Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
* These authors contributed equally
U danio pręgowanych Mollugin w bezpiecznych dawkach (≤200 µg/mL) wiązał się z poprawą regeneracji ogona, której towarzyszyły zmiany w ekspresji genów związanych z apoptozą, markerach stanu zapalnego, aktywności enzymów przeciwutleniających oraz markerach związanych z makrofagami. Wyniki te sugerują, że Mollugin może modulować lokalną odpowiedź na uraz podczas regeneracji ogona u danio pręgowanych.
Molugin jest naturalnym związkiem naftochinonowym o zgłoszonym działaniu przeciwzapalnym i przeciwutleniającym, jednak jego rola w regeneracji tkanek pozostaje nie do końca poznana. W niniejszym badaniu wykorzystano model amputacji ogona danio pręgowanego w celu zbadania wpływu moluginy na gojenie ran oraz związane z tym odpowiedzi immunologiczne i redoksowe. Embriony danio pręgowanego po urazie ogona traktowano moluginą w stężeniach 22 µg/mL, 66 µg/mL oraz 200 µg/mL. Leczenie moluginą wiązało się z poprawą regeneracji powierzchni ogona w sposób zależny od dawki, czemu towarzyszyło obniżenie ekspresji genów związanych z apoptozą oraz supresja mediatorów prozapalnych, w tym IL-1β, IL-6, TNF-α, TLR4 i NF-κB1. Równolegle molugina przywróciła aktywność enzymów przeciwutleniających, takich jak dysmutaza ponadtlenkowa i katalaza. Obrazowanie fluorescencyjne u danio pręgowanego Tg(mpeg1:GFP) wykazało zależny od czasu wpływ moluginy na akumulację makrofagów, bez wyraźnego zmniejszenia w 24 h, ale ze zmniejszoną powierzchnią zajmowaną przez makrofagi w 48 h w grupach 66 i 200 µg/mL w porównaniu z grupą modelową z urazem. Analiza qRT-PCR wykazała ponadto obniżoną ekspresję markera związanego z fenotypem M1, iNOS, oraz zwiększoną ekspresję markera związanego z fenotypem M2, arginazy-1. Zbiorczo wyniki te sugerują, że molugina może wspomagać regenerację ogona danio pręgowanego w powiązaniu ze zmianami w markerach stanu zapalnego, stresu oksydacyjnego, apoptozy oraz markerach związanych z makrofagami. Dalsze badania są niezbędne do określenia podstawowych mechanizmów komórkowych i molekularnych.
Regeneracja tkanek jest krytycznym procesem fizjologicznym, dzięki któremu organizmy naprawiają uszkodzenia, co wiąże się ze złożoną regulacją proliferacji i różnicowania komórek oraz utrzymaniem homeostazy mikrośrodowiska1. Wśród modeli kręgowców ryby danio-ostrolepisze stały się kluczowym systemem do badania mechanizmów gojenia ran ze względu na ich niezwykłą zdolność do regeneracji. W szczególności regeneracja płetwy ogonowej u danio-ostrolepiszy obejmuje spatiotemporalną koordynację wielu zdarzeń biologicznych, w tym regulację stanu zapalnego, równowagę odpowiedzi oksydacyjnej oraz kontrolę apoptozy2,3. W ostatnich latach działania farmakologiczne produktów naturalnych stały się punktem ciężkości w badaniach nad medycyną regeneracyjną. Związki naftochinonowe były szczególnie szeroko badane ze względu na ich różnorodne efekty biologiczne4. Mollugina jest związkiem naftochinonowym pochodzącym z roślin z rodziny Rubiaceae, który w poprzednich badaniach wykazał działanie przeciwzapalne, przeciwutleniające oraz regulujące cykl komórkowy5,6. Jednakże mechanizm jej działania w regeneracji tkanek pozostaje niejasny, a jej potencjalna rola w modulowaniu zapalnego mikrośrodowiska i polaryzacji komórek odpornościowych wymaga systematycznego zbadania.
Po urazie szybko aktywowany jest stan zapalny, który bezpośrednio wpływa na naprawę tkanek. Umiarkowana sygnalizacja zapalna jest niezbędna do usuwania tkanki martwiczej i inicjowania programu regeneracji, natomiast nadmierna kaskada zapalna może nasilić stres oksydacyjny i prowadzić do włóknienia tkanek7. Cytokiny, w tym IL-1β, IL-6 i TNF-α, wyraźnie wzrastają po urazie, czemu towarzyszy aktywacja sygnalizacji TLR4/NF-κB, co prowadzi do nasilenia odpowiedzi zapalnej i przebudowy tkanek8,9. Po urazie podwyższone są również poziomy cząsteczki adhezji międzykomórkowej-1 (ICAM-1) oraz liganda chemokiny CC 2 (CCL-2), co wiąże się ze zwiększoną rekrutacją neutrofili i makrofagów do uszkodzonych tkanek10. Co istotne, zaburzenie równowagi oksydacyjnej dodatkowo pogarsza uszkodzenia tkanek, a obniżona aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i katalazy (CAT) wskazuje na upośledzoną zdolność antyoksydacyjną2,11.
Makrofagi pełnią rolę kluczowych regulatorów zapalnego mikrośrodowiska, a ich polaryzacja funkcjonalna znacząco wpływa na proces regeneracji12. Makrofagi M1 wiążą się z ekspresją indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS) i aktywnością zapalną, podczas gdy makrofagi M2 wykazują ekspresję arginazy-1 (Arg-1) i są powiązane z naprawą tkanek13,14. Na polaryzację makrofagów wpływają lokalne cytokiny, stres oksydacyjny oraz sygnały związane z apoptozą. W tym kontekście apoptyczna sieć regulacyjna, składająca się z białek rodziny B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) oraz kaspazy-3, wpływa nie tylko na przeżywalność komórek w miejscu urazu, ale także pośrednio moduluje zachowanie chemotaktyczne komórek odpornościowych poprzez uwalnianie sygnałów "find-me"15. Dlatego zbadanie strategii interwencyjnych, które jednocześnie modulują odpowiedzi zapalne, stres oksydacyjny i polaryzację makrofagów, może pomóc w poprawie regeneracji tkanek.
Związki naturalne wykazały wyjątkowe zalety w modulowaniu tych procesów biologicznych. Niedawne badania potwierdziły, że substancje naftochinonowe, dzięki swoim sprzężonym strukturom, posiadają potencjał do wychwytywania wolnych rodników; ich rdzeń benzochinonowy może wpływać na wrażliwe na utlenianie i redukcję szlaki sygnalizacyjne poprzez mechanizmy przeniesienia elektronów16,17. Wykazano, że mollugin łagodzi reakcje zapalne w zapaleniu jelita grubego indukowanym DSS, co objawia się zmniejszoną produkcją cytokin prozapalnych i obniżoną ekspresją TLR4 w tkankach jelita grubego18. Wykazano również, że mollugin hamuje sygnalizację TAK1-NF-κB/MAPK i aktywuje szlak Keap1-Nrf2 w makrofagach6; jednak jego wpływ na polaryzację makrofagów oraz sieć apoptozy i antyapoptozy w in vivo modelu rany nie został jeszcze wyjaśniony. Ponadto, zależne od dawki efekty biologiczne molluginy oraz jej rola regulacyjna w procesie regeneracji wymagają wciąż systematycznego wyjaśnienia.
W niniejszym badaniu zbadano efekty działania molluginy w modelu regeneracji płetwy ogonowej danio pręgowanego. W szczególności przeanalizowano odrastanie ogona, ekspresję genów związanych z apoptozą, sygnalizację zapalną, aktywność enzymów przeciwutleniających oraz odpowiedzi związane z makrofagami po zastosowaniu molluginy. Nasze wyniki sugerują, że leczenie molluginą wiąże się z poprawą regeneracji ogona oraz zmianami w wielu markerach odpowiedzi na uraz w tym modelu danio pręgowanego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie procedury z udziałem zwierząt były zgodne z wytycznymi National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Fuzhou First General Hospital (nr zatwierdzenia 202408002).
Hodowla danio pręgowanego
Wszystkie eksperymenty przeprowadzono z wykorzystaniem danio pręgowanego (Danio rerio) utrzymywanego w standardowych warunkach laboratoryjnych. Do testu toksyczności oraz testu regeneracji po amputacji ogona wykorzystano ryby linii dzikiej AB. Ryby Tg(mpeg1:GFP) wykorzystano specjalnie do obrazowania makrofagów. Tg(mpeg1:GFP) jest linią reporterową makrofagów, w której ekspresja GFP znakuje komórki linii makrofagów pod kontrolą promotora mpeg1 eksprymowanego w makrofagach. Wszystkie linie danio pręgowanego utrzymywano w temperaturze 28.5 °C w 14-godzinnym/10-godzinnym cyklu światło/ciemność. Do eksperymentów wykorzystano wyłącznie embriony prawidłowe morfologicznie. we wszystkich eksperymentach embriony inkubowano w buforze Danieau, który przygotowano z odczynników czystości analitycznej, w tym NaCl, KCl, Ca(NO₃)₂·4H₂O, MgSO₄·7H₂O oraz HEPES z pH dostosowanym do 7.2.
Przygotowanie leku i określenie bezpieczeństwa
Mollugin (40 mg) rozpuszczono w 1 mL DMSO, aby otrzymać roztwór zapasowy o stężeniu 40 mg/mL. Roztwór zapasowy rozcieńczono najpierw 1:10 w buforze Danieau do stężenia 4 mg/mL, a następnie dokonano dalszych rozcieńczeń do stężeń 22, 66 i 200 µg/mL do celów traktowania. Aby określić maksymalne bezpieczne stężenie, zarodki szczepu AB w 48. godzinie po zapłodnieniu (hpf) poddano dechorionacji i dezynfekcji 0,003% podchlorynem sodu, a następnie rozdysponowano do płytek 6-dołkowych (n=20, trzy dołki na grupę). Zarodki inkubowano z Molluginem (22 µg/mL, 66 µg/mL, 200 µg/mL, 240 µg/mL, 280 µg/mL, 320 µg/mL lub 360 µg/mL) w medium E3 przez 48 h w temperaturze 28,5 °C. Przeżywalność monitorowano pod stereomikroskopem, a najwyższe stężenie, przy którym żywotność zarodków wynosiła ≥90%, ustalono jako bezpieczną górną granicę dla kolejnych eksperymentów.
Konstrukcja modelu amputacji i regeneracji ogona
Do badań nad regeneracją embriony typu dzikiego AB w wieku 48 hpf znieczulono 0,03% roztworem trikainy przygotowanym w medium dla embrionów i ułożono bocznie pod stereomikroskopem. Przed amputacją ogona embriony utrzymywano w buforze Danieau. Pod nadzorem stereomikroskopowym wykonano standaryzowaną poprzeczną amputację ogona. Linię amputacji wyznaczono bezpośrednio za końcówką notochordy, przyjmując jej tylny koniec jako punkt orientacyjny. Fałd płetwy ogonowej dystalnie od tego punktu usunięto za pomocą mikroskalpela, aby zapewnić jednolity poziom uszkodzenia u wszystkich osobników. Bezpośrednio po amputacji (0 h) wykonano zdjęcia za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego. Po amputacji embriony przeniesiono do odpowiedniego medium traktującego na bazie E3 w celu przeprowadzenia testu regeneracji. Roztwory robocze molluginy przygotowano poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego molluginy w medium E3 do stężeń końcowych 22, 66 i 200 µg/mL. Molluginę podawano poprzez kąpiel podczas okresu regeneracji. Aby zachować spójność z ekspozycją na nośnik, nieuszkodzoną grupę kontrolną oraz grupę z modelem uszkodzenia utrzymywano w medium E3 zawierającym 0,5% DMSO, co odpowiadało końcowemu stężeniu DMSO w grupie 200 µg/mL molluginy. Embriony utrzymywano w płytkach 6-dołkowych w temperaturze 28,5 °C przez 2 dni, codziennie odświeżając odpowiednie medium traktujące na bazie E3. Proces regeneracji dokumentowano za pomocą obrazowania w 24 i 48 h po amputacji, zarówno w świetle białym, jak i w ustawieniach fluorescencyjnych, aby ocenić odrastanie ogona oraz rozkład makrofagów. Pomiary obrazów przeprowadzono w programie ImageJ.
W celu kwantyfikacji regeneracji zmierzono odrodzony obszar ogona jako pole powierzchni bezwzględne w µm2, bez normalizacji do wielkości zarodka lub pierwotnego rozmiaru ogona. Aby zminimalizować zmienność, we wszystkich zarodkach amputację wykonano w tym samym punkcie anatomicznym, bezpośrednio za końcem notochordu, a ten sam punkt posłużył do zdefiniowania obszaru pomiarowego we wszystkich grupach. Obszary zainteresowania (ROI) wyznaczono ręcznie w programie ImageJ na podstawie obrysu ogona, a analizy dokonał badacz nieznający przydziału grup terapeutycznych. Do kwantyfikacji obszaru pozytywnego pod kątem makrofagów przeanalizowano w ImageJ obrazy fluorescencji GFP zarodków Tg(mpeg1:GFP). Obszar urazu/regeneracji ogona zdefiniowano ręcznie jako obszar zainteresowania, stosując ten sam punkt anatomiczny, który wykorzystano do pomiaru powierzchni ogona. Obrazy przekształcono na 8-bitową skalę szarości, a fluorescencję tła odjęto, stosując te same ustawienia korekcji tła dla wszystkich obrazów w ramach tego samego eksperymentu. Następnie do wszystkich obrazów w każdym eksperymencie zastosowano jednolity, stały próg fluorescencji w celu zidentyfikowania sygnałów GFP pozytywnych dla makrofagów. Powierzchnię pozytywną dla makrofagów obliczono jako obszar GFP powyżej progu w zdefiniowanym ROI. Pomiary oparto na powierzchni pozytywnej pod kątem fluorescencji, a nie na intensywności fluorescencji czy ręcznym liczeniu komórek. Wszystkie analizy obrazów zostały przeprowadzone przez badacza nieznającego przydziału grup terapeutycznych.
Ekstrakcja RNA i ilościowa PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)
Po zakończeniu testu regeneracji embriony z każdego wariantu doświadczalnego zostały zebrane i połączone (co najmniej 20 embrionów na grupę) w celu analizy RNA. Dla każdego wariantu jedna replika biologiczna składała się z połączonej próbki zawierającej co najmniej 20 embrionów z tej samej grupy doświadczalnej. Dla każdego wariantu przygotowano trzy niezależne, połączone repliki biologiczne, które wykorzystano do analizy statystycznej. Całkowite RNA wyizolowano po homogenizacji mechanicznej w odczynniku do ekstrakcji RNA opartym na fenolu/guanidynie. Jakość i stężenie RNA oceniono spektrofotometrycznie poprzez pomiar stosunków A260/A280. cDNA zsyntetyzowano przy użyciu komercyjnego zestawu do odwrotnej transkrypcji. Amplifikację PCR przeprowadzono z użyciem odczynników SYBR Green. Warunki cykliczne qRT-PCR były następujące: wstępna denaturacja w 95 °C przez 30 s, a następnie 40 cykli denaturacji w 95 °C przez 5 s oraz przyłączania/elongacji w 60 °C przez 30 s. Zmierzono poziomy ekspresji genów związanych z apoptozą (caspase-3 i Bcl-2), zapaleniem (TNF-α, IL-1β, IL-6, NF-κB1, TLR4, CCL2 i ICAM1) oraz fenotypem makrofagów (iNOS i arginase-1). β-Actin służyła jako gen referencyjny. Krotność zmian w ekspresji genów określono metodą 2−ΔΔCt. Informacje o starterach zamieszczono w Tabeli 1.
Testy aktywności SOD i CAT
Poziomy SOD i CAT wykorzystano do oceny stanu przeciwutleniającego po urazie ogona. W 48 h po amputacji zebraną z każdej grupy daninę ryb zebrafish poddano homogenizacji w zimnym PBS. Po wirowaniu klarowne ekstrakty wykorzystano do pomiaru SOD i CAT przy użyciu komercyjnych zestawów do testów aktywności. Aktywność SOD zmierzono za pomocą zestawu testowego opartego na WST-1 zgodnie z instrukcjami producenta. Próbki wraz ze wzorcami naniesiono na płytki testowe z 96 dołkami, a absorbancję odczytano za pomocą czytnika mikropłytek. Aktywności enzymów wyznaczono na podstawie krzywych wzorcowych. Wszystkie testy przeprowadzono w trzech powtórzeniach.
Analiza statystyczna
Dane przedstawiono jako średnia ± SEM z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. W przypadku testu toksyczności każdy niezależny eksperyment obejmował jedną partię zarodków, po 20 zarodków na grupę w trzech powtórzeniach w studzienkach. W obrazowaniu regeneracji i obrazowaniu makrofagów u danio pręgowanych Tg(mpeg1:GFP) jednostkami pomiarowymi były pojedyncze zarodki; w każdej grupie przeanalizowano 10 zarodków. Dla analizy qRT-PCR jedna replika biologiczna składała się z próbki zbiorczej zawierającej co najmniej 20 zarodków z tej samej grupy eksperymentalnej, a dla każdego warunku przeanalizowano trzy niezależne zbiorcze repliki biologiczne. W analizie aktywności SOD i CAT dla każdego warunku przeanalizowano pięć niezależnych zbiorczych replik biologicznych. Różnice między grupami analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem post hoc Tukeya. Analizy statystyczne wykonano w programie GraphPad Prism. Różnice przy p < 0,05 uznano za istotne statystycznie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Określenie toksyczności i bezpiecznej dawki
Aby zbadać działanie molluginy, w pierwszej kolejności przeprowadzono testy toksyczności. Wyniki wykazały, że śmiertelność embrionów rybek danio pozostawała niska przy stężeniach do 200 µg/mL, natomiast przy stężeniach powyżej 200 µg/mL zaobserwowano wzrost śmiertelności (Tabela 2). W związku z tym najwyższą bezpieczną dawką uznano 200 µg/mL, natomiast dawkę niską i średnią ustalono odpowiednio na 22 i 66 µg/mL.
...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W niniejszej pracy zbadano wpływ molluginy na regenerację ogona u danio pręgowanego. W badanym zakresie dawek leczenie molluginą wiązało się z poprawą regeneracji powierzchni ogona po urazie, a także ze zmianami w ekspresji genów związanych z apoptozą, markerami stanu zapalnego, aktywnością enzymów antyoksydacyjnych oraz markerami związanymi z makrofagami.
Danio pręgowany, będący istotnym modelem w badaniach nad regeneracją, wykazuje zdolność do regeneracji ogona, która angażuje skoordynowane ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy oświadczają, że nie istnieją żadne konflikty interesów.
Niniejsze badanie było sponsorowane przez Komisję Zdrowia Prowincji Fujian w Chinach (Grant nr 2022QNA085).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 6-dołkowe płytki do hodowli tkanek | Corning | 3516 | |
| Zestaw do oznaczania katalazy (CAT) | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Czytnik mikropłytek CMax Plus | Molecular Devices | iD3s | |
| Bufor Danieau’s – Ca(NO3)2·4H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Stężenie końcowe w buforze Danieau’s: 0.6 mM. |
| Bufor Danieau’s – HEPES | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Stężenie końcowe w buforze Danieau’s: 5 mM; pH skorygowane do 7.2. |
| Bufor Danieau’s – KCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Stężenie końcowe w buforze Danieau’s: 0.7 mM. |
| Bufor Danieau’s – MgSO4·7H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Stężenie końcowe w buforze Danieau’s: 0.4 mM. |
| Bufor Danieau’s – NaCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Stężenie końcowe w buforze Danieau’s: 58 mM. |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Pożywka do embrionów E3 | Przygotowana w laboratorium (standardowa receptura) | N/A | Standardowa receptura. |
| Specyficzne dla genów startery qPCR (tnfα, il1β, il6, nfkb1, tlr4, ccl2, icam1, inos, arginase-1, caspase-3, bcl2, β-actin) | Sangon Biotech | N/A | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | N/A | Wersja 8.0. |
| Oprogramowanie ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Wersja 1.52n. |
| Mollugina (≥98%, HPLC) | Sigma-Aldrich | SMB00431 | Związek aktywny z Rubia cordifolia, rozpuszczony w DMSO do stężenia 40 mg/mL i rozcieńczony do 22, 66 i 200 µg/mL w pożywce E3. |
| Zmotoryzowany homogenizator tkanek | IKA, T10 basic ULTRA-TURRAX (lub odpowiednik) | N/A | |
| NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | Novoprotein | abs60077 | |
| Fosforanowy bufor solny (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| System PCR w czasie rzeczywistym (Archimed X4) | Sansure Biotech Inc. | Archimed X4 | |
| Chłodzona mikrowirówka | SCILOGEX | CF1524R | |
| Nawki wolne od RNA | Sangon Biotech | F603222-0010 | |
| RNAiso Plus | Takara Bio Inc. | 9109 | Odczynnik do ekstrakcji RNA oparty na fenolu/guanidynie. |
| Probiówki do mikrowirówki wolne od RNazy, 1.5 mL | Axygen / Eppendorf | N/A | |
| Stereomikroskop fluorescencyjny SMZ800N | Nikon | SMZ800N | Stereomikroskop fluorescencyjny używany do obrazowania larw Tg(mpeg1:GFP) i ilościowego oznaczania agregacji makrofagów. |
| Roztwór podchlorynu sodu | McLean, USA | N/A | 0.003% roztwór roboczy. |
| SYBR Green qPCR Mix (2× SYBR qPCR Mix) | Novoprotein | E096 | |
| Stereomikroskop SZX16 | Olympus | SZX16 | Używany do obserwacji morfologicznych, oceny toksyczności i amputacji płetwy ogonowej larw. |
| Zestaw do oznaczania całkowitej dysmutazy ponadtlenkowej (T-SOD) | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-3 | |
| Transgeniczne danio pręgowane Tg (mpeg1:GFP) | Anburui, Fujian, China (lub kolonia własna) | N/A | Linia reporterowa makrofagów. |
| Metansulfonian tricainy (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | 0.03% roztwór roboczy. |
| UltraPure woda destylowana wolna od DNazy/RNazy | Invitrogen | 10977023 | |
| Danio pręgowane typu dzikiego, szczep CZ98 (Danio rerio) | Anburui, Fujian, China | N/A | Zapłodnione embriony i larwy pozyskano z dorosłego stada hodowlanego. |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.