Zsyntetyzowano serię pochodnych octamidu opartych na triazolu i oksydazolu oraz oceniono je jako inhibitory ureazy i α-glukozydazy. Związek 8c wykazał najsilniejszą inhibicję ureazy, podczas gdy 9e przewyższał akarbozę w przypadku α-glukozydazy. Wiązanie BSA i badania in silico potwierdziły ich właściwości przypominające leki, identyfikując oba związki jako obiecujące kandydatki do prowadzenia.
Artykuł badawczy
Synteza, Ocena biologiczna i in Silico Badania nowych acet amidów na bazie triazolu i oksadiazolu jako inhibitorów ureazy i α-Glukozydazy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
To badanie zbadano terapeutyczny potencjał nowych pochodnych acetamido-1,2,4-triazolu i 1,3,4-oksadiazolu jako dwukierunkowych inhibitorów ureazy i α-glukozydazy, dwóch enzymów zaangażowanych odpowiednio w zaburzenia żołądkowo-jelitowe i cukrzycę typu 2. Zastosowano zintegrowane podejście łączące wieloetapowy syntezę organiczną, in vitro ocenę biologiczną, dokowanie molekularne, in silico przewidywanie ADME i analizę DFT (teoria funkcjonału gęstości). Wyjściowo od kwasu benzoesowego, udało się syntetyzować szereg pochodnych 1,2,4-triazolu (8a–c) i 1,3,4-oksadiazolu (9d–f) zawierających podstawione grupy acetaminowe. Wszystkie związki wykazywały aktywność inhibitory wobec obu enzymów. Związek 8c był najsilniejszym inhibitorem ureazy (IC₅₀ = 6,14 ± 1,06 µM), podczas gdy związek 9e wykazywał najsilniejszą inhibicję α-glukozydazy (IC₅₀ = 27,29 ± 0,41 µM), przewyższając inhibitor referencyjny akarbozę (IC₅₀ = 38,25 ± 0,12 µM). Analizy komputerowe potwierdziły wyniki eksperymentalne: przewidywania ADME wskazywały na korzystne właściwości podobne do leków, a dokowanie molekularne wykazało silne interakcje wiązania, przy czym związek 8a wykazywał najwyższą afininość do α-glukozydazy (−7,165 kcal/mol), a związek 9e wykazywał najsilniejsze wiązanie z ureazą (−7,30 kcal/mol). Obliczenia DFT dodatkowo korelują aktywność biologiczną z właściwościami elektronicznymi, ujawniając stosunkowo małe przerwy energetyczne HOMO–LUMO dla najbardziej aktywnych związków, 8c (0,14831 a.u.) i 9e (0,14302 a.u.). Łącznie, te odkrycia identyfikują związki 8c i 9e jako obiecujące szkielety w prowadzeniu nowej generacji inhibitorów ureazy i α-glukozydazy.
Wprowadzenie
Fragmenty heterocykliczne były wcześniej opisywane w wielu istniejących lekach, a heterocykle stanowią ważną klasę inhibitorów enzymów stosowanych w leczeniu chorób metabolicznych i zakaźnych1․ Wśród heterocykli‚ 1‚3‚4-oksadyazole są jednym z najbardziej badanych szkieletów w odkrywaniu leków i zostały opisane jako wirusobójcze‚ antybakteryjne‚ przeciwnowotworowe‚ hipotensyjne‚ neuroprotekcyjne‚ przeciwdrgawkowe i przeciwgruźlicze środki2,3,4,5․ Podobnie‚ pochodne 1‚2‚4-triazolu również wykazują działanie przeciwdrgawkowe‚ antybakteryjne‚ przeciwwirusowe‚ przeciwgruźlicze‚ przeciwcukrzycowe‚ przeciwzapalne‚ przeciwrozrostowe‚ przeciwutleniające‚ przeciwmalaryczne‚ i inhibitorowe działanie ureazy6,7․ Związki zawierające acetamid mają silny profil farmakologiczny i były stosowane jako syntetyczne pośredniki w chemii heterocyklicznej, jak również jako środki przeciwcukrzycowe, przeciwzakrzepowe i chemosensybilizujące, co czyni je atrakcyjnymi strukturami wiodącymi w odkrywaniu leków8,9․
Znaczące wysiłki zostały skierowane na opracowanie wielocelowych inhibitorów α-glukozydazy i ureazy. Hamowanie α-glukozydazy opóźnia trawienie węglowodanów i wchłanianie glukozy, obniżając tym samym stężenie glukozy we krwi po posiłku u pacjentów z cukrzycą typu 2. Obecne inhibitory, takie jak akarboza, są skuteczne, ale są związane z działaniami niepożądanymi ze strony układu pokarmowego‚ co stwarza potrzebę strukturalnie różnorodnych inhibitorów10,11․ Ureaza rozkłada mocznika na amoniak i dwutlenek węgla․ Reakcja umożliwia bakterii Helicobacter pylori‚ która powoduje wrzody i zwiększa podatność organizmu na raka żołądka‚ przetrwanie w żołądku, dlatego ureaza jest ważnym celem w rozwoju leków przeciwwrzodowych․ Celem terapeutycznym jest opracowanie nowych inhibitorów dla obu enzymów9,12․
Jednakże‚ pomimo dostępnych badań badania nad szkieletami 1‚2‚4-triazolu i 1‚3‚4-oksadyazolu, bardzo niewiele badań dotyczyło pochodnych acetamidu 1‚2‚4-triazolu i 1‚3‚4-oksadyazolu zawierających grupę tieter jako dwóch α-glukozydaz i inhibitorów ureazy13․ Ich zachowanie wiążące się z białkami i charakterystyka obliczeniowa również zyskały ograniczoną uwagę w tym kontekście․ W niniejszym artykule zaproponowaliśmy, że połączenie fragmentów triazolu lub oksadyazolu i zastępowanych acetamidów w tym samym szkielecie molekularnym przyniosłoby satysfakcjonujący profil hamowania enzymów z przyjętymi właściwościami fizykochemicznymi․
Aby przetestować tę hipotezę, syntetyzowano i oceniono szereg pochodnych acetamidu na bazie 1,2,4-triazolu (8a–c) oraz pochodnych acetamidu na bazie 1,3,4-oksadyazolu (9d–f) na ich aktywność inhibitorową wobec α-glukozydazy i ureazy. Wiązanie najbardziej aktywnych związków (8a, 8c i 9e) z białkiem surowicy wołowej (BSA) badano za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej, oznaczania stałej wiązania i analizy termodynamicznej. Ponadto przeprowadzono dokowanie molekularne, predykcje ADME i obliczenia teorii funkcjonału gęstości (DFT) w celu zbadania ich trybów wiązania, właściwości farmakokinetycznych i charakterystyk elektronicznych.
Protokół
Wszystkie odczynniki posiadały czystość analityczną i były stosowane bez dalszego oczyszczania. Postęp reakcji monitorowano za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na żelu krzemionkowym, wykorzystując układ n-heksan/octan etylu (7:3–6:4, v/v), a plamy wizualizowano w świetle ultrafioletowym. O ile nie wskazano inaczej, wszystkie reakcje przeprowadzano w atmosferze otoczenia. Zsyntetyzowane związki scharakteryzowano za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) oraz spektroskopii NMR 1H i 13C. Widma NMR 1H i 13C zarejestrowano w CDCl₃ odpowiednio przy 600 MHz i 150 MHz, a przesunięcia chemiczne podano w ppm względem sygnału pozostałego rozpuszczalnika. Ścieżka syntetyczna przedstawiona jest na Rysunku 1. Pełne dane charakterystyki fizykochemicznej wszystkich zsyntetyzowanych związków znajdują się w Pliku uzupełniającym 1.
Synteza benzoesyanu etylu (1)
Kwas benzoesowy (50 g, 0.41 mol) umieszczono w kolbie okrągłodennej o pojemności 500 mL i dodano etanol bezwodny (150 mL). Stężony kwas siarkowy (6 mL) dodawano kroplami jako katalizator przy ciągłym mieszaniu magnetycznym. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia przy 78 °C przez 4–6 h, stosując chłodnicę wodną. Postęp reakcji monitorowano za pomocą TLC. Po zakończeniu reakcji mieszaninę schłodzono do temperatury pokojowej i zneutralizowano nasyconym wodnym roztworem węglanu sodu, aż pH osiągnęło wartość 7–8. Mieszaninę reakcyjną przeniesiono do rozdzielacza, a warstwę organiczną oddzielono, przemyto wodą destylowaną i osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu. Po przefiltrowaniu benzoesan etylu (1) wykorzystano bezpośrednio w kolejnym etapie bez dalszego oczyszczania (Rysunek 1).
Synteza benzohydrazidu (2)
Benzoesan etylu (1; 0,41 mol) rozpuszczono w bezwodnym etanolu (100 mL), a następnie przy ciągłym mieszaniu dodano hydrat hydrazyny (80%, 25 mL, nadmiar). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia przy 78 °C przez 4–5 h na powietrzu, stosując chłodnicę wodną. Przebieg reakcji monitorowano metodą TLC. Po zakończeniu procesu biały krystaliczny osad benzohydrazidu (2) oddzielono przez filtrację, przemyto zimnym etanolem, suszono do stałej masy w temperaturze pokojowej i wykorzystano w kolejnych etapach syntezy (Rysunek 1).
Synteza 5-fenylo-1,3,4-oksadiazolo-2-tiolu (3)
Benzohydrazyd (2; 10 g, 0.073 mol) oraz wodorotlenek potasu (4,12 g, 0.073 mol) umieszczono w kolbie okrągłodennej o pojemności 250 mL zawierającej etanol (30 mL). Mieszaninę ogrzewano w warunkach refluksu w temperaturze 78 °C przez 10 min, stosując chłodnicę wodną. Następnie dodano dwusiarczek węgla (CS₂; 5 mL, 0.083 mol) i kontynuowano refluks przez kolejne 3–4 h. Postęp reakcji monitorowano za pomocą TLC. Po zakończeniu reakcji mieszaninę przeniesiono do wody destylowanej i ogrzewano przy ciągłym mieszaniu. Kroplami dodawano rozcieńczony kwas solny, aż do osiągnięcia pH 5, co doprowadziło do wytrącenia związku (3) (Rysunek 1). Osad zebrano poprzez filtrację, dokładnie przemyto zimną wodą destylowaną, wysuszono do stałej masy i zważono w celu określenia wydajności. Związek scharakteryzowano za pomocą spektroskopii FTIR, 1H NMR oraz 13C NMR.
Synteza 4,5-difenylo-4H-1,2,4-triazolo-3-tiolu (4)
Benzohydrazyd (2; 5 g, 0.037 mol) oraz izotiocyjanian fenylu (4 mL, 0.037 mol) umieszczono w kolbie okrągłodennej o pojemności 100 mL wyposażonej w chłodnicę wodną. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia przy 78 °C do czasu całkowitego utworzenia produktu pośredniego w postaci tiosemikarbazydy, co potwierdzono za pomocą TLC w układzie n-heksan/octan etylu (7:3, v/v). Następnie dodano wodorotlenek potasu (2 g, 0.036 mol) rozpuszczony w etanolu (20 mL) i kontynuowano ogrzewanie w temperaturze wrzenia do momentu powstania związku (4), co potwierdzono metodą TLC. Mieszaninę reakcyjną przeniesiono do wody destylowanej, ogrzewano przy ciągłym mieszaniu, a następnie zakwaszono rozcieńczonym kwasem solnym do pH 5, aby wytrącić związek (4) (Rysunek 1). Osad zebrano poprzez filtrację, dokładnie przemyto zimną wodą destylowaną, suszono do stałej masy i scharakteryzowano za pomocą spektroskopii FTIR, 1H NMR oraz 13C NMR.
Synteza produktów pośrednich bromoacetamidu 7(a–f)
Każdą z podstawionych pochodnych aniliny 5(a–f) (1 ekwiwalent) rozpuszczono w chloroformie i schłodzono w łaźni lodowej, aby utrzymać temperaturę reakcji w zakresie 0–5 °C. Bromek bromoacetylu (6, ≥98%, 1 ekwiwalent) dodawano kroplami przy ciągłym mieszaniu. W trakcie reakcji, w razie potrzeby, dodawano 18% wodny roztwór węglanu sodu, aby utrzymać pH reakcji między 9 a 10 poprzez neutralizację powstającego bromowodoru. Po zakończeniu dodawania bromku bromoacetylu pozwolono mieszaninie reakcyjnej ogrzać się do temperatury pokojowej i mieszano ją do momentu, gdy analiza TLC potwierdziła całkowite zużycie substratu wyjściowego. Powstałe półprodukty bromoacetamidowe 7(a–f) zebrano przez filtrowanie, przemyto zimną wodą destylowaną, wysuszono do stałej masy i wykorzystano bezpośrednio w kolejnym etapie syntezy bez dalszego oczyszczania (Rycina 1).
Synteza pochodnych acetamidu opartych na triazolu 8(a–c)
Pochodną triazolu (4; 0,5 g, 0,002 mol) rozpuszczono w N, N-dimetyloformamidzie (10 mL) w kolbie okrągłodennej o pojemności 50 mL. Przy ciągłym mieszaniu dodano odpowiedni produkt pośredni w postaci bromoacetamidu (7a, 7b lub 7c; 0,002 mol, 1 ekwiwalent), a następnie wodorek sodu (0,05 g, 0,002 mol) w celu przeprowadzenia S-alkilacji. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 24–48 h, monitorując postęp reakcji za pomocą TLC. Po zakończeniu reakcji mieszaninę wylano do lodowatej wody, aby wywołać wytrącanie. Osad zebrano poprzez filtrację, dokładnie przemyto zimną wodą, wysuszono i scharakteryzowano za pomocą spektroskopii FTIR, 1H NMR oraz 13C NMR (Rysunek 1).
Synteza pochodnych acetamidu opartych na oksadiazolu 9(d–f)
Pochodną oksadiazolu (3; 0,5 g, 0,002 mol) rozpuszczono w N, N-dimetyloformamidzie (10 mL) w kolbie okrągłodennej o pojemności 50 mL. Następnie dodano odpowiedni produkt pośredni w postaci bromoacetamidu, 7d, 7e lub 7f (0,002 mol, 1 ekwiwalent), a następnie wodorek sodu (0,05 g, 0,002 mol), aby ułatwić S-alkilację. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 24–48 h, monitorując postęp reakcji za pomocą TLC. Po zakończeniu reakcji mieszaninę wylano do lodowatej wody w celu wytrącenia produktu. Osad zebrano przez filtrację, dokładnie przemyto zimną wodą, wysuszono i scharakteryzowano za pomocą spektroskopii FTIR, 1H NMR oraz 13C NMR (Rycina 1).
Test hamowania α-glukozydazy
Aktywność inhibicyjną α-glukozydazy oceniono poprzez zmieszanie 50 µL roztworu badanej próbki z 100 µL roztworu α-glukozydazy (0,35 U/mL) przygotowanego w buforze fosforanowym (pH 6,8). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 37 °C przez 10 min, a następnie dodano 100 µL p-nitrofenylo-α-D-glukopiranozyd w stężeniu 1,5 mM jako substrat. Po dalszej inkubacji w temperaturze 37 °C przez 20 min reakcję przerwano poprzez dodanie 1 mL 1 M węglanu sodu (Na₂CO₃). Absorbancję zmierzono przy 400 nm14. Jako kontrolę pozytywną zastosowano akarbozę. Mieszanina reakcyjna bez związku badanego służyła jako kontrola negatywna, natomiast mieszanina reakcyjna bez enzymu została użyta jako próba ślepa.
Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a wyniki przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD). Procentowe zahamowanie aktywności α-glukozydazy obliczono za pomocą następującego równania(1)14:
(1)
gdzie As oznacza absorbancję roztworu próbki badawczej, Ab absorbancję ślepej próby odczynnika (bez α-glukozydazy), a A0 absorbancję kontroli negatywnej (bez próbki). Wartości IC50 określono poprzez badanie stężeń związków w zakresie od 3.125 do 100 µM. Analizę regresji nieliniowej przeprowadzono przy użyciu standardowego oprogramowania graficznego.
Test inhibicji ureazy
Aktywność inhibicyjną ureazy określono przy użyciu zmodyfikowanej metody Berthelota. Mieszanina reakcyjna składała się z 300 µL roztworu badanej próbki, 200 µL roztworu ureazy z bobu (jack bean) oraz 200 µL 25 mM mocznika. Mieszaninę inkubowano w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 min. Po inkubacji dodano 500 µL roztworu barwnego zawierającego 10 g/L fenolu i 50 g/L nitroprusyku sodu, a następnie 500 µL drugiego roztworu zawierającego 5% (v/v) podchlorynu sodu i 5 g/L wodorotlenku sodu. Mieszaninę reakcyjną inkubowano przez kolejne 15–30 min w celu wywołania barwy.
Absorbancję roztworu mierzono przy 625 nm względem ślepej próby odczynnikowej15. Jako kontrolę pozytywną wykorzystano tiomocznik, jako kontrolę negatywną mieszaninę reakcyjną bez związku testowanego, a jako próbę ślepą mieszaninę bez enzymu ureazy. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach (n = 3), a wyniki przedstawiono jako wartości średnie ± odchylenie standardowe (S.D.). Procent hamowania obliczono przy użyciu następującego wzoru matematycznego (2)15:
(2)
gdzie A0 to absorbancja kontroli (bez inhibitora), a As to absorbancja próbki badanej (z inhibitorem). Wykreślanie oraz analiza regresji nieliniowej w celu wyznaczenia wartości IC50 zostały przeprowadzone przy użyciu standardowego oprogramowania do analizy danych.
Test wiązania BSA
Oddziaływania wiążące między albuminą surowicy bydlęcej (BSA) a zsyntetyzowanymi związkami badano za pomocą spektroskopii wygaszania fluorescencji. Roztwór zapasowy BSA o stężeniu 10 µM przygotowano w 20 mM buforze fosforanowym (pH 7.4). Dla każdego eksperymentu miareczkowania 1,0 mL roztworu BSA zmieszano z 2,0 mL buforu fosforanowego w kuwecie kwarcowej. Roztwór miareczkowano poprzez sukcesywne dodawanie 5 µL alikwotów badanego związku (1,5 mM w metanolu). Widma emisji fluorescencji rejestrowano w zakresie długości fal 300–400 nm po wzbudzeniu przy 295 nm, przy czym maksimum emisji obserwowano przy około 336 nm. Pomiary fluorescencji przeprowadzono przy użyciu spektrofluorometru wyposażonego w standardowe oprogramowanie do akwizycji fluorescencji, z szerokością szczelin wzbudzenia i emisji ustawioną odpowiednio na 10 nm i 2,5 nm. W celu wyznaczenia parametrów termodynamicznych wiązania, w tym energii swobodnej Gibbsa (ΔG), entalpii (ΔH) i entropii (ΔS), eksperymenty miareczkowania powtórzono w temperaturach 298, 308 i 313 K.
W celu zbadania mechanizmu wygaszania fluorescencji dane eksperymentalne przeanalizowano przy użyciu równania Sterna–Volmera (Równanie 3)16:
(3)
gdzie F0 oraz F reprezentują odpowiednio intensywności fluorescencji BSA w obecności i w nieobecności wygaszacza; Kq to bimolekularna stała szybkości wygaszania; τ0 to średni czas życia BSA w nieobecności wygaszacza; KSV to stała wygaszania Sterna-Volmera; a [Q] to stężenie wygaszacza. Stałą wiązania (Kb) oraz liczbę miejsc wiązania (n) określono następnie poprzez wykreślenie podwójnego logarytmu zgodnie z równaniem (4)16:
(4)
Ponadto, standardową zmianę energii swobodnej Gibbsa (ΔG°), standardową zmianę entalpii (ΔH°) oraz standardową zmianę entropii (ΔS°), które determinują oddziaływanie wiązania, obliczono z wykorzystaniem zależności Van't Hoffa i Gibbsa-Helmholtza przedstawionych w równaniach (5) i (6)17:
ΔG∘ = -RT ln Kb (5)
(6)
gdzie R to uniwersalna stała gazowa, a T to temperatura bezwzględna w Kelvinach.
Dokowanie molekularne
Wszystkie symulacje modelowania molekularnego i dokowania przeprowadzono przy użyciu pakietu Schrödinger Suite (interfejs Maestro), a samo dokowanie wykonano za pomocą modułu Glide. Struktury krystaliczne α-glukozydazy (PDB ID: 5NN8) oraz ureazy (PDB ID: 4H9M) pobrano z RCSB Protein Data Bank. Struktury białek przygotowano za pomocą narzędzia Protein Preparation Wizard poprzez usunięcie współkrystalizowanych ligandów, cząsteczek wody oraz nieistotnych heteroatomów, uzupełnienie brakujących reszt i pętli, przypisanie prawidłowych rzędów wiązań oraz dodanie polarnych atomów wodoru. Stany protonowania i tautomerii przypisano dla fizjologicznego pH (7,0 ± 2,0) przy użyciu modułu Epik. Przygotowane struktury białek poddano następnie ograniczonej minimalizacji energii z wykorzystaniem pola siłowego OPLS w celu wyeliminowania kolizji sterycznych.
Struktury dwuwymiarowe związków 3, 4, 8(a–c) oraz 9(d–f), wraz z inhibitorami referencyjnymi: akarbozą i tiomocznikiem, zostały przygotowane przy użyciu modułu LigPrep. Zoptymalizowano rzędy wiązań, stereochemię oraz stany jonizacji w fizjologicznym pH, a otrzymane trójwymiarowe konformacje ligandów poddano minimalizacji energii z wykorzystaniem pola siłowego OPLS.
Siatki receptorów zostały wygenerowane za pomocą narzędzia Receptor Grid Generation, przy czym ramki siatek wycentrowano na kokrystalizowanych ligandach natywnych w celu zdefiniowania centrów aktywnych. Wymiary ramki siatki ustawiono na 25 × 25 × 25 Å dla obu białek. Siatka ureazy została wycentrowana w punkcie x = −38.76, y = −44.14 i z = 66.88, natomiast siatka α-glukozydazy została wycentrowana w punkcie x = 21.14, y = −7.56 i z = 24.37.
Obliczenia dokowania przeprowadzono w trybie extra-precision (XP) programu Glide z zastosowaniem próbkowania elastycznego ligandu. Dla każdego ligandu wygenerowano wiele poz kompleksu, a do dalszej analizy wybrano pozę z najniższą wartością Glide docking score. Protokół dokowania zwalidowano poprzez redokowanie ligandów kokrystalizowanych do ich odpowiednich siatek receptorowych. Wartości RMSD ≤2.0 Å potwierdziły wiarygodność i powtarzalność protokołu dokowania.
Konformacje wiązania zadokowanych kompleksów wizualizowano za pomocą programu PyMOL (wersja 3.1)18. Oddziaływania białko–ligand, w tym wiązania wodorowe, kontakty hydrofobowe i oddziaływania elektrostatyczne, analizowano przy użyciu programu Discovery Studio Visualizer19.
Analiza w ramach teorii funkcjonału gęstości (DFT)
Wszystkie obliczenia w ramach teorii funkcjonału gęstości (DFT) przeprowadzono przy użyciu programu Gaussian 09, a zoptymalizowane geometrie cząsteczek oraz molekularne orbitale graniczne zwizualizowano za pomocą programu GaussView 5. Zsyntetyzowane pochodne acetamidu oparte na triazolu i oksadiazolu, 8(a–c) oraz 9(d–f), poddano optymalizacji geometrii w fazie wodnej z wykorzystaniem hybrydowego funkcjonału Becke’a trzechparametrowego Lee–Yang–Parr (B3LYP) w połączeniu z bazą funkcyjną 6-311+G(d,p)20. Efekty rozpuszczalnika uwzględniono, stosując model polaryzowalnego kontinuum typu przewodzącego (CPCM)21. Następnie przeprowadzono obliczenia częstotliwości wibracyjnych na tym samym poziomie teorii, aby potwierdzić, że wszystkie zoptymalizowane struktury odpowiadają rzeczywistym minimom lokalnym na powierzchni energii potencjalnej, o czym świadczy brak częstotliwości urojonych.
Aby zrozumieć przejścia elektronowe i stabilność kinetyczną zsyntetyzowanych związków, obliczono energie najwyższego zajętego orbitalu molekularnego (EHOMO) oraz najniższego niezajętego orbitalu molekularnego (ELUMO). Dla każdego pochodnego wyznaczono przerwę energetyczną orbitali molekularnych granicznych (ΔE = ELUMO - EHOMO) w celu oceny jego reaktywności chemicznej i stabilności kinetycznej, przy czym mniejsza przerwa energetyczna wskazuje na wyższą reaktywność.
Ponadto, globalne deskryptory reaktywności chemicznej — w tym twardość chemiczna (η), miękkość (S), potencjał chemiczny (μ), elektroujemność (X) oraz indeks elektrofilowości (w) — zostały obliczone z energii orbitali granicznych przy użyciu następujących standardowych równań operacyjnych22:
(7)
(8)
(9)
(10)
Obliczone właściwości elektroniczne oraz deskryptory globalne zostały systematycznie porównane w całej serii w celu ustalenia zależności struktura-aktywność (SAR), które odzwierciedlają zaobserwowane profile hamowania α-glukozydazy i ureazy.
Dodatkowo, przy użyciu programu VESTA wygenerowano i zwizualizowano mapy potencjału elektrostatycznego cząsteczek (MESP), aby przedstawić rozkład ładunku w zoptymalizowanych strukturach molekularnych. Powierzchnie MESP pozwoliły na zidentyfikowanie obszarów elektrofilowych (ubogich w elektrony, sprzyjających atakowi nukleofilowemu) oraz nukleofilowych (bogatych w elektrony, sprzyjających atakowi elektrofilowemu). Rozkład potencjału elektrostatycznego skorelowano ostatecznie z konkretnymi niekowalencyjnymi oddziaływaniami wiążącymi, takimi jak wiązania wodorowe i kontakty elektrostatyczne, zaobserwowanymi w symulacjach dokowania molekularnego.
Analiza ADME
W celu oceny charakteru lekopodobnego oraz właściwości biofarmaceutycznych syntetyzowanych pochodnych acetamidu opartych na triazolu i oksadiazolu 8(a–c) oraz 9(d–f), przeprowadzono analizę in silico w zakresie wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu i wydalania (ADME). Reprezentacje w uproszczonym systemie zapisu liniowego struktur molekularnych (SMILES) wszystkich syntetyzowanych związków, wraz z inhibitorami referencyjnymi – akarbosem i tiomocznikiem, zostały wygenerowane przy użyciu pakietu oprogramowania do modelowania molekularnego i przesłane do serwera internetowego SwissADME23.
Obliczone parametry fizykochemiczne obejmowały masę cząsteczkową (MW), lipofilność (logP), topologiczną polarną powierzchnię cząsteczki (TPSA), liczbę donorów wiązań wodorowych (HBD), liczbę akceptorów wiązań wodorowych (HBA) oraz liczbę wiązań rotowalnych (RB).
Właściwości farmakokinetyczne oceniono poprzez przewidywanie wchłaniania w przewodzie pokarmowym (GI) oraz przenikalności bariery krew-mózg (BBB). Ponadto związki oceniono pod kątem zgodności z regułą pięciu Lipińskiego oraz innymi uznanymi kryteriami podobieństwa do leków (drug-likeness), aby oszacować ich biodostępność doustną. Na koniec dla każdego związku obliczono wskaźnik dostępności syntetycznej (SA) w skali od 1 (łatwy do syntezy) do 10 (bardzo trudny do syntezy). Przewidywane profile ADME i podobieństwa do leków zsyntetyzowanych związków porównano z profilami inhibitorów referencyjnych, aby ocenić ich potencjał jako związków wiodących w rozwoju leków.
Wyniki
Chemia i charakterystyka zsyntetyzowanych związków
Docelowe pochodne acetamidu oparte na triazolu i oksadiazolu zostały zsyntezowane zgodnie ze schematem syntezy przedstawionym na Rysunku 1. Pożądane związki otrzymano z dobrą do doskonałą wydajnością (69%–87%) w postaci białych do żółtych krystalicznych ciał stałych. Ich czystość potwierdzono za pomocą TLC, oznaczenia temperatury topnienia oraz analiz spektroskopowych. Reprezentatywne widma NMR potwierdzające charakterystyczne grupy funkcyjne zsyntezowanych związków przedstawiono na Rysunku 2. Widma wykazały oczekiwane pasma absorpcji odpowiadające grupom funkcyjnym karbonylu amidowego (C=O), N–H, C=N, C–S oraz aromatycznym grupom C–H, co potwierdza pomyślną syntezę docelowych pochodnych.
Reprezentatywne widma 1H NMR przedstawiono na Rysunku 3. Widma wykazały charakterystyczne rezonanse dla protonu NH amidu, protonów aromatycznych, łącznika metylenowego oraz podstawników metylowych, co było zgodne z proponowanymi strukturami. Reprezentatywne widma 13C NMR przedstawiono na Rysunku 4. Obserwowane rezonanse węgla potwierdziły obecność węgli karbonylowych, aromatycznych, metylenowych i heterocyklicznych, oczekiwanych dla zsyntetyzowanych pochodnych. Reprezentatywne związki obejmowały 8a (wydajność 87%), 8c (wydajność około 80%–85%) oraz 9e (wydajność 69%). Pełne dane charakterystyki fizykochemicznej i widma NMR dla wszystkich zsyntetyzowanych związków znajdują się w Pliku uzupełniającym 1.
Inhibicja α-glukozydazy
Aktywności hamujące α-glukozydazę zsyntetyzowanych związków podsumowano w Tabeli 1. Wszystkie związki hamowały α-glukozydazę w różnym stopniu. Związek 9e wykazał najwyższą aktywność hamującą z wartością IC50 wynoszącą 27,29 ± 0,41 µM, a następnie związek 8a (33,15 ± 0,07 µM) oraz związek 8c (40,93 ± 0,59 µM). Związki 8b, 9d i 9f wykazały porównawczo słabsze hamowanie, z wartościami IC50 wynoszącymi odpowiednio 108,19 ± 0,18 µM, 108,10 ± 0,03 µM i 94,44 ± 0,25 µM. Związek 9e wykazał większą siłę hamowania niż inhibitor referencyjny akarbaza (IC50 = 38,25 ± 0,12 µM), natomiast związek 8a wykazał aktywność porównywalną. Profile hamowania zależne od stężenia przedstawiono na Rysunku 5.
Potencjał inhibicji ureazy
Aktywność hamująca ureazę zsyntetyzowanych związków podsumowano w Tabeli 1. Związek 8c wykazał najsilniejsze hamowanie ureazy, z wartością IC50 wynoszącą 6,14 ± 1,06 µM, a następnie związki 9e (8,14 ± 0,71 µM) oraz 8a (12,25 ± 0,42 µM). Związki te wykazały większą aktywność hamującą niż inhibitor referencyjny, tiomocznik (IC50 = 21,25 ± 0,15 µM). Związki 8b, 9d i 9f były mniej aktywne, z wartościami IC50 w zakresie od 82,15 do 103,05 µM. Odpowiednie krzywe hamowania zależne od stężenia przedstawiono na Ryc. 5.
Wiązanie BSA
Parametry wygaszania fluorescencji zostały zestawione w Tabeli 2. W przypadku związków 8a i 9e stała Sterna–Volmera (Ksv) wzrastała wraz ze wzrostem temperatury, natomiast stała wygaszania (Kq) przekraczała maksymalną granicę kontrolowaną dyfuzyjnie (2 × 1010 M⁻1 s⁻1), co wskazuje na mieszany mechanizm wygaszania statycznego i dynamicznego. Z kolei związek 8c wykazywał malejące wartości Ksv wraz ze wzrostem temperatury, przy jednoczesnym utrzymaniu wartości Kq powyżej granicy kontrolowanej dyfuzyjnie, co wskazuje na przewagę wygaszania statycznego. Analiza termodynamiczna wykazała ujemne wartości ΔH i ΔS dla związku 8a, co sugeruje, że podczas wiązania dominowały wiązania wodorowe i oddziaływania van der Waalsa. Dodatnie wartości ΔH i ΔS uzyskane dla związków 8c i 9e wskazały, że główną siłą napędową były oddziaływania hydrofobowe. Analiza powinowactwa wiązania przeprowadzona w 298 K wykazała, że związek 8a charakteryzował się najwyższą stałą wiązania (Kb = 3,92 × 105 M⁻1), a następnie związek 8c (1,54 × 104 M⁻1) i związek 9e (6,78 × 101M⁻1). Widma fluorescencji oraz wykresy Sterna–Volmera przedstawiono na Rysunku 6, Rysunku 7, Rysunku 8, Rysunku 9, Rysunku 10 oraz Rysunku 11.
Analiza dokowania
Wyniki dokowania molekularnego zestawiono w Tabeli 3. Protokół dokowania zwalidowano poprzez redokowanie ligandów kokrystalizowanych do ich odpowiednich miejsc wiązania, co dało wartości RMSD ≤2.0 Å, potwierdzając tym samym wiarygodność protokołu dokowania (Rysunek uzupełniający 1).
Na podstawie aktywności biologicznej i wyników dokowania do szczegółowej analizy oddziaływań wybrano związki 8a, 8c oraz 9e. Reprezentatywne pozy dokowania w centrum aktywnym α-glukozydazy przedstawiono na Rysunku 12A–D. Związek 8a wykazał najwyższy wynik dokowania (−7.165 kcal/mol), a następnie związki 8c (−6.80 kcal/mol) i 9e. Związki te utworzyły wiązania wodorowe z kluczowymi resztami katalitycznymi, w tym D282, D404, D616, R600, S523 oraz H674.
Reprezentatywne pozy dokowania w centrum aktywnym ureazy przedstawiono na Rysunku 12E–H. Związek 8c utworzył wiązania wodorowe z A636, Q635 i R439, natomiast związek 9e utworzył rozległą sieć wiązań wodorowych obejmującą E493, D494, H593, R609 i A636. Związek 8a wykazał również korzystne oddziaływania z aminokwasami centrum katalitycznego. Ogólnie analiza dokowania potwierdziła eksperymentalne wyniki inhibicji.
Badania DFT
Obliczone deskryptory chemii kwantowej zestawiono w Tabeli 4. Rozkłady frontierowych orbitali molekularnych oraz mapy potencjału elektrostatycznego cząsteczek związków referencyjnych przedstawiono na Rysunku 13, natomiast odpowiadające im analizy dla związków syntetyzowanych pokazano na Rysunku 14 oraz Rysunku 15.
Wśród zsyntetyzowanych związków 9e wykazał najmniejszą przerwę energetyczną HOMO–LUMO (0,14302 a.u.), a następnie 8c (0,14831 a.u.) i 8a (0,15788 a.u.). Mapy potencjału elektrostatycznego cząsteczek pozwoliły zidentyfikować obszary bogate i ubogie w elektrony, które mogą przyczyniać się do oddziaływań międzycząsteczkowych. Obliczone globalne deskryptory reaktywności, w tym potencjał jonizacji, powinowactwo elektronowe, elektroujemność, potencjał chemiczny, twardość, miękkość oraz indeks elektrofilowości, przedstawiono w Tabeli 4. Związki z serii 9 wykazały mniejsze przerwy HOMO–LUMO oraz wyższą elektrofilowość niż odpowiadające im pochodne z serii 8.
Analiza ADME
Przewidywane właściwości farmakokinetyczne zestawiono w Tabeli 5. Wszystkie zsyntetyzowane związki spełniały główne kryteria podobieństwa do leków. Pochodne z serii 9 nie wykazały naruszeń reguły Lipińskiego, podczas gdy każdy związek z serii 8 wykazywał jedno naruszenie. W przypadku wszystkich związków przewidywano wysoką wchłanialność z przewodu pokarmowego, brak przenikania przez barierę krew-mózg oraz akceptowalną liczbę donorów i akceptorów wiązań wodorowych. Wartości biodostępności były konsekwentnie przewidywane na poziomie 0,55. Wskaźniki dostępności syntetycznej mieściły się w zakresie od 5,70 do 6,39, co wskazuje na umiarkowaną złożoność syntezy.
DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Zbiory danych oraz materiały pomocnicze wygenerowane podczas niniejszego badania zostały zdeponowane w repozytorium Zenodo i są publicznie dostępne pod adresem https://doi.org/10.5281/zenodo.21238952.
Rycina 1: Ścieżka syntetyczna otrzymywania pochodnych acetamidu opartych na triazolu i oksadiazolu. Schemat reakcji ilustrujący syntezę produktów pośrednich oraz związków końcowych 8(a–c) i 9(d–f). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Widma NMR związku 8a. (A) Widmo 1H NMR związku 8a. (B) Widmo 13C NMR związku 8a. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Widma NMR związku 8c. (A) Widmo 1H NMR związku 8c. (B) Widmo 13C NMR związku 8c. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 4: Widma NMR związku 9e. (A) Widmo 1H NMR związku 9e. (B) Widmo 13C NMR związku 9e. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 5: Działanie hamujące zsyntetyzowanych związków wobec α-glukozydazy i ureazy. (A) Procentowe zahamowanie α-glukozydazy i ureazy przez związki 3, 4, 8(a–c) oraz 9(d–f) w porównaniu z inhibitorami referencyjnymi: odpowiednio akarbozą i tiomocznikiem. (B) Wartości IC50 tych samych związków wobec α-glukozydazy i ureazy. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3). Istotność statystyczną określono w odniesieniu do odpowiadającego inhibitora referencyjnego (p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001, p < 0.0001; ns = brak istotności). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6: Analiza gaszenia fluorescencji albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez związek 8a. (A) Widma emisji fluorescencji BSA (3.33 × 10⁻6 M) po stopniowym dodawaniu związku 8a w temperaturze 298 K. (B) Wykresy Sterna-Volmera otrzymane w temperaturach 298, 308 i 313 K. (C) Wykres podwójnie logarytmiczny log[(F₀ − F)/F] w funkcji log Q. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 7: Analiza gaszenia fluorescencji albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez związek 8b. (A) Widma emisji fluorescencji BSA (3.33 × 10⁻6 M) po stopniowym dodawaniu związku 8b w temperaturze 298 K. (B) Wykresy Sterna–Volmera otrzymane w temperaturach 298, 308 i 313 K. (C) Wykres dwulogarytmiczny log[(F₀ − F)/F] w funkcji log Q. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 8: Analiza wygaszania fluorescencji albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez związek 8c. (A) Widma emisji fluorescencji BSA (3.33 × 10⁻6 M) po stopniowym dodawaniu związku 8c w temperaturze 298 K. (B) Wykresy Sterna–Volmera otrzymane w temperaturach 298, 308 i 313 K. (C) Wykres podwójnie logarytmiczny log[(F₀ − F)/F] w funkcji log Q. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 9: Analiza wygaszania fluorescencji albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez związek 9d. (A) Widma emisji fluorescencji BSA (3,33 × 10⁻6 M) po stopniowym dodawaniu związku 9d w temperaturze 298 K. (B) Wykresy Sterna–Volmera otrzymane w temperaturach 298, 308 i 313 K. (C) Wykres podwójnie logarytmiczny log[(F₀ − F)/F] w funkcji log Q. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 10: Analiza wygaszania fluorescencji albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez związek 9e. (A) Widma emisji fluorescencji BSA (3.33 × 10⁻6 M) po stopniowym dodawaniu związku 9e w temperaturze 298 K. (B) Wykresy Sterna–Volmera uzyskane w temperaturach 298, 308 i 313 K. (C) Wykres podwójnie logarytmiczny log[(F₀ − F)/F] w funkcji log Q. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 11: Analiza wygaszania fluorescencji albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez związek 9f. (A) Widma emisji fluorescencji BSA (3,33 × 10⁻6 M) po stopniowym dodawaniu związku 9f w temperaturze 298 K. (B) Wykresy Sterna–Volmera uzyskane w temperaturach 298, 308 i 313 K. (C) Wykres podwójnie logarytmiczny log[(F₀ − F)/F] w funkcji log Q. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 12: Sposoby wiązania inhibitorów referencyjnych i wybranych zsyntetyzowanych związków w centrach aktywnych α-glukozydazy i ureazy. (A) Pozycja wiązania akarbozy w centrum aktywnym α-glukozydazy. (B) Pozycja wiązania związku 8a. (C) Pozycja wiązania związku 8c. (D) Pozycja wiązania związku 9e. (E) Pozycja wiązania tiomocznika w centrum aktywnym ureazy. (F) Pozycja wiązania związku 8a. (G) Pozycja wiązania związku 8c. (H) Pozycja wiązania związku 9e. Wiązania wodorowe przedstawiono żółtymi liniami przerywanymi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 13: Graniczne orbitale molekularne i mapy potencjału elektrostatycznego (MEP) inhibitorów referencyjnych. (A) Akarboza. (B) Tio mocznik. Przedstawiono najwyższy zajęty orbital molekularny (HOMO), najniższy niezajęty orbital molekularny (LUMO) oraz powierzchnie MEP. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rycina 14: Graniczne orbitale molekularne oraz mapy potencjału elektrostatycznego cząsteczek (MEP) pochodnych triazolu. (A) Związek 8a. (B) Związek 8b. (C) Związek 8c. Dla każdego związku przedstawiono powierzchnie HOMO, LUMO oraz MEP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 15: Graniczne orbitale molekularne oraz mapy potencjału elektrostatycznego cząsteczek (MEP) pochodnych oksadiazolu. (A) Związek 9d. (B) Związek 9e. (C) Związek 9f. Dla każdego związku przedstawiono powierzchnie HOMO, LUMO oraz MEP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Kody | Ureaza | α-glukozydaza | ||
| Inhibicja (%) przy 0.5 mM | IC50 (µM) | Inhibicja (%) przy 0.5 mM | IC50 (µM) | |
| 3 | 67.54 ± 1.03 | 41.51 ± 0.01 | 63.09 ± 0.25 | 79.12 ± 0.43 |
| 4 | 62.51 ± 0.42 | 45.14 ± 0.14 | 65.26 ± 0.55 | 70.28 ± 0.42 |
| 8a | 95.22 ± 1.55 | 12.25 ± 0.42 | 95.01 ± 0.57 | 33.15±0.07 |
| 8b | 62.64 ± 1.01 | 82.15 ±1.48 | 38.02 ± 1.71 | 108.19 ± 0.18 |
| 8c | 99.39 ± 0.27 | 06.14 ± 1.06 | 90.51 ± 0.01 | 40.93 ± 0.59 |
| 9d | 47.51 ± 1.01 | 103.05 ± 0.54 | 39.08 ± 0.25 | 108.10 ± 0.03 |
| 9e | 98.57 ± 0.04 | 08.14 ± 0.71 | 91.55 ± 0.34 | 27.29 ± 0.41 |
| 9f | 58.07 ± 1.68 | 85.15 ± 0.12 | 43.15 ± 0.42 | 94.44 ± 0.25 |
| Tioomocznik | 96.24 ± 0.16 | 21.25 ± 0.15 | - | - |
| Akarboza | - | - | 92.23 ± 0.14 | 38.25 ± 0.12 |
Tabela 1: Działanie hamujące zsyntetyzowanych związków wobec α-glukozydazy i ureazy. Wartości IC50 oraz procent hamowania związków 8(a–c) i 9(d–f) w porównaniu z inhibitorami referencyjnymi: akarbozą i tiomocznikiem. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3). Skróty: IC50 = połowowe maksymalne stężenie hamujące; SD = odchylenie standardowe.
| Związek | 298K | 308K | 313K | ||||||
| N | Kb (M-1) | ΔG | ΔH | ΔS (J/mol.K) | N | Kb (M-1) | N | Kb (M-1) | |
| (kJ/mol) | (kJ/mol) | ||||||||
| 8a | 1.28 | 3.92 x105 | -32.55 | -218.28 | -623.24 | 1.12 | 6.49 x104 | 0.85 | 4.33 x103 |
| 8b | 1.31 | 6.49 x105 | -34.24 | -306.6 | -913.96 | 1.1 | 6.95 x104 | 0.66 | 1.07 x103 |
| 9d | 1.47 | 2.41 x106 | -36.32 | -204.1 | -563.01 | 1.17 | 1.44 x105 | 1.04 | 4.84 x104 |
| 9e | 0.62 | 6.78 x101 | -10.32 | 243.16 | 850.61 | 0.81 | 1.32 x103 | 0.91 | 7.93 x103 |
| 9f | 1.11 | 4.69 x104 | -26.35 | 178.13 | 686.21 | 1.26 | 2.99 x105 | 1.41 | 1.67 x106 |
| 8c | 0.91 | 1.54 x104 | -23.98 | 341.31 | 1225.82 | 1.36 | 1.53 x105 | 1.6 | 1.10 x107 |
Tabela 2: Stałe wiązania i parametry termodynamiczne dla oddziaływań wybranych związków z albuminą surowicy bydlęcej (BSA). Stała wiązania (Kb), liczba miejsc wiązania (n), stała wygaszania Sterna-Volmera (Ksv), bimolekularna stała szybkości wygaszania (Kq), energia swobodna Gibbsa (ΔG), zmiana entalpii (ΔH) oraz zmiana entropii (ΔS) dla związków 8a, 8c i 9e wyznaczone w temperaturach 298, 308 i 313 K. Skróty: BSA = albuminy surowicy bydlęcej; Kb = stała wiązania; n = liczba miejsc wiązania; Ksv = stała wygaszania Sterna-Volmera; Kq = bimolekularna stała szybkości wygaszania; ΔG = energia swobodna Gibbsa; ΔH = zmiana entalpii; ΔS = zmiana entropii.
| Związki | Alfa-glukozydaza (kcal/mol) | Ureaza (kcal/mol) |
| Akarboza | −6.90 | - |
| Tio mocznik | - | −5.80 |
| 3 | −4.35 | −4.50 |
| 4 | −4.10 | −4.30 |
| 8a | −7.165 | −7.624 |
| 8b | −5.20 | −5.45 |
| 8c | −6.80 | −7.10 |
| 9d | −5.10 | −5.35 |
| 9e | −6.70 | −7.30 |
| 9f | −5.00 | −5.25 |
Tabela 3: Wyniki dokowania molekularnego zsyntetyzowanych związków względem α-glukozydazy i ureazy. Wyniki dokowania (kcal/mol) związków 8(a–c) i 9(d–f) oraz inhibitorów referencyjnych: akarbozy i tiomocznika względem α-glukozydazy i ureazy. Skróty: kcal/mol = kilokalorie na mol.
| Ligand | Moment dipolowy (Debye) | HOMO | LUMO | Energia | Jonizacja | powinowactwo elektronowe (eV) | Elektro- negatywność χ (eV) | Elektro- potencjał chemiczny μ (eV) | Twardość η (eV) | Miękkość | Elektro- filiczność |
| (j.a.) | (j.u.) | Przerwa (ΔEPrzerwa) | Potencjał (eV) | S (eV) | ω (eV) | ||||||
| Akarboza | 8.1124 | -0.1597 | -0.0336 | 0.12612 | 4.345 | 0.913 | 2.629 | -2.629 | 1.716 | 0.291 | 2.015 |
| Tiomocznik | 7.619 | -0.2193 | -0.0179 | 0.20135 | 5.967 | 0.488 | 3.228 | -3.228 | 2.739 | 0.182 | 1.903 |
| 8a | 8.8025 | -0.2044 | -0.0466 | 0.15788 | 5.566 | 1.266 | 3.416 | -3.416 | 2.15 | 0.233 | 2.71 |
| 8b | 8.2451 | -0.2033 | -0.0467 | 0.15659 | 5.534 | 1.27 | 3.402 | -3.402 | 2.132 | 0.234 | 2.72 |
| 8c | 8.319 | -0.2039 | -0.0555 | 0.14831 | 5.55 | 1.511 | 3.53 | -3.53 | 2.02 | 0.247 | 3.08 |
| 9d | 3.8264 | -0.2065 | -0.0621 | 0.14432 | 5.619 | 1.691 | 3.655 | -3.655 | 1.964 | 0.255 | 3.4 |
| 9e | 4.0969 | -0.2052 | -0.0621 | 0.14302 | 5.584 | 1.691 | 3.637 | -3.637 | 1.947 | 0.257 | 3.4 |
| 9f | 4.298 | -0.2059 | -0.0627 | 0.14324 | 5.604 | 1.704 | 3.654 | -3.654 | 1.95 | 0.256 | 3.42 |
Tabela 4: Deskryptory teorii funkcjonału gęstości (DFT) zsyntetyzowanych związków. Obliczone kwantowo-chemiczne deskryptory związków 8(a–c) i 9(d–f) wraz ze związkami referencyjnymi: akarbozą i tiomocznikiem, obejmujące energie HOMO i LUMO, przerwę energetyczną HOMO–LUMO (ΔE), potencjał jonizacji (IP), powinowactwo elektronowe (EA), elektroujemność (χ), potencjał chemiczny (µ), twardość chemiczną (η), miękkość chemiczną (S), moment dipolowy (D) oraz indeks elektrofilowości (ω). Skróty: DFT = teoria funkcjonału gęstości; HOMO = najwyższy zajęty orbital molekularny; LUMO = najniższy niezajęty orbital molekularny; ΔE = przerwa energetyczna HOMO–LUMO; IP = potencjał jonizacji; EA = powinowactwo elektronowe; χ = elektroujemność; µ = potencjał chemiczny; η = twardość chemiczna; S = miękkość chemiczna; D = moment dipolowy; ω = indeks elektrofilowości.
| Związek | HA | RB | HBA | HBD | TPSA (Ų) | iLOGP | Konsensus LogP | Wchłanianie w przewodzie pokarmowym | Przepuszczalność BBB | Naruszenia reguły Lipińskiego | Wskaźnik biodostępności | Wskaźnik SA |
| 8a | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.86 | 4.41 | 4.71 | Wysokie | Nie | 1 | 0.55 | 6.32 |
| 8b | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.06 | 4.41 | 4.62 | Wysokie | Nie | 1 | 0.55 | 6.34 |
| 8c | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.26 | 4.41 | 4.11 | Wysokie | Nie | 1 | 0.55 | 6.39 |
| 9d | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.95 | 3.08 | 2.75 | Wysokie | Nie | 0 | 0.55 | 5.71 |
| 9e | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.82 | 3.08 | 2.27 | Wysokie | Nie | 0 | 0.55 | 5.7 |
| 9f | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.85 | 3.08 | 2.77 | Wysokie | Nie | 0 | 0.55 | 5.73 |
Tabela 5: Przewidywane właściwości absorpcji, dystrybucji, metabolizmu i wydalania (ADME) zsyntetyzowanych związków. Przewidywane właściwości fizykochemiczne, farmakokinetyczne i podobieństwo do leków dla związków 8(a–c) i 9(d–f) zostały wygenerowane przy użyciu serwera WWW SwissADME. Skróty: ADME = absorpcja, dystrybucja, metabolizm i wydalanie; MW = masa cząsteczkowa; LogP = współczynnik podziału oktanol/woda; TPSA = topologiczna polarna powierzchnia cząsteczki; RB = wiązania rotowalne; HBA = akceptor wiązania wodorowego; HBD = donor wiązania wodorowego; GI = przewód pokarmowy; BBB = bariera krew-mózg; SA = dostępność syntetyczna.
Rysunek uzupełniający 1: Walidacja dokowania poprzez redokowanie ligandów natywnych. (A) Superpozycja ligandu kokrystalizowanego (poza referencyjna) oraz redokowanego akarbose w centrum aktywnym α-glukozydazy (PDB ID: 5NN8), wykazująca ścisłą zgodność konformacji wiązania. (B) Poza wiązania tiomocznika w centrum aktywnym ureazy (PDB ID: 4H9M), wykorzystana do walidacji dokowania w układzie ureazy, wykazująca zachowanie kluczowych oddziaływań w kieszeni katalitycznej.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 1: Dane charakterystyki fizykochemicznej oraz pełne widma NMR 1H i 13C związków 3, 4, 8(a–c) oraz 9(d–f).Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.
Dyskusja
Niniejsze badanie syntetyzowało szereg pochodnych acetamidu opartych na triazolu i oksydazolu oraz oceniło ich właściwości strukturalne, biologiczne, obliczeniowe i farmakokineticzne. Charakterystyka spektroskopowa poprzez HRMS, analizę elementarną, 1H NMR i 13C NMR potwierdziła pomyślną syntezę docelowym cząsteczek. Obserwowane przesunięcia chemiczne, wzorce sprzęgania i rezonanse węgla były zgodne z proponowanymi strukturami. Charakterystyczne sygnały NH amidowe, rezonanse metylenowe, dystrybucje protonów aromatycznych i sygnały węgla czwartorzędowego potwierdziły dalsze pomyślne wprowadzenie podstawionych grup acetamidu zarówno do szkieletu triazolu jak i oksydazolu. Ogólnie wysokie plony syntezy uzyskane dla tych pochodnych wskazują na wydajność ścieżki syntetycznej i sugerują, że te heterocykliczne struktury są dostępne do dalszych modyfikacji strukturalnych.
Zaobserwowano wyraźny wpływ wzorca podstawników na aktywność inhibitora ureazy. Związek 8c, zawierający podstawnik 2,6-dimetylu, wykazał najwyższą aktywność inhibitora ureazy, za nim związki 8a (2,3-dimetylu) i 9e (2,5-dimetylu), identyfikując te cząsteczki jako obiecujące kandydatki do dalszych badań. Podobny trend zaobserwowano przeciwko α-glukozydazie, gdzie związek 9e wykazał najsilniejsze hamowanie, zaś związki 8a i 8c również wykazały znaczną aktywność. Ponieważ związki 8a i 8c różnią się tylko pozycjami podstawników metylowych na pierścieniu aromatycznym, podczas gdy związek 9e różni się zarówno wzorcem podstawienia jak i szkieletem heterocyklicznym, te wyniki sugerują, że zarówno wzorzec podstawienia metylowego jak i architektura szkieletu przyczyniają się do aktywności biologicznej w tej serii. Wyższa aktywność związku 8c może odzwierciedlać bardziej korzystne usytuowanie w aktywnym miejscu enzymu, podczas gdy mocna aktywność związku 9e sugeruje dodatkowy wkład ze strony szkieletu oksydazolu wraz z wzorcem podstawienia 2,5-dimetylu. Te obserwacje są zgodne z wcześniejszymi raportami wskazującymi, że efekty steryczne powstające z podstawienia fenylu mogą wpływać na wiązanie w miejscu aktywnym inhibitorów enzymów opartych na triazolu i oksydazolu24,25,26,27. Niemniej jednak, ustalenie jednoznacznej relacji struktura-aktywność będzie wymagało oceny większej serii pochodnych regioizomerycznych.
Analiza interakcji między najbardziej aktywnymi związkami a albuminą krowy (BSA) poprzez tłumienie fluorescencji i analizę termodynamiczną wykazała, że związki 8a i 9e przebiegały zgodnie z mieszanym mechanizmem tłumienia statycznego/dynamicznego, podczas gdy związek 8c wykazywał przede wszystkim tłumienie statyczne. Parametry termodynamiczne wskazywały, że wiązanie związku 8a było przede wszystkim sterowane przez wiązania wodorowe i oddziaływania van der Waals, podczas gdy oddziaływania hydrofobowe dominowały w wiązaniu związków 8c i 9e. Związek 8a wykazywał najsilniejsze powinowactwo do BSA, ze stałą wiązania 3,92 × 105 M-1L i korzystną ujemną wolną energią Gibbsa wiązania. Te wyniki wskazują na stabilne tworzenie kompleksu białko-ligand i sugerują potencjał transportu pośredniczonego przez albuminę w warunkach fizjologicznych.
Wyniki eksperymentalne zostały dodatkowo potwierdzone przez badania dokowania molekularnego, które wykazały, że związki 8a, 8c i 9e przyjęły korzystne konformacje wiązania w miejscach aktywnych zarówno α-glukozydazy jak i ureazy. Te związki tworzyły wiązania wodorowe z kluczowymi resztkami, w tym D282, A284, D404, R600, D616 i H674 w α-glukozydazie oraz A636, Q635, R439 i A440 w ureazie. Podobne interakcje zostały wcześniej opisane dla strukturalnie pokrewnych inhibitorów enzymów28,29. Największa różnica między wynikiem dokowania a aktywnością eksperymentalną została zaobserwowana dla związku 8a, który wykazał najkorzystniejszy wynik dokowania przeciwko α-glukozydazie (-7,165 kcal/mol), podczas gdy związek 9e wykazywał największą in vitro potencję inhibitora (IC50 = 27,29 µM). Ta różnica nie jest nieoczekiwana, ponieważ wyniki dokowania estymują wiązanie ligandu w stosunkowo sztywnej strukturze białka i nie uwzględniają czynników takich jak rozpuszczalność ligandu, elastyczność konformacyjna, odwodnienie, dynamika białka czy inne efekty fazy roztworowej, które wpływają na wartości IC50 określone eksperymentalnie. W konsekwencji, różnice między przewidywaną powinowactwem wiązania a zmierzoną aktywnością biologiczną reprezentują uznaną ograniczność dokowania molekularnego, a nie sprzeczność między wynikami obliczeniowymi a eksperymentalnymi. Ogólnie rzecz biorąc, dane dokowania i inhibicji enzymatycznej jednoznacznie identyfikują związki 8a,
Oświadczenia
Autor deklaruje, że nie ma konfliktu interesów
Podziękowania
Autor wyraża swoją wdzięczność dla Wydziału Farmacji Klinicznej, Uniwersytetu Al Baha, Arabia Saudyjska.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1-Naphtylamina | Merck | 106148 | Aromatyczna amina stosowana do przygotowania zastąpionych analogów |
| 2,5-Dimethylanilina | Sigma-Aldrich | D146706 | Aromatyczna amina stosowana do syntezy zastąpionych pochodnych |
| 3,4-Dimethylanilina | Alfa Aesar | A15416 | Aromatyczna amina stosowana do przygotowania analogów strukturalnych |
| Kwas benzoesowy | Sigma-Aldrich | 242381 | Materiał początkowy do syntezy pośredniego benzohydrazydu |
| Bromoacetylobromek | Sigma-Aldrich | B17601 | Elektrofilowy reagent stosowany w syntezie pośrednich bromoacetamidów |
| Disiarczek węgla | Sigma-Aldrich | 289116 | Kluczowy reagent do cyklizacji do układu pierścieniowego oksadiazolu |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Rozpuszczalnik stosowany w procesach ekstrakcji i oczyszczania |
| Dimethyloformamid (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Polarny aprotyczny rozpuszczalnik stosowany w reakcjach derywatyzacji i substytucji |
| Difenyloamina | Sigma-Aldrich | D23802 | Aromatyczna amina stosowana w syntezie pochodnych związków |
| Epik (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (oprogramowanie) | Stosowany do generowania stanów jonizacji ligandów w pH 7,0; RRID: N/A |
| Etanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Rozpuszczalnik reakcji do esteryzacji i formowania hydrazydów |
| Octan etylu | Sigma-Aldrich | 270989 | Polarny ruchomy składnik fazy w analizie TLC i ekstrakcji |
| Gaussian 09, Revision D.01 (Gaussian 09W) | Gaussian, Inc. | N/A (oprogramowanie) | Oprogramowanie stosowane do obliczeń DFT (HOMO-LUMO, MESP, globalne deskryptory reaktywności); RRID:SCR_014897 |
| GaussView 5 | Gaussian, Inc., Wallingford, CT, USA | N/A (oprogramowanie) | Stosowany do wizualizacji zoptymalizowanych struktur i energii orbitali; RRID: N/A |
| Glide (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (oprogramowanie) | Oprogramowanie dokujące stosowane do generowania siatki receptora i precyzyjnego (XP) molekularnego dokowania; RRID:SCR_000187 |
| GraphPad Prism, version 9 | GraphPad Software, Boston, MA, USA | N/A (oprogramowanie) | Stosowany do analizy regresji IC50 i ewaluacja statystyczna danych dotyczących hamowania enzymów; RRID:SCR_002798 |
| Hydrazyna | Sigma-Aldrich | 225819 | Reagent stosowany do przemiany estrów w benzohydrazydy |
| L(+)-Glutamina | Sigma-Aldrich | G3126 | Reagent stosowany w badaniach ewaluacji biologicznej |
| LigPrep (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (oprogramowanie) | Stosowany do optymalizacji struktury ligandów i generowania konformerów 3D; RRID:SCR_016746 |
| Wodorek litu | Sigma-Aldrich | 201049 | Katalizator stosowany do aktywacji grupy tiolowej w reakcjach substytucyjnych |
| Maestro (v13.2, Schrödinger Release 2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (oprogramowanie) | Pakiet do modelowania molekularnego stosowany do przygotki i wizualizacji struktur białek/ligandów; RRID:SCR_016748 |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Rozpuszczalnik stosowany w czyszczeniu i preparatach do badań biologicznych |
| n-Heksan | Merck | 104391 | Niepolarny składnik fazy ruchomej w analizie TLC |
| OPLS-2005 / OPLS-AA | Schrödinger, LLC | N/A (pole sił) | Pole sił stosowane do minimalizacji energii struktur białek i ligandów; RRID: N/A |
| Izotiocyjanian fenylu | Merck | 807028 | Reagent stosowany w syntezie pochodnych triazolu |
| Protein Preparation Wizard (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (oprogramowanie) | Stosowany do ulepszania struktury receptora przed dokowaniem; RRID:SCR_016749 |
| Wodorotlenek sodu | Sigma-Aldrich | 221465 | Zasada stosowana do regulacji pH i neutralizacji reakcji |
| Kwas siarkowy | BDH | 10276 | Kwas katalizytor stosowany w etapie esteryzacji w warunkach refluksu |
| Trimetyloamina | Riedel-de Haen | 22129 | Organiczna baza stosowana podczas syntezy zastąpionych pochodnych |
| VESTA, version 3.5.8 | Momma & Izumi (deweloperzy); dystrybuowane za darmo | N/A (oprogramowanie) | Stosowany do wizualizacji potencjału elektrostatycznego cząsteczek (MESP) i map powierzchni HOMO-LUMO; RRID: N/A |
Bibliografia
- Siddiqui SZ, et al. BSA binding, molecular docking, and in vitro biological screening of new 1,2,4-triazole heterocycles bearing an azinane nucleus. Pak J Pharm Sci. 2020;33(1):149-160.
- Khalilullah H, Ahsan MJ, Hedaitullah M, Khan S, et al. 1,3,4-Oxadiazole: A biologically active scaffold. Mini Rev Med Chem. 2012;12(8):789-801.
- Wang JJ, Sun W, Jia WD, Bian M, et al. Research progress on the synthesis and pharmacology of 1,3,4-oxadiazole and 1,2,4-oxadiazole derivatives: A mini review. J Enzyme Inhib Med Chem. 2022;37(1):2304-2319.
- Glomb T, Świątek P. Antimicrobial activity of 1,3,4-oxadiazole derivatives. Int J Mol Sci. 2021;22(13):6979.
- Glomb T, Szymankiewicz K, Świątek P. Anti-cancer activity of derivatives of 1,3,4-oxadiazole. Molecules. 2018;23(12):3361.
- Aggarwal R, Sumran G. An insight into the medicinal attributes of 1,2,4-triazoles. Eur J Med Chem. 2020;205:112652.
- Strzelecka M, Świątek P. 1,2,4-Triazoles as important antibacterial agents. Pharmaceuticals (Basel). 2021;14(3):224.
- Kumar S, Khokra SL, Yadav A. Triazole analogues as potential pharmacological agents: A brief review. Future J Pharm Sci. 2021;7(1):106.
- Raza A, et al. Deep learning in drug discovery: A futuristic modality to materialize large datasets for cheminformatics. J Biomol Struct Dyn. 2023;41(18):9177-9192.
- Liu SK, et al. Discovery of new α-glucosidase inhibitors: Structure-based virtual screening and biological evaluation. Front Chem. 2021;9:639279.
- Lebovitz HE. Alpha-glucosidase inhibitors. Endocrinol Metab Clin North Am. 1997;26(3):539-551.
- Rego YF, et al. A review on the development of urease inhibitors as antimicrobial agents against pathogenic bacteria. J Adv Res. 2018;13:69-100.
- Daud S, et al. Design, synthesis, in vitro evaluation, and docking studies of ibuprofen-derived 1,3,4-oxadiazole derivatives as dual α-glucosidase and urease inhibitors. Med Chem Res. 2022;31(2):316-336.
- Chapdelaine P, Tremblay RR, Dubé JY. p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside as a substrate for measurement of maltase activity in human semen. Clin Chem. 1978;24(2):208-211.
- Manoharan A, et al. N-Acetylcysteine prevents catheter occlusion and inflammation in catheter-associated urinary tract infections by suppressing urease activity. Front Cell Infect Microbiol. 2023;13:1216798.
- Lakowicz JR. Principles of Fluorescence Spectroscopy. 3rd ed. Springer; New York, NY; 2006.
- Atkins P, de Paula J, Keeler J. Atkins' Physical Chemistry. 11th ed. Oxford University Press; Oxford, UK; 2018.
- DeLano WL. PyMOL: An open-source molecular graphics tool. CCP4 Newsl Protein Crystallogr. 2002;40:82-92.
- Discovery Studio Visualizer, Version 2.0. Accelrys Software Inc.; San Diego, CA; 2005.
- Tirado-Rives J, Jorgensen WL. Performance of B3LYP density functional methods for a large set of organic molecules. J Chem Theory Comput. 2008;4(2):297-306.
- Takano Y, Houk KN. Benchmarking the conductor-like polarizable continuum model (CPCM) for aqueous solvation free energies of neutral and ionic organic molecules. J Chem Theory Comput. 2005;1(1):70-77.
- Parr RG, Szentpály LV, Liu S. Electrophilicity index. J Am Chem Soc. 1999;121(9):1922-1924.
- Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness, and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 2017;7(1):42717.
- Wang YN, et al. Synthesis and biological evaluation of triazolones/oxadiazolones as novel urease inhibitors. Bioorg Med Chem. 2024;102:117656.
- Mehdi K, et al. Molecular docking and in vitro studies of synthesized oxadiazole derivatives as urease inhibitors. J Math Fundam Sci. 2025;57(1):1-23.
- Aziz M, et al. Phytochemical, pharmacological, and in silico molecular docking studies of Strobilanthes glutinosus Nees: An unexplored source of bioactive compounds. S Afr J Bot. 2022;147:618-627.
- Khan KM, et al. Biochemical, toxicological, and in silico aspects of Trillium govanianum Wall. ex D. Don (Trilliaceae): A rich source of natural bioactive compounds. Chem Biodivers. 2024;21(1):e202301375.
- Bibi H, et al. Isolation and characterization of bioactive constituents from Withania coagulans Dunal with antioxidant and multifunctional enzyme inhibition potential, supported by docking, molecular dynamics, and DFT studies. RSC Adv. 2025;15(56):48566-48584.
- Khurm M, Guo Y, Wu Q, Zhang X, et al. Conocarpus lancifolius (Combretaceae): Pharmacological effects, LC-ESI-MS/MS profiling and in silico. attributes. Metabolites. 2023;13(7):794.
- Abdo MA, Badawy SA, Fadda AA, Elmorsy MR. Design, synthesis, structural characterization, and antioxidant potential of novel triazole- and oxadiazole-based hydrazide-hydrazone derivatives: spectroscopic, DFT, and molecular docking studies. BMC Chem. 2025;19:192.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie