Ocena wewnętrznego sztywnienia aorty u myszy za pomocą mikromografii igiełkowej: Translacyjna ramka do badania wpływu krążącego środowiska

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół do oceny sztywności ściany aorty (moduł sprężystości) poprzez pin-miografię oraz podejścia do badania potencjalnej roli krążącego otoczenia w modulowaniu sztywności ściany aorty.

Streszczenie

Zsztywnienie aorty jest niezależnym czynnikiem ryzyka chorób układu krążenia i innych przewlekłych chorób, w tym upośledzenia funkcji poznawczych, niewydolności nerek, upośledzenia wzroku i obniżonej funkcji glukozy-insuliny. In vivo, sztywność aorty jest zwykle oceniana za pomocą technik opartych na tonometrii lub ultradźwiękach, które wizualizują fale tętnicze lub wzdłużne segmenty tętnic, odpowiednio. Jednak pomiary in vivo są wpływowane przez wiele czynników—takich jak ciśnienie tętnicze i wpływ układu autonomicznego—które ograniczają mechanizmy wskazujące jak i dlaczego zmienia się sztywność aorty. Prekliniczne modele mysie, które pozwalają na bezpośrednie pozyskiwanie tkanki aorty, oferują unikalną ramę eksperymentalną do oceny zarówno in vivo sztywności aorty, jak i właściwości mechanicznych aorty, wolnych od wpływów zmienne fizjologiczne. Modele te pozwalają również na bezpośrednie badanie krążącego otoczenia (tj. pobieranie krążących bioaktywnych cząsteczek we krwi) i jego roli w modyfikacji sztywności aorty na całym przedkliniczno-klinicznym spektrum translacji. Zmiany w krążącym otoczeniu wyłoniły się jako kluczowe mechanizmy sztywnienia aorty w licznych warunkach—w tym podstawowym starzeniu się i przedwczesnym starzeniu związanym z rakiem i terapiami przeciwnowotworowymi—zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych, a także w mediacji efektów interwencji. Ten artykuł zapewnia krokową instrukcję do oceny: (1) właściwości sztywności aorty (moduł sprężystości) w preklinicznych modelach mysich i (2) wkładu krążącego otoczenia (i jego składników) w sztywnienie aorty przy użyciu zarówno preklinicznych, jak i klinicznych próbek biologicznych.

Wprowadzenie

Stywnienie aorty jest niezależnym czynnikiem ryzyka chorób układu krążenia i innych przewlekłych chorób^1,2. Ocena sztywności aorty in vivo może brakować rozdzielczości mechanizowanej, biorąc pod uwagę integracyjne procesy fizjologiczne, które regulują sztywność aorty in vivo (np. ciśnienie krwi i autonomiczny wkład)². Dlatego ocena wewnętrznej sztywności aorty (tj. sztywności ściany aorty/moduł sprężystości) ex vivo przy użyciu mikrografu igłowego pozwala na bezpośrednią ocenę sztywności aorty niezależną od wpływających na nią zmiennych fizjologicznych². Co więcej, zastosowanie ex vivo podejścia eksperymentalnego umożliwia badanie potencjalnych mechanizmów molekularnych, które mogą pośredniczyć w sztywnieniu ściany aorty. W przeciwieństwie do innych uznanych metod oceny sztywności tętnic ex vivo, takich jak mikrografiaciśnieniowa, badanie dwupłaszczyznowe i układy mikrografu cyklicznego/pulsacyjnego, które polegają na modelowaniu układów fizjologicznych (np. ciśnienie wewnątrzosierdziowe i pulsująca hemodynamiczna), mikrografia igłowa umożliwia bezpośrednią ocenę sztywności ściany aorty poprzez siłę izometryczną w wysoce kontrolowanych warunkach, które nie wymagają modelowania in vivo.

Krążące środowisko (tj. zbiór bioaktywnych cząstek we krwi), które ma bezpośredni i częsty kontakt z aortą, jest zwykle zmienione w przypadku sztywnienia aorty (np. starzenie się chronologiczne/pierwotne i przedwczesne starzenie, takie jak u osób po leczeniu raka lub modeli przeżywalności po raku)^3,4. Za pomocą próbek biomedycznych (zarówno przedklinicznych (mysi), jak i klinicznych (ludzkich) (osocze i surowica)), ustaliliśmy, że krążące środowisko bezpośrednio przyczynia się do sztywnienia aorty zarówno w przypadku pierwotnego⁴, jak i przedwczesnego starzenia³. Co więcej, ustaliśmy eksperymentalne ramy do określania bezpośredniego wkładu wybranych składników krążącego środowiska w pośredniczeniu jego wpływu na sztywnienie aorty^3,5,6. Przedstawiamy i opisujemy szczegółowo podejścia eksperymentalne do oceny wewnętrznej sztywności aorty oraz wkładu krążącego środowiska (i jego składników) w sztywnienie aorty za pomocą mikrografa igłowego i przedstawiamy reprezentatywne wyniki (z rysunkami i cytowaniami).

Protokół

Male wild-type C57BL/6J young adult (4 months of age) mice were used throughout this study. Housing and procedures involving experimental mice were approved by the University of Colorado Anschutz Medical Campus Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Preparation of cold physiological saline solution (CPSS)

1. Prepare Ca²⁺ Ringer's Stock Solution in 1 L of diH₂O and store at 4 °C (Table 1).
2. Add 13.9 g of MOPS in 100 mL of diH₂O to prepare the MOPS buffer stock solution and store at 4 °C.
3. Add 0.186 g of EDTA in 100 mL of diH₂O to prepare the EDTA stock solution, pH to 8.0, and store at room temperature.
4. Prepare CPSS containing stock solutions prepared above and the chemicals listed below (Table 2). Bring the total volume to 2 L with diH₂O, pH to 7.4 at 34 °C, and filter CPSS through a ≤ 0.45 µm filter. Distribute in 50 mL conical tubes and store in -20 °C.

2. Dissection of the mouse aorta (Figure 1, Figure 2, and Figure 3)

1. Anesthetize the mouse by inhaled isoflurane (2.5%) and place the mouse in a dorsal recumbent position (Figure 1A-C).
2. Once the mouse is under the surgical plane of anesthesia, collect blood by performing a cardiac puncture and complete secondary euthanasia method by bilateral thoracotomy (Figure 1B–C).
3. Next, carefully remove the aorta from the aortic arch to the abdominal aorta (Figure 1D–F).
4. Place the aorta in CPSS and remove all connective and perivascular adipose tissue using Fine Science Tools Vannas Spring Scissors (2.5 mm) (Figure 2A–E).
5. Carefully cut three 1 mm wide aortic segments in the thoracic region just below the aortic arch (Figure 3).
6. Place the two 1 mm aortic segments in a 1.5 mL tube filled with CPSS and store in -80 °C until stress-strain pin myography experiments. Store the 3^rd segment appropriately for subsequent histological measurements as described below.

3. Stress-strain pin myography experiments

NOTE: The Pin Myography System will be used to perform in vitro testing of aortic stiffness (Figure 4 and Figure 5).

1. First, pre-heat the chambers to 37 °C containing approximately 6 mL of phosphate-buffered saline (PBS) and thaw 1 mm frozen aortic segments.
   ​NOTE: Alternative physiological salt solutions that are appropriately oxygenated and pH-controlled may also be used as described previously⁷.
2. Once 37 °C is obtained, follow the manufacturer's calibration protocol.
   1. Place the calibration bridge on the myograph so that the T-balance bar does not touch the pin connected to the force transducer of the pin myography chamber.
   2. Ensure the force transducer pin is not subject to any force. When the relative force is stable, place a 2 g weight on the T-bridge so that the T-balance bar is now applying ~2 g of force on the force transducer pin.
   3. Confirm that the force readout is within 9.71–9.91 mN. If so, calibration is complete.
3. Determine baseline micrometer reading and record value (i.e., initial reading).
   1. Under a dissection scope, determine the baseline micrometer distance at which the two parallel pins are nearly touching (Figure 4).
      NOTE: Do not allow the two pins to touch, as this could cause damage or disrupt the force transducer within the myograph chamber.
4. Under a dissection microscope, place 1 mm aortic segment over the two pins and record the width of the segment using micro calipers (Figure 6A). Then connect the chamber unit to the pin myography system interface.
   ​NOTE: Increase the pin width to place tension on the aorta segment while mounting the aorta to secure it onto the two pins, which prevents the aorta segment from being dislodged.
5. If tension is placed on the aorta and the chamber has been connected and mounted on the pin myography system, return the micro positioner to the "initial position" as determined in step 3.3 above.
6. Complete pre-stretch of the aorta.
   1. Stretch the aorta by increasing the distance between the two pins by 1 mm from the initial micro positioner position (Figure 6B).
   2. Next, relax the aorta by returning the pins to the initial micro positioner reading. Perform this stretch-relax sequence three times (Figure 6A).
      ​NOTE: Following the last stretch-relax sequence, the micro positioner should be back to the initial reading.
7. On the pin myography system interface, zero force reading for each chamber in use (Figure 7).
8. Commence stress-strain experiment.
   1. Increase the force reading to approximately 1 mN by adjusting the micro positioner (Figure 7).
   2. Following ~1 mN force equilibration (3–5 s), record the new micro positioner reading at the ~1 mN force and record the first force reading.
   3. Increase the micro positioner by 50 µm (i.e., 5 clicks/hashes) and allow the aorta segment to be stretched for 3 min. Following 3 min, record force.
   4. Continue increasing the micro positioner 50 µm every 3 min and record force until "yield point" is reached.
      NOTE: Yield point is the highest amount of force generated before irreversible structural damage occurs on the aorta (i.e., a tear or break in the aorta, a significant drop in force).
   5. Confirm the yield point by stretching the aorta an additional 50 µm following the initial yield point. Ensure that the force value remains decreased or is slightly above the yield point. If the yield point is not confirmed, continue with 3 min increases until the yield point is achieved.
   6. Upon confirmation of the yield point, experiments are complete. Begin analysis now.

4. Analysis of stress-strain pin myography experiments to determine collagen and elastin region elastic modulus

1. Using the force readings obtained from the myograph, generate a stress-strain curve using the following equations:
   Strain (λ)=∆d/[d(i)]
   here d is

Wyniki

Ztwardnienie aorty związane z wiekiem

W przypadku wewnętrznej sztywności mechanicznej rejestrowana jest siła odpowiadająca każdemu przedziałowi rozciągania i jest używana do obliczeń. W wcześniej omówionych obliczeniach wygeneruje się krzywe naprężenia-odkształcenie i oblicza się moduł sprężystości dla 1) obszaru kolagenu i/lub 2) obszaru elastyny tych krzywych, jak opisano powyżej i pierwotnie pokazano przez Gioscia-Ryan et al⁹. Moduł sprężystości obs...

Dyskusja

Zastosowanie pin miografu do oceny wewnętrznej sztywności aorty ex vivo zapewnia możliwość oceny wewnętrznej sztywności aorty niezależnie od potencjalnie kłopotliwych zmiennych fizjologicznych in vivo, takich jak ciśnienie krwi i wkład układu autonomicznego². Co więcej, to podejście eksperymentalne ex vivo daje możliwość przesiewowych badań potencjalnych mechanizmów molekularnych, które mogą leżeć u podstaw różnic w wewnętrznej sztywności aorty. Przedstawiamy tutaj szcze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-methylbutane	Fisher Scientific	AA19387AP
BSA	Fisher Bioreagents	BP1600
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
D-(+)-Glucose (Dextrose)	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Fisher Scientific	MT10017CV
EDTA (A.C.S.)	Fisher Chemical	E478
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
MitoQ	Cayman Chemical	845959-50-4
Monosodium Phosphate	Sigma-Aldrich	S5011
MOPS (Na salt)	Sigma-Aldrich	M9024
Multi Pin Myography System	Danish Myo Technology (DMT)	620M
NaCl	Fisher Chemical	S271
Penicillin-streptomycin	Fisher Scientific	15-140-148
RAGE antibody	R&D System	AF1145
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
TEMPOL	Sigma-Aldrich	2226-96-2
Tissue-tek OCT compound	Sakura	4583
Trimethylamine N-oxide (TMAO)	Sigma Aldrich	317594