirusa, należy to uwzględnić podczas obliczania N_Control
   2. Obliczyć MOI. Podczas transdukcji lentiwirusowej zdarzenia infekcji podlegają rozkładowi Poissona. Zatem frakcja komórek zainfekowanych co najmniej jednym wirusem jest definiowana jako:
      p =1- e ^-MOI
      W związku z tym MOI oblicza się jako:
      MOI = - ln(1-p)
   3. Obliczyć miano lentiwirusa (cząstki infekcyjne na mililitr, IP/mL) na podstawie liczby zainfekowanych komórek:
      Titer (IP/mL) = (MOI x N_starting)/ Objętość wirusa
      N_starting: liczba komórek wysianych do infekcji
      Objętość wirusa: objętość wirusa dodana do jednego dołka (w mL)
      ​UWAGA: Obliczyć miano lentiwirusa oddzielnie dla każdej infekcji i wyznaczyć miano końcowe, wyciągając średnią z dołków wykazujących proporcjonalne wartości ilości wirusa i miana. Dołki wykazujące nasycenie lub odchylenie od proporcjonalnego skalowania powinny zostać wykluczone z obliczeń miana.

5. Generowanie i/lub walidacja stabilnej linii komórkowej wykazującej ekspresję Cas9

UWAGA: Ten krok jest wymagany podczas korzystania z LentiGuide_EPIKOL. Jeśli dostępna jest już zwalidowana linia stabilna Cas9 lub jeśli używany jest LentiCRISPR_v2_EPIKOL, należy przejść bezpośrednio do sekcji 6.

1. Przygotować lentiwirus Cas9 przy użyciu wektora LentiCas9_blast zgodnie z opisem w sekcji 2.
2. Następnego dnia zainfekować komórki, dążąc do uzyskania MOI równego 10. Obliczyć ilość wirusa zgodnie z zamierzonym MOI opisanym w sekcji 4, odmierzyć obliczoną objętość wirusa i dodać ją bezpośrednio do komórek w płytce zawierającej pożywkę hodowlaną z dodatkiem 8 µg/mL siarczanu protaminy (PS).
3. Wymienić pożywkę z wirusem na świeżą pożywkę 16 h po infekcji.
4. Następnego dnia zastosować selekcję blastycydyną, dodając do komórek pożywkę hodowlaną zawierającą uprzednio ustaloną stężenie blastycydyny (stężenie końcowe ustalone dla danej linii komórkowej za pomocą testu żywotności komórek opisanego w sekcji 3) aż do wyeliminowania niezinfekowanych komórek (zazwyczaj od 6 do 7 dni).
   UWAGA: Jeśli komórki wykazujące ekspresję Cas9 są hodowane przez dłuższy czas przed przesiewaniem, należy powtórzyć selekcję blastycydyną w celu wyeliminowania komórek Cas9-ujemnych.
5. Walidacja Cas9 (zalecana): Zweryfikować aktywność Cas9 przy użyciu kontrolnych sgRNA celujących w geny niezbędne (sekwencje sgRNA są dostępne w bibliotece EPIKOL; patrz Tabela uzupełniająca 3) lub systemów reporterowych, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), aby ocenić wydajność i kinetykę knockoutu. Szczegółowe metody walidacji można znaleźć w poprzednim badaniu¹⁹.

6. Infekcja i screening biblioteki lentiwirusowej CRISPR do knockoutu w skali całego epigenomu

UWAGA: Aby zapewnić dokładne mapowanie genotypu na fenotyp, pulowe ekrany CRISPR wymagają infekcji z niskim MOI oraz wystarczającego pokrycia biblioteki (zazwyczaj 500×–1000), w zależności od rygoru eksperymentalnego i zachowania linii komórkowej. Ogólne zasady przepływu pracy w pulowych ekranach CRISPR w całym genomie, w tym projektowanie bibliotek i konfiguracja eksperymentalna, zostały opisane w wcześniej opublikowanych protokołach^21,22. W przypadku EPIKOL silnie zaleca się utrzymanie pokrycia >500x przez cały okres ekranowania, ponieważ spadek poniżej tego progu zwiększa ryzyko stochastycznego wypadnięcia sgRNA, szczególnie w ramieniu ekranu z zastosowaniem leku. Następujące obliczenia są niezbędne do określenia początkowej liczby komórek, wydajności transdukcji oraz objętości wirusa potrzebnej do transdukcji EPIKOL, aby przeprowadzić infekcję z niskim MOI bez naruszania złożoności biblioteki.

1. Dzień -1: Wysiej całkowitą liczbę komórek obliczoną poniżej w naczyniach hodowlanych o średnicy 100 mm lub 150 mm, zachowując odpowiednią liczbę komórek na płytkę.                                       
   1. Oblicz liczbę skutecznie zainfekowanych komórek, aby osiągnąć pożądaną pokrycie biblioteki (użyj Tabeli uzupełniającej 2 jako szablonu):
      N_infected = (liczba sgRNA) × (pożądane pokrycie)
   2. Oblicz początkową liczbę komórek na powtórzenie, aby skompensować frakcję niezinfekowanych komórek przy niskim MOI (0,3–0,4) podczas infekcji:
      N_starting = N_infected/p
      gdzie p to stopień transdukcji (frakcja zainfekowanych komórek) wyznaczony na podstawie rozkładu Poissona (patrz krok 4.6).
      UWAGA: Korekta ta zapewnia, że w puli po infekcji przy niskim MOI znajdzie się wystarczająca liczba komórek zainfekowanych pojedynczym sgRNA, aby osiągnąć pożądane pokrycie biblioteki.
2. Dzień 0 - Transdukcja
   1. Oblicz wymaganą objętość wirusa na powtórzenie
      Wymagana objętość wirusa = (N_starting × MOI) / (Miano wirusa (wcześniej wyznaczone w ip/mL))
      UWAGA: Wydajność transdukcji w docelowym zakresie MOI 0,3–0,4 odpowiada w przybliżeniu
      26%–33% komórek opornych na puromycynę przed selekcją.
   2. Zainfekuj komórki obliczoną objętością wirusa w pełnej pożywce hodowlanej zawierającej 8 µg/mL siarczanu protaminy (PS). Zmniejsz objętość pożywki, aby zwiększyć kontakt wirusa z komórkami podczas infekcji (np. 8 mL zamiast 10 mL dla płytki 100 mm)
   3. Przygotuj niezależne mieszaniny infekcyjne dla każdego powtórzenia biologicznego.
      UWAGA: Zaleca się zastosowanie co najmniej dwóch powtórzeń biologicznych; preferowane są trzy. Powtórzenia biologiczne muszą być transdukowane, selekcjonowane i utrzymywane osobno (łącznie ze zmianami pożywki i pasażowaniem) i nie powinny być łączone na żadnym etapie przed sekwencjonowaniem.
3. Dzień 1 - Wymień pożywkę z wirusem na świeżą po 16 h i inkubuj w 37 °C przy 5% CO₂
4. Dzień 2 - Selekcja komórek transdukowanych: Przeprowadź selekcję puromycyną w obecności werapamilu (stężenia wyznaczone w kroku 3.2), aby wzbogacić populację komórek zainfekowanych sgRNA w komórkach SUM159PT opornych na Taxol. Kontynuuj selekcję do momentu wyeliminowania wszystkich komórek na płytce kontrolnej niezinfekowanej (zazwyczaj ~3 dni).
5. Dzień 5 - Pobieranie próbek referencyjnych T₀: Po zakończeniu selekcji puromycyną + werapamilem, potraktuj komórki trypsyną i pobierz początkowy osad komórkowy dla czasu zero (time zero, T₀) z każdego powtórzenia biologicznego, zgodnie z poziomem pokrycia ustalonym podczas transdukcji. Ponieważ będzie on służył jako referencja dla początkowego rozkładu biblioteki, pobierz osady komórkowe niezwłocznie po zakończeniu selekcji, przed wystąpieniem jakiejkolwiek utraty komórek. Wysiej odpowiednią liczbę komórek, aby w każdym momencie zachować pokrycie.
   UWAGA: Po selekcji puromycyną + werapamilem liczba przeżyjących komórek transdukowanych będzie się różnić w zależności od czasu podwojenia linii komórkowej i osiągniętej wydajności transdukcji. Przeżywająca populacja zazwyczaj powraca do początkowej gęstości wysiewu po zakończeniu selekcji, a w przypadku szybciej rosnących linii komórkowych może ją przekroczyć. Jeśli liczba przeżyjących komórek na to pozwala, pobierz kilka osadów T₀ i zamroź próbki zapasowe w -80 °C. Dodatkowo komórki zainfekowane EPIKOL mogą być kriokonserwowane w ciekłym azocie przy zachowaniu pokrycia. Te zapasowe zasoby mogą zostać rozmrożone w przypadku nieoczekiwanej porażki ekranowania lub dla przyszłych alternatywnych podejść eksperymentalnych (np. testowania dodatkowych terapii lekowych). Sprawdź wydajność transdukcji, używając niezinfekowanej płytki kontrolnej, aby potwierdzić, że osiągnięto zamierzoną wydajność (patrz sekcja 4). Jeśli zaobserwowana wydajność transdukcji jest wyższa od oczekiwanej, rozpocznij eksperyment od nowa, aby upewnić się, że transdukcja jest przeprowadzana przy niskim MOI, co zapobiegnie integracji wielu sgRNA w jednej komórce.
6. Przeprowadzenie ekranowania: Po czasie niezbędnym do zakończenia edycji genomu za pośrednictwem Cas9, określonym w sekcji 5, podziel komórki na grupy traktowane.
   UWAGA: Zazwyczaj zajmuje to od 7 do 9 dni po transdukcji, ponieważ maksymalna wydajność knockoutu jest osiągana około 7. dnia po transdukcji²³. W przypadku celów epigenetycznych 9-dniowe okno pozwala również na wprowadzenie zmian na poziomie chromatyny przed rozpoczęciem selekcji lekowej.
   1. Podziel komórki na ramiona eksperymentalne, zachowując pokrycie: jedno jest ramieniem kontrolnym stanowiącym warunek bazowy otrzymujący DMSO, a drugie ramieniem traktowanym, czyli warunkiem otrzymującym Taxol.
   2. Utrzymuj kultury przez 14–16 podwojeń populacji. Poziom podwojenia populacji (PDL) oblicza się następująco:
      PDL = PDL_s + 3,322 (Log C_f – log C_i)
      PDL_s = początkowy poziom podwojenia populacji
      C_i = początkowa liczba wysianych komórek
      C_f = całkowita liczba komórek na koniec okresu wzrostu
   3. Przy każdym pasażu monitoruj żywotność i kinetykę wzrostu i unikaj wąskich gardeł, utrzymując odpowiednią liczbę komórek. Dostosuj intensywność leczenia, jeśli występuje nadmierna śmierć komórek.
      UWAGA: Dąż do pobierania zapasowych osadów komórkowych przy każdym pasażu, co tydzień lub przy określonych PDL podczas ekranowania. Te próbki zapasowe mogą służyć jako alternatywne punkty czasowe do sekwencjonowania lub jako próbki do optymalizacji procesu ekstrakcji gDNA. Okresowo kriokonserwuj komórki, aby uniknąć nieoczekiwanej utraty materiału.
7. Pobieranie próbek T_final: Po osiągnięciu pożąnego PDL pobierz osady końcowe (T_final) dla każdego powtórzenia i warunku, zachowując pokrycie biblioteki na osad. Przechowuj osady w -80 °C do czasu późniejszej ekstrakcji gDNA.
   ​UWAGA: Dąż do zakończenia ekranowania przy porównywalnych poziomach PDL między ramionami, nawet jeśli czas hodowli różni się w zależności od warunków.

7. Izolacja genomowego DNA

1. Wyizoluj genomowe DNA (gDNA) przy użyciu zwalidowanej metody (np. zestaw MN NucleoSpin Tissue Kit), wprowadzając niewielkie poprawki do protokołu w celu poprawy wydajności lizy dużych, połączonych pelletów komórkowych.
   1. Zastosuj protokół dla tkanek zamiast protokołu dla komórek ze względu na dużą wielkość pelletu. Jeśli jest to konieczne dla zapewnienia wydajnej lizy, rozważ zwiększenie objętości odczynników oraz użycie wielu kolumn wirówkowych na jeden pellet komórkowy (nie przekraczać 5 × 10⁶ komórek na kolumnę).
      UWAGA: Przed lizą resuspensja pelletu minimalną ilością PBS (~50 µL) może poprawić wydajność lizy. Niepełna liza pelletu może doprowadzić do zapchania kolumny wirówkowej, co skutkuje obniżeniem wydajności DNA.
   2. Postępuj zgodnie z zaleceniami dotyczącymi elucji o wysokiej wydajności i wysokim stężeniu. Eluuj gDNA w zmniejszonej objętości buforu do elucji (około ⅔ zalecanej objętości) na kolumnę, szczególnie jeśli pellety komórkowe zostały podzielone na wiele kolumn.
2. Oceń jakość i ilość gDNA (np. za pomocą Nanodrop).

8. Przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania EPIKOL z genomicznego DNA

1. Wszystkie etapy PCR biblioteki należy przeprowadzać w dedykowanej komorze do PCR, aby zapobiec kontaminacji plazmidowej podczas PCR gDNA, ponieważ matryce plazmidowe amplifikują się efektywniej niż DNA genomowe i mogą zaburzyć rozkład sgRNA.
   1. Przestrzeń roboczą, mikropipety i statywy należy oczyścić odpowiednio 10% wybielaczem i 70% etanolem.
   2. Przed użyciem należy przygotować alikwoty wszystkich odczynników (zwłaszcza starterów) w objętościach jednorazowych, aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji krzyżowej oraz cykli zamrażania i rozmrażania.
   3. Odczynniki należy przechowywać w temperaturze -20 °C i utrzymywać na lodzie podczas przygotowywania reakcji PCR.
2. Należy zoptymalizować początkową objętość wprowadzanego gDNA, dążąc do pokrycia 200×–500× na sgRNA, aby zachować odpowiednią złożoność biblioteki. Przykład: dla biblioteki EPIKOL gDNA są preferencyjnie ekstrahowane z pelletów komórkowych zebranych przy pokryciu 1000×, a do amplifikacji gDNA stosuje się końcowe pokrycie 250×.
   1. Wymaganą ilość gDNA dla pożądanej głębokości pokrycia oblicza się następująco:
      ilość gDNA = (liczba sgRNA) × pokrycie × (66pg DNA/jądro)
      Przykład: 8000 gRNA × (pokrycie 250×) × (6,6 pg DNA/jądro) = należy amplifikować 13,2 µg gDNA/próbkę.
   2. Należy przeprowadzić testowy PCR, stosując warunki reakcji PCR zewnętrznego i wewnętrznego podane w Tabeli 3, Tabeli 4, Tabeli 5 i Tabeli 6, z zastosowaniem zwiększających się ilości gDNA na reakcję (np. 1 µg, 3 µg, 6 µg), aby wyznaczyć optymalną ilość gDNA na probówkę.
      UWAGA: Niewystarczająca ilość wprowadzanego gDNA lub zbyt duża liczba cykli PCR może wprowadzić błąd amplifikacji i zaburzyć pokrycie sgRNA.
   3. Należy przeprowadzić elektroforezę na 2% żelu agarozowym, aby przeanalizować produkty wewnętrznego PCR. Należy upewnić się, że widoczny jest wyraźny prążek przy około 350 bp.
   4. Na podstawie optymalnej ilości gDNA na probówkę należy określić całkowitą liczbę reakcji PCR wymaganych na próbkę, aby osiągnąć pożądane pokrycie biblioteki, unikając jednocześnie nadmiernych ilości gDNA w pojedynczej reakcji.
      UWAGA: Jeśli wymagane jest 13,2 µg całkowitego gDNA, a 3,3 µg gDNA na reakcję daje optymalną amplifikację, należy przygotować cztery równoległe reakcje PCR z 3,3 µg gDNA w 100 µL objętości reakcyjnej. W tej konfiguracji objętość gDNA nie powinna przekraczać 10% objętości reakcji, aby uniknąć inhibicji PCR spowodowanej nadmierną ilością matrycy.
3. Amplifikacja kaset sgRNA z matrycy gDNA (pierwszy/zewnętrzny PCR)
   1. Należy amplifikować regiony genomowe zawierające stabilnie zintegrowaną lentiwirusową kasetę sgRNA, używając starterów wymienionych w Tabeli uzupełniającej 2. Reakcje PCR należy przeprowadzić z ilością gDNA wyznaczoną w kroku 8.2 (patrz Tabela 3), stosując warunki reakcji PCR podane w Tabeli 4. Należy przygotować probówkę kontrolną PCR bez DNA matrycy, aby sprawdzić ewentualną kontaminację; probówki należy przez cały czas trzymać na lodzie.
   2. Na samym końcu należy dodać polimerazę DNA, dokładnie wymieszać poprzez delikatne opukiwanie lub pipetowanie, a następnie krótko odwirować probówki PCR przed umieszczeniem ich w termocyklerze. Należy zastosować hot-start, aby zapobiec niespecyficznej amplifikacji.
   3. Po zakończeniu zewnętrznego PCR wszystkie reakcje PCR należy połączyć w jednej probówce do mikrocentryfugi. Oczyszczanie produktów PCR lub wizualizacja w żelu po zewnętrznym PCR nie jest wymagana. Połączony produkt PCR należy wykorzystać bezpośrednio jako matrycę w drugim (wewnętrznym) PCR. Produkty PCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

Odczynnik	Objętość na reakcję
dNTP (po 10 mM każdy)	2 µL
Polimeraza Phusion	1 µL
Bufor 6´ GC	20 µL
Startery forward (10 µM)	5 µL
Startery reverse (10 µM)	5 µL
gDNA	X µL
Woda wolna od nukleaz	do 100 µL (67–X µL)
Suma	100  µL

Tabela 3: Odczynniki wymagane do pierwszej/zewnętrznej reakcji PCR.

Numer cyklu	Denaturacja	Wyżarzanie	Rozszerzenie
1	95 °C, 3 min
2–19	95 °C, 25 s	65 °C, 20 s	72 °C 15 s
20			72 °C 3 min

Tabela 4: Warunki PCR dla pierwszej/zewnętrznej reakcji PCR.

4. Przeprowadzenie kodowania indeksowego (druga/wewnętrzna PCR) oraz ekstrakcji z żelu
   1. Podczas drugiej (wewnętrznej) reakcji PCR do kodowania próbek stosuje się odwrotny starter indeksowy; należy zatem użyć różnych starterów indeksowych dla każdej próbki.
      UWAGA: W przypadku bibliotek wygenerowanych przy użyciu pLentiCrispr v2 szkielet, należy użyć odwróconych starterów indeksujących kończących się zasadami CT, oznaczonych jako lenticrisprv2_rev(index X) (patrz Tabela uzupełniająca 2).
   2. Dla bibliotek przygotowanych przy użyciu pLentiGuide szkielet, użyj indeksów kończących się zasadami GT i oznaczonych jako rev_index_X w Tabela uzupełniająca 2.
   3. Przygotuj mieszaninę starterów przesuniętych (staggered primers) dla nici forward, łącząc po 2 µL z każdego z dziewięciu starterów przesuniętych (stok 100 µM) i dodając 162 µL wody wolnej od nukleaz do sterylnej probówki do mikrocentryfugi. Końcowe stężenie mieszaniny starterów wyniesie 10 µM.
   4. Wykorzystaj połączony produkt zewnętrznej reakcji PCR jako materiał wyjściowy i przeprowadź dwie równoległe wewnętrzne reakcje PCR w objętości 100 µL na każdą próbkę, postępując zgodnie z instrukcjami w Tabela 5 i Tabela 6Przygotuj Reakcja kontrolna PCR z wykorzystaniem kontroli „bez matrycy DNA” z zewnętrznego PCR (krok 7.3) jako materiału wejściowego w celu monitorowania potencjalnego zanieczyszczenia.
   5. Na koniec dodać polimerazę DNA, wymieszać dokładnie poprzez delikatne opukiwanie lub pipetowanie, a następnie krótko odwirować probówki PCR przed umieszczeniem ich w termocyklerze. Przeprowadzić szybki start (hot-start), aby zapobiec niespecyficznej amplifikacji.
   6. Połącz i przeprowadź reakcje wewnętrznego PCR, a następnie poddaj je elektroforezie w 2% żelu agarozowym w celu wyizolowania docelowego amplikonu.
      UWAGA: W kontrolach PCR bez matrycy nie powinny być wykrywalne żadne prążki. Należy zaobserwować wyraźny prążek o wielkości około 337 bp dla bibliotek LentiCrispr_V2 oraz 357 bp dla bibliotek LentiGuide. Może wystąpić również górny prążek niespecyficzny o wielkości około 500 bp, który należy wykluczyć z dalszej obróbki.
   7. Nanieś 12 µL (10 µL produktu PCR + 2 µL barwnika do nakładania próbek) produktu PCR wewnętrznego w celu wizualizacji prążków, a pozostałą część produktu PCR nanieś do połączonych lub sąsiednich studzienek przeznaczonych do ekstrakcji z żelu. Zminimalizuj grubość agarozy, aby zmaksymalizować odzysk DNA. Unikaj nadmiernej ekspozycji ścieżek przeznaczonych do ekstrakcji podczas wizualizacji, aby zminimalizować uszkodzenia DNA indukowane promieniowaniem UV podczas wycinania fragmentu żelu.
   8. Oczyścić produkty PCR z żelu agarozy, używając odpowiedniego zestawu do ekstrakcji z żelu (np. NucleoSpin Gel and PCR Clean-up), zgodnie z instrukcją producenta. Stężenie DNA zmierzyć za pomocą spektrofotometru. Produkty PCR przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Minimalne stężenie wynoszące >Do prawidłowego sekwencjonowania wymagane jest stężenie 20 ng/µL po ekstrakcji z żelu. Jeśli nie udało się uzyskać wymaganej wydajności nawet przy trzech równoległych wewnętrznych reakcjach PCR, należy wyizolować nowe gDNA i powtórzyć proces.

Odczynnik	Objętość na reakcję
dNTP (po 10 mM każdego)	2 µL
Polimeraza Phusion	1 µL
Bufor 6´ GC	20 µL
Starter Forward Stagger Mix (10 µM)	5 µL
Starter Reverse Index (10 µM)	5 µL
Zewnętrzny PCR	5 µL
Woda wolna od nukleaz	62 µL
Suma	100  µL

Tabela 5: Odczynniki wymagane do drugiej/wewnętrznej reakcji PCR.

Numer cyklu	Denaturacja	Wyżarzanie	Rozszerzenie
1	95 °C, 3 min
2–25	95 °C, 25 s	65 °C, 20 s	72 °C 15 s
26			72 °C przez 3 min

Tabela 6: Warunki PCR dla drugiej/wewnętrznej reakcji PCR.

9. Sekwencjonowanie

1. Wyznaczyć wymaganą liczbę zmapowanych odczytów na podstawie pokrycia biblioteki zdefiniowanego na początku ekranu. Zakładając wydajność mapowania na poziomie 60%–70%, należy zamówić większą całkowitą liczbę odczytów, aby zrekompensować straty. Dla pokrycia 1000× biblioteki EPIKOL wymaganych jest ok. 8 milionów zmapowanych odczytów, co odpowiada 10–12 milionom odczytów całkowitych.
2. Przed sekwencjonowaniem przeprowadzić kontrolę jakości bibliotek sekwencyjnych za pomocą systemu Tapestation lub Bioanalyzer w celu potwierdzenia rozmiaru i integralności biblioteki.
3. Przed sekwencjonowaniem połączyć biblioteki sekwencyjne z różnych próbek, ponieważ są one unikalnie oznakowane primerami indeksowymi (barcoding).
4. Potwierdzić strukturę odczytów (orientacja R1/R2) oraz wymagania dotyczące demultipleksowania w jednostce sekwencjonującej. Sugerowane jest sekwencjonowanie par readów 2× 150 bp na platformie Illumina HiSeq, Novaseq lub równoważnej platformie kompatybilnej z systemem Illumina. Rozważyć zamówienie co najmniej 5% domieszki PhiX w celu zwiększenia różnorodności sekwencjonowania.

10. Przegląd analizy sekwencjonowania dla EPIKOL

1. Użyj potoku analizy MAGeCK do analizy plików FASTQ z sekwencjonowaniem par końców²⁴. Zorganizuj każdy powtórz biologiczny jako oddzielny plik wejściowy.
2. Użyj pliku wejściowego sgRNA z systemu EPIKOL, który jest kompatybilny z MAGeCK, jako biblioteki referencyjnej (podanej w Tabeli uzupełniającej 4) i zastosuj funkcję count, aby ilościowo określić odczyty sgRNA z poszczególnych plików FASTQ w celu utworzenia plików z surowymi zliczeniami dla każdego powtórzenia i warunku.
   1. Znormalizuj każdy plik zliczeń, stosując normalizację Reads per million (RPM), aby sprawdzić jakość i rozkład każdej próbki poprzez wizualizację wykresów znormalizowanych zliczeń sgRNA¹⁴.
3. Wykonaj drugą funkcję -count, aby połączyć zliczenia w jeden plik, stosując normalizację medianową z ustawieniami domyślnymi.
4. Uruchom funkcję -test, aby zidentyfikować zmiany na poziomie genów przy użyciu połączonych plików surowych zliczeń. Aby ocenić wydajność przesiewu, porównaj próbki T_final z próbkami T₀ i sprawdź rozkład niecelujących sgRNA kontrolnych oraz sgRNA celujących w geny niezbędne.
   UWAGA: Krytycznym elementem oceny wydajności przesiewu jest analiza stopnia wyczerpania genów kontroli pozytywnej w każdym ramieniu badania. W ramieniu przesiewu z zastosowaniem leku oczekuje się wystąpienia zmienności biologicznej między powtórzeniami, ponieważ ekspozycja na lek może powodować stochastyczne różnice w odpowiedzi komórkowej. Zmienność ta jest nieodłączną cechą przesiewów chemiooporności i nie musi wskazywać na niską jakość badania. Dlatego podczas identyfikacji trafień (hit-calling) należy analizować wspólnie co najmniej trzy powtórzenia biologiczne, a jako trafienia należy uznać geny, dla których co najmniej 6 z 10 sgRNA wykazuje skuteczność.
5. Aby zidentyfikować indukowane lekiem zmiany w obfitości sgRNA oraz efekty na poziomie genów, porównaj próbki T_final traktowane Taxolem z próbkami T_final-DMSO, przyjmując grupę DMSO jako kontrolę.
6. Zastosuj próg poziomu fałszywych odkryć (FDR) na poziomie FDR < 0.05, aby zidentyfikować geny wyczerpane w grupie traktowanej, co pozwoli ujawnić geny przyczyniające się do przeżywalności lub oporności komórek opornych na Taxol.

Wyniki

Aby zbadać epigenetyczne regulatory chemooporności w TNBC, przedstawiono ogólny protokół z wykorzystaniem linii komórkowej SUM159PT na Rysunku 1. Najpierw wyznaczono wartości IC₁₀ i IC₅₀ Taxolu w komórkach SUM159PT poprzez traktowanie komórek rosnącymi stężeniami Taxolu (Rysunek 2A). Do wygenerowania odpornych na Taxol komórek SUM159PT zastosowano metodę stopniowego zwiększania dawki. Po kilku miesiącach przesunięcie wartości IC50 ilustruje skuteczne ustanowienie fenotypu odpornego przy użyciu tego protokołu w porównaniu z komórkami kontrolnymi, które były pasażowane równolegle bez ekspozycji na Taxol (Rysunek 2B).

Rycina 1: Schemat przesiewu EPIKOL w komórkach SUM159PT opornych na Taxol. Ogólny przebieg przesiewu EPIKOL w wygenerowanych komórkach SUM159PT opornych na Taxol. Rycina została stworzona za pomocą BioRender.com Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Po uzyskaniu linii komórek opornych przeprowadzono szereg eksperymentów w celu scharakteryzowania ich zmian fenotypowych i molekularnych. Zdolność do proliferacji komórek opornych pod wpływem Taxolu oceniono za pomocą testu tworzenia kolonii w porównaniu z komórkami wyjściowymi. Jak widać na Rysunku 2C,D, komórki oporne zachowują zdolność do proliferacji podczas leczenia Taxolem, podczas gdy komórki wyjściowe nie są w stanie przetrwać. Test ten jest jednym z istotnych etapów charakterystyki komórek opornych i demonstruje sposób oceny zdolności proliferacyjnej komórek wyjściowych i opornych podczas leczenia lekiem.

W ramach charakterystyki komórek opornych przeprowadzono sekwencjonowanie RNA komórek macierzystych i opornych, aby przeanalizować zmiany transkrypcyjne związane z chemoopornością (Rysunek 2E). Wśród genów o najwyższym poziomie nadekspresji w komórkach opornych znalazł się ABCB1, a następnie kilka innych transporterów ABC, w tym ABCB4 i ABCA5. Nadekspresję ABCB1 potwierdzono za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), co obrazuje sposób walidacji zmian w ekspresji genów kandydackich przy użyciu qPCR (Rysunek 2F).

Rysunek 2: Generowanie opornych komórek i ich charakterystyka. (A) Schemat przedstawiający generowanie opornych na Taxol komórek SUM159PT przy użyciu metody stopniowania dawki. (B) Krzywa odpowiedzi na dawkę wykazująca różnicę między wartościami IC50 komórek macierzystych a wygenerowanymi komórkami opornymi. IC50 dla linii macierzystej = 6 nM i IC50 dla linii opornej na Taxol = 355,4 nM. (C) Test tworzenia kolonii w obecności Taxolu. (D) Ilościowe oznaczenie obszarów kolonii z punktu (C). Zastosowano dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z testem post hoc Tukeya przy użyciu programu Prism 8 (GraphPad Software). Poziomy istotności określono jako *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. (E) Wykresy wulkaniczne (volcano plots) przedstawiające geny o różnej ekspresji w komórkach Taxol-Res w porównaniu z komórkami macierzystymi, z punktem odcięcia LFC>2 i p<0,001. (F) Walidacja qPCR ekspresji mRNA ABCB1 w komórkach macierzystych i Taxol-Res. Wartości P określone za pomocą obustronnego testu t Studenta w porównaniu z grupą kontrolną; **P < 0,01. Panel A został stworzony za pomocą BioRender.com. Rysunek w panelu E został zmodyfikowany za zgodą Yedier-Bayram i wsp.¹⁷. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Po wykazaniu nadekspresji ABCB1 oraz innych transporterów ABC w komórkach opornych na Taxol i biorąc pod uwagę szerokie spektrum substratów ABCB1, oceniono występowanie fenotypu MDR. W tym celu komórki oporne na Taxol poddano działaniu wielu leków będących znanymi substratami transportera ABCB1 o różnych mechanizmach działania, a następnie oceniono ich wrażliwość na te leki (Rysunek 3A,B). Zgodnie z obserwowanym profilem ekspresji transporterów ABC, komórki oporne na Taxol wykazały również oporność na doksorubicynę i winkrystynę, co potwierdziło obecność profilu MDR i zilustrowało sposób funkcjonalnej oceny fenotypu wielolekowości.

Fenotyp MDR stanowi wyzwanie dla podejścia do przesiewania opartego na technologii CRISPR, metody EPIKOL, ponieważ biblioteka wymaga selekcji puromycyną w celu wzbogacenia populacji komórek przetransdukowanych. Ponieważ puromycyna może być usuwana z komórek poprzez efekt wysyłania leków zależny od białka ABCB1, selekcja puromycyną może być nieefektywna w komórkach opornych (Rycyna 3C). W konsekwencji komórki nieprzetransdukowane mogą przetrwać selekcję, co zakłóca wyniki przesiewu.

Aby rozwiązać to ograniczenie, przed ekranowaniem EPIKOL zoptymalizowano proces selekcji komórek chemoopornych o profilu MDR. W celu zablokowania efleuksu leków zapśredniczonego przez transportery ABC zastosowano werapamil, inhibitor ABCB1 pierwszej generacji, co pozwoliło na wewnątrzkomórkową akumulację leków chemioterapeutycznych lub puromycyny (Rysunek 3D). Choć sam werapamil nie wpływał na żywotność komórek, przyłączenie go do leków chemioterapeutycznych przywracało wrażliwość na leki (Rysunek 3E,F). Podobnie krzywe przeżywalności po podaniu puromycyny w połączeniu z nietoksycznymi dawkami werapamilu wykazały, że inhibicja ABCB1 przywraca wrażliwość na puromycynę (Rysunek 3G,H). Zapewnia to, że komórki, które przeżyły selekcję, są komórkami skutecznie przetransdukowanymi, a nie takimi, które uniknęły selekcji z powodu efleuksu leków napędzanego przez ABCB1. Ustanowienie skutecznego schematu selekcji w komórkach chemoopornych jest kluczowe dla wiarygodnych wyników ekranowania EPIKOL.

Rycina 3: Fenotyp wielolekowej oporności i wpływ werapamilu na komórki oporne. Krzywe zależności odpowiedzi od dawki wykazujące różnice między wartościami IC50 komórek wyjściowych a wygenerowanymi komórkami opornymi w przypadku (A) doksorubicyny, (B) winkrystyny, (C) puromycyny. (D) Schemat przedstawiający selekcję komórek SUM159PT opornych na Taxol z dodatkiem i bez dodatku werapamilu. Rycina została stworzona za pomocą BioRender.com. (E) Test żywotności komórek Taxol-Res w celu ustalenia optymalnego stężenia werapamilu przy stosowaniu Taxolu. (F) Verapamil przywraca wrażliwość komórek opornych na Taxol na działanie Taxolu. (G) Verapamil nie zmienia odpowiedzi komórek wyjściowych na puromycynę. (H) Verapamil przywraca wrażliwość na puromycynę w komórkach Taxol-Res. Panele A, B i F zostały wykorzystane ponownie za zgodą autorów Yedier-Bayram et al.¹⁷. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W celu znalezienia nowych regulatorów chemooporności w TNBC przeprowadzono przesiew EPIKOL z wykorzystaniem komórek SUM159PT opornych na Taxol, zgodnie z ilustracją na Rysunku 4A. Ponieważ komórki oporne rosną wolniej niż komórki wyjściowe¹⁷, w trakcie całego przesiewu monitorowano poziom podwojenia populacji zarówno w grupach traktowanych Taxolem, jak i DMSO, aby określić czas potrzebny do osiągnięcia 16 podwojeń populacji (Rysunek 4B). W związku z tym przesiew EPIKOL dla grupy traktowanej DMSO zakończono około 35. dnia, natomiast grupę traktowaną Taxolem hodowano przez dodatkowe 15 dni, aby osiągnąć ten sam poziom podwojenia populacji.

Po sekwencjonowaniu wykorzystano potok analityczny MAGeCK, aby połączyć efekt sgRNA celujących w ten sam gen i ujawnić zmiany na poziomie genów po ich znokautowaniu²⁴. Biblioteka EPIKOL zawiera sgRNA celujące w geny niezbędne do życia jako kontrole pozytywne; pierwszym krokiem kontroli jakości była ocena, czy sgRNA te uległy oczekiwanemu uszczupleniu. Wykresy wodospadowe ilustrują Log2-krotne zmiany genów niezbędnych w różnych porównaniach (Rycyna 4C–E). W przypadku porównania próbek z końcowego punktu czasowego w warunkach traktowania DMSO lub Taxolem z punktem początkowym, prawie wszystkie geny niezbędne uległy uszczupleniu po znokautowaniu, co wskazuje na efektywność badania (Rycyna 4C,D). Jednakże uszczuplenie to nie jest wyraźnie obserwowane przy porównywaniu ze sobą dwóch próbek końcowych (traktowanych DMSO i traktowanych Taxolem), co było spodziewane, ponieważ geny niezbędne są wymagane do przeżycia komórek w obu warunkach (Rycyna 4E).

Alternacyjną metodą wizualizacji wyników przesiewu jest wykres wulkaniczny (volcano plot), który przedstawia zmiany logarytmiczne (Log2 fold changes) wraz z istotnością statystyczną (wartość p lub wartość FDR). W przesiewie EPIKOL przeprowadzonym na komórkach opornych na Taxol zidentyfikowano wiele genów kontroli pozytywnej jako istotnie uszczuplone, co dodatkowo potwierdza niezawodność przesiewu, ponieważ uszczuplenie sgRNA celujących w geny kontroli pozytywnej stanowi typową kontrolę jakości udanego przesiewu (Rycina 4F). Oprócz kontroli genów niezbędnych, biblioteka EPIKOL zawiera specyficzne dla kontekstu sgRNA kontroli pozytywnej, celujące w kilka genów transporterów ABC. Zgodnie z oczekiwaniami, znormalizowane liczby sgRNA dla ABCB1 w różnych grupach wykazały istotne uszczuplenie sgRNA celujących w ABCB1 specyficznie w grupie traktowanej Taxolem (Rycina 4G). W ogólnym ujęciu demonstruje to, w jaki sposób zmiany na poziomie sgRNA mogą być interpretowane w celu identyfikacji genów kandydackich związanych z odpowiedzią na lek.

Rysunek 4: Wyniki przesiewu EPIKOL w komórkach opornych na Taxol oraz przykładowe wykresy. (A) Schemat protokołu przesiewu EPIKOL. (B) Poziom podwojenia populacji (PDL) komórek Taxol-Res. (C–E) Wykresy kaskadowe (waterfall plots) przedstawiające wyniki przesiewu EPIKOL w komórkach Taxol-Res, z zaznaczeniem genów niezbędnych; grupa traktowana DMSO w porównaniu z punktem początkowym na panelu C, grupa traktowana Taxolem w porównaniu z punktem początkowym na panelu D oraz grupa traktowana Taxolem w porównaniu z grupą traktowaną DMSO na panelu E. (F) Wykres wulkaniczny (volcano plot) przedstawiający Log2FoldChanges genów w próbkach traktowanych Taxolem w porównaniu z punktem początkowym. Geny o p<0.05 zostały pokolorowane i opisane. Rysunek ten został zmodyfikowany z poprzedniej publikacji¹⁷. (G) Liczba odczytów na milion (rpm) dla 10 różnych sgRNA ABCB1 na wykresach z EPIKOL. Panel A został stworzony za pomocą BioRender.com. Panel E został wykorzystany ponownie za zgodą Yedier-Bayram i wsp.¹⁷. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Tabela rozwiązywania problemów.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Obliczanie miana wirusa i MOI.Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Tabela uzupełniająca 3: Lista sgRNA biblioteki EPIKOL.Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Tabela uzupełniająca 4: Primery użyte podczas przygotowywania biblioteki do sekwencjonowania EPIKOL. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Podejścia do przesiewowych badań opartych na CRISPR-Cas9 są dobrze ustalone w różnych kontekstach komórkowych. Jednak przesiewanie w komórkach odpornych na chemioterapię stwarza wyjątkowe wyzwania i wymaga dodatkowej optymalizacji. Ponieważ komórki odporne na chemioterapię służą jako cenne modele do badania podatności guzów odpornych na chemioterapię, ważne jest, aby rozwiązać te ograniczenia w strategiach przesiewowych, aby niezawodnie zidentyfikować genetyczne lub epigenetyczne regulatorzy odporności na chemioterapię.

Generowanie linii komórkowych odpornych na chemioterapię może być uciążliwe i zależy w dużym stopniu od stosowanego środka chemioterapeutycznego. Podczas gdy komórki mogą łatwo przystosować się do niektórych leków, mogą być bardzo podatne na inne²⁵. Dlatego ważne jest określenie wartości IC50 specyficznych dla linii komórkowych przed rozpoczęciem protokołu generacji komórek odpornych¹⁷. W przypadkach, gdy komórki nie są w stanie tolerować narażenia na poziom leku odpowiadający IC50 przez kilka przelewów, można rozpocząć od niższego stężenia leku (np. IC10-20) (patrz sekcja Protokół 1)¹⁷. Ponieważ nabycie odporności jest zdarzeniem losowym, kilka dobrze/płytek komórek może być leczonych w tym samym czasie, aby zwiększyć prawdopodobieństwo uzyskania odpornych komórek. Kluczowe jest wszechstronne scharakteryzowanie uzyskiwanej populacji komórek odpornych na leki, aby opisać zmiany transkrypcyjne i fenotypowe podczas procedury zwiększania dawki w porównaniu z ich stanem pierwotnym. Globalne podejście profilujące, takie jak RNA-seq, może być zastosowane do zidentyfikowania genów o zróżnicowanej ekspresji w stosunku do linii macierzystej. Funkcjonalnie, nabyta odporność na leki powinna być zweryfikowana za pomocą testów na żywotność i proliferację komórek, aby wykazać, że odporne komórki utrzymują przetrwanie w warunkach leczenia lekami, które są cytotoksyczne dla komórek macierzystych. Ponadto potencjalne zmiany w ich zdolności proliferacyjnej i szybkości wzrostu powinny być mierzone w porównaniu z linią komórek macierzystych, aby obliczyć ich odpowiednie PDL. Ponieważ znana jest nabyta odporność na Taxol, którą pośredniczą, przynajmniej częściowo, wydalanie leków za pośrednictwem ABC, ekspresja kluczowych transporterów ABC (np. ABCB1) powinna być oceniana na poziomie mRNA i białka za pomocą qPCR i Western blottingu i może być uzupełniona danymi transkryptomowymi. Na podstawie profilu ekspresji transporterów ABC należy rozważyć obecność fenotypu MDR i należy ocenić odporność na inne leki chemioterapeutyczne. W naszym poprzednim badaniu scharakteryzowaliśmy linie komórek odpornych na Taxol i zidentyfikowaliśmy ABCB1 jako jeden z najbardziej nadekspresowanych genów, i założyliśmy, że medianowana przez ABCB1 wielolekowa odporność może powodować niepowodzenie w selekcji puromycinem¹⁷. Dlatego po utworzeniu komórek odpornych należy ocenić ekspresję transporterów ABC i fenotypu MDR przed każdą procedurą transfekcji.

Metoda zwiększania dawki oferuje zalety w stosunku do protokołów narażenia na wysokie dawki leków, ponieważ komórki mogą być krioprzechowywane na każdym etapie przed zwiększeniem dawki leku, zapewniając elastyczność i ochronę przed utratą kultury. Ponadto stopniowe zwiększanie dawki pozwala na nabycie fenotypu odporności w czasie, umożliwiając adaptacyjną ewolucję; w przeciwieństwie do ostrej wysokiej dawki leczenia, która prowadzi do selekcji uprzednio istniejących podpopulacji odpornych. Jego stopniowe postępy umożliwiają badaczom celowe wybór pożądanego poziomu odporności, na którym należy przerwać selekcję i ocenić właściwości wynikającego fenotypu. Ponadto, pośrednie kroki zwiększania dawki mogą być wykorzystane do badania mechanizmów nabytej odporności w sposób chronologiczny. Zgodnie z podstawowym pytaniem biologicznym, można uzyskać różne poziomy odporności, aby badać wczesne mechanizmy adaptacyjne o niższych poziomach odporności lub stabilne i w pełni ustalone fenotypy odporności w bardziej odpornych komórkach. Co więcej, klinicznie istotne progi odporności różnią się znacznie w zależności od leku, linii komórek i właściwej szybkości proliferacji; dlatego harmonogram zwiększania dawki może się różnić (w naszym przypadku, generowanie komórek odpornych na Taxol wymagało około 6 miesięcy). Zgodnie z tym rozumowaniem, w naszym poprzednim badaniu ustaliliśmy dwa różne poziomy odporności z komórkami SUM159PT i porównaliśmy ich różne i wspólne cechy¹⁷. Dlatego zalecamy, aby badacze zdefiniowali docelowy zakres IC50 leku o interesującym klinicznie i biologicznie zainteresowaniu.

Jest dobrze ustalone, że wycofanie stresu leku może prowadzić do utraty odporności na chemioterapię, ponieważ komórki mogą przebudować swoje epigenom i transkryptom²⁵. Z tego powodu sugeruje się ocenę stabilności fenotypu odporności przez kilka miesięcy. Jeśli komórki mają tendencję do powrotu do stanu wrażliwego po wycofaniu leku, komórki odporne mogą być hodowane w obecności dawki utrzymującej, która zazwyczaj odpowiada końcowej stężeniu leku

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100 mm plate	Corning	353003	Cell culture
45 µm filter	Sigma-Aldrich	SLHVM33RS	Cell culture
6 well plate	Corning	3506	Cell culture
96-well black clear bottom plates	Sigma-Aldrich	CLS356259	For CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay
Blasticidin	Thermo Fisher	A1113903	For selection
CellTiter-Glo luminescent cell viability assay	CellTiter-Glo, Promega	G7570	For CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay
DMEM	Gibco		Cell culture
DMSO	PanReac AppliChem	A3672,0050	Cell culture
FBS	Gibco	16140071	Cell culture
Ham’s F12 nutrient mix	Gibco	11765054	Cell culture
HEK293T cells			Kind gifts from Robert Weinberg (MIT, Boston, USA).
HEPES	Thermo Fisher	15630080	Cell culture
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001-1G	Cell culture
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278-5ML	Cell culture
LentiCas9-blast	Addgene	#52962	For Cas9-stable cell line generation
LentiGuide-Puro	Addgene	#52963	Backbone for gRNA cloning
MN NucleoSpin tissue kit	Macherey-Nagel	740952.5	For genomic DNA extraction
PBS	Gibco	10010023	Cell culture
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cell culture
pLentiCRISPR v2	Addgene	#52961	Backbone for gRNA cloning
Polyethylene glycol (PEG)-8000	Sigma-Aldrich	P2139-500G	For lentivirus concentration
Polyethylenimine, linear (PEI)	Sigma-Aldrich	765090-1G	For lentivirus production
Protamine sulfate (PS)	Sigma-Aldrich	P4380-25G	For lentivirus infection
psPAX2	Addgene	# 12260	For lentivirus production
Puromycin	Thermo Fisher	A1113803	For selection
SUM159PT adherent cells			Kind gifts from Robert Weinberg (MIT, Boston, USA).
Taxol	Paclitaxel, Sigma	PHR1803-200MG	For res cell generation and maintenance
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054	Cell culture
Verapamil	Selleck Chemicals	S4202	For selection
VSV-G	Addgene	# 8454	For lentivirus production