Artykuł badawczy

Związek ekspresji MPO z mikrośrodowiskiem immunologicznym w raku piersi: wnioski z analiz bioinformatycznych i analiz pojedynczych komórek

38 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71189

⸱

14 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, 2Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 5College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł przedstawia odtwarzalny schemat bioinformatyczny i analizę pojedynczych komórek służące do badania powiązań między ekspresją mieloperoksydazy (MPO) a cechami odpornościowymi i mieloidalnymi w raku piersi. Ponieważ analizy opierają się na publicznych zbiorach danych i metodach in silico, wyniki mają charakter eksploracyjny i służą do generowania hipotez.

Streszczenie

Rak piersi pozostaje główną przyczyną śmiertelności związanej z nowotworami, a eksploracyjne przepływy pracy obliczeniowej mogą pomóc w priorytetyzacji markerów związanych z odpowiedzią immunologiczną do dalszych badań. W niniejszej pracy wykorzystano dane transkryptomiczne bulk z bazy The Cancer Genome Atlas dla inwazyjnego raka piersi (TCGA-BRCA) oraz publiczny zbiór danych jednokomórkowych GSE161529, aby zbadać powiązania między ekspresją mieloperoksydazy (MPO) a wynikami klinicznymi, infiltracją immunologiczną, metylacją, adnotacjami regulatorów nadrzędnych, wzorcami ekspresji na poziomie pojedynczych komórek, wynikami wrażliwości na wirtualny nokdaun, wyszukiwaniem interakcji lek–gen oraz adnotacjami dotyczącymi absorpcji, dystrybucji, metabolizmu, wydalania i toksyczności (ADMET). Ekspresja MPO była niższa w tkankach raka piersi niż w sąsiednich tkankach nietumorowych. Wyższa ekspresja MPO wiązała się z dłuższym czasem wolnym od progresji, natomiast powiązania z przeżyciem całkowitym oraz przeżyciem specyficznym dla choroby nie były istotne statystycznie. Analiza charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) sugerowała rozdzielenie tkanki nowotworowej od prawidłowej w analizowanym publicznym zbiorze danych, jednak nie należy interpretować tego jako walidacji diagnostyki klinicznej. Dekonwolucja immunologiczna oraz analizy wzbogacenia wykazały, że ekspresja MPO korelowała głównie z cechami transkrypcyjnymi związanymi z układem odpornościowym i komórkami mieloidalnymi, a nie ustanawiała wewnątrznowotworowej regulacji mikrośrodowiska immunologicznego. W rozdzielczości jednokomórkowej sygnał MPO był rzadki – przed rozszerzeniem sąsiedztwa w oparciu o algorytm k-najbliższych sąsiadów (KNN) wykryto jedynie 85 komórek MPO-dodatnich. Wykrywalny sygnał MPO oraz powiązane z nią wyniki interpretowano z ostrożnością, ponieważ mogły one być pod wpływem rzadkiej ekspresji, niepewności adnotacji typów komórek, zjawiska dropout, doubletów lub wolnego RNA w środowisku (ambient RNA). In silico wirtualny knockdown wskazał potencjalne zmiany transkrypcyjne związane z odpowiedzią odpornościową i zapalną, jednak wyniki te uznano za wstępne i wymagają one walidacji. Wyszukiwanie leków i genów w oparciu o bazę danych interakcji lek-gen (DGIdb) oraz adnotacje ADMET zostały wykorzystane wyłącznie jako wstępne adnotacje chemiczne i nie były interpretowane jako dowody terapeutyczne. Podsumowując, niniejsze badanie dostarcza powtarzalnego schematu in silico do generowania hipotez dotyczących cech odpornościowych i mieloidalnych związanych z MPO w raku piersi, które wymagają walidacji na zewnętrznych kohortach oraz potwierdzenia eksperymentalnego.

Wprowadzenie

Rak piersi jest wysoce heterogennym nowotworem związanym z układem odpornościowym1. Postępowanie choroby, ryzyko nawrotu i przerzutów oraz odpowiedź na leczenie są ściśle powiązane ze składem i statusem funkcjonalnym immunologicznego mikrośrodowiska guza (TIME)2. Pomimo ciągłej optymalizacji kompleksowych strategii terapeutycznych, u niektórych pacjentów nadal dochodzi do progresji lub nawrotu choroby, co podkreśla pilną potrzebę zidentyfikowania biomarkerów molekularnych charakteryzujących stan TIME i wspierających stratyfikację ryzyka, przy jednoczesnym wyjaśnieniu leżących u ich podstaw mechanizmów.

Mieloperoksydaza (MPO) jest zawierającą hem peroksydazą, która wykazuje ekspresję głównie w neutrofilach, a w mniejszym stopniu w monocytach i makrofagach. Poprzez generowanie kwasu podchlorawego i innych reaktywnych utleniaczy MPO przyczynia się do obrony przeciwdrobnoustrojowej, ale może również promować oksydacyjne uszkodzenie tkanek i przewlekły stan zapalny. W nowotworach znaczenie biologiczne MPO wydaje się być zależne od kontekstu3. Z jednej strony stres oksydacyjny indukowany przez MPO jest powiązany z kancerogenezą i progresją guza poprzez uszkadzanie DNA, utlenianie lipidów i białek, sygnalizację zapalną oraz przebudowę mikrośrodowiska guza4,5,6. Z drugiej strony naciek komórek mieloidalnych lub wrodzonych komórek odpornościowych wykazujących pozytywną ekspresję MPO był kojarzony z korzystnym rokowaniem lub przeciwnowotworową aktywnością immunologiczną w niektórych kontekstach nowotworowych7,8,9. Te pozornie sprzeczne wyniki sugerują, że znaczenie kliniczne i biologiczne MPO może zależeć od typu nowotworu, stopnia zaawansowania choroby, komórkowego źródła MPO oraz składu immunologicznego mikrośrodowiska guza. Niemniej jednak wzorzec ekspresji i znaczenie prognostyczne MPO w raku piersi, szczególnie na poziomie pojedynczych komórek, pozostają nie w pełni scharakteryzowane.

Immunologiczne mikrośrodowisko guza (TIME) składa się z heterogenicznych komponentów mieloidalnych, limfoidalnych, zrębowych i nabłonkowych10. MPO jest klasycznie kojarzone z neutrofilami i innymi komórkami linii mieloidalnej, zatem sygnały związane z MPO w profilach guza z analizy bulk mogą odzwierciedlać skład komórek odpornościowych, a nie aktywność wewnątrzpochodną komórek nowotworowych10. W raku piersi rozkład sygnału MPO w zbiorach danych bulk oraz single-cell, jego związek z szacunkami nacieku immunologicznego oraz granice reprodukowalności późniejszych analiz obliczeniowych pozostają niewystarczająco scharakteryzowane. Niniejsze badanie traktuje zatem MPO jako marker powiązany z układem odpornościowym w celu opracowania eksploracyjnego schematu postępowania, a nie jako udowodniony regulator przyczynowy TIME lub zwalidowany cel terapeutyczny. W porównaniu z analizami różnicowej ekspresji w obrębie jednej kohorty lub szacunkami nacieku immunologicznego z jednej platformy, zintegrowany schemat łączący transkryptomikę bulk, dekonwolucję immunologiczną, adnotację metylacji, mapowanie single-cell i obliczeniowe zaburzenia może zapewnić szerszy wgląd eksploracyjny w kontekst immunologiczny powiązany z genem. Podejście to jest przydatne do priorytetyzacji potencjalnych markerów i generowania testowalnych hipotez, zwłaszcza gdy zestawy danych eksperymentalnych nie są jeszcze dostępne. Jednakże taka integracja obliczeniowa nie może sama w sobie określić źródła komórkowego, przyczynowości, aktywności farmakologicznej ani użyteczności klinicznej. Dzięki rozwojowi wielkoskalowych publicznych kohort nowotworowych i technologii transkryptomicznych single-cell, podejścia bioinformatyczne mogą być wykorzystywane do badania powiązań między ekspresją genów, wynikami klinicznymi, składem komórek odpornościowych a stanami transkrypcyjnymi zarówno na poziomie populacyjnym, jak i pojedynczych komórek11. Metody obliczeniowych zaburzeń oparte na sieciach regulacji genów single-cell mogą dodatkowo dostarczyć informacji służących do generowania hipotez dotyczących wrażliwości transkrypcyjnej powiązanej z genami12,13. Dlatego celem niniejszego badania była charakterystyka wzorca ekspresji, związku z przeżywalnością, kontekstu immunologicznego/mieloidalnego, profilu metylacji, rozkładu single-cell oraz eksploracyjnego profilu obliczeniowych zaburzeń MPO w raku piersi. Całkowity schemat postępowania przedstawiono na Rysunku 1.

Protokół

Pobieranie danych z bazy TCGA

Dane z sekwencjonowania RNA oraz informacje kliniczne dla kohorty raka inwazyjnego piersi TCGA (TCGA-BRCA) pobrano z portalu genomic data commons14. Dane RNA-seq z przepływu STAR w formacie transcripts per million (TPM) wyodrębniono wraz z dopasowanymi adnotacjami klinicznymi. Próbki RNA-seq pozbawione odpowiadających im informacji klinicznych zostały wykluczone. W analizach opartych na ekspresji wartości TPM przekształcono jako log2(TPM + 1). Ekspresję MPO wyodrębniono przy użyciu symbolu genu MPO oraz identyfikatora genu Ensembl ENSG00000005381.8. W analizach wymagających podziału na grupy MPO-high i MPO-low uwzględniono wyłącznie próbki nowotworowe TCGA-BRCA, natomiast próbki tkanek prawidłowych z sąsiedztwa wykluczono z przypisania do grup. Próbki nowotworowe podzielono zgodnie z wartością mediany przekształconej log2(TPM + 1) ekspresji MPO wśród próbek nowotworowych TCGA-BRCA. Próbki z ekspresją MPO większą lub równą medianie przypisano do grupy MPO-high, natomiast próbki poniżej mediany przypisano do grupy MPO-low. Tę strategię grupowania opartą na medianie zastosowano w analizie przeżywalności, analizie ekspresji różnicowej, analizie wzbogacenia, grupowaniu metylacji oraz porównaniach wzbogacenia komórek odpornościowych, chyba że wskazano inaczej. Charakterystyki kliniczno-patologiczne, w tym płeć, wiek, pochodzenie etniczne, patologiczne stadium T, stopień histologiczny, podtyp PAM50, stadium patologiczne, status nowotworu oraz punkty końcowe przeżywalności, w tym przeżywalność całkowita (OS), czas wolny od progresji (PFI) i przeżywalność specyficzna dla choroby (DSS), analizowano przy użyciu programu R w wersji 4.2.1.

Publiczne wyszukiwanie obrazów immunohistochemicznych

Reprezentatywne obrazy immunohistochemii (IHC) MPO z sąsiadującej prawidłowej tkanki piersi oraz tkanki raka piersi zostały wykorzystane jako jakościowe referencje dla poziomu białka. Obrazy te nie zostały uwzględnione w ilościowych analizach morfometrycznych ani statystycznych. Obramowane obszary wskazują regiony przedstawione w większym powiększeniu. Paski skali wskazują 100 µm na obrazach 20× oraz 50 µm na obrazach 40×.

Analiza korelacji ekspresji

Do zbadania genów współzmieniających się z ekspresją MPO w raku piersi wykorzystano zbiór danych TCGA-BRCA. Obliczono genomowe współczynniki korelacji Pearsona pomiędzy MPO a genami kodującymi białka, a do wizualizacji wybrano 30 genów o najwyższej korelacji dodatniej oraz 30 genów o najwyższej korelacji ujemnej. W przypadku analiz korelacji obejmujących wiele badanych genów, nominalne wartości p skorygowano za pomocą metody kontroli odsetka fałszywych odkryć Benjamini-Hochberga. Sieć oddziaływań białko-białko (PPI) powiązaną z MPO skonstruowano przy użyciu bazy danych STRING (search tool for the retrieval of interacting genes/proteins), zachowując do wizualizacji pary białek z wynikiem oddziaływania powyżej 0,4015.

Analiza wzbogacenia funkcjonalnego

Geny różnicowo wyrażone (DEGs) zidentyfikowano poprzez porównanie grup nowotworowych TCGA-BRCA o wysokim i niskim poziomie MPO, stosując progi |log2FC| > 1 oraz skorygowaną metodą Benjamini-Hochberga wartość p < 0,05. Analizę wzbogacenia funkcjonalnego DEG-ów przeprowadzono przy użyciu pakietu R clusterProfiler w wersji 4.4.4, obejmując analizy procesów biologicznych, komponentów komórkowych i funkcji molekularnych w ramach ontologii genów (GO) oraz analizy szlaków w bazie Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)16,17,18,19,20. Wzbogacone terminy GO i KEGG uznano za istotne, gdy skorygowana wartość p była < 0,05.

Analizę wzbogacenia zestawów genów (GSEA) przeprowadzono przy użyciu wstępnie uszeregowanej listy genów, opracowanej na podstawie statystyk ekspresji różnicowej pomiędzy grupami MPO-high a MPO-low. Wykorzystano kolekcję MSigDB C2 Canonical Pathways c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt, odpowiadającą wersji MSigDB v2022.1.Hs i zawierającą 3 050 zestawów genów21,22. Terminy wzbogacone uznano za istotne przy wartości p skorygowanej metodą Benjamini–Hochberga < 0,05, wartości q FDR < 0,25 oraz |znormalizowany wynik wzbogacenia| > 1. W odpowiednich przypadkach wartości Z-score dla istotnie wzbogaconych terminów obliczono za pomocą pakietu GOplot w celu wizualizacji.

Analiza wzbogacenia komórek odpornościowych w guzach

Składniki immunologiczne i stromaalne w kohorcie TCGA-BRCA oceniono przy użyciu algorytmu ESTIMATE zaimplementowanego w pakiecie R estimate w wersji 1.0.13. Jako dane wejściowe wykorzystano dane ekspresji poddane transformacji Log2(TPM + 1), a dla każdej próbki guza obliczono wynik immunologiczny (immune score), wynik stromaalny (stromal score) oraz wynik ESTIMATE. Do oceny powiązań między ekspresją MPO a szacowanym poziomem infiltracji głównych populacji komórek immunologicznych w kohorcie TCGA-BRCA, w tym limfocytów B, limfocytów T CD8+, limfocytów T CD4+, makrofagów, neutrofili i komórek dendrytycznych, wykorzystano TIMER/TIMER2.023,24,25. Wyniki oparte na TIMER zinterpretowano jako szacunki infiltracji immunologicznej pochodzące z odpowiedniego zasobu online. Do analizy wzbogacenia komórek immunologicznych dla 24 typów komórek zastosowano analizę wzbogacenia zestawów genów dla pojedynczych próbek (ssGSEA) przy użyciu pakietu R GSVA w wersji 1.46.026. Macierz sygnatur komórek immunologicznych LM22, wykorzystana do dekonwolucji 22 typów komórek immunologicznych metodą CIBERSORT, znajduje się w Tabe lice uzupełniającej 1. Korelacje między ekspresją MPO a wynikami wzbogacenia komórek immunologicznych oceniono za pomocą korelacji rang Spearmana. Różnice w wynikach wzbogacenia komórek immunologicznych pomiędzy grupami guzów z wysoką i niską ekspresją MPO, zdefiniowanymi na podstawie mediany, porównano za pomocą testu sum rang Wilcoxona. W analizach obejmujących wiele typów komórek immunologicznych wartości p skorygowano metodą Benjamini-Hochberga dla kontroli stopnia odkryć fałszywych (FDR).

Metylacja DNA genu MPO

Wzorce metylacji DNA w obrębie locus MPO oceniono za pomocą narzędzia MethSurv. Wartości beta metylacji CpG oraz powiązania z przeżywalnością dla TCGA-BRCA pobrano z platformy MethSurv. Zwizualizowano wybrane miejsca CpG powiązane z MPO, a ich korelacje z przeżywalnością oceniono na podstawie wyników analizy przeżywalności dostarczonych przez MethSurv27. W przypadku analiz obejmujących wiele miejsc CpG, wartości p skorygowano dla wszystkich badanych miejsc CpG powiązanych z MPO przy użyciu metody Benjamini-Hochberg dla fałszywych odkryć (FDR). Powyższe analizy metylacji zinterpretowano jako eksploracyjne adnotacje epigenetyczne.

Konstrukcja sieci PPI i analiza korelacji genów związanych z neutrofilami

W celu zbadania związku między MPO a biologią związaną z neutrofilami przeprowadzono systematyczną analizę sieciową. Z aktualnej literatury opracowano zestaw genów obejmujący uznane mediatory aktywacji neutrofili oraz powiązane z nimi procesy zapalne. Pełna lista genów związanych z neutrofilami została przedstawiona w Tabeli uzupełniającej 2. Symbole genów ujednolicono zgodnie z oficjalną nomenklaturą, usunięto duplikaty, a dostępne geny zestawiono z macierzą ekspresji TCGA-BRCA przed przeprowadzeniem analizy STRING/PPI, priorytetyzacją genów hubowych oraz analizą korelacji między MPO a genami hubowymi. Sieć PPI dla tych genów skonstruowano przy użyciu bazy danych STRING (wersja 11.5) z zastosowaniem średniego progu ufności dla interakcji (>0,40). Geny hubowe w tej sieci zostały spriorytetyzowane algorytmicznie na podstawie centralności stopnia, która określa liczbę bezpośrednich interakcji przypadających na jeden węzeł. Do dalszej analizy korelacji wybrano 20 genów o najwyższych wartościach stopnia.

Następnie profile ekspresji tych genów węzłowych (hub genes) oraz MPO wyekstrahowano z zestawu danych transkrypcyjnych TCGA-BRCA. Powiązanie między MPO a każdym genem węzłowym oceniono statystycznie za pomocą korelacji rang Spearmana. Aby scharakteryzować wzorce korelacji pomiędzy samymi genami węzłowymi, obliczono macierz korelacji Spearmana dla wszystkich próbek nowotworowych. Analizy korelacyjne te stanowiły podstawę ilościową dla późniejszych wizualizacji, w tym wykresu typu „lollipop” korelacji MPO z genami węzłowymi oraz diagramu chordowego/mapy ciepła przedstawiającej wzorce korelacji genów węzłowych.

Przewidywanie czynników transkrypcyjnych i miRNA celujących w MPO

Do przewidywania czynników TF będących celami MPO wykorzystano bazę danych KnockTF (https://bio.liclab.net/KnockTF/index.php)28,29, bazę danych ChIP (http://chip-atlas.org/)30,31 oraz bazę danych GTRD32,33 (https://gtrd.biouml.org/#!). Ponadto do przewidywania potencjalnych miejsc wiązania miRNA celujących w MPO wykorzystano bazę danych TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_80/). Diagramy Venna zostały wygenerowane za pomocą strony MicroBioinformatics (https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)34.

Analiza pojedynczych komórek MPO

Specyficzny zbiór danych GSE161529 pochodzi z bazy Gene Expression Omnibus (GEO). Podczas wstępnego przetwarzania danych przeprowadzono filtrowanie na poziomie komórek w celu wykluczenia komórek o niskiej jakości — tych, które spełniały dowolne z następujących kryteriów: ekspresja genów mitochondrialnych przekraczająca 25%, całkowita liczba unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI) poniżej 5000 lub wykrycie mniej niż 2500 genów. Następnie skorygowano zanieczyszczenia RNA z otoczenia (ambient RNA) oraz techniczne efekty serii35. W celu redukcji wymiarowości i oceny podobieństwa komórkowego przeprowadzono analizę głównych składowych (PCA), a następnie zastosowano UMAP do klastrowania i wizualizacji komórek. Następnie, w oparciu o typowe geny markerowe komórek, poszczególne klastry przypisano do typów komórek11. Zestaw genów związanych z MPO, wykorzystany do obliczania wyników sygnatur pojedynczych komórek, znajduje się w Pliku uzupełniającym 1. Przed obliczeniami symbole genów zharmonizowano z oficjalnymi symbolami genów, usunięto duplikaty, a dostępne geny zestawiono z macierzą ekspresji GSE161529. Do obliczenia wyników związanych z MPO dla poszczególnych komórek wykorzystano AUCell, funkcję AddModuleScore pakietu Seurat oraz ssGSEA. Wyniki uzyskane trzema metodami poddano normalizacji Z-score, przeskalowano do porównywalnego zakresu i zintegrowano w celu wygenerowania złożonego wyniku związanego z MPO do późniejszych analiz opisowych. Przeanalizowano sieci oddziaływań komórka-komórka, aby porównać wnioskowane wzorce komunikacji ligand–receptor z udziałem komórek nowotworowych nabłonkowych, rozdzielonych według sygnału związanego z MPO, oraz różnorodnych typów komórek partnerskich. Wyniki te zinterpretowano jako opisowe wzorce komunikacji, a nie jako dowód na to, że komórki wykazujące ekspresję MPO bezpośrednio pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej.

Wirtualny knockdown pojedynczych komórek MPO oraz analiza wzbogacenia szlaków za pomocą scTenifoldKnk

Wirtualny knockdown MPO na poziomie pojedynczych komórek przeprowadzono poprzez integrację narzędzi Seurat i scTenifoldKnk. Po standardowej kontroli jakości (200–6 000 genów na komórkę; frakcja mitochondrialna < 10%), dane poddano logarytmicznej normalizacji, a do redukcji wymiarowości i klastrowania wybrano 2 000 genów o wysokiej zmienności. Aby wzbogacić konteksty istotne dla MPO, zachowano komórki, które znalazły się w górnych 50% wyników dla modułu genów mieloidalnych/neutrofilnych. Z tych komórek zdefiniowano podzbiór sąsiedztwa MPO poprzez rozszerzenie zziaren MPO-dodatnich przy użyciu k = 40 najbliższych sąsiadów w przestrzeni PCA. Rozszerzony podzbiór nie był traktowany jako czysta populacja MPO-dodatnia i na podstawie tego kroku rozszerzenia KNN nie wyciągano wniosków dotyczących proporcji typów komórek. Podzbiór ten poddano analizie wirtualnego knockdownu za pomocą scTenifoldKnk, wykorzystując zbiór genów obejmujący geny o wysokiej zmienności oraz MPO (wykazujący ekspresję w ≥25 komórkach). Zidentyfikowano geny istotnie zaburzone (FDR < 0,05, korekta BH). Uzyskane geny poddano dalszej analizie wzbogacenia funkcjonalnego w ramach procesów biologicznych GO oraz szlaków KEGG (q < 0,05).

Eksploracyjne wyszukiwanie powiązań lek-gen i adnotacja ADMET

W celu uzyskania wstępnych zapisów interakcji lek–gen lub związek chemiczny–gen związanych z MPO przeprowadzono kwerendę w bazie DGIdb. Ponieważ listy interakcji pochodzące z baz danych mogą zawierać wpisy poparte heterogennymi typami dowodów i mogą nie odpowiadać bezpośrednio agentom terapeutycznym o znaczeniu klinicznym, pobrane związki potraktowano jako adnotacje eksploracyjne, a nie priorytetowych kandydatów do leczenia. Następnie wykorzystano narzędzia SwissADME oraz ADMETlab do podsumowania przewidywanych właściwości fizykochemicznych, farmakokinetycznych i toksykologicznych. Adnotacje te, opracowane in silico, posłużyły do zapewnienia wstępnego kontekstu dla interpretacji na poziomie poszczególnych związków oraz do podkreślenia konieczności dalszej kuracji farmakologicznej, toksykologicznej i klinicznej przed rozważeniem jakiegokolwiek znaczenia terapeutycznego36.

Wyniki

Wzorce ekspresji MPO i eksploracyjne powiązania z przeżywalnością w raku piersi

Aby opisać wzorce ekspresji MPO w zbiorach danych dotyczących nowotworów, przeanalizowano dane RNA-seq dla MPO z pan-rakowego zbioru danych TCGA. Zaobserwowano niższą ekspresję MPO w tkankach nowotworowych w przypadku raka urotelialnego pęcherza moczowego (BLCA), inwazyjnego raka piersi (BRCA), glejaka wielopostaciowego (GBM), raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSC), chromofobowego raka nerki (KICH), raka hepatokomórkowego wątroby (LIHC), gruczolakoraka płuca (LUAD), raka płaskonabłonkowego płuca (LUSC), gruczolakoraka trzustki (PAAD), gruczolakoraka prostaty (PRAD) i raka tarczycy (THCA), natomiast wyższą ekspresję MPO w gruczolakoraku okrężnicy (COAD), brodawkowym raku nerki (KIRP) oraz w innych tkankach (Rysunek 2A). Następnie oceniono związki między ekspresją MPO a wynikami klinicznymi w każdym typie nowotworu. W kohorcie TCGA-BRCA zarówno porównania nieparzyste, jak i parzyste wykazały niższą ekspresję MPO w tkance nowotworowej niż w tkance prawidłowej/przyległej (Rysunek 2B,C). Po przeprowadzeniu stratyfikacji próbek nowotworowych TCGA-BRCA z wykorzystaniem mediany ekspresji MPO w guzie jako punktu odcięcia, analiza Kaplana-Meiera wykazała, że pacjenci z wyższą ekspresją MPO mieli dłuższy czas przeżycia wolny od progresji (Hazard Ratio (HR) = 0,67, p = 0,028) (Rysunek 2D). Przeżycie całkowite (OS) (p = 0,296; Rysunek uzupełniający 1A) oraz przeżycie specyficzne dla choroby (DSS) (p = 0,18; Rysunek uzupełniający 1B) nie były istotne statystycznie. Krzywa ROC dla porównania tkanki nowotworowej z prawidłową zasugerowała rozróżnienie między grupami tkanek w tym zbiorze danych (Rysunek 2E), jednak analiza ta nie powinna być interpretowana jako walidacja diagnostyki klinicznej. To wstępne rozróżnienie może być wpływem źródła próbek prawidłowych, efektów seryjnych, czystości nowotworu oraz różnic w składzie tkankowym. Ekspresja MPO była również powiązana z patologicznym stopniem T (Rysunek 2F) oraz rozkładem podtypów PAM50 (Rysunek 2G). Reprezentatywne obrazy immunohistochemiczne (IHC) MPO z przyległej prawidłowej tkanki piersi oraz tkanki raka piersi dołączono jako jakościowe referencje na poziomie białka (Rysunek 2H). Obszary zaznaczone ramkami wskazują regiony przedstawione przy większym powiększeniu. Obrazy przeglądowe 20× zawierają paski skali 100 µm, natomiast obrazy o większym powiększeniu 40× zawierają paski skali 50 µm.

Analiza korelacji i wzbogacenia MPO w kohorcie TCGA-BRCA

Analiza korelacji Pearsona pozwoliła zidentyfikować 30 genów najsilniej dodatnio skorelowanych z MPO, które wykazywały skoordynowaną nadekspresję wzdłuż gradientu ekspresji MPO (Rysunek 3A), podczas gdy 30 genów najsilniej ujemnie skorelowanych wykazywało odwrotny wzorzec ekspresji (Rysunek 3B). Na poziomie szlaków sygnałowych ekspresja MPO była istotnie i dodatnio powiązana z wieloma wynikami sygnatur związanych z nowotworem, w tym z sygnaturą odpowiedzi zapalnej (r = 0,41; Rysunek 3C), markerami EMT (r = 0,264; Rysunek 3D) oraz wynikiem dla zestawu genów związanych z reaktywnymi formami tlenu (ROS) (r = 0,415; Rysunek 3E), co sugeruje, że ekspresja MPO koreluje ze stanami transkrypcyjnymi zapalnymi/oksydacyjnymi oraz mezenchymalnymi w kohorcie TCGA-BRCA.

Nienadzorowane grupowanie genów powiązanych z MPO pozwoliło na dalszą stratyfikację guzów na wzorce ekspresji zgodne z adnotacjami klinicznymi, w tym patologicznym stadium T oraz wewnętrznymi podtypami PAM50 (Rysunek 3F). Aby zbadać możliwą łączność między genami powiązanymi z MPO, skonstruowano sieć oddziaływań białko-białko (PPI) przy użyciu bazy STRING, co ujawniło wzajemnie powiązany moduł obejmujący kilka genów skorelowanych z MPO (Rysunek 3G). W sieci PPI geny ESR1, FOXA1, XBP1, GATA3 oraz KRT18 wykazywały wysoką łączność sieciową w ramach tego modułu pochodzącego z analizy korelacji. Wyniki te identyfikują geny współzmienne z ekspresją MPO, lecz nie określają patogenezy ani kierunkowości związanej z MPO. Analiza ekspresji różnicowej między grupami z wysokim i niskim poziomem MPO ujawniła różnice transkrypcyjne przedstawione na wykresie wulkanicznym (Rysunek 3H). Zidentyfikowano łącznie 1159 genów o zwiększonej i 854 genach o zmniejszonej ekspresji, co stanowiło dane wejściowe do późniejszych analiz wzbogaceń.

Następnie, przy użyciu pakietu clusterProfiler w środowisku R, zbadaliśmy istotność funkcjonalną genów różnicowo wyrażonych (DEGs) pomiędzy grupami MPO-high i MPO-low. Analiza wzbogacenia Ontologii Genów (GO) wykazała, że geny te uczestniczyły przede wszystkim w procesach biologicznych związanych z odpornością, w tym w regulacji sygnalizacji receptorów powierzchniowych komórek związanych z odpowiedzią immunologiczną oraz w odporności zależnej od limfocytów; wzbogacenie zaobserwowano również w składnikach komórkowych, takich jak kompleks receptora limfocytów T, oraz w funkcjach molekularnych związanych z aktywnością aktywatorów receptorowych (Rycyna 4A). Spójnie z tym, analiza szlaków KEGG wyróżniła ścieżki związane z odpornością i stanem zapalnym, w tym oddziaływania cytokina–receptor cytokinowy, sygnalizację chemokin, sygnalizację receptora limfocytów T, cytotoksyczność zależną od komórek natural killer, różnicowanie Th1/Th2 i Th17, sygnalizację NF-κB, pierwotne niedobory odporności oraz jelitową sieć immunologiczną odpowiedzialną za produkcję IgA (Rycyna 4B).

Aby dodatkowo zintegrować kierunkowość ekspresji z terminami funkcjonalnymi, wykorzystano wykres GO do obliczenia wyników Z na poziomie terminów w oparciu o wartości |log2FC| DEG, co ponownie uwydatniło programy transkrypcyjne wzbogacone w elementy immunologiczne, takie jak humoralna odpowiedź odpornościowa, odporność pośredniczona przez leukocyty/limfocyty, aktywacja odpowiedzi immunologicznej oraz transdukcja sygnału (Rysunek 4C). Analiza wzbogacenia zestawów genów (GSEA) oparta na uszeregowanej liście genów wykazała również wzbogacenie szlaków układu odpornościowego, w tym adaptacyjnego układu odpornościowego, interakcji cytokina–receptor cytokinowy oraz degranulacji neutrofili (Rysunek 4D–G). Ponieważ MPO jest genem powiązanym z komórkami mieloidalnymi/neutrofilami, wzbogacenia te interpretuje się jako dowód na to, że próbki z wysokim poziomem MPO wykazują silniejsze sygnały transkrypcyjne immunologiczne/mieloidalne, a nie jako dowód na to, że sam MPO przebudowuje mikrośrodowisko immunologiczne.

Korelacja między ekspresją MPO a infiltracją komórek odpornościowych w raku piersi

Oceniliśmy związek między ekspresją MPO a charakterystyką mikrośrodowiska guza w kohorcie TCGA-BRCA. Zastosowanie algorytmu ESTIMATE ujawniło istotne korelacje dodatnie między ekspresją MPO a wynikiem ESTIMATE (R = 0.347, p < 0.001), wynikiem odpornościowym (immune score) (R = 0.361, p < 0.001) oraz wynikiem stromalnym (stromal score) (R = 0.232, p < 0.001) (Rycina 5A). Rozkład tych wyników w próbkach przedstawiono na Rycynie 5B. Analiza z wykorzystaniem zasobów TIMER/TIMER2.0 wykazała, że ekspresja MPO wiązała się z szacowanymi poziomami nacieku głównych populacji komórek odpornościowych, w tym limfocytów B, limfocytów T CD8+, neutrofili, limfocytów T CD4+, makrofagów i komórek dendrytycznych w kohorcie TCGA-BRCA (Rycina 5C). Wzór tych powiązań oceniono dalej za pomocą wyników wzbogacenia komórek odpornościowych opartych na metodzie ssGSEA dla 24 typów komórek odpornościowych. Po korekcie współczynnika fałszywych odkryć metodą Benjamini–Hochberga, ekspresja MPO wykazała dodatnie związki z wieloma wynikami wzbogacenia komórek odpornościowych, w tym limfocytów T, limfocytów B, komórek cytotoksycznych, podzbiorów komórek dendrytycznych, makrofagów, podzbiorów limfocytów T pomocniczych, regulatorowych limfocytów T, limfocytów T CD8+, komórek NK, komórek tucznych i neutrofili (Rycina 5D). Wyniki te interpretuje się jako powiązania z kompozycją immunologiczną, a nie jako dowód na to, że MPO bezpośrednio kontroluje naciek komórek odpornościowych. W celu wizualizacji wzorców wzbogacenia komórek odpornościowych na poziomie próbek w całej kohorcie TCGA-BRCA wygenerowano mapę ciepła (Rycina 5E). Następnie porównaliśmy wyniki wzbogacenia komórek odpornościowych szacowane metodą ssGSEA pomiędzy grupami guzów o wysokiej i niskiej ekspresji MPO, zdefiniowanymi na podstawie mediany. Kilka wyników wzbogacenia komórek odpornościowych różniło się między obiema grupami, w tym aktywowane komórki dendrytyczne (aDC), limfocyty B, limfocyty T CD8+, komórki cytotoksyczne, neutrofile, limfocyty T, Tregs, limfocyty Th1, limfocyty Th2, limfocyty Th17, limfocyty T γδ, limfocyty T pomocnicze pęcherzykowe (TFH), komórki o wysokiej zmienności genów (HVG), limfocyty T pamięci efektorowej, limfocyty T pamięci centralnej oraz limfocyty T pomocnicze (Rycina 5F,G). Ponadto przeprowadzono dekonwolucję opartą na CIBERSORT z użyciem macierzy sygnatur LM22 w celu oszacowania względnych frakcji 22 typów komórek odpornościowych; wynikowe wzorce kompozycji komórek odpornościowych przedstawiono na Rycynie 5H.

Analiza metylacji DNA MPO w kohorcie TCGA-BRCA

Stosując ten sam próg medianowej ekspresji MPO w guzach, próbki TCGA-BRCA podzielono na grupy MPO-high i MPO-low, a następnie zwizualizowano wzorce metylacji DNA dla każdej z grup (Rycyna 6A). Wybrane miejsca CpG w obrębie locus MPO wykazały korelacje z przeżywalnością w analizie MethSurv, w tym cg22331200, cg14619064 oraz cg11151395 (Rycyna 6B–G). Wyniki dotyczące metylacji zinterpretowano jako wstępne adnotacje epigenetyczne, które wymagają niezależnej walidacji przed sformułowaniem wniosków prognostycznych lub mechanistycznych.

Związek między ekspresją MPO a sieciami genów powiązanymi z neutrofilami w raku piersi

Wykorzystano kohortę TCGA-BRCA w celu zbadania związku między ekspresją MPO a genami związanymi z neutrofilami. Dla genów powiązanych z neutrofilami skonstruowano sieć PPI w oparciu o bazę STRING, a następnie wyłoniono geny węzłowe (hub genes) zgodnie z topologią sieci (Rysunek 7A). Następnie oceniono korelację 20 najważniejszych genów węzłowych z ekspresją MPO. Jak pokazano na wykresie typu lollipop, MPO wykazało przeważnie dodatnie korelacje z wieloma mediatorami związanymi z neutrofilami, przy czym silniejsze powiązania zaobserwowano dla komponentów sygnalizacji chemokinowej i wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, takich jak CCL5, CCL2 i TLR2, a także TLR4, CXCR4, TNF i MMP9 (Rysunek 7B).

Aby dalej scharakteryzować wzorzec współregulacji między tymi genami hubowymi, zwizualizowano ich relacje parami za pomocą diagramu chordowego oraz mapy ciepła korelacji, co ujawniło rozległe dodatnie korelacje międzygenowe w obrębie modułu hubowego, co jest spójne ze skoordynowanym programem transkrypcyjnym związanym z procesami zapalnymi/neutrofilowymi (Rycina 7C,D). Zbiorczo wyniki te wskazują, że wyższa ekspresja MPO wiąże się ze skoordynowaną ekspresją sieci genów związanych z neutrofilami w raku piersi.

Adnotacja potencjalnych czynników transkrypcyjnych dla MPO

W celu zbadania potencjalnych czynników transkrypcyjnych związanych z MPO, przeszukano i zestawiono publiczne zasoby czynników transkrypcyjnych, w tym KnockTF, ChIP-Atlas oraz GTRD. Wytypowane czynniki transkrypcyjne podsumowano następnie, wykorzystując analizę korelacyjną oraz priorytetyzację opartą na sieciach. Podsumowanie graficzne przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 2, a pełne wyniki w formie tabelarycznej znajdują się w Pliku uzupełniającym 2. Ponieważ bazy te integrują dowody z heterogenicznych kontekstów eksperymentalnych, nakładanie się baz danych oraz stopień węzła w sieci zostały wykorzystane wyłącznie do adnotacji i priorytetyzacji kandydatów. Wyniki te nie zostały zinterpretowane jako funkcjonalny dowód bezpośredniej regulacji transkrypcyjnej MPO w raku piersi. Dlatego też potencjalne czynniki, w tym MYC, są przedstawione jako uzupełniające adnotacje eksploracyjne, a nie jako zwalidowane regulatory nadrzędne.

Klasteryzacja pojedynczych komórek i opisowa analiza komunikacji międzykomórkowej uwarstwiona według sygnału MPO

Aby dokonać adnotacji typów komórek, w pierwszej kolejności przeprowadzono analizę ekspresji specyficznej dla klastrów w oparciu o kanoniczne markery dla każdej linii komórkowej. Przedstawiono średnie poziomy ekspresji oraz odsetek komórek wykazujących ekspresję tych kluczowych genów w poszczególnych klastrach, co stanowi podstawę do późniejszej adnotacji (Rysunek 8A). Odpowiednio, zaadnotowane klastry komórkowe zwizualizowano na wykresie aproksymacji i projekcji wielowymiarowej (UMAP), w którym każda populacja została oznaczona kolorem zgodnie z zidentyfikowanym typem, w tym: plazmocytopodobne komórki dendrytyczne, komórki śródbłonka, komórki mioepitelialne, cyklicznie dzielące się komórki nabłonka, komórki plazmatyczne, cytotoksyczne limfocyty T, nabłonkowe komórki nowotworowe, limfocyty B, aktywowane limfocyty T CD4, monocyty–makrofagi, fibroblasty oraz konwencjonalne limfocyty T (Rysunek 8B). Mapa ciepła przedstawia poziomy ekspresji wybranych genów w klastrach komórkowych (C1-C8). Każdy wiersz reprezentuje gen, a każda kolumna klaster komórkowy. Gradient kolorów wskazuje poziomy ekspresji, gdzie kolor czerwony oznacza wysoką ekspresję, a niebieski niską ekspresję. Dendrogram po lewej stronie grupuje geny o podobnych wzorcach ekspresji (Rysunek 8C). Wynik powiązany z MPO obliczono dla każdej komórki, korzystając ze zbioru genów powiązanych z MPO dostarczonego w Pliku uzupełniającym 1. Do obliczenia wyników dla poszczególnych komórek wykorzystano AUCell, funkcję AddModuleScore z pakietu Seurat oraz analizę wzbogacenia zbiorów genów dla pojedynczych próbek (ssGSEA). Wyniki z trzech metod poddano normalizacji Z-score, przeskalowano do porównywalnego zakresu i zinterowano w celu uzyskania złożonego wyniku powiązanego z MPO do dalszej analizy opisowej (Rysunek 8D).

Analiza oddziaływań międzykomórkowych porównywała wnioskowane wzorce komunikacji ligand–receptor pomiędzy grupami komórek podzielonymi według sygnału związanego z MPO, w tym sieć oddziaływań, mapy ciepła wzorców sygnalizacji, wykres pęcherzykowy sygnalizacji wychodzącej oraz wykres pęcherzykowy sygnalizacji przychodzącej (Rysunek 8E–H). Ponieważ sygnał MPO był rzadki na poziomie pojedynczych komórek, a widoczny rozkład w obrębie opisanych typów komórek mógł zostać wpłynięty przez zjawisko dropoutu, RNA tła, dublety oraz niepewność adnotacji, wykresy komunikacji te należy interpretować jako opisowe wyniki przepływu pracy. Nie dowodzą one, że komórki wykazujące ekspresję MPO pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej lub ją kontrolują. Wykrywalny sygnał MPO zaobserwowano w ograniczonej liczbie komórek, w tym w opisanych nowotworowych komórkach nabłonkowych oraz monocytach-makrofagach (Rysunek 8I). Biorąc pod uwagę, że MPO jest kanonicznie powiązane z liniami neutrofilnymi/mieloidalnymi, wzorzec ten wymaga walidacji w niezależnych zbiorach danych z sekwencjonowania pojedynczych komórek lub za pomocą ortogonalnych metod eksperymentalnych.

Eksploracyjna analiza wrażliwości scTenifoldKnk w oparciu o rzadkie komórki MPO-dodatnie

Zintegrowano wiele próbek z systemu 10x Genomics, a następnie przeprowadzono normalizację i wybór genów o wysokiej zmienności (HVG), redukcję wymiarowości metodą PCA, konstrukcję grafu k-najbliższych sąsiadów oraz klasteryzację metodą Louvaina. Kanoniczne wzorce ekspresji genów markerowych w klastrach podsumowano za pomocą wykresu DotPlot, co posłużyło do późniejszej adnotacji typów komórek (Rycina 9A). Wizualizacja UMAP przedstawiła adnotowane populacje pojedynczych komórek w zintegrowanym zbiorze danych (Rycina 9B). Kanoniczne markery linii komórkowych (np. EPCAM i KRT8/KRT18 dla komórek nabłonkowych; PTPRC dla komórek odpornościowych; MS4A1 dla limfocytów B; LST1/S100A8/S100A9 dla komórek mieloidalnych; PECAM1 dla komórek śródbłonka oraz COL1A1 dla linii fibroblastów/mięśni gładkich) wykazały specyficzne dla klastrów wzorce ekspresji, co potwierdziło adnotację typów komórek (Rycina 9C). Stratyfikowane według próbek skumulowane wykresy słupkowe wskazały, że każda próbka zawierała wiele klastrów przy ograniczonej ogólnej zmienności między partiami danych (Rycina 9D).

Ekspresja MPO w zbiorze danych z pojedynczych komórek była stosunkowo rzadka, początkowo wykryto jedynie 85 komórek MPO-dodatnich (Rycyna 9E). Ze względu na tę ograniczoną liczbę, ekspansja sąsiedztwa w oparciu o algorytm KNN została zastosowana wyłącznie w celu zdefiniowania lokalnego podzbioru sąsiedztwa MPO do eksploracyjnej analizy wrażliwości. Rozszerzonego podzbioru tego nie należy interpretować jako czystej populacji MPO-dodatniej, ponieważ może on obejmować komórki sąsiednie o niskiej lub niewykrywalnej ekspresji MPO. W obrębie tego podzbioru sąsiedztwa MPO przeprowadzono wirtualny knockdown MPO przy użyciu narzędzia scTenifoldKnk jako obliczeniową analizę wrażliwości. Wynikowy wykres wulkaniczny, analiza przemieszczenia rozmaitości (manifold displacement analysis), wizualizacja wyrównania rozmaitości, wyniki wzbogacenia GO/KEGG oraz geny o największym przemieszczeniu (Rycina 9F-N) wskazały na kandydujące programy transkrypcyjne związane z prezentacją antygenu, aktywacją myeloidną/limfocytarną, produkcją cytokin oraz szlakami związanymi z fagosomami. Wyniki te należy interpretować jako eksploracyjne dane dotyczące wrażliwości transkrypcyjnej, a nie jako bezpośredni dowód na to, że MPO mechanistycznie reguluje te szlaki w raku piersi. Do potwierdzenia tych obserwacji będą wymagane niezależne zbiory danych z pojedynczych komórek oraz ortogonalna walidacja eksperymentalna, taka jak immunohistochemia, cytometria przepływowa, qPCR lub testy funkcjonalne.

Eksploracyjne wyszukiwanie interakcji leków z genami oraz adnotacja ADMET

Jako eksploracyjne rozszerzenie analizy skoncentrowanej na MPO, informacje o interakcjach lek–gen pobrano z bazy DGIdb. Podsumowanie graficzne przedstawiono na Rycynie dodatkowej 3, a wyniki na poziomie związków podano w Tabeli dodatkowej 3. Zapytanie w DGIdb zwróciło niejednorodny zestaw wpisów chemicznych związanych z MPO, w tym związki o ograniczonej prawdopodobieństwie klinicznym lub niekorzystnych profilach toksykologicznych. W związku z tym związki pochodzące z tej bazy danych nie zostały uznane w niniejszej analizie za potencjalne kandydaty terapeutyczne w leczeniu raka piersi. Podsumowano informacje dotyczące ADMET, aby zapewnić wstępną adnotację przewidywanych właściwości fizykochemicznych, farmakokinetycznych i toksykologicznych. Pobieranie związków z baz danych oraz adnotacje ADMET nie są równoznaczne z klinicznie opracowaną priorytetyzacją leków. Wyniki te służą zatem wyłącznie jako adnotacje chemiczne na poziomie przesiewowym i ilustrują potrzebę starannego filtrowania farmakologicznego, toksykologicznego i klinicznego, zanim jakikolwiek związek zostanie rozważony pod kątem badań terapeutycznych. Główne wnioski z niniejszego badania koncentrują się na powiązaniu między ekspresją MPO a cechami transkrypcyjnymi związanymi z układem odpornościowym i komórkami mieloidalnymi.

Dostępność danych>:

Dane transkryptomiczne i kliniczne TCGA-BRCA pobrano z portalu Genomic Data Commons (https://portal.gdc.cancer.gov; pobrano 26 sierpnia 2025 r.; wersja danych 202208). Zestaw danych z sekwencjonowania pojedynczych komórek GSE161529 pobrano z bazy Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161529). W niniejszym badaniu nie wygenerowano nowych danych z sekwencjonowania. Skrypty analityczne są publicznie dostępne pod adresem https://github.com/tengfeitcm/MPO.

Schemat analizy multiomicznej, komunikacji komórkowej, ekspresji MPO oraz integracji danych klinicznych.
Rycina 1: Schemat procesu gromadzenia i analizy danych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Badania nad rakiem piersi; wykresy słupkowe ekspresji MPO, krzywa przeżycia, ROC, analiza obrazów histologicznych.
Rycina 2: Wzorce ekspresji MPO i eksploracyjne powiązania z przeżywalnością w raku piersi. (A) Poziomy ekspresji MPO przeanalizowano w 33 różnych typach nowotworów oraz w sąsiednich tkankach prawidłowych z wykorzystaniem bazy danych TCGA. (B) Z zestawu danych TCGA-BRCA wybrano niezależne próbki w celu analizy ekspresji mRNA MPO w raku piersi i tkankach prawidłowych. (C) Z zestawu danych TCGA-BRCA wybrano próbki sparowane w celu analizy ekspresji mRNA MPO w raku piersi i tkankach prawidłowych. (D) Analiza Kaplana-Meiera dla PFI u pacjentów stratyfikowanych według mediany odcięcia ekspresji MPO w guzie w kohorcie TCGA-BRCA. (E) Eksploracyjna krzywa ROC oceniająca rozróżnienie między guzem a tkanką prawidłową na podstawie ekspresji MPO w analizowanym publicznym zbiorze danych transkrypcyjnych. (F) Ekspresja MPO w różnych patologicznych stadiach T. (G) Ekspresja MPO w podtypach molekularnych PAM50 z naniesionymi etykietami podtypów. (H) Reprezentatywne obrazy immunohistochemiczne (IHC) dla MPO w sąsiedniej prawidłowej tkance piersi oraz tkance raka piersi. Obramowane obszary wskazują regiony przedstawione przy większym powiększeniu. Obrazy przeglądowe 20× zawierają paski skali 100 µm, natomiast obrazy o większym powiększeniu 40× zawierają paski skali 50 µm. Obrazy te służą jako jakościowe odniesienie dla poziomu białka i nie były wykorzystywane do ilościowej analizy morfometrycznej lub statystycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy analizy ekspresji genów i diagram sieci, mapy ciepła, wykresy rozrzutu i wulkaniczne.
Rycina 3: Analiza korelacji i różnicowej ekspresji związanej z MPO w raku piersi. (A) 30 czołowych genów kodujących dodatnio skorelowanych z ekspresją MPO na poziomie mRNA na podstawie współczynników korelacji Pearsona z bazy danych TCGA. (B) 30 czołowych genów kodujących ujemnie skorelowanych z ekspresją MPO na poziomie mRNA na podstawie współczynników korelacji Pearsona. (C) Wykresy rozrzutu ilustrujące korelacje Spearmana pomiędzy MPO a genami o zwiększonej ekspresji w odpowiedzi zapalnej. (D) Wykresy rozrzutu ilustrujące korelacje Spearmana pomiędzy MPO a genami o zwiększonej ekspresji markerów EMT. (E) Wykresy rozrzutu ilustrujące korelacje Spearmana pomiędzy MPO a genami o zwiększonej ekspresji indukowanej przez ROS. (F) Mapa ciepła klastrów genów związanych z MPO na podstawie znaczenia klinicznego (stadium T oraz PAM50). (G) Sieć PPI przewidziana przy użyciu bazy danych STRING dla białek związanych z MPO. (H) Wykres wulkaniczny genów o różnicowej ekspresji pomiędzy grupami guzów z wysokim i niskim poziomem MPO, zdefiniowanymi według mediany, w kohorcie TCGA-BRCA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy analizy wzbogacenia genów z szlakami i kategoriami ontologii; wykresy słupkowe i liniowe.
Rycina 4: Analiza wzbogacenia MPO w raku piersi. (A) Analiza wzbogacenia Gene Ontology dla 2 013 genów o różnej ekspresji pomiędzy grupami z wysokim i niskim poziomem MPO. (B) Analiza wzbogacenia szlaków Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes dla 2 013 genów o różnej ekspresji. (C) Połączona wizualizacja wzbogacenia Gene Ontology integrująca wzbogacone terminy z kierunkiem różnicowej ekspresji i wartościami |log2FC|. (D) Reprezentatywny wykres wzbogacenia GSEA dla zestawu genów związanych z odpornością i powiązanych z MPO; nazwa zestawu genów, znormalizowany wynik wzbogacenia oraz wartość q FDR są przedstawione w panelu. (E) Reprezentatywny wykres wzbogacenia GSEA dla dodatkowego zestawu genów związanych z odpornością i powiązanych z MPO; nazwa zestawu genów, znormalizowany wynik wzbogacenia oraz wartość q FDR są przedstawione w panelu. (F) Reprezentatywny wykres wzbogacenia GSEA dla dodatkowego zestawu genów związanych z odpornością i powiązanych z MPO; nazwa zestawu genów, znormalizowany wynik wzbogacenia oraz wartość q FDR są przedstawione w panelu. (G) Reprezentatywny wykres wzbogacenia GSEA dla dodatkowego zestawu genów związanych z odpornością i powiązanych z MPO; nazwa zestawu genów, znormalizowany wynik wzbogacenia oraz wartość q FDR są przedstawione w panelu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy analizy ekspresji genów, rola MPO w infiltracji komórek odpornościowych, korelacja i wizualizacja danych.
Rysunek 5: Korelacja między wzbogaceniem komórek odpornościowych a ekspresją MPO w raku piersi. (A) Wykresy rozrzutu przedstawiające korelacje między ekspresją MPO a wynikiem ESTIMATE, wynikiem immunologicznym (immune score) i wynikiem zrębowym (stromal score). (B) Wykresy pudełkowe przedstawiające różnice w wyniku ESTIMATE, wyniku immunologicznym i wyniku zrębowym pomiędzy grupami guzów z wysoką i niską ekspresją MPO, zdefiniowanymi według mediany. (C) Analiza oparta na TIMER/TIMER2.0 wykazująca powiązania między ekspresją MPO a szacowaną infiltracją głównych populacji komórek odpornościowych. (D) Wykres typu lollipop przedstawiający korelacje Spearmana między ekspresją MPO a wynikami wzbogacenia szacowanymi metodą ssGSEA dla 24 typów komórek odpornościowych. Wartości p dla wielu korelacji komórek odpornościowych zostały skorygowane metodą FDR Benjamini–Hochberga. (E) Mapa ciepła ilustrująca wzorce wzbogacenia komórek odpornościowych na poziomie próbek w kohorcie TCGA-BRCA. (F) Wykresy pudełkowe przedstawiające pierwszy zestaw różnic w wynikach wzbogacenia komórek odpornościowych szacowanych metodą ssGSEA pomiędzy grupami guzów z wysoką i niską ekspresją MPO, zdefiniowanymi według mediany; porównania grup przeprowadzono za pomocą testu sum rang Wilcoxona z korektą Benjamini–Hochberga. (G) Wykresy pudełkowe przedstawiające drugi zestaw różnic w wynikach wzbogacenia komórek odpornościowych szacowanych metodą ssGSEA pomiędzy grupami guzów z wysoką i niską ekspresją MPO, zdefiniowanymi według mediany; porównania grup przeprowadzono za pomocą testu sum rang Wilcoxona z korektą Benjamini–Hochberga. (H) Skumulowany wykres słupkowy przedstawiający frakcje komórek odpornościowych szacowane metodą CIBERSORT w oparciu o macierz sygnatur LM22 dla 22 typów komórek odpornościowych w grupach guzów z niską i wysoką ekspresją MPO, zdefiniowanych według mediany. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mapa ciepła wzorców metylacji DNA oraz wykresy analizy przeżywalności dla badania ekspresji genów.
Rysunek 6: Analiza metylacji DNA genu MPO w raku piersi. (A) Mapa ciepła przedstawiająca wzorce metylacji MPO w grupach MPO-high i MPO-low zdefiniowanych według mediany. (B) Krzywa przeżywalności Kaplana-Meiera wykazująca znaczenie prognostyczne metylacji w obrębie miejsca cg27456487. (C) Krzywa przeżywalności Kaplana-Meiera wykazująca znaczenie prognostyczne metylacji w obrębie miejsca cg02668773. (D) Krzywa przeżywalności Kaplana-Meiera wykazująca znaczenie prognostyczne metylacji w obrębie miejsca cg07110356. (E) Krzywa przeżywalności Kaplana-Meiera wykazująca znaczenie prognostyczne metylacji w obrębie miejsca cg11151395. (F) Krzywa przeżywalności Kaplana-Meiera wykazująca znaczenie prognostyczne metylacji w obrębie miejsca cg14619064. (G) Krzywa przeżywalności Kaplana-Meiera wykazująca znaczenie prognostyczne metylacji w obrębie miejsca cg22331200. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza sieci ekspresji genów; schemat, wykres, wyniki korelacji; dane o interakcjach białek.
Rycina 7: Analiza korelacji genów MPO i genów związanych z neutrofilami na poziomie mRNA z wykorzystaniem bazy danych TCGA. (A) Wizualizacja sieci interakcji białek, przedstawiająca oddziaływania między białkiem kluczowym a innymi białkami. (B) Analiza korelacji 20 najważniejszych genów związanych z neutrofilami z MPO, prezentująca współczynniki korelacji i rozkłady wartości P dla różnych genów. (C) Diagram chordowy korelacji między 20 najważniejszymi genami związanymi z neutrofilami, wizualnie reprezentujący siłę i kierunek powiązań genetycznych. (D) Mapa ciepła korelacji 20 najważniejszych genów związanych z neutrofilami, wyświetlająca współczynniki korelacji i poziomy istotności za pomocą gradientów kolorystycznych i markerów statystycznych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Klastry komórkowe i analiza ekspresji; wykresy, mapy ciepła i diagram sieci; dane z sekwencjonowania RNA.
Rycina 8: Klastrowanie pojedynczych komórek i analiza komunikacji międzykomórkowej związanej z MPO w zbiorze danych pojedynczych komórek raka piersi. (A) Wykres DotPlot kanonicznych genów markerowych w klastrach w celu adnotacji typów komórek. (B) Wizualizacja UMAP adnotowanych populacji komórek. (C) Mapa ciepła wybranych genów markerowych w klastrach komórkowych. (D) Wykres DotPlot podsumowujący wyniki związane z MPO w adnotowanych typach komórek, obliczone przy użyciu AUCell, ssGSEA i Seurat AddModuleScore na podstawie zestawu genów podanego w Pliku uzupełniającym 1. (E) Sieć interakcji międzykomórkowych przedstawiająca komunikację między nabłonkowymi komórkami nowotworowymi stratyfikowanymi według sygnału związanego z MPO a innymi typami komórek; szerokość krawędzi reprezentuje siłę interakcji, a rozmiar węzła odzwierciedla ogólną aktywność interakcji. (F) Mapy ciepła pokazujące wzorce sygnalizacji wychodzącej i przychodzącej między typami komórek. (G) Wykres bąbelkowy szlaków sygnalizacji wychodzącej z nabłonkowych komórek nowotworowych stratyfikowanych według sygnału związanego z MPO do innych typów komórek. (H) Wykres bąbelkowy szlaków sygnalizacji przychodzącej z innych typów komórek do nabłonkowych komórek nowotworowych stratyfikowanych według sygnału związanego z MPO. (I) Rozkład ekspresji MPO w adnotowanych typach komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Diagramy klastrowania UMAP, mapa ciepła ekspresji genów, wykresy słupkowe i wykres wulkaniczny dla analizy danych.
Rycina 9: Analiza atlasu pojedynczych komórek i eksploracyjny wirtualny knockdown efektu czułości MPO. (A) Wykres kropkowy (DotPlot) przedstawiający ekspresję kanonicznych genów markerowych w klastrach pojedynczych komórek; rozmiar kropki reprezentuje procent komórek wykazujących ekspresję każdego markera, a intensywność koloru reprezentuje średni poziom ekspresji. (B) Wizualizacja UMAP adnotowanych populacji pojedynczych komórek, gdzie każdy kolor reprezentuje odrębny typ komórek lub klaster. (C) Wizualizacja UMAP ekspresji kluczowych genów markerowych, pokazująca rozkład ekspresji genów markerowych dla typów komórek, w tym komórek mieloidalnych. (D) Skumulowany wykres słupkowy proporcji klastrów komórkowych w próbkach. (E) Wizualizacja UMAP ekspresji genu MPO. (F) Wykres skrzypcowy (violin plot) przedstawiający metryki kontroli jakości (QC) sekwencjonowania pojedynczych komórek. (G) Wykres klastrowania kluczowych genów markerowych. (H) Wykres kropkowy (DotPlot) kanonicznych genów markerowych na poziomie klastra. (I) Wykres wulkaniczny genów zmienionych w analizie czułości wirtualnego knockdownu. (J) Wykres rozrzutu przemieszczenia w stosunku do istotności. (K) Wykres strzałkowy wyrównania rozmaitości (manifold alignment). (L) Analiza wzbogacenia GO BP genów z wyników wirtualnego knockdownu. (M) Analiza wzbogacenia szlaków KEGG genów z wyników wirtualnego knockdownu. (N) 20 genów o najwyższym przemieszczeniu rozmaitości po wykluczeniu MPO. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca 1: Dodatkowe analizy przeżywalności dla MPO w kohorcie TCGA-BRCA. (A,B) Plik ten zawiera uzupełniające analizy przeżywalności Kaplana-Meiera dla (A) przeżycia całkowitego oraz (B) przeżycia specyficznego dla choroby, zestratyfikowane według mediany poziomu ekspresji MPO w guzie. Analizy te stanowią uzupełniające analizy wyników dla Ryciny 2D i nie były istotne statystycznie w obecnej kohorcie.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Eksploracyjna adnotacja kandydujących czynników transkrypcyjnych dla MPO. (A) Diagram Venna przedstawiający część wspólną kandydujących czynników transkrypcyjnych z trzech publicznych zasobów czynników transkrypcyjnych. (B) Wynik porównania ekspresji MYC. (C) Mapa ciepła korelacji czynników transkrypcyjnych z etykietami wierszy i kolumn. (D) Wynik korelacji MPO–MYC. (E) Wynik analizy przeżywalności dla MYC. (F) Wynik analizy ROC dla MYC. Wyniki związane z MYC przedstawiono wyłącznie jako uzupełniające adnotacje kandydujących czynników transkrypcyjnych i nie są one wykorzystywane do wspierania wniosków dotyczących mechanistycznych regulatorów nadrzędnych.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 3: Eksploracyjny wynik wyszukiwania leków i genów w bazie DGIdb dla MPO. Szare węzły reprezentują gen MPO, pomarańczowe węzły reprezentują wyszukane wpisy dla małych cząsteczek, a linie łączące wskazują przewidywane przez bazę danych relacje lek–gen.Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Macierz sygnatur komórek odpornościowych LM22 wykorzystana do analizy dekonwolucji 22 typów komórek odpornościowych w oparciu o algorytm CIBERSORT. Przed przeprowadzeniem dalszych analiz zharmonizowano symbole genów, usunięto duplikaty, a dostępne geny przecięto z odpowiadającymi im macierzami ekspresji TCGA-BRCA lub GSE161529.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Lista genów związanych z neutrofilami wykorzystana do analizy STRING/PPI, priorytetyzacji genów hubowych oraz analizy korelacji między MPO a genami hubowymi. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 3: Eksploracyjne wyniki wyszukiwania leków i genów w bazie DGIdb oraz adnotacje ADMET dla MPO. Plik ten zawiera rekordy interakcji chemicznych z genami powiązanymi z MPO pobrane z DGIdb oraz przewidywane adnotacje fizykochemiczne, farmakokinetyczne i toksykologiczne na poziomie związków. Wyniki te są dostarczone wyłącznie jako wstępne adnotacje chemiczne i nie powinny być interpretowane jako listy kandydatów terapeutycznych. Nie potwierdzają one hamowania MPO, wiązania z celem, swoistości ligandu, selektywności, bezpieczeństwa, skuteczności terapeutycznej ani przydatności klinicznej. Wartości w tej tabeli reprezentują przewidywane parametry fizykochemiczne i podobieństwo do leku dla wymienionych związków. Masa cząsteczkowa jest wyrażona w gramach na mol (g/mol). Wartości akceptorów i donorów wiązań wodorowych wskazują odpowiednio przewidywaną liczbę akceptorów i donorów wiązań wodorowych. Współczynnik podziału octanol–woda Moriguchiego wskazuje przewidywaną lipofilność. Naruszenia reguły Lipińskiego wskazują liczbę kryteriów reguły pięciu Lipińskiego, które nie zostały spełnione przez dany związek. Wynik biodostępności reprezentuje przewidywaną wartość związaną z biodostępnością doustną, a powierzchnia topologiczna odnosi się do przewidywanej topologicznej polarnej powierzchni cząsteczki.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Lista genów związanych z MPO wykorzystana do oceny sygnatur w pojedynczych komórkach za pomocą AUCell, Seurat AddModuleScore i ssGSEA. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Eksploracyjne wyniki adnotacji kandydackich czynników transkrypcyjnych i miRNA dla MPO. Plik ten zawiera wyniki adnotacji kandydackich czynników transkrypcyjnych i miRNA pochodzące z baz danych w oparciu o zasoby publiczne, w tym KnockTF, ChIP-Atlas, GTRD oraz TargetScan. Adnotacje te są dostarczone wyłącznie w celu eksploracyjnej priorytetyzacji kandydatów i nie powinny być interpretowane jako funkcjonalny dowód regulacji upstream MPO w raku piersi.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Niniejsze badanie przedstawia eksploracyjny przepływ pracy oparty na publicznych zbiorach danych i analizach in silico w celu zbadania powiązań między ekspresją MPO a cechami immunologicznymi i mieloidalnymi w raku piersi. Analizy TCGA-BRCA wykazały, że ekspresja MPO była niższa w tkankach nowotworowych niż w przyległych tkankach niedowotworowych oraz że wyższa ekspresja MPO wiązała się z dłuższym odstępem wolnym od progresji. Jednak przeżycie całkowite oraz przeżycie swoiste dla choroby nie były istotne statystycznie. W związku z tym, w oparciu o aktualne dowody, MPO nie powinno być interpretowane jako wiarygodny lub uznany biomarker prognostyczny. Przyszłe badania powinny ocenić MPO z wykorzystaniem wieloczynnikowych modeli regresji Coxa skorygowanych o uznane zmienne kliniczno-patologiczne, niezależnych kohort walidacyjnych oraz analiz stratyfikowanych według podtypów.

W porównaniu do konwencjonalnej analizy różnicowej ekspresji w jednej kohorcie lub szacowania infiltracji immunologicznej z wykorzystaniem jednej platformy, ten skoncentrowany na MPO schemat postępowania integruje transcriptomikę bulk, wzbogacenie immunologiczne, adnotację metylacji, mapowanie pojedynczych komórek oraz wirtualną perturbację, aby zapewnić szerszy pogląd eksploracyjny na cechy immunologiczne i mieloidalne związane z MPO. Niemniej jednak schemat ten pozostaje uzupełnieniem, a nie zastępstwem dla walidacji w zewnętrznych kohortach, walidacji na poziomie przestrzennym lub białkowym oraz eksperymentalnych testów perturbacyjnych.

Wyniki infiltracji i wzbogacenia immunologicznego należy interpretować jako kontekst immunologiczny związany z MPO, a nie jako przebudowę immunologiczną napędzaną przez MPO. MPO jest wyrażane głównie w neutrofilach i innych komórkach linii mieloidalnej37. W związku z tym dodatnie korelacje między ekspresją MPO a wynikami ESTIMATE, wynikami immunologicznymi, wynikami wzbogacenia komórek odpornościowych, genami związanymi z neutrofilami, szlakami cytokinowymi, sygnaturami prezentacji antygenu lub szlakami degranulacji neutrofili są biologicznie prawdopodobne i mogą w dużej mierze odzwierciedlać różnice w liczbie komórek odpornościowych/mieloidalnych w próbkach guza typu bulk. Interpretacja ta jest zgodna z wcześniejszymi badaniami wykazującymi, że infiltracja neutrofili MPO-dodatnich wiąże się z korzystnym rokowaniem w raku piersi oraz że MPO jest zaangażowane w funkcje komórek dendrytycznych i zapalenie tkanek napędzane przez limfocyty T38,39. Dane z sekwencjonowania bulk RNA-seq nie pozwalają określić, czy MPO wykazuje aktywność wewnętrzną dla komórek nowotworowych, czy też obserwowany sygnał odzwierciedla głównie infiltrujące komórki odpornościowe. Do wyjaśnienia źródła komórkowego i funkcji niezbędne byłyby niezależne zbiory danych z sekwencjonowania pojedynczych komórek, profilowanie przestrzenne, immunohistochemia, cytometria przepływowa lub modele eksperymentalne oparte na perturbacjach.

Analiza pojedynczych komórek dostarcza dodatkowych informacji opisowych, lecz pozostaje ograniczona przez rzadką detekcję MPO. Przed zastosowaniem ekspansji sąsiedztwa w oparciu o KNN początkowo wykryto jedynie 85 komórek wykazujących pozytywny wynik dla MPO. Chociaż ekspansja KNN umożliwiła analizę wrażliwości komórek w lokalnym sąsiedztwie transkrypcyjnym komórek MPO-dodatnich, procedura ta może obejmować komórki, które nie wykazują bezpośredniej ekspresji MPO. W związku z tym wynik wirtualnego wyciszenia scTenifoldKnk należy interpretować jako eksploracyjną obliczeniową analizę wrażliwości, a nie jako dowód na regulację szlaku zależną od MPO40. Przed sformułowaniem wniosków mechanistycznych wymagana będzie walidacja w niezależnych zbiorach danych z pojedynczych komórek raka piersi oraz w ortogonalnych testach eksperymentalnych.

Analizę czynników transkrypcyjnych należy również interpretować z ostrożnością. Nakładanie się wyników z KnockTF, GTRD i ChIP-Atlas, a następnie priorytetyzacja oparta na stopniu powiązań, pozwala wytypować potencjalne czynniki transkrypcyjne, lecz nie pozwala na stwierdzenie funkcjonalnej regulacji transkrypcyjnej MPO w raku piersi. W związku z tym MYC oraz inne potencjalne czynniki zachowano jedynie jako adnotacje eksploracyjne. Ponieważ aktywność czynników transkrypcyjnych jest silnie zależna od kontekstu i może różnić się w zależności od podtypu guza, składu komórkowego, platformy analitycznej oraz strategii przetwarzania wstępnego, przed przypisaniem jakiejkolwiek roli regulacyjnej upstream dla kandydującego czynnika konieczna byłaby walidacja specyficzna dla danego kontekstu. Taka walidacja powinna obejmować ChIP-qPCR lub ChIP-seq, testy reporterowe promotora oraz perturbację czynników transkrypcyjnych z następującym po niej pomiarem ekspresji MPO.

Wyszukiwanie powiązań lek–gen oraz adnotacje ADMET powinny być również interpretowane z ostrożnością. Baza DGIdb może zwracać heterogeniczne asocjacje chemiczne–genowe, w tym związki, które nie są selektywnymi ligandami MPO i mogą mieć ograniczoną plausybilność kliniczną lub niekorzystne właściwości toksykologiczne36. Przewidywania ADMET dostarczają wstępnych adnotacji chemicznych, ale nie potwierdzają wiązania z celem, aktywności, selektywności, bezpieczeństwa ani skuteczności terapeutycznej41. W związku z tym obecne wyniki na poziomie poszczególnych związków nie powinny być wykorzystywane do wnioskowania o potencjale terapeutycznym. Sensowna ocena translacyjna wymagałaby opracowanego zbioru farmakologicznie istotnych inhibitorów lub sond MPO, porównania z uznanymi związkami celującymi w MPO oraz walidacji za pomocą testów biochemicznych, komórkowych i farmakologicznych. Przy interpretacji wyników związanych z lekami należy również wziąć pod uwagę zależną od kontekstu i potencjalnie podwójną rolę MPO w nowotworach. MPO może przyczyniać się do procesów pronowotworowych poprzez stres oksydacyjny, generowanie reaktywnych utleniaczy, uszkadzanie DNA, przewlekły stan zapalny i przebudowę mikrośrodowiska guza. Jednocześnie ekspresja MPO w zbiorach danych z całych guzów może odzwierciedlać naciekanie przez neutrofile lub inne mieloidalne komórki odpornościowe, co w niektórych kontekstach może być związane z immunoaktywnym mikrośrodowiskiem i korzystniejszymi wynikami klinicznymi39,42. Biologiczna interpretacja roli MPO zależy zatem od typu nowotworu, źródła komórkowego, stadium choroby i składu komórek odpornościowych.

Wyniki metylacji DNA w obrębie locus MPO uznano również za eksploracyjne. Wybrane miejsca CpG wykazały powiązania z przeżywalnością w analizie MethSurv, jednak wyniki te wymagają niezależnej walidacji, zanim będą można wyciągnąć wnioski prognostyczne lub mechanistyczne. Regulacja epigenetyczna MPO może oddziaływać na wiązanie czynników transkrypcyjnych i regulację na poziomie chromatyny, lecz takie interakcje pozostają spekulacyjne bez funkcjonalnych danych dotyczących chromatyny lub danych z zaburzeń funkcji43.

Implikacje kliniczne ekspresji MPO należy interpretować z ostrożnością. Przedstawione wyniki nie dowodzą, że MPO jest biomarkerem umożliwiającym podjęcie działań klinicznych ani markerem, który obecnie mógłby kierować decyzjami dotyczącymi immunoterapii w raku piersi. MPO może raczej odzwierciedlać kontekst immunologiczny związany z komórkami mieloidalnymi/neutrofilami w mikrośrodowisku guza. W przyszłych badaniach ekspresję MPO można by oceniać wraz z uznanymi markerami związanymi z immunoterapią, w tym z limfocytami naciekającymi guz, ekspresją PD-L1, ekspresją genów punktów kontrolnych układu odpornościowego, podtypem molekularnym oraz zwalidowanymi sygnaturami immunologicznymi. Przed rozważeniem wykorzystania MPO do stratyfikacji pacjentów lub podejmowania decyzji o immunoterapii, takie analizy powinny obejmować niezależne kohorty, modele wielowymiarowe oraz zbiory danych dotyczących odpowiedzi na leczenie.

Kluczowe dla powtarzalności są kilka etapów przepływu pracy, w tym spójny preprocessing danych TCGA-BRCA, grupowanie MPO-high/MPO-low oparte na medianie wyłącznie z próbek nowotworowych, zdefiniowane progi statystyczne i korekta wielokrotnego testowania, algorytmy wzbogacania komórek odpornościowych oraz zestawy sygnatur, kontrola jakości i adnotacja pojedynczych komórek, rozszerzanie sąsiedztwa MPO w oparciu o KNN, a także eksploracyjne przetwarzanie wyników wirtualnego knockdownu oraz bazy DGIdb/ADMET. Zmiany w tych parametrach mogą wpłynąć na późniejsze wyniki i ich interpretację, dlatego powinny być one starannie raportowane i odtwarzane. W przypadku rozwiązywania problemów, niespójne wyniki należy analizować poprzez sprawdzenie źródła próbek, normalizacji ekspresji, progu grupowania, korekty wielokrotnego testowania, zestawów sygnatur komórek odpornościowych, kontroli jakości i adnotacji pojedynczych komórek, definicji sąsiedztwa KNN, progów wirtualnego knockdownu, progów wzbogacenia oraz heterogenicznych rekordów związków w DGIdb/ADMET.

Należy zwrócić uwagę na kilka ograniczeń niniejszego badania. Po pierwsze, badanie to oparto na retrospektywnych analizach publicznych baz danych z wykorzystaniem TCGA-BRCA oraz ogólnodostępnych danych z pojedynczych komórek, w związku z czym mogło ono zostać objęte wpływem heterogeniczności kohorty, różnic w źródłach próbek, efektów seryjnych (batch effects), niepełnej adnotacji klinicznej oraz różnic w składzie guza. Po drugie, obecne wyniki wynikają głównie z powiązań transkrypcyjnych i analiz in silico i brakuje im bezpośredniej walidacji eksperymentalnej. W związku z tym zaobserwowane korelacje między ekspresją MPO, cechami odpornościowymi/mieloidalnymi, adnotacjami metylacji, potencjalnymi czynnikami transkrypcyjnymi i wynikami wirtualnego wyciszenia genów nie powinny być interpretowane jako mechanizmy przyczynowe. Po trzecie, detekcja MPO w zbiorze danych z pojedynczych komórek była rzadka – przed rozszerzeniem sąsiedztwa w oparciu o algorytm KNN wykryto jedynie 85 komórek wykazujących pozytywny wynik dla MPO. Rozszerzony podzbiór sąsiedztwa MPO może zawierać komórki o niskiej lub niewykrywalnej ekspresji MPO i nie powinien być uważany za czystą populację MPO-dodatnią. Po czwarte, ponieważ MPO jest przede wszystkim związane z neutrofilami i innymi komórkami linii mieloidalnej, sygnały związane z MPO w danych bulk RNA-seq mogą być zaburzone przez obfitość komórek odpornościowych, czystość guza i skład komórkowy, zamiast odzwierciedlać aktywność wewnętrzną komórek nowotworowych. Wreszcie, wyszukiwanie leków i genów w bazie DGIdb oraz adnotacje ADMET miały charakter wyłącznie eksploracyjnych adnotacji chemicznych. Wyniki te nie potwierdzają inhibicji MPO, wiązania z celem, selektywności, bezpieczeństwa, skuteczności terapeutycznej ani przydatności klinicznej. Przyszłe badania z wykorzystaniem niezależnych kohort, walidacji przestrzennej lub na poziomie białka oraz eksperymentów funkcjonalnych są niezbędne do potwierdzenia znaczenia biologicznego i klinicznego tych odkryć.

Podsumowując, przeprowadzone analizy publicznych zbiorów danych wspierają istnienie związku między ekspresją MPO a transkrypcyjnymi cechami immunologicznymi i mieloidalnymi w raku piersi, przy czym wyższa ekspresja MPO wiąże się z dłuższym czasem wolnym od progresji w analizowanej kohorcie. Wyniki te mają charakter wstępny i służą do formułowania hipotez. Nie dowodzą one, że MPO przyczynowo reguluje immunologiczne mikrośrodowisko guza, że MYC funkcjonalnie reguluje MPO ani że zidentyfikowane związki mają znaczenie terapeutyczne. Głównym wkładem niniejszego badania jest powtarzalny schemat obliczeniowy oraz zestaw weryfikowalnych hipotez, które wymagają walidacji na zewnętrznych kohortach oraz potwierdzenia eksperymentalnego.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają konfliktów interesów w niniejszej pracy. Narzędzie do edycji językowej oparte na sztucznej inteligencji zostało wykorzystane wyłącznie w celu poprawy stylu i czytelności języka angielskiego podczas rewizji manuskryptu. Narzędzie nie było wykorzystywane do projektowania badania, analizy danych, generowania rycin, interpretacji wyników, wyboru referencji ani wyciągania wniosków naukowych. Wszystkie analizy, wyniki, interpretacje, referencje oraz ostateczny tekst zostały starannie sprawdzone, zweryfikowane i zatwierdzone przez autorów, którzy biorą pełną odpowiedzialność za treść manuskryptu.

Podziękowania

Autorzy wyrażają wdzięczność za wsparcie finansowe z Funduszu Badań Naukowych Szpitala Centrum Lotnictwa i Kosmonautyki (YN202530).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CellChatPakiet R/Open sourcehttps://github.com/sqjin/CellChatAnaliza komunikacji międzykomórkowej
ChIP-AtlasPubliczna baza danychhttps://chip-atlas.org/Przesiewanie celów TF; aktualizacja z 2021 r. 
clusterProfilerBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/Analiza wzbogacenia GO/KEGG; v4.4.4
CytoscapeCytoscape Consortiumhttps://cytoscape.org/Wizualizacja sieci i analiza topologii
DGIdbWashington University/Publiczna baza danychhttps://www.dgidb.org/Wyszukiwanie interakcji lek-gen
GDC/TCGA-BRCANational Cancer Institutehttps://portal.gdc.cancer.gov/Źródło danych klinicznych i transkrypcyjnych typu bulk
Gene Expression Omnibus: GSE161529NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/Źródło zbioru danych single-cell
GSEA/MSigDBBroad Institutehttps://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdbAnaliza wzbogacenia zbiorów genów i referencyjny zbiór genów; wersja 3.0 
GSVABioconductorhttps://bioconductor.org/packages/GSVA/Punktacja wariacji zbiorów genów/powiązana z ssGSEA; wersja 1.46.0
GTRDPubliczna baza danychhttp://gtrd.biouml.org/Przesiewanie celów TF; 2021 
KnockTFPubliczna baza danychhttp://www.licpathway.net/KnockTF/index.htmlZasób perturbacji TF; wersja 2.0 
RR Foundation for Statistical Computinghttps://www.r-project.org/Środowisko obliczeń statystycznych
scTenifoldKnkPakiet R/Open sourcehttps://github.com/cailab-tamu/scTenifoldKnkAnaliza wirtualnego nokdaunu
SeuratPakiet R/Open sourcehttps://satijalab.org/seurat/Preprocessing i klasteryzacja danych single-cell
STRINGELIXIR/Publiczna baza danychhttps://string-db.org/Analiza oddziaływań białko-białko; v11 
SwissADMESIB Swiss Institute of Bioinformaticshttp://www.swissadme.ch/Ocena podobieństwa do leku; wersja z 2017 r./narzędzie webowe 
TIMERPubliczny zasób internetowyhttps://timer.cistrome.org/Analiza infiltracji immunologicznej; TIMER2.0 
UCSC Xena lub powiązany portal TCGAUCSChttps://xenabrowser.net/Eksploracyjny dostęp do danych/walidacja 

Bibliografia

  1. Onkar SS, et al. The great immune escape: Understanding the divergent immune response in breast cancer subtypes. Cancer Discov. 2023;13(1):23-40.
  2. Quail DF, Park M, Welm AL, Ekiz HA. Breast cancer immunity: It is time for the next chapter. Cold Spring Harb Perspect Med. 2024;14(2):a041324.
  3. Valadez-Cosmes P, Raftopoulou S, Mihalic ZN, Marsche G, Kargl J. Myeloperoxidase: Growing importance in cancer pathogenesis and potential drug target. Pharmacol Ther. 2022;236:108052.
  4. Ohshima H, Tatemichi M, Sawa T. Chemical basis of inflammation-induced carcinogenesis. Arch Biochem Biophys. 2003;417(1):3-11.
  5. Davies MJ, Hawkins CL. The role of myeloperoxidase in biomolecule modification, chronic inflammation, and disease. Antioxid Redox Signal. 2020;32(13):957-981.
  6. Gomez-Mejiba SE, et al. Myeloperoxidase-induced genomic DNA-centered radicals. J Biol Chem. 2010;285(26):20062-20071.
  7. Eruslanov EB, et al. Tumor-associated neutrophils stimulate T cell responses in early-stage human lung cancer. J Clin Invest. 2014;124(12):5466-5480.
  8. Däster S, et al. Absence of myeloperoxidase and CD8 positive cells in colorectal cancer infiltrates identifies patients with severe prognosis. Oncoimmunology. 2015;4(12):e1050574.
  9. Droeser RA, et al. High myeloperoxidase positive cell infiltration in colorectal cancer is an independent favorable prognostic factor. PLoS One. 2013;8(5):e64814.
  10. Gerber-Ferder Y, et al. Breast cancer remotely imposes a myeloid bias on haematopoietic stem cells by reprogramming the bone marrow niche. Nat Cell Biol. 2023;25(12):1736-1745.
  11. Xu H, et al. Single-cell transcriptomics reveals CCL3+ classical monocyte subset linked to autoimmune pathogenesis. J Inflamm Res. 2025;18:16273-16291.
  12. Jiahao S, Cong W, Xin L, Xu C, Wenpeng X, et al. BCAT1 mediates the carcinogenic effects of environmental bisphenol exposure: mechanistic discoveries in osteosarcoma and pan-cancer analysis. Mol Divers. 2026. doi:10.1007/s11030-026-11566-7.
  13. Huo Z, Sun W, Lou C, Yang T. Integrated single-cell and spatial mapping coupled with machine learning unveils core stemness landscapes and regulatory drivers in triple-negative breast cancer. Discov Oncol. 2026;17(1):602.
  14. Das SC, et al. Comprehensive bioinformatics and machine learning analyses for breast cancer staging using TCGA dataset. Brief Bioinform. 2024;26(1):bbae628.
  15. Szklarczyk D, et al. STRING v11: protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D607-D613.
  16. Yu G, Wang LG, Han Y, He QY. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284-287.
  17. Ashburner M, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 2000;25(1):25-29.
  18. Kanehisa M, Goto S. KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 2000;28(1):27-30.
  19. Chen GY, et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of gubitong recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022;2022:7858925.
  20. Chen GY, et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:5233462.
  21. Liberzon A, et al. Molecular signatures database MSigDB 3.0. Bioinformatics. 2011;27(12):1739-1740.
  22. Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545-15550.
  23. Li B, et al. Comprehensive analyses of tumor immunity: implications for cancer immunotherapy. Genome Biol. 2016;17(1):174.
  24. Li T, et al. TIMER: A web server for comprehensive analysis of tumor-infiltrating immune cells. Cancer Res. 2017;77(21):e108-e110.
  25. Li T, et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 2020;48(W1):W509-W514.
  26. Hänzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 2013;14:7.
  27. Modhukur V, et al. MethSurv: a web tool to perform multivariable survival analysis using DNA methylation data. Epigenomics. 2018;10(3):277-288.
  28. Feng C, et al. KnockTF: a comprehensive human gene expression profile database with knockdown/knockout of transcription factors. Nucleic Acids Res. 2020;48(D1):D93-D100.
  29. Feng C, et al. KnockTF 2.0: a comprehensive gene expression profile database with knockdown/knockout of transcription co-factors in multiple species. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D183-D193.
  30. Oki S, et al. ChIP-Atlas: a data-mining suite powered by full integration of public ChIP-seq data. EMBO Rep. 2018;19(12):e46255.
  31. Zou Z, Ohta T, Miura F, Oki S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Res. 2022;50(W1):W175-W182.
  32. Kolmykov S, et al. GTRD: an integrated view of transcription regulation. Nucleic Acids Res. 2021;49(D1):D104-D111.
  33. Yevshin I, Sharipov R, Kolmykov S, Kondrakhin Y, Kolpakov F. GTRD: a database on gene transcription regulation—2019 update. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D100-D105.
  34. Tang D, et al. SRplot: A free online platform for data visualization and graphing. PLoS One. 2023;18(11):e0294236.
  35. Wang Y, et al. Immunological profiling of rheumatoid factor-positive primary Sjögren's syndrome by single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 2026;17:1822615.
  36. Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissADME: a free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 2017;7:42717.
  37. Lin W, Chen H, Chen X, Guo C. The roles of neutrophil-derived myeloperoxidase MPO in diseases: The new progress. Antioxidants. 2024;13(1):132.
  38. Odobasic D, et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 2013;121(20):4195-4204.
  39. Zeindler J, et al. Infiltration by myeloperoxidase-positive neutrophils is an independent prognostic factor in breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2019;177(3):581-589.
  40. Osorio D, et al. scTenifoldKnk: An efficient virtual knockout tool for gene function predictions via single-cell gene regulatory network perturbation. Patterns. 2022;3(3):100434.
  41. Li X, Tang L, Li Z, Qiu D, Yang Z, et al. Prediction of ADMET properties of anti-breast cancer compounds using three machine learning algorithms. Molecules. 2023;28(5):2326.
  42. Scandolara TB, et al. Anti-neutrophil antibodies anti-MPO-ANCAs are associated with poor prognosis in breast cancer patients. Immunobiology. 2020;225(6):152011.
  43. Gilbert J, Gore SD, Herman JG, Carducci MA. The clinical application of targeting cancer through histone acetylation and hypomethylation. Clin Cancer Res. 2004;10(14):4589-4596.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza pojedynczych kom rekprzep yw pracy bioinformatycznejinfiltracja immunologicznaTCGA BRCAcechy mieloidalnedekonwolucja immunologicznainterakcja lek gen

Powiązane artykuły