Ten protokół umożliwia reprodukowalną wizualizację kropli lipidowych i dynamiki organelli podczas mitozy z wykorzystaniem zsynchronizowanych komórek hepatomu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda oparta na fluorescencji do wizualizowania dynamiki kropelek lipidowych i organelli podczas mitozy w komórkach hepatoma
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kropki lipidowe wewnątrzkomórkowe (LDs) są powszechne w wielu typach komórek. LDs gromadzą neutralne lipidy, takie jak trigliceryd i ester cholesterolu i odgrywają ważną rolę w metabolizmie energetycznym, przekaźnictwie sygnałowym i reakcjach na stres. Mimo że LDs są rozpoznawane jako organelle wewnątrzkomórkowe, ich zachowanie podczas progresji cyklu komórkowego pozostaje niejasne. Podczas mitozy, kilka organelli, w tym mitochondria i aparat Golgiego, przechodzi rozległe przekształcenia i następnie ponowne zespolenie, co rodzi pytanie, czy LDs również przechodzą zmiany zależne od cyklu komórkowego. Ponieważ LDs mogą służyć jako źródła energii i centra przekaźnikowe, wyjaśnienie ich dynamiki podczas mitozy ma szczególne znaczenie. Aby to osiągnąć, przedstawiamy protokół, który łączy synchronizację cyklu komórkowego z fluorescencyjnym barwieniem LDs w komórkach hepatomu. Komórki są zsynchronizowane na granicy G2/M przy użyciu podejścia opartego na inhibitorze kinazy zależnej od cykliny, uwolnione do cyklu komórkowego i pobrane w określonych punktach czasowych. LDs są następnie oznaczane neutralnym barwnikiem lipidowym i wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda zapewnia powtarzalne podejście do badania redystrybucji LDs podczas mitozy i może być szeroko stosowana w badaniach biologii organelli, regulacji metabolicznej i fizjologii komórek nowotworowych.
Wprowadzenie
Cykl komórkowy to wydarzenie bardzo skoordynowane, które zapewnia dokładne duplikację i segregację chromosomowego DNA1,2, w czasie którego organelle wewnątrzkomórkowe są dynamicznie reorganizowane3. Składa się z czterech głównych faz: G1, S, G2 i M1,2. Podczas mitozy, zduplikowane chromosomy wyrównując się na płaszczyźnie równikowej wrzeciona dwubiegunowego są następnie przenoszone do dwóch komórek potomnych4. Organelle takie jak mitochondria i aparat Golgiego ulegają rozległym przebudowom podczas mitozy5,6,7,8. Te organelle ulegają fragmentacji na małe wezykuły przed rozdzieleniem między dwiema komórkami potomnymi, gdzie ponownie łączą się w trakcie postępowania przez kolejny cykl komórkowy3.
Kropele lipidowe (LDs) to zawierające neutralne lipidy organelle zbudowane z rdzenia z neutralnymi lipidami otoczonego warstwą fosfolipidów. Są powiązane z różnorodnymi białkami i są szeroko rozpowszechnione w wielu typach komórek, włączając komórki proliferacyjne9,10. Skład białkowy i lipidowy LDs zmienia się w zależności od rodzaju komórki i tkanki11. Wśród tych białek rodzina perilipin (PLIN) została szczegółowo przebadana, a PLIN2 stabilizuje LDs w hepatocytach12,13. Oprócz stabilizacji strukturalnej, białka rodziny PLIN są zaangażowane w regulację dynamiki LDs i interakcje z innymi komponentami komórkowymi14. LDs funkcjonują nie tylko jako magazyny dla triacyloglicerolów i cholesteryl esterów, ale także jako centra metabolizmu energii15, szlaków sygnałowych16 i adaptacji do stresu17. W patologicznych warunkach, takich jak stłuszczeniowe zapalenie wątroby związane z dysfunkcją metaboliczną (MASH, wcześniej określane jako NASH), gromadzenie LDs jest znacznie zwiększone w porównaniu ze zdrowym kontrolnym18,19, co podkreśla jego znaczenie w biologii choroby. Jednak tylko ograniczona liczba obserwacji lokalizacji przestrzennej LDs w dzielących się komórkach była dostępna, pomimo rozległych badań nad dynamiką mitochondriów, retikulum endoplazmatycznego i aparatu Golgiego podczas mitozy. Analizowaliśmy lokalizację LDs podczas mitozy, stosując metodę przedstawioną tutaj. Wcześniej zgłaszamy, że LDs wykazywały wzorce rozmieszczenia przestrzennego odmienne od tych innych organelli wewnątrzkomórkowych20.
Tutaj, dostarczamy szczegółowy protokół do badania rozmieszczenia LDs i innych organelli wewnątrzkomórkowych podczas mitozy w komórkach hepatoma. Metoda obejmuje synchronizację cyklu komórkowego i fluorescencyjne barwienie, umożliwiające powtarzalną wizualizacje dynamiki LDs podczas mitozy. Reprezentatywne wyniki pokazują, że LDs wykazują zależne od cyklu komórkowego zmiany w rozmieszczeniu przestrzennym między interfazą a mitozą, ułatwiając porównawczą analizę lokalizacji LDs podczas podziału komórki. To podejście może być szeroko zastosowane do badania lokalizacji organelli, dynamiki i regulacji metabolicznej zarówno w fizjologicznych jak i patologicznych kontekstach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Roztwory bazowe wymagane do tego protokołu
- Przygotuj 24% (w/v) roztwór albuminy krążącej bydlęcej (BSA) wolnej od kwasów tłuszczowych, rozpuszczony w 150 mM NaCl.
- Przygotuj 10 mM roztwór RO-3306 (selektywny inhibitor kinazy zależnej od cykliny 1 (CDK1)), rozpuszczony w DMSO w sterylnych warunkach.
UWAGA: Inne powszechnie stosowane roztwory, takie jak NaOH, NaCl i buforowany roztwór fosforanowy (PBS), zostały przygotowane zgodnie ze standardową praktyką laboratoryjną. PBS został przygotowany przez rozpuszczenie 2,6 g NaH2PO4·2H2O, 29 g Na2HPO4·12H2O, 80 g NaCl i 2,0 g KCl w wodzie destylowanej i dostosowanie końcowej objętości do 1 L.
2. Przygotowanie kwasu oleinowego skonjugowanego z BSA
- Umieść 90 mg kwasu oleinowego w 50-ml becherce i dodaj 2 ml etanolu (99,5%) w celu jego rozpuszczenia.
- Dodaj 100 μL 5 N NaOH do roztworu i mieszaj do pełnego wymieszania.
- Odparuj etanol pod strumieniem gazu azotowego.
- Dodaj 10 mL 150 mM NaCl i inkubuj mieszaninę w 60 °C przez 5 min.
- Dodaj 12,5 mL lodowato schłodzonego 24% (w/v) BSA stock solution powoli, kroplą po kropli, do roztworu kwasu oleinowego (2,4) i delikatnie mieszaj mieszaninę ciągle przez 10 min, aby umożliwić stopniowe i jednorodne mieszanie w temperaturze pokojowej.
- Dostosuj pH do 7,4 i doprowadź końcową objętość do 25 mL za pomocą 150 mM NaCl. Końcowe stężenie kwasu oleinowego wynosi 12,8 mM.
- Przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 μm w sterylnych warunkach i przechowuj porcje w 4 °C przez maksymalnie 2 tygodnie lub w -20 °C dla dłuższego przechowywania.
3. Synchronizacja komórek na granicy G2/M
- Przygotuj niezbędne kontrole.
- Przygotuj nieleczone komórki asymetryczne bez leczenia RO-3306 jako kontrolę bazowej linii.
- Dla warunków leczonych kwasem oleinowym, przygotuj komórki leczone kwasem oleinowym bez synchronizacji jako kontrolę bazowej linii.
- Dla barwienia fluorescencyjnego, wykonaj kontrole pojedynczego barwienia dla każdego fluoroforu w celu zweryfikowania specyficzności sygnału i wykluczenia nakładania się widma między kanałami (Dodatkowa Figura 1).
- Zdobądź obrazy używając ustawień nabywania sekwencyjnego lub odpowiednich konfiguracji filtrów, aby zminimalizować nakładanie się widma i przesłuchiwanie między kanałami.
UWAGA: Te kontrole są niezbędne do rozróżnienia zmian zależnych od cyklu komórkowego od bazowej dystrybucji organelli i do walidacji specyficzności fluorescencji.
- Utrzymuj komórki HuH7 w zmodyfikowanym przez Dulbecco medium Eagle uzupełnionym o 10% fetalnego surowicy wołowej, 100 U/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny w 37 °C w inkubatorze CO2 5%.
- Umieść szklaną pokrywkę w 35-mm naczyniu hodowli. Zasiaj 2 × 105 komórek na każde 35-mm naczynie w opisanym powyżej medium i inkubuj komórki przez noc w 37 °C w inkubatorze CO2 5%.
- Przepłucz komórki dwa razy PBS, a następnie inkubuj z świeżym medium zawierającym 9 μM RO-3306 i 0,5 mM kwas oleinowy.
- Inkubuj komórki przez 20 godzin w standardowych warunkach hodowli.
4. Usunięcie reagentu RO-3306 z zsynchronizowanych komórek w celu wejścia w fazę mitotyczną
- Przepłucz komórki (krok 3.4) trzy do pięciu razy z PBS.
- Przepłucz komórki raz z świeżym medium hodowli.
- Inkubuj komórki w świeżym medium przez 1 godzinę w 37 °C w inkubatorze CO2 5% aby umożliwić wejście w mitozę.
UWAGA: Usunięcie RO-3306 pozwala zsynchronizowanym komórkom na wejście w fazę mitotyczną od granicy G2/M. Po spłukaniu reagentu znaczna część komórek wchodzi w fazę mitotyczną w ciągu około 1 godziny, podczas której komórki mitotyczne można zidentyfikować poprzez zaokrąglenie komórek i kondensację chromosomów. Optymalny czas, w którym można obserwować określoną fazę mitozy, może się różnić w zależności od typu komórki i warunków hodowli.
5. Przygotowanie próbki komórek mitotycznych
- Ufiksuj komórki 4% paraformaldehydem w PBS przez 10 min w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Komórki mitotyczne mają tendencję do oderwania się od naczynia; unikaj przepłukiwania przed fiksacją.
UWAGA: W przypadku barwienia PLIN3 komórki zostały fiksowane za pomocą kombinacji 2% paraformaldehydu i 2% glutar
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Synchronizacja komórek hepatoma na granicy G2/M przy użyciu RO-3306
Aby zbadać dynamikę wewnątrzkomórkowych organelli podczas mitozy, RO-3306, selektywny inhibitor CDK1, został użyty do synchronizacji komórek na granicy G2/M20,21. Gdy komórki były leczone inhibitorem CDK1 przez 20 godzin, a następnie przez kolejną godzinę w świeżym pożywie, ponad 50% komórek było zsynchronizowanych na granicy G2/M (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obserwowana redystrybucja LD podczas mitozy sugeruje, że ich pozycjonowanie nie jest losowe, ale jest skoordynowane z reorganizacją cytoszkieletu i postępem cyklu komórkowego. W szczególności wykluczenie LD z obszaru wrzeciona może odzwierciedlać ograniczenia przestrzenne nakładane przez montaż wrzeciona mitotycznego lub aktywne mechanizmy transportu, które utrzymują segregację organelli podczas podziału komórki. W niniejszym badaniu przedstawiamy prosty i powtarzalny sposób przygotowania komórek mitotycznych do barwieni...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie mają żadnych sporów interesów dotyczących treści tego artykułu.
Podziękowania
To badanie zostało wspierane przez Showa University Grant for Young Researchers i JSPS KAKENHI Grant Number 24K10084.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin/EDTA | Wako | 201-16945 | Cell dissociation |
| 10 cm dish | Corning | 430167 | Cell culture |
| 35 mm tissue culture dish | IWAKI | 3000-035 | Cell culture |
| 6 cm tissue culture dish | IWAKI | 3010-060 | Cell culture |
| Anti-PLIN2 (ADRP) antibody | Proteintech | 15294-1-AP | Lipid droplet marker |
| Anti-PLIN3 (TIP47) antibody | Proteintech | 10694-1-AP | Lipid droplet marker |
| Anti-α-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T6199 | Mitotic spindle marker |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Neutral lipid staining |
| Bottle-top filter (0.22 μm) | NEST | WNB343001 | Sterile filtration of OA–BSA solution |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8022 | Blocking reagent |
| Clear nail polish | Commercially available | Not applicable | Sealing coverslips |
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | High-resolution imaging |
| DAPI | Dojindo | 340-07971 | Nuclear staining |
| D-PBS (–) | Wako | 049-29793 | Cell culture |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Wako | 041-30081 | Cell culture medium |
| Ethanol (99.5%) | Wako | 057-00456 | Solvent for oleic acid |
| Fatty acid–free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | Carrier protein for oleic acid |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Medium supplement |
| Fluorescent secondary antibodies (Alexa Fluor–conjugated) | Commercially available | Not applicable | Species-specific secondary antibodies for immunofluorescence |
| FV10-ASW software | Olympus | Not applicable | Image acquisition and processing |
| Glass coverslips (φ15 mm) | Matsunami | 2-176-03 | Cell seeding for microscopy |
| Glass microscope slides | Matsunami | SFF-001 | Glass slides for mounting coverslips |
| Glutaraldehyde (25% solution) | Wako | 073-00536 | Alternative fixation for PLIN3 |
| HuH7 cells | JCRB Cell Bank | JCRB0403 | Human hepatoma cell line |
| LipidTOX Red Neutral Lipid Stain | Invitrogen | H34476 | Alternative lipid droplet stain |
| Nitrogen gas (N2) | Commercially available | Not applicable | Evaporation of ethanol |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1383 | For preparation of oleic acid–BSA conjugates |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Nacalai Tesque | 09154-85 | Fixation |
| Penicillin–Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Phosphate-buffered saline (×10) | Not applicable | Not applicable | Can be substituted with any vendor |
| RO-3306 | Sigma-Aldrich | SML0569 | CDK1 inhibitor for G2/M synchronization |
| SlowFade Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | S36963 | Mounting medium |
| Sodium chloride (NaCl) | Wako | 191-01665 | Preparation of 150 mM NaCl |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Wako | 080-01061 | Used for saponification of oleic acid |
| Tali Cellular Analysis Slides | Thermo | T10794 | Used for cell cycle analysis |
| Tali Image-based Cytometer | Thermo | Not applicable | Used for cell cycle analysis |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Cell permeabilization |
| Widefield fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-9000 | Rapid screening of mitotic cells |
Bibliografia
- Wang, G., Jiang, Q., Zhang, C. The role of mitotic kinases in coupling the centrosome cycle with the assembly of the mitotic spindle. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4111-4122 (2014).
- Asteriti, I. A., De Mattia, F., Guarguaglini, G. Crosstalk between AURKA and PLK1 in mitotic entry and spindle assembly. Front Oncol. 5, 283(2015).
- Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of Cyclin B1-CDK1 coordinates entry to mitosis. Dev Cell. 18 (4), 533-543 (2010).
- Mardin, B. R., Agircan, F. G., Lange, C., Schiebel, E. Plk1 controls the NEK2A-PP1γ antagonism in centrosome disjunction. Curr Biol. 21 (13), 1145-1151 (2011).
- Taguchi, N., Ishihara, N., Jofuku, A., Oka, T., Mihara, K. Mitotic phosphorylation of dynamin-related GTPase DRP1 participates in mitochondrial fission. J Biol Chem. 282 (15), 11521-11529 (2007).
- Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
- Makiyama, T., et al. Trafficking of acetyl-C16-ceramide-NBD with long-term stability and no cytotoxicity into the Golgi complex. Traffic. 16 (5), 476-492 (2015).
- Tang, D., Yuan, H., Vielemeyer, O., Perez, F., Wang, Y. Sequential phosphorylation of GRASP65 during mitotic Golgi disassembly. Biol Open. 1 (12), 1204-1214 (2012).
- Xia, Y., et al. Silencing of ste20-type kinase TAOK1 confers protection against hepatocellular lipotoxicity through metabolic rewiring. Hepatol Commun. 7 (4), e0037(2023).
- Makishima, M., et al. Translation inhibitors induce formation of cholesterol ester-rich lipid droplets. PLoS ONE. 7 (8), e42379(2012).
- Krahmer, N., et al. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1115-1126 (2013).
- Takahashi, K., et al. Glucagon regulates intracellular distribution of adipose differentiation-related protein during triacylglycerol accumulation in the liver. J Lipid Res. 51 (9), 2571-2580 (2010).
- Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids Health Dis. 16 (1), 83(2017).
- Herker, E., Vieyres, G., Beller, M., Krahmer, N., Bohnert, M. Lipid droplet contact sites in health and disease. Trends Cell Biol. 31 (5), 345-358 (2021).
- Krahmer, N., et al. Organellar proteomics and phospho-proteomics reveal subcellular reorganization in diet-induced hepatic steatosis. Dev Cell. 47 (2), 205-221.e7 (2018).
- Ramosaj, M., et al. Lipid droplet availability affects neural stem/progenitor cell metabolism and proliferation. Nat Commun. 12 (1), 7362(2021).
- Cruz, A. L. S., Barreto, E. A., Fazolini, N. P. B., Viola, J. P. B., Bozza, P. T. Lipid droplets: Platforms with multiple functions in cancer hallmarks. Cell Death Dis. 11 (2), 105(2020).
- Mashek, D. G., Khan, S. A., Sathyanarayan, A., Ploeger, J. M., Franklin, M. P. Hepatic lipid droplet biology: Getting to the root of fatty liver. Hepatology. 62 (3), 964-967 (2015).
- Minami, Y., et al. Liver lipophagy ameliorates nonalcoholic steatohepatitis through extracellular lipid secretion. Nat Commun. 14 (1), 4084(2023).
- Makiyama, T., et al. Behavior of intracellular lipid droplets during cell division in Huh7 hepatoma cells. Exp Cell Res. 433 (2), 113855(2023).
- Makiyama, T., Higashi, S., Sakane, H., Nogami, S., Shirataki, H. γ-taxilin temporally regulates centrosome disjunction in a NEK2A-dependent manner. Exp Cell Res. 362 (2), 412-423 (2018).
- Aizawa, R., Ibayashi, M., Mitsui, J., Tsukamoto, S. Lipid droplet formation is spatiotemporally regulated in oocytes during follicular development in mice. J Reprod Dev. 70 (1), 18-24 (2024).
- Ohsaki, Y., Maeda, T., Fujimoto, T. Fixation and permeabilization protocol is critical for the immunolabeling of lipid droplet proteins. Histochem Cell Biol. 124 (5), 445-452 (2005).
- Helps, N., Luo, X., Barker, H., Cohen, P. Nima-related kinase 2 (NEK2), a cell-cycle-regulated protein kinase localized to centrosomes, is complexed to protein phosphatase 1. Biochem J. 349 (Pt 2), 509-518 (2000).
- O'Regan, L., Blot, J., Fry, A. M. Mitotic regulation by nima-related kinases. Cell Div. 2, 25(2007).
- Xie, K., et al. MDT-28/PLIN-1 mediates lipid droplet-microtubule interaction via DLC-1 in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 9 (1), 14902(2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
