Tu prezentujemy protokół wykorzystania mikro-TK do ilościowej oceny cech włóknienia płuc indukowanego bleomycyną w modelu fretki. Ten model fretki wykazuje silny potencjał translacyjny dla zrozumienia włóknienia płuc i testowania nowych terapii.
Artykuł metodologiczny
* These authors contributed equally
Tu prezentujemy protokół wykorzystania mikro-TK do ilościowej oceny cech włóknienia płuc indukowanego bleomycyną w modelu fretki. Ten model fretki wykazuje silny potencjał translacyjny dla zrozumienia włóknienia płuc i testowania nowych terapii.
Fibroza płuc (PF) to przewlekła i postępująca choroba płuc charakteryzująca się wielokrotnym uszkodzeniem pęcherzyków płucnych prowadzącym do pogrubienia parenchymy, przetoczeniu i upośledzeniu oddychania. Obecne modele na gryzoniach, szczególnie te wykorzystujące bleomycynę (BLEO), mają ograniczone znaczenie translacyjne dla ludzkiej idiopatycznej fibrozy płuc (IPF) ze względu na różnice anatomiczne, takie jak brak oskrzeli oddechowych. Aby zapobiec tej ograniczoności, opracowałeśmy duży model zwierzęcy fibrozy płuc u fretek, które posiadają oskrzela oddechowe podobne do tych u ludzi. Trzymiesięczne fretki dzikiej populacji otrzymały wewnątrztchawicze podanie BLEO. Płuca były pobrane 8 tygodni po leczeniu w celu wykonania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT) oraz oceny histologicznej. Ze względu na ograniczoną rozdzielczość przestrzenną wielodetyktorowej tomografii komputerowej (MDCT) w wizualizacji drobnych oskrzeli fretek, wycięte płuca były skanerowane ex vivo za pomocą skanera mikro-CT przy kontrolowanych ciśnieniach w oskrzelach (0 cmH2O i 25 cmH2O) w celu symulacji warunków wydechowych i wziewnych.
Wyniki obrazowania mikro-CT ujawniły wyraźne różnice strukturalne między normalnymi a leczonymi BLEO płucami fretek. Normalne płuca wykazywały niską atenuację i zachowaną architekturę, podczas gdy płuca leczonych BLEO wykazywały znacznie zwiększoną atenuację, co było zgodne z fibrozą. Cechy charakterystyczne dla ludzkiej choroby fibrotycznej płuc, w tym ulitkowane struktury z przestrzeniami torbielowatymi, pogrubienie przegród międzypłaszczyznowych i przejrzyste zacienienia wskazujące na wczesne zmiany fibrotyczne lub zapalne, były widoczne. Za pomocą ilościowej analizy mikro-CT stwierdzono, że oskrzela w płucach fretek leczonych BLEO wykazywały znacznie zmniejszoną radialną ekspansję, rozciąganie wzdłużne i zmianę objętości przy obu zastosowanych ciśnieniach powietrza. Ponadto analiza pokoleniowa wykazała znaczne pogrubienie ścian oskrzeli w regionach z widoczną fibrozą. Ocena histologiczna, w tym barwienie Massona, potwierdziło rozległe odkładanie kolagenu i fibrozę.
Niniejsze badanie wykazuje, że fretki leczone BLEO rozwijają cechy radiologiczne, mechaniczne i histopatologiczne przypominające ludzką fibrozę płuc. Co więcej, mikro-CT umożliwia wysokiej rozdzielczości ocenę rozmieszczenia fibrozy, dynamiki oskrzeli i zmian objętości płuc. Te wyniki podkreślają potencjał fretki jako modelu translacyjnego do badania patogenezy PF i oceny nowych strategii terapeutycznych.
Fibroza płuc (PF) jest przewlekłą i postępującą chorobą międzypęcherzową płuc, w której wielokrotne uszkodzenie pęcherzyków płucnych prowadzi do pogrubienia miąższu płuc, zwłóknienia i postępującego zaburzenia czynności oddechowej1. Fibroza płuc może być wywołana różnymi czynnikami, w tym lekami, toksynami środowiskowymi, infekcjami, podstawowymi chorobami autoimmunologicznymi lub może być idiopatyczna1. Chociaż opracowano leki, które spowalniają postęp choroby, szczególnie dla pacjentów z idiopatyczną fibrozą płuc (IPF), fibroza płuc pozostaje nieuleczalna, ze wskaźnikiem przeżywalności 3–5 lat po rozpoznaniu1,2. W większości przypadków jedynym ostatecznym leczeniem jest przeszczep płuc; dlatego istnieje pilna potrzeba opracowania nowych i bardziej skutecznych opcji terapeutycznych.
Bleomycyna jest lekiem powszechnie stosowanym u ludzi w leczeniu złośliwych nowotworów; jednak jego stosowanie jest ograniczone przez toksyczność dla płuc, która może szybko prowadzić do fibrozy płuc3. Po odkryciu tego działania niepożądanego, bleomycyna była wykorzystywana w badaniach nad modelami zwierzęcymi fibrozy płuc. Myszy były powszechnie używane do tego celu4,5,6 z różnymi metodami podawania bleomycyny, w tym dożylnie i przez tchawiczną instilacje7,8. Chociaż w tych modelach rozwija się fibroza, żaden z nich nie obejmuje wszystkich podstawowych cech fibrozy płuc obserwowanych u ludzi8. Modele zwierzęce fibrozy płuc u gryzoni nie odzwierciedlają kluczowych cech zaawansowanej choroby, w tym tworzenia jasnych cyst i zwłóknienia dalszych pęcherzyków płucnych9. Ponadto badania wykazały, że uszkodzenie płuc indukowane bleomycyną zaczyna się samoistnie ustępować u gryzoni około 28 dni po leczeniu bleomycyną10. Dodatkowo żaden z czynników wykazujących hamowanie fibrozy w tych modelach nie miał równoważnego efektu u ludzi, co ogranicza nasze opcje terapeutyczne11.
Frettki domowe (Mustela putorius furo) są coraz częściej stosowane w badaniach biomedycznych nad układem oddechowym ze względu na ich anatomiczne podobieństwo do ludzkiego układu oddechowego12. Ponadto są one podatne na podobne patogeny układu oddechowego, które infikują ludzi, w tym wirusa RSV i grypę, co pokazuje ich fizjologiczne podobieństwa12. Modele fretek z bleomycyną wykazują zwłóknienie oskrzelików, tworzenie ognisk włóknistych i obecność aberracyjnych komórek przypominających bazoidowe (KRT7+/KRT17+/KRT5–/TP63+)9. Jedna dawka bleomycyny wywołała trwałą fibrozę płuc u fretek, z restrykcyjną fizjologią i włóknistych nieprawidłowościami w płucach trwającymi co najmniej 22 tygodnie13. To stwierdzenie znacząco różni się od powszechnie stosowanego modelu mysiego z bleomycyną, gdzie fibroza jest ogólnie samoograniczająca się i zaczyna ustępować po około 28 dniach, z znaczną regresją występującą w ciągu 6–8 tygodni, co sugeruje, że model fretek może lepiej odzwierciedlać przewlekły i postępujący charakter ludzkiej fibrozy płuc. Co więcej, fretki zostały ostatnio wykorzystane w badaniach nad mukowiscydozą, przewlekłą chorobą układu oddechowego, ze względu na ich podobieństwo do ludzi14. Dlatego te zwierzęta mogą służyć jako lepsze modele PF niż poprzednie modele gryzoni.
Obecne badanie miało na celu opracowanie modelu zwierzęcego fibrozy płuc, który bardziej przypomina ludzką chorobę. Podaliśmy bleomycynę przez tchawiczną instilacje domowym fretkom. Po 8 tygodniach fretki te wykazywały zmiany radiograficzne i histologiczne podobne do tych obserwowanych u ludzi z fibrozą płuc.
Wszystkie procedury zwierzęce przeprowadzano zgodnie z wytycznymi i regulacjami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Zastosowania (IACUC) na Michigan State University (numer zatwierdzenia protokołu dotyczącego zwierząt PROTO202300066). Opieka nad zwierzętami oraz protokoły eksperymentalne zostały zaakceptowane przez Michigan State University i wykonane zgodnie ze standardami instytucjonalnymi dotyczącymi etycznego wykorzystywania zwierząt w badaniach.
1. Bronchoskopijne podawanie bleomycyny fretkom
2. Mikro-TK wysokiej rozdzielczości płuc fretek
3. Przetwarzanie i segmentacja obrazu
Z pięciu fretek, płuca wycięte od jednej zdrowej fretki i jednej z fibrytą zostały przeskane za pomocą skanera mikro-CT przy kontrolowanym ciśnieniu dróg oddechowych wynoszącym 0 cmH2O i 25 cmH2O, aby symulować odpowiednio ekspirium i inspiratoryczne napełnienie płuc.
Rysunek 1 przedstawia pośrednie wyniki przetwarzania obrazu dla obrazu mikro-CT (Rysunek 1A) ex vivo płuca fretki przy ciśnieniu 0 cmH2O. Rysunek 1B przedstawia pośrednie wyniki segmentacji objętości drzewa dróg oddechowych w różnych iteracjach i odpowiednich parametrach progowych na obrazie mikro-CT wyciętego płuca fretki napełnionego do ciśnienia 0 cmH2O. Rysunek 1B demonstruje skuteczność algorytmu FG w wykrywaniu mniejszych dróg oddechowych poprzez relaksację parametrów w późniejszych iteracjach. Rysunek 1C ilustruje wyniki wykrywania centralnej linii drzewa dróg oddechowych przed i po przycinaniu pozornych gałęzi.
Zaobserwowano, że poza piątą generacją, liczba wykrytych dróg oddechowych w fibrytycznych płucach jest znacznie mniejsza niż wykrytych na odpowiedniej generacji w zdrowym płucu (Rysunek 2A). Szczegółowo, 161 gałęzi dróg oddechowych zostało wykrytych w zdrowym płucu poza piątą generacją, podczas gdy tylko 91 dróg oddechowych zostało wykrytych w fibrytycznych płucach na odpowiednich generacjach. Ogólnie rzecz biorąc, ściany dróg oddechowych były grubsze w fibrytycznych płucach w porównaniu ze zdrowym płucem (Rysunek 2B). Analiza obliczeniowa wykazała znaczny wzrost grubości ścian dróg oddechowych normalizowanej do średnicy światła w regionach z widocznie fibrytycznymi zmianami w porównaniu z odpowiadającymi regionami w zdrowym płucu.
Fibrytyczne płuca wykazywały małe, grubościenne cystyczne przestrzenie powietrzne zgodne z ulkami miodówki, zgrubienie przegród międzypłatownych i obszary przezroczystego szkła. Przezroczyste szkło odnosi się do obszarów płuc, gdzie zgrubienie tkanki płucnej i częściowo wypełnione przestrzenie powietrzne sprawiają, że obszar wygląda mglisto i szarą na obrazach CT. Zaobserwowano, że fibrytyczne płuca miały wyższe wartości intensywności CT w parenchymie odpowiadającej fibrytycznym regionom. Rysunek 3A przedstawia "3D przestrzenny widok objętości przestrzeni powietrznej" segmentu parenchymy płuc razem z segmentowanym drzewem dróg oddechowych. Wartości intensywności mikro-CT nad parenchymą w fibrytycznych płucach fretek (-502 ± 238 HU) były znacząco wyższe (p < 0,001) niż w zdrowym płucu fretki (-588 ± 167 HU). Analiza regionalnej podwyższonej intensywności (Rysunek 3B) wykazała, że fibrytyczne płuco ma 27,8% objętości parenchymy z podwyższoną intensywnością CT (wskazana fioletowa powierzchnia na histogramie). Dla porównania, zdrowo płuco ma tylko 1,24% swojej objętości parenchymy z podwyższoną intensywnością CT.
Porównanie wizualne mechaniki dróg oddechowych między normalnymi a chorobowymi płucami ilustruje rozkład biomarkerów mechanicznych dróg oddechowych u zdrowych i fibrytycznych fretek w poszczególnych gałęziach dróg oddechowych (Rysunek 4). Rozszerzenie promieniowe dróg oddechowych wynoszące 66,8% ± 9,8% zostało zaobserwowane w zdrowych płucach fretek, co było znacząco wyższe (p < 0,001) niż zaobserwowane w fibrytycznych płucach fretek (32,4% ± 7,6%). Znacząca różnica (p < 0,001) w podłużnym rozciąganiu dróg oddechowych została również zaobserwowana między zdrowymi (35,7% ± 5,3%) a fibrytycznymi (16,0% ± 4,9%) płucami fretek.
Przedstawicielskie obrazy CT zostały zdobyte za pomocą skanera mikro-CT przy dwóch różnych ciśnieniach dróg oddechowych (0 cmH2O i 25 cmH2O) dla każdego płuca. Rysunek 5 ilustruje różnice między normalnymi (Rysunek 5B,C) i leczonymi BLEO fretkami płucami (Rysunek 5E,F). W normalnych płucach, skanowanie CT pokazuje typową architekturę płuc z niską atenuacją i bez oznak fibrozy (Rysunek 5B,C). Natomiast, fretki leczone BLEO wykazują znaczące zmiany patologiczne, w tym zwiększoną atenuację płuc, co wskazuje na fibrozę tkanki (Rysunek 5E,F). Dodatkowo, obserwuje się wyraźne ułki miodówki charakteryzujące się cystycznymi przestrzeniami i zgrubieniem przegród międzypłatownych (Rysunek 5E,F). Przezroczyste
Niniejsze badanie opisuje protokół łączący dotleniakowanie bleomycyny przez przewód oddechowy u fretek z wysokorozdzielczym mikrotomografem komputerowym ex vivo (mikro-TK) w celu scharakteryzowania cech strukturalnych i mechanicznych przewlekłej fibrozy płuc. Mikro-TK może wykrywać małe drogi oddechowe o średnicy do 0,2 mm i mierzyć objętości, grubość dróg oddechowych, gęstość i morfologię. Zwiększona gęstość tkanki, utrata objętości i regionalna heterogeniczność są ściśle zgodne z wynikami badań histopatologicznych. Głównym celem było ustalenie wykonalności i udowodnienie, że ten model na dużych zwierzętach wraz z zaawansowanymi analizami obrazowymi może uchwycić cechy radiologiczne, dróg oddechowych i histopatologiczne, które przypominają ludzką przewlekłą fibrozę płuc. Kilka kroków w protokole jest kluczowych dla możliwości powtórzenia i interpretacji. Po pierwsze, bronchoskopowo ukierunkowana instillacja bleomycyny przez przewód oddechowy umożliwia rozproszone narażenie płuc, minimalizując jednocześnie gromadzenie się w bliższych drogach oddechowych, co jest znaną wadą modeli na małych zwierzętach4,7,11. Takie podejście prawdopodobnie zmniejsza zmienność w regionalnym rozkładzie uszkodzeń, co jest szczególnie istotne w większych płucach o bardziej złożonych rozgałęzieniach dróg oddechowych. Po drugie, wybór 8-tygodniowego punktu czasowego po instilacji sprzyja ustalonym się zwłóknieniom nad ostrą inflamacją. W modelach mysich fibroza indukowana bleomycyną często częściowo ustępuje z czasem, co ogranicza istotność translacyjną4,8,11. W przeciwieństwie do tego, płuca fretek w tym badaniu wykazywały trwałe cechy radiologiczne i histologiczne fibrozy.
Kontrolowana inflacja płuc podczas wykonywania obrazów ex vivo stanowi kolejny kluczowy element. Obrazowanie przy znormalizowanych ciśnieniach w drogach oddechowych (0 cmH₂O i 25 cmH₂O) umożliwiło ilowane określenie radialnego rozszerzenia dróg oddechowych i ich podłużnego rozciągania, co zmniejszyło efekty przesądzające spowodowane zmienną objętością płuc i ich sprężystością. Te wskaźniki mechaniczne dróg oddechowych, uzyskane za pomocą zautomatyzowanych, dopasowanych algorytmów, dostarczają obiektywnych miar dysfunkcji dróg oddechowych, które są trudne do oceny wyłącznie za pomocą konwencjonalnej histologii15,21.
Kilka modyfikacji protokołu może jeszcze bardziej zwiększyć ich odporność. Dawkowanie bleomycyny można byłoby stopniować lub podawać w powtarzanych małych dawkach, aby lepiej modelować przewlekłe uszkodzenia nabłonka, które są centralne dla obecnych paradygmatów patogenezy przewlekłej fibrozy płuc1,3. Segmentowe strategie instilacji mogą umożliwić porównanie pomiędzy zwłkniętymi a stosunkowo zachowanymi regionami w obrębie jednego zwierzęcia. Z punktu widzenia obrazowania, staranne standaryzowanie ciśnienia w drogach oddechowych, warunków fiksacji i temperatury jest istotne, aby zminimalizować odkształcenie tkanek podczas skanowania ex vivo. Ciężka fibroza może komplikować zautomatyzowaną segmentację dróg oddechowych z powodu ich obliteracji i wysokiej gęstości tkanki; dlatego adaptacyjna progowanie i ręczna kontrola jakości pozostają istotnymi dodatkami do zautomatyzowanych potoków przetwarzania15.
Ta metoda ma kilka ograniczeń. Co do zasady, niewielka liczba zwierząt obrazowanych za pomocą mikro-TK ogranicza wnioskowanie statystyczne, a wyniki należy interpretować jako opisowe. Praca ta została zaprojektowana jako pilotażowe badanie, aby określić wykonalność charakteryzacji indukowanemu przez bleomycynę modelowi przewlekłej fibrozy płuc u fretek za pomocą ilościowego mikro-TK. Przyszłe badania z większymi grupami pacjentów będą potrzebne, aby zweryfikować te wyniki i poprawić moc statystyczną. Jednak opis pokazuje zauważalną różnicę w wskaźnikach i pomiarach obrazowych.
Ponadto, mimo że szeroko stosowana, fibroza indukowana bleomycyną pozostaje modelem urazu spowodowane toksyną i nie w pełni odwzorowuje wieloczynnikową etiologię idiopatycznej fibrozy płuc, w tym starzenia się, genetycznej podatności i ekspozycji na czynniki środowiskowe3,6,11. Obrazowanie przeprowadzono ex vivo, co wyklucza bezpośrednią ocenę wymiany gazów, wkładu naczyń krwionośnych i postęp choroby w czasie. Mimo to, mikro-TK ex vivo oferuje lepszą rozdzielczość przestrzenną i umożliwia szczegółową trójwymiarową analizę małych dróg oddechowych, która nie jest obecnie osiągalna za pomocą klinicznego wielodetektorowego TK u fretek.
Mimo tych ograniczeń, protokół ten oferuje kilka zalet w porównaniu z istniejącymi modelami. Fretki posiadają oskrzela oddechowe i wzorce rozgałęziania dróg oddechowych, które bardziej przypominają te u ludzi niż u gryzoni
MATK otrzymał honorarium jako konsultant od InflaRx za udział w Radzie Doradczej IMV/ECMO dla hospitalizowanych pacjentów z COVID-19 w 5/2024. Te opłaty zostały przekazane na rzecz Corewell Health Foundation.
Autorzy deklarują, że wsparcie finansowe zostało otrzymane na badania, autorstwo i/lub publikację tego artykułu. Finansowanie tego badania zostało w części zapewnione dzięki grantowi R01 HL153165-01A1 (dla X.P.L.) oraz Funduszowi Badań Pediatrycznych Dziecięcego Szpitala Helen DeVos.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 mL Luer locking syringe | BD | 309628 | |
| 10 mL Luer locking syringe | BD | 303134 | |
| 24 G ´ 3/4" Exel safelet catheter | EXELINT INTERNATIONAL CO. | 26751 | |
| 3 mL Luer locking syringe | BD | 309657 | |
| 30 mL Luer locking syringe | BD | 302832 | |
| 5 mL Luer locking syringe | BD | 309647 | |
| BD Precision glide needle 18 G ´ 1 1/1" | BD | 305196 | |
| BD Precision glide needle 20 G ´ 1" | BD | 305175 | |
| BD Precision glide needle 23 G ´ 1" | BD | 305145 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS -/-) | Gibco | 14190250 | |
| Endotracheal intubation tubes with cuff oxygen catheter | Caphstion | 2.0MM | |
| ET Tube, Uncuffed, 2.0 | Teleflex | 5-10404 | |
| Ethicon Permahand silk suture, Size 2-0, No Needle, 18", 36/Box, A185H | Fisher Scientific | 50-209-2809 | |
| Invitrogen RNAlater stabilization solution | Fisher Scientific | AM7021 | |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Lubricant PM ointment | AACE Pharmaceuticals | 71406-124-35 | Maści okulistyczna |
| MADgic 700 atomizer | Teleflex | MAD700 | |
| Manometer, Professional air pressure meter | Leaton | T168 | |
| Rodent ventilator model 683 | Harvard Apparatus, Inc. | 55-3438 | |
| Sterile saline, 0.9% | CellPro | DS0329 | |
| Veterinary pulse oximeter | uPM60V | UVMI |
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie