Artykuł metodologiczny

Ocena efektywności transdukcji i docelowania komórek przez peptydy przenikające do komórek w płucach myszy

DOI:

10.3791/71217

⸱

16 czerwca 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic, 2Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje zintegrowany przepływ pracy w celu oceny efektywności transdukcji i specyficzności komórkowej peptydów penetrujących komórki, przy użyciu jako przykładu peptydu ukierunkowanego na płuca scyklizowanego R11A (cR11A; KAPWHLSSQYSAT). Przepływ pracy łączy powiązaną frakcję FACS z sekwencjonowaniem RNA pojedynczych komórek, cytometrią przepływową u myszy reporterowych AT2 oraz konfokalnymi obrazami z-stack, aby potwierdzić wiązanie peptydu z celem AT2.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptydy przenikajace do komórek (CPPs) to krótkie peptydy (5–30 aminokwasów) zdolne do przekraczania błon komórkowych i dostarczania makrocząsteczkowych ładunków bez konieczności stosowania reagentów transfekcyjnych. Jednakże, definiowanie in vivo. selektywności komórkowej wymaga walidacji na poziomie typu komórki. Przedstawiono zintegrowane działanie do oceny efektywności transdukcji scytywanego CPP oznaczonego Cy5.5, cR11A, w komórkach nabłonka pęcherzykowego płuc typu II (AT2) po retro-orbitalnej iniekcji dożylnej u myszy. Płuca były pobrane 15 lub 60 minut po iniekcji i analizowane przy użyciu uzupełniających metod pomiarowych, w tym parzystej fluorescencyjnej sortacji komórek (FACS) w celu izolowaniu jednokomórkowych zawiesin płuc Cy5.5⁺ i Cy5.5⁻, po których następowało sekwencjonowanie RNA jednej komórki, cytometria przepływowa jednokomórkowych komórek płuc z myszy reporterowych Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2 w celu iloczynowania zdarzeń GFP⁺/Cy5.5⁺, oraz konfokalne zobrazowanie sekwencji z przestrzeni z kriosekcji płuc w celu potwierdzenia kolokalizacji cR11A-Cy5.5 z sygnałem związanym z AT2. Ten protokół dostarcza zgodnych dowodów na zaangażowanie typu komórki przy użyciu wielu uzupełniających metod pomiarowych i zapewnia powtarzalną ramę do oceny komórkowego ukierunkowania CPPs, z modyfikacjami dla różnych docelowych narządów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptydy penetrujące komórki (CPPs) to peptydy o długości 5–30 aminokwasów, które mogą przekraczać błony komórkowe i ułatwiać dostarczanie materiałów makrocząsteczkowych w nienaruszonym, w pełni funkcjonalnym stanie do wnętrza komórek bez konieczności stosowania środków transfekcyjnych1,2. Poprzednie prace wykorzystujące metody kombinacyjne in vitro i in vivo z wykorzystaniem fagowej ekspresji zidentyfikowały 12-aminokwasowy peptyd ukierunkowany na serce (APWHLSSQYSRT), który jest wzięty specyficznie przez komórki mięśnia sercowego w czasie krótszym niż 5 minut3,4. Aby zbadać jego mechanizm transdukcji, przeprowadzono skan alaninowy, co doprowadziło do odkrycia dwóch wariantów, S7A i R11A (APWHLSSQYSAT), które nieoczekiwanie wykazywały wzbogacenie płuc in vivo. i zostały zatem nazwane peptydami ukierunkowanymi na płuca (LTPs)5. Ponadto, dodanie lizyny na N-końcu i cyklizacja głowa do ogona wygenerowała cykliczną wersję R11A (cR11A) o znacznie poprawionej stabilności w surowicy i znacznie wzmocnionym wzięciu wewnątrzkomórkowym w porównaniu z jego liniową wersją5.

LTPs mają potencjał do precyzyjnego dostarczania leków do odległych populacji nabłonka płuc, w tym komórek nabłonkowych pęcherzyków płuc typu II (AT2). Komórki te są kluczowe dla utrzymania homeostazy surfaktantu i służą jako przodkowie dla regeneracji pęcherzyków płuc6. Jednak głównym wyzwaniem w rozwoju LTP jest rygorystyczna ocena selektywności komórkowej in vivo. Dystrybucja na poziomie narządów sama w sobie nie jest w stanie odróżnić prawdziwej transdukcji komórkowej od sygnału naczyniowego, zatrzymania pozakomórkowego lub fagocytarnego wychwytu i dlatego musi być uzupełniona pomiarami rozdzielającymi pojedyncze komórki7. Aby przeciwdziałać tej ograniczoności, ten przepływ pracy integruje przypisywanie transkryptomiczne na poziomie pojedynczych komórek, przepływomiętrzenie oparte na reporterach i konfokalne zobrazowanie stosu z, aby wygenerować dowód na poziomie typu komórkowego na temat zaangażowania peptydów poza odczytami fluorescencji na poziomie narządów lub dystrybucji biorozkładowej8,9.

Głównym celem tego protokołu jest zapewnienie reprodukowalnego, wieloczytelnego przepływu pracy do walidacji efektywności transdukcji in vivo i specyficzności komórkowej Cy5.5-oznaczonego cR11A w odległych płucach, ze skupieniem na komórkach AT2 po wstrzyknięciu retro-orbitalnym. Protokół definiuje tożsamość komórki związanej z peptydem za pomocą komplementarnych i niezależnych pomiarów, w tym sortowanie komórek z aktywacją fluorescencyjną (FACS) z użyciem par (Cy5.5⁺ vs Cy5.5⁻) z następującym po nim sekwencjonowaniem RNA z pojedynczych komórek w celu odwzorowania populacji związanych z peptydami, oceny ilościowego wzięcia wewnątrzkomórkowego w płucach reportera AT2 za pomocą przepływomierzenia oraz konfokalnego zobrazowania stosu z kryosekcji płuc w celu potwierdzenia kolokalizacji cR11A-Cy5.5 z sygnałem związanym z AT2. Ten protokół może być łatwo przystosowany do innych LTPs lub wektorów dostarczających i zastosowany do płuc lub innych układów narządowych w celu oceny specyficzności komórkowej CPPs w trakcie rozwoju. Jest szczególnie przydatny w zastosowaniach wymagających walidacji na poziomie typu komórki dotyczącej ukierunkowania CPP in vivo zamiast oceny akumulacji na poziomie narządów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zwierzęce były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Instytucjonalnymi i ich Użytkowania (IACUC) w Mayo Clinic i zostały zatwierdzone na podstawie protokołu numer A00006842-22-R25. Wszystkie starania zostały podjęte, aby zminimalizować cierpienie zwierząt i zapewnić etyczne postępowanie zgodnie z odpowiednimi przepisami krajowymi i instytucjonalnymi. Narzędzia badawcze użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Zwierzęta

  1. Użyj dorosłych szczurów C57BL/6J mieszanych pod względem płci (6–8 tygodni) uzyskanych z The Jackson Laboratory (Strain #000664).
  2. Do AT2-specificznej ilościowej oceny użyj Sftpc-CreERT2(+/+) (Jax Strain #028054) skrzyżowanego z LSL-GFP(+/+) (Jax Strain #007906), aby wygenerować Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) szczury reporterowe AT2.
  3. Hoduj szczury w indywidualnie wentylowanych klatkach. Upewnij się, że wszystkie protokoły zwierzęce są zatwierdzone przez Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Instytucjonalnymi i ich Użytkowania.
  4. Przeprowadź indukcję tamoksyfenu w Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) szczurach. Gdy szczury mają ≥6 tygodni, podawaj 100 mg/kg tamoksyfenu rozpuszczonego w oleju kukurydzianym przez oralne podawanie żołądkowe przez trzy dawki przez 7 dni. Przeprowadzaj eksperymenty co najmniej 2 tygodnie po ostatniej dawce, aby zapewnić maksymalną efektywność rekombinacji.

2. Przygotowanie odczynników i sprzętu

  1. Przygotuj znieczulenie (mieszanina robocza ketaminy/ksylazyny).
    1.  Przygotuj 5 mL roztworu roboczego: ketamina (1 mL 50 mg/mL), ksylazyna (50 µL 100 mg/mL) i sterylny roztwór chlorku sodu (3,95 mL).
    2.  Podawaj 1 µL/g masy ciała przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (ostateczna dawka: 10 mg/kg ketaminy i 1 mg/kg ksylazyny).
  2. Przygotuj peptyd (cR11A-Cy5.5).
    1. Uzyskaj CPP jako liofilizowano proszki. Przechowuj proszki w temperaturze −20 °C przez maksymalnie 2 lata lub jako roztwory bazowe w DMSO w temperaturze −80 °C przez maksymalnie 6 miesięcy w zabezpieczonych przed światłem probówkach. Unikaj cyklicznego zamrażania i odmrażania oraz minimalizuj ekspozycję na światło. Przygotuj 10 mM roztwór bazowy cR11A-Cy5.5 w DMSO.
    2. Ważyć szczura, obliczyć dawkę i rozcieńczyć skoncentrowany roztwór do 1 mg/kg w wodzie bez nukleaz do objętości 100 µL na szczura.
  3. Przygotuj bufor trawienia (świeży; trzymaj na lodzie).
    1. Przygotuj bufor trawienia zawierający 2 mg/mL Dispase II, 0,1 mg/mL DNase I, DMEM/F12 i 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny.
    2. Używaj 3 mL na szczura.
  4. Przygotuj niespecyficzny bufor do mycia enzymów proteazowych (trzymaj na lodzie).
    1. DMEM/F12 zawierające 0,05 mg/mL DNase I i 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny.
    2. Używaj 10 mL na szczura.
  5. Przygotuj bufor do lizy czerwonych krwinek (trzymaj na lodzie).
    1. Rozcieńcz bufor lizujący 10× do 1× buforem PBS.
    2. Używaj 2 mL na próbkę.
  6. Przygotuj bufor perfuzji.
    1. Używaj lodowatego DMEM/F12 (10 mL na szczura).
  7. Przygotuj bufor do płukania.
    1. Używaj DMEM/F12 z 2% FBS.
  8. Wstępnie schłodź wirówki do 4 °C.

3. Retro-orbitalne podawanie cR11A-Cy5.5

  1. Znieczulić szczura za pomocą mieszaniny ketaminy/ksylazyny. Potwierdź wystarczające znieczulenie brakiem wycofania kończyn w odpowiedzi na szczypnięcie palca.
  2. Podaj 100 µL cR11A-Cy5.5 (1 mg/kg) przez retro-orbitalną iniekcję dożylną za pomocą strzykawki do insuliny.
  3. Uruchomić timer i utrzymywać szczura na podgrzewanej poduszce pod odpowiednim nadzorem przez 15 lub 60 minut.

4. Zbieranie płuc i perfuzja

  1. Eutanazja szczura zgodnie z zatwierdzonymi protokołami (np. inhalacja CO₂ z następującą po niej dyslokacją szyjną). Umieść szczura w pozy

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczna aplikacja tego protokołu powinna generować zgodne dowody z trzech uzupełniających się odczytów: parowanie frakcji scRNA-seq, cytometria przepływowa oparta na reporterach i przetwarzanie obrazów confocal z-stack.

W analizie parowania frakcji scRNA-seq frakcje Cy5.5⁻ i Cy5.5⁺ pojedynczych komórek płuc zostały odzyskane po systemowej podaniu cR11A-Cy5.5 i przeanalizowane oddzielnie. Wizualizacja UMAP zidentyfikowała główne populacje komórek płuc, w tym układ odpornościowy, śródbłonek, nabłonek i mezenchymalny (Rysunek 1A, B). Chociaż komórki odpornościowe stanowiły dominującą populację w obu posortowanych frakcjach, frakcja Cy5.5⁺ wykazywała względne wzbogacenie kompartmentów nieimmunologicznych, w tym komórek nabłonkowych (Rysunek 1C). Analiza podzbioru nabłonka wykazała większą reprezentację komórek AT2 w frakcji Cy5.5⁺ niż w frakcji Cy5.5⁻, podczas gdy komórki AT1 pozostały niskie w obu frakcjach (Rysunek 1D). Wyniki te wskazują, że parowanie frakcji scRNA-seq może wykryć wzbogacenie komórek AT2 w frakcji komórek płuc dodatnich dla cR11A-Cy5.5.

Cytometria przepływowa została wykorzystana do ilościowego określenia sygnału cR11A-Cy5.5 w komórkach AT2 zdefiniowanych przez reportera. Reprezentatywne bramki obejmowały selekcję wszystkich komórek przez FSC-A/SSC-A, dwie sekwencyjne bramki pojedyncze, bramki komórek żywych i końcową analizę GFP versus. Cy5.5 (Rysunek 2A–E). W próbce kontrolnej zdarzenia GFP⁺/Cy5.5⁺ były minimalne, ustanawiając próg fluorescencji tła. Po podaniu cR11A-Cy5.5 zdarzenia GFP⁺/Cy5.5⁺ reportera AT2 dodatnie wzrosły do 7,99% w 15 min. i 7,41% w 60 min. po iniekcji w tym reprezentatywnym zestawie danych (Rysunek 2E). Wyniki te potwierdzają wykrywalny sygnał cR11A-Cy5.5 w komórkach reportera AT2 dodatnich in vivo.

Przetwarzanie obrazów confocal z-stack zapewnia przestrzenną weryfikację fluorescencji związanej z peptydem w sekcjach tkanki płucnej. Dodano kontrolę bez reportera, aby ocenić fluorescencję tła i wykazała minimalny sygnał w kanałach GFP i Cy5.5. W płucach reportera AT2 po leczeniu cR11A-Cy5.5 fluorescencję Cy5.5 wykryto w pobliżu komórek reportera AT2 dodatnich dla GFP⁺ i wygenerowany kanał Imaris kolocalizacji wykrył nakładanie się sygnałów GFP i Cy5.5 (Rysunek 3A). Reprezentatywna analiza kolocalizacji Imaris wykazała 89,6% i 86,8% kolocalizacji w zespole GFP⁺ AT2 w 15 min. i 60 min. odpowiednio (Rysunek 3B).

Niedostateczne wyniki mogą obejmować wysoką fluorescencję tła Cy5.5 w próbkach kontrolnych, słabe odzyskiwanie komórek nabłonkowych, niską żywotność komórek lub słabe rozdzielenie zdarzeń GFP⁺/Cy5.5⁺. Te problemy zwykle wskazują na niekompletną perfuzję, nadmierną dyrupcję tkanki, nieodpowiednie kompensację lub niekonsekwentne progi obrazu.

figure-results-1
Rysunek 1: Parowanie frakcji scRNA-seq wykrywa wzbogacenie nabłonka pęcherzykowego w frakcji płuc dodatnich dla cR11A-Cy5.5. Suspensje pojedynczych komórek płuc zostały posortowane na frakcje Cy5.5⁻ i Cy5.5⁺ po retro-orbitalnym wstrzyknięciu cR11A-Cy5.5 i każda frakcja została przeanalizowana przez sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek. (A) Wykresy UMAP pokazują klastry typów komórek w dopasowanych frakcjach od reprezentatywnej myszy. (B) Nakładanie UMAP pokazuje rozkład komórek Cy5.5⁻ i Cy5.5⁺. Obwężone obszary w (A) i (B) wskazują kompartment nabłonkowy podkreślony do analizy podzbioru nabłonka. (C) Populacje odpornościowe są bardzo rozpowszechnione w obu frakcjach, reprezentując ponad 80% każdej z nich. W porównaniu z frakcją Cy5.5⁻, frakcja Cy5.5⁺ zawiera większą proporcję populacji śródbłonkowych, nabłonkowych i mezenchymalnych, co wskazuje na wzięcie cR11A do tych populacji. (D) W populacji nabłonkowej komórki AT2 są bardziej reprezentowane w frakcji Cy5.5⁺ niż w frakcji Cy5.5⁻, podczas gdy komórki AT1 pozostają niskie w obu frakcjach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół identyfikuje ukierunkowanie peptydów na określone populacje komórek przy użyciu wielu niezależnych pomiarów działających na uzupełniających się poziomach rozdzielczości: mapowanie na poziomie transkryptomu (sparowanych frakcji scRNA-seq), pomiar ilościowy oparty na zdarzeniach (cytometria przepływowa reporterowa) i potwierdzenie przestrzenne (konfokalne stosy z-stacks). Razem te podejścia zmniejszają typowe niejednoznaczności związane z badaniami opartymi na fluorescencji lub rozkładzie biomasy w skali całych narządów, takie jak myląca fluorescencja naczyń krwionośnych lub zatrzymanie pozakomórkowe, a także niemożność przypisania sygnału związanego z peptydem do określonych populacji komórek płuc7.

Kilka kroków wymaga szczególnej uwagi. Jakość perfuzji wpływa mocno na tło fluorescencji i wydajność sortowania; wystarczająca perfuzja charakteryzuje się jednolitym, kości słoniowa kolor wszystkich płatów płuc, podczas gdy niekompletna perfuzja może podwyższyć sygnał Cy5.5 w niesamocelowych przedziałach. W celu dissociacji tkanki stosuje się przedłużoną zimną trawienie (4 °C, 20 h) zamiast typowych warunków trawienia (37 °C, 1–2 h), aby zachować populacje nabłonkowe i poprawić odzyskiwanie delikatnych komórek, szczególnie komórek płuc typu I (AT1)10. Komórki AT1 są łatwo tracić podczas izolacji, ponieważ ich duża, cienka morfologia sprawia, że są bardzo wrażliwe na trawienie mechaniczne. Poza standardowymi praktykami laboratoryjnymi, w tym spójnym trawieniu, kompensacją, bramkowaniem i ustawianiem progów, 3D analiza lokalizacji pomaga określić, czy sygnał peptydowy nakłada się na sygnał reportera AT2, zamiast polegać wyłącznie na dwuwymiarowej nakładce fluorescencji13.

Krok deplecji komórek odpornościowych CD45⁺ można rozważyć przed ilościowym wyznaczeniem scRNA-seq lub cytometrią przepływową. Komórki odpornościowe stanowią dużą część populacji komórek płuc i mogą pobierać CPP jako część typowej odpowiedzi odpornościowej na obce cząstki. Aby dokładniej określić pobór CPP w populacjach nie-odpornościowych, w tym układów naczyniowych, nabłonkowych i mezenchymalnych, deplecja komórek CD45⁺ może poprawić czułość. Można to osiągnąć za pomocą deplecji na perłach przed sortowaniem lub wykluczając komórki CD45⁺ podczas analizy cytometrii przepływowej12. Jednak tę modyfikację należy stosować wybiórczo, ponieważ usuwa informacje o poborze przez komórki odpornościowe i zmienia skład komórkowy analizowanej próbki.

Należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń tego przepływu pracy. Fluorescencja Cy5.5 identyfikuje sygnał związany z peptydem, ale sama nie odróżnia zinternalizowanego peptydu od sygnału adhezji do membrany lub sygnału okołokomórkowego. Sparowane frakcje scRNA-seq są również wpływane przez dissociację tkanki, odzyskiwanie komórek, progi sortowania i względną obfitość każdej populacji komórek płuc. Dlatego rzadkie populacje, takie jak komórki podstawne lub jonocyty, mogą być niedoreprezentowane lub pominięte. Cytometria przepływowa myszy reportera zapewnia silniejsze przypisywanie typów komórek, ale wymaga odpowiedniej linii reportera lub zweryfikowanego panelu przeciwciał. Ponadto kontrola pojazdu z użyciem myszy reportera lepiej określiłoby tło nakładki w komórkach AT2 bez GFP w badaniach obrazowania. W związku z tym interpretacja powinna opierać się na zgodnych dowodach z scRNA-seq, cytometrii przepływowej i konfokalnego obrazowania, a nie na pojedynczym pomiarze.

Ten przepływ pracy jest modułowy i może być dostosowany do alternatywnych fluoroforów, linii myszy reporterowych, schematów dawkowania lub punktów czasowych zbioru. W przypadku badań rozwijających dodatkowe CPP specyficzne dla komórek lub narządów, projekt sparowanych frakcji scRNA-seq można zastosować z modyfikacjami do innych narządów (np. wątroba, nerki lub mózg). Ten protokół zapewnia wydajne podejście do porównywania populacji związanych z peptydami w pojedynczym narządzie tego samego zwierzęcia, poprawiając w ten sposób interpretowalność i zmniejszając zmienność między zwierzętami. Przyszłe zastosowania obejmują przesiewanie dodatkowych CPP, testowanie połączeń CPP-ładunku, porównywanie liniowych i cyklicznych projektów peptydów oraz stosowanie przepływu pracy do modeli chorobowych, w których architektura tkanki lub obfitość komórek docelowych jest zmieniona.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To dzieło było wspierane przez grant NHLBI R01 HL153407, grant NIH HL092961 i grant NHLBI F32 HL175907.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anti-mouse CD45-BV605 antibodyBioLegend103140Używany do identyfikacji lub wykluczenia komórek CD45+
C57BL/6J myszyThe Jackson LaboratoryStrain #000664Myszy dzikiego typu używane w eksperymentach
CD45 MicroBeads, myszMiltenyi Biotec130-052-301Używane do magnetycznego usuwania komórek CD45+
Licznik komórekInvitrogenCountess 3; AMQAX2000Automatyczne liczenie komórek
Inkubator CO2Thermo ScientificHeracell VIOS 160i; TSH160IDSInkubacja komórek
Mikroskop konfokalnyZeissLSM 980; 1872-551Używany do zdobywania obrazów z-stack
Peptyd cR11A-Cy5.5Mayo Clinic Proteomics CoreSynteza na zamówienie; brak numeru katalogowegoFluorescencyjnie oznaczony CPP stosowany do dostarczania in vivo
KriostatyLeica BiosystemsLeica CM1950Używane do przekrojów tkanki
Dispase IISigma-AldrichD4693-1GEnzym stosowany do trawienia tkanki płucnej
DMEM/F12Gibco11330-032Bufor do dysocjacji i płukania komórek
DNase IRoche10104159001Zmniejsza skupianie komórek związane z DNA
Sorter komórek FACSBD BiosciencesBD FACSAria II, 4-laserowy systemUżywany do sortowania komórek Cy5.5+ i Cy5.5-
FBSGibcoA52567-01Dodawane do buforów w celu poprawy żywotności komórek
Oprogramowanie FlowJoFlowJoWersja 10.10.0Analiza danych cytometrii przepływowej
Oprogramowanie GraphPad PrismGraphPad SoftwareWersja 10Analiza statystyczna i rysowanie wykresów
Oprogramowanie ImarisOxford InstrumentsWersja 9.9.13D wizualizacja i analiza kolokalizacji
Inkubator z orbitalnym mieszadłemThermo ScientificSolaris; 01-258-086Używany do trawienia tkanki
KetaminaWestWard (Hikma)NDC 0143-9508-01
LD ColumnsMiltenyi Biotec130-042-901Używane do magnetycznej separacji komórek (MACS)
LD ColumnsMiltenyi Biotec130-042-901
Zestaw do barwienia komórek martwych zieloną substancją Live/dead fixable yellow dead cell stain kitInvitrogenL34968Używany do barwienia żywotności w cytometrii przepływowej
Zestaw do barwienia komórek martwych zieloną substancją Live/dead fixable yellow dead cell stain kitInvitrogenL34968
Myszy reporterowe LSL-GFPThe Jackson LaboratoryStrain #007906Linia reporterowa GFP indukowana Cre
Myszy reporterowe LSL-GFPThe Jackson LaboratoryStrain #007906
MikrowirówkaEppendorfEPP-5427RCentryfugacja próbek
MikrowirówkaEppendorfEPP-5427R
Środek montujący z DAPIAbcamAB104139Kontrabarwienie jąder do obrazowania
Środek montujący z DAPIAbcamAB104139
Woda bez nukleazyQiagen175034992
Igła do oraznej intubacjiBraintree ScientificN-PK 020
PBSGibco10010-023Ogólny bufor do płukania
PBSGibco10010-023
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122Zapobiega zakażeniom bakteryjnym
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
Chłodzona wirówkaThermo ScientificST16R; TSST16RPeleczkowanie komórek w kontrolowanej temperaturze
Chłodzona wirówkaThermo ScientificST16R; TSST16R
SalinaBaxter2F7124
Myszy Sftpc-CreERT2The Jackson LaboratoryStrain #028054Linia indukcji Cre specyficzna dla AT2
Myszy Sftpc-CreERT2The Jackson LaboratoryStrain #028054
Myszy reporterowe Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2Hodowla wewnętrznaUzyskane przez skrzyżowanie myszy Sftpc-CreERT2(+/+) z myszami LSL-GFP(+/+)Używane do specyficznego dla AT2 barwienia GFP
Myszy reporterowe Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2Hodowla wewnętrznaUzyskane przez skrzyżowanie myszy Sftpc-CreERT2(+/+) z myszami LSL-GFP(+/+)
Szylka jedwabnaLookSP117
Usługa sekwencjonowania RNA pojedynczych komórekMayo Clinic Genome Analysis Corehttps://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/servicesPrzygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie
Usługa sekwencjonowania RNA pojedynczych komórekMay

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki nab onka p cherzyk w p ucnychsekwencjonowanie RNA pojedynczych kom rekcytometria przep ywowaobrazowanie konfokalnesortowanie kom rekkrioprzekroje p uc

Powiązane artykuły