Artykuł metodologiczny

Metoda oparta na fluorescencji do wizualizowania dynamiki kropelek lipidowych i organelli podczas mitozy w komórkach hepatoma

DOI:

10.3791/71222

⸱

15 maja 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, Showa Medical University Graduate School of Pharmacy

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół umożliwia reprodukowalną wizualizację kropli lipidowych i dynamiki organelli podczas mitozy z wykorzystaniem zsynchronizowanych komórek hepatomu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kropki lipidowe wewnątrzkomórkowe (LDs) są powszechne w wielu typach komórek. LDs gromadzą neutralne lipidy, takie jak trigliceryd i ester cholesterolu i odgrywają ważną rolę w metabolizmie energetycznym, przekaźnictwie sygnałowym i reakcjach na stres. Mimo że LDs są rozpoznawane jako organelle wewnątrzkomórkowe, ich zachowanie podczas progresji cyklu komórkowego pozostaje niejasne. Podczas mitozy, kilka organelli, w tym mitochondria i aparat Golgiego, przechodzi rozległe przekształcenia i następnie ponowne zespolenie, co rodzi pytanie, czy LDs również przechodzą zmiany zależne od cyklu komórkowego. Ponieważ LDs mogą służyć jako źródła energii i centra przekaźnikowe, wyjaśnienie ich dynamiki podczas mitozy ma szczególne znaczenie. Aby to osiągnąć, przedstawiamy protokół, który łączy synchronizację cyklu komórkowego z fluorescencyjnym barwieniem LDs w komórkach hepatomu. Komórki są zsynchronizowane na granicy G2/M przy użyciu podejścia opartego na inhibitorze kinazy zależnej od cykliny, uwolnione do cyklu komórkowego i pobrane w określonych punktach czasowych. LDs są następnie oznaczane neutralnym barwnikiem lipidowym i wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda zapewnia powtarzalne podejście do badania redystrybucji LDs podczas mitozy i może być szeroko stosowana w badaniach biologii organelli, regulacji metabolicznej i fizjologii komórek nowotworowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cykl komórkowy to wydarzenie bardzo skoordynowane, które zapewnia dokładne duplikację i segregację chromosomowego DNA1,2, w czasie którego organelle wewnątrzkomórkowe są dynamicznie reorganizowane3. Składa się z czterech głównych faz: G1, S, G2 i M1,2. Podczas mitozy, zduplikowane chromosomy wyrównując się na płaszczyźnie równikowej wrzeciona dwubiegunowego są następnie przenoszone do dwóch komórek potomnych4. Organelle takie jak mitochondria i aparat Golgiego ulegają rozległym przebudowom podczas mitozy5,6,7,8. Te organelle ulegają fragmentacji na małe wezykuły przed rozdzieleniem między dwiema komórkami potomnymi, gdzie ponownie łączą się w trakcie postępowania przez kolejny cykl komórkowy3.

Kropele lipidowe (LDs) to zawierające neutralne lipidy organelle zbudowane z rdzenia z neutralnymi lipidami otoczonego warstwą fosfolipidów. Są powiązane z różnorodnymi białkami i są szeroko rozpowszechnione w wielu typach komórek, włączając komórki proliferacyjne9,10. Skład białkowy i lipidowy LDs zmienia się w zależności od rodzaju komórki i tkanki11. Wśród tych białek rodzina perilipin (PLIN) została szczegółowo przebadana, a PLIN2 stabilizuje LDs w hepatocytach12,13. Oprócz stabilizacji strukturalnej, białka rodziny PLIN są zaangażowane w regulację dynamiki LDs i interakcje z innymi komponentami komórkowymi14. LDs funkcjonują nie tylko jako magazyny dla triacyloglicerolów i cholesteryl esterów, ale także jako centra metabolizmu energii15, szlaków sygnałowych16 i adaptacji do stresu17. W patologicznych warunkach, takich jak stłuszczeniowe zapalenie wątroby związane z dysfunkcją metaboliczną (MASH, wcześniej określane jako NASH), gromadzenie LDs jest znacznie zwiększone w porównaniu ze zdrowym kontrolnym18,19, co podkreśla jego znaczenie w biologii choroby. Jednak tylko ograniczona liczba obserwacji lokalizacji przestrzennej LDs w dzielących się komórkach była dostępna, pomimo rozległych badań nad dynamiką mitochondriów, retikulum endoplazmatycznego i aparatu Golgiego podczas mitozy. Analizowaliśmy lokalizację LDs podczas mitozy, stosując metodę przedstawioną tutaj. Wcześniej zgłaszamy, że LDs wykazywały wzorce rozmieszczenia przestrzennego odmienne od tych innych organelli wewnątrzkomórkowych20.

Tutaj, dostarczamy szczegółowy protokół do badania rozmieszczenia LDs i innych organelli wewnątrzkomórkowych podczas mitozy w komórkach hepatoma. Metoda obejmuje synchronizację cyklu komórkowego i fluorescencyjne barwienie, umożliwiające powtarzalną wizualizacje dynamiki LDs podczas mitozy. Reprezentatywne wyniki pokazują, że LDs wykazują zależne od cyklu komórkowego zmiany w rozmieszczeniu przestrzennym między interfazą a mitozą, ułatwiając porównawczą analizę lokalizacji LDs podczas podziału komórki. To podejście może być szeroko zastosowane do badania lokalizacji organelli, dynamiki i regulacji metabolicznej zarówno w fizjologicznych jak i patologicznych kontekstach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Roztwory bazowe wymagane do tego protokołu

  1. Przygotuj 24% (w/v) roztwór albuminy krążącej bydlęcej (BSA) wolnej od kwasów tłuszczowych, rozpuszczony w 150 mM NaCl.
  2. Przygotuj 10 mM roztwór RO-3306 (selektywny inhibitor kinazy zależnej od cykliny 1 (CDK1)), rozpuszczony w DMSO w sterylnych warunkach.
    UWAGA: Inne powszechnie stosowane roztwory, takie jak NaOH, NaCl i buforowany roztwór fosforanowy (PBS), zostały przygotowane zgodnie ze standardową praktyką laboratoryjną. PBS został przygotowany przez rozpuszczenie 2,6 g NaH2PO4·2H2O, 29 g Na2HPO4·12H2O, 80 g NaCl i 2,0 g KCl w wodzie destylowanej i dostosowanie końcowej objętości do 1 L.

2. Przygotowanie kwasu oleinowego skonjugowanego z BSA

  1. Umieść 90 mg kwasu oleinowego w 50-ml becherce i dodaj 2 ml etanolu (99,5%) w celu jego rozpuszczenia.
  2. Dodaj 100 μL 5 N NaOH do roztworu i mieszaj do pełnego wymieszania.
  3. Odparuj etanol pod strumieniem gazu azotowego.
  4. Dodaj 10 mL 150 mM NaCl i inkubuj mieszaninę w 60 °C przez 5 min.
  5. Dodaj 12,5 mL lodowato schłodzonego 24% (w/v) BSA stock solution powoli, kroplą po kropli, do roztworu kwasu oleinowego (2,4) i delikatnie mieszaj mieszaninę ciągle przez 10 min, aby umożliwić stopniowe i jednorodne mieszanie w temperaturze pokojowej.
  6. Dostosuj pH do 7,4 i doprowadź końcową objętość do 25 mL za pomocą 150 mM NaCl. Końcowe stężenie kwasu oleinowego wynosi 12,8 mM.
  7. Przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 μm w sterylnych warunkach i przechowuj porcje w 4 °C przez maksymalnie 2 tygodnie lub w -20 °C dla dłuższego przechowywania.

3. Synchronizacja komórek na granicy G2/M

  1. Przygotuj niezbędne kontrole.
    1. Przygotuj nieleczone komórki asymetryczne bez leczenia RO-3306 jako kontrolę bazowej linii.
    2. Dla warunków leczonych kwasem oleinowym, przygotuj komórki leczone kwasem oleinowym bez synchronizacji jako kontrolę bazowej linii.
    3. Dla barwienia fluorescencyjnego, wykonaj kontrole pojedynczego barwienia dla każdego fluoroforu w celu zweryfikowania specyficzności sygnału i wykluczenia nakładania się widma między kanałami (Dodatkowa Figura 1).
    4. Zdobądź obrazy używając ustawień nabywania sekwencyjnego lub odpowiednich konfiguracji filtrów, aby zminimalizować nakładanie się widma i przesłuchiwanie między kanałami.
      UWAGA: Te kontrole są niezbędne do rozróżnienia zmian zależnych od cyklu komórkowego od bazowej dystrybucji organelli i do walidacji specyficzności fluorescencji.
  2. Utrzymuj komórki HuH7 w zmodyfikowanym przez Dulbecco medium Eagle uzupełnionym o 10% fetalnego surowicy wołowej, 100 U/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny w 37 °C w inkubatorze CO2 5%.
  3. Umieść szklaną pokrywkę w 35-mm naczyniu hodowli. Zasiaj 2 × 105 komórek na każde 35-mm naczynie w opisanym powyżej medium i inkubuj komórki przez noc w 37 °C w inkubatorze CO2 5%.
  4. Przepłucz komórki dwa razy PBS, a następnie inkubuj z świeżym medium zawierającym 9 μM RO-3306 i 0,5 mM kwas oleinowy.
  5. Inkubuj komórki przez 20 godzin w standardowych warunkach hodowli.

4. Usunięcie reagentu RO-3306 z zsynchronizowanych komórek w celu wejścia w fazę mitotyczną

  1. Przepłucz komórki (krok 3.4) trzy do pięciu razy z PBS.
  2. Przepłucz komórki raz z świeżym medium hodowli.
  3. Inkubuj komórki w świeżym medium przez 1 godzinę w 37 °C w inkubatorze CO2 5% aby umożliwić wejście w mitozę.
    UWAGA: Usunięcie RO-3306 pozwala zsynchronizowanym komórkom na wejście w fazę mitotyczną od granicy G2/M. Po spłukaniu reagentu znaczna część komórek wchodzi w fazę mitotyczną w ciągu około 1 godziny, podczas której komórki mitotyczne można zidentyfikować poprzez zaokrąglenie komórek i kondensację chromosomów. Optymalny czas, w którym można obserwować określoną fazę mitozy, może się różnić w zależności od typu komórki i warunków hodowli.

5. Przygotowanie próbki komórek mitotycznych

  1. Ufiksuj komórki 4% paraformaldehydem w PBS przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Komórki mitotyczne mają tendencję do oderwania się od naczynia; unikaj przepłukiwania przed fiksacją.
    UWAGA: W przypadku barwienia PLIN3 komórki zostały fiksowane za pomocą kombinacji 2% paraformaldehydu i 2% glutar

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synchronizacja komórek hepatoma na granicy G2/M przy użyciu RO-3306

Aby zbadać dynamikę wewnątrzkomórkowych organelli podczas mitozy, RO-3306, selektywny inhibitor CDK1, został użyty do synchronizacji komórek na granicy G2/M20,21. Gdy komórki były leczone inhibitorem CDK1 przez 20 godzin, a następnie przez kolejną godzinę w świeżym pożywie, ponad 50% komórek było zsynchronizowanych na granicy G2/M (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obserwowana redystrybucja LD podczas mitozy sugeruje, że ich pozycjonowanie nie jest losowe, ale jest skoordynowane z reorganizacją cytoszkieletu i postępem cyklu komórkowego. W szczególności wykluczenie LD z obszaru wrzeciona może odzwierciedlać ograniczenia przestrzenne nakładane przez montaż wrzeciona mitotycznego lub aktywne mechanizmy transportu, które utrzymują segregację organelli podczas podziału komórki. W niniejszym badaniu przedstawiamy prosty i powtarzalny sposób przygotowania komórek mitotycznych do barwieni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych sporów interesów dotyczących treści tego artykułu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało wspierane przez Showa University Grant for Young Researchers i JSPS KAKENHI Grant Number 24K10084.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0.25% Trypsin/EDTAWako201-16945Cell dissociation
10 cm dishCorning430167Cell culture
35 mm tissue culture dishIWAKI3000-035Cell culture
6 cm tissue culture dishIWAKI3010-060Cell culture
Anti-PLIN2 (ADRP) antibodyProteintech15294-1-APLipid droplet marker
Anti-PLIN3 (TIP47) antibodyProteintech10694-1-APLipid droplet marker
Anti-α-tubulin antibodySigma-AldrichT6199Mitotic spindle marker
BODIPY 493/503InvitrogenD3922Neutral lipid staining
Bottle-top filter (0.22 μm)NESTWNB343001Sterile filtration of OA–BSA solution
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA8022Blocking reagent
Clear nail polishCommercially availableNot applicableSealing coverslips
Confocal microscopeOlympusFV1200High-resolution imaging
DAPIDojindo340-07971Nuclear staining
D-PBS (–)Wako049-29793Cell culture
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Wako041-30081Cell culture medium
Ethanol (99.5%)Wako057-00456Solvent for oleic acid
Fatty acid–free BSASigma-AldrichA7030Carrier protein for oleic acid
Fetal Bovine SerumGibco10270-106Medium supplement
Fluorescent secondary antibodies (Alexa Fluor–conjugated)Commercially availableNot applicableSpecies-specific secondary antibodies for immunofluorescence
FV10-ASW softwareOlympusNot applicableImage acquisition and processing
Glass coverslips (φ15 mm)Matsunami2-176-03Cell seeding for microscopy
Glass microscope slidesMatsunamiSFF-001Glass slides for mounting coverslips
Glutaraldehyde (25% solution)Wako073-00536Alternative fixation for PLIN3
HuH7 cellsJCRB Cell BankJCRB0403Human hepatoma cell line
LipidTOX Red Neutral Lipid StainInvitrogenH34476Alternative lipid droplet stain
Nitrogen gas (N2)Commercially availableNot applicableEvaporation of ethanol
Oleic acidSigma-AldrichO1383For preparation of oleic acid–BSA conjugates
Paraformaldehyde, 4% in PBSNacalai Tesque09154-85Fixation
Penicillin–StreptomycinGibco15140-122Antibiotics
Phosphate-buffered saline (×10)Not applicableNot applicableCan be substituted with any vendor
RO-3306Sigma-AldrichSML0569CDK1 inhibitor for G2/M synchronization
SlowFade Diamond Antifade MountantInvitrogenS36963Mounting medium
Sodium chloride (NaCl)Wako191-01665Preparation of 150 mM NaCl
Sodium hydroxide (NaOH)Wako080-01061Used for saponification of oleic acid
Tali Cellular Analysis SlidesThermoT10794Used for cell cycle analysis
Tali Image-based CytometerThermoNot applicableUsed for cell cycle analysis
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Cell permeabilization
Widefield fluorescence microscopeKEYENCEBZ-9000Rapid screening of mitotic cells

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, G., Jiang, Q., Zhang, C. The role of mitotic kinases in coupling the centrosome cycle with the assembly of the mitotic spindle. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4111-4122 (2014).
  2. Asteriti, I. A., De Mattia, F., Guarguaglini, G. Crosstalk between AURKA and PLK1 in mitotic entry and spindle assembly. Front Oncol. 5, 283(2015).
  3. Gavet, O., Pines, J. Progressive activation of Cyclin B1-CDK1 coordinates entry to mitosis. Dev Cell. 18 (4), 533-543 (2010).
  4. Mardin, B. R., Agircan, F. G., Lange, C., Schiebel, E. Plk1 controls the NEK2A-PP1γ antagonism in centrosome disjunction. Curr Biol. 21 (13), 1145-1151 (2011).
  5. Taguchi, N., Ishihara, N., Jofuku, A., Oka, T., Mihara, K. Mitotic phosphorylation of dynamin-related GTPase DRP1 participates in mitochondrial fission. J Biol Chem. 282 (15), 11521-11529 (2007).
  6. Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
  7. Makiyama, T., et al. Trafficking of acetyl-C16-ceramide-NBD with long-term stability and no cytotoxicity into the Golgi complex. Traffic. 16 (5), 476-492 (2015).
  8. Tang, D., Yuan, H., Vielemeyer, O., Perez, F., Wang, Y. Sequential phosphorylation of GRASP65 during mitotic Golgi disassembly. Biol Open. 1 (12), 1204-1214 (2012).
  9. Xia, Y., et al. Silencing of ste20-type kinase TAOK1 confers protection against hepatocellular lipotoxicity through metabolic rewiring. Hepatol Commun. 7 (4), e0037(2023).
  10. Makishima, M., et al. Translation inhibitors induce formation of cholesterol ester-rich lipid droplets. PLoS ONE. 7 (8), e42379(2012).
  11. Krahmer, N., et al. Protein correlation profiles identify lipid droplet proteins with high confidence. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1115-1126 (2013).
  12. Takahashi, K., et al. Glucagon regulates intracellular distribution of adipose differentiation-related protein during triacylglycerol accumulation in the liver. J Lipid Res. 51 (9), 2571-2580 (2010).
  13. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids Health Dis. 16 (1), 83(2017).
  14. Herker, E., Vieyres, G., Beller, M., Krahmer, N., Bohnert, M. Lipid droplet contact sites in health and disease. Trends Cell Biol. 31 (5), 345-358 (2021).
  15. Krahmer, N., et al. Organellar proteomics and phospho-proteomics reveal subcellular reorganization in diet-induced hepatic steatosis. Dev Cell. 47 (2), 205-221.e7 (2018).
  16. Ramosaj, M., et al. Lipid droplet availability affects neural stem/progenitor cell metabolism and proliferation. Nat Commun. 12 (1), 7362(2021).
  17. Cruz, A. L. S., Barreto, E. A., Fazolini, N. P. B., Viola, J. P. B., Bozza, P. T. Lipid droplets: Platforms with multiple functions in cancer hallmarks. Cell Death Dis. 11 (2), 105(2020).
  18. Mashek, D. G., Khan, S. A., Sathyanarayan, A., Ploeger, J. M., Franklin, M. P. Hepatic lipid droplet biology: Getting to the root of fatty liver. Hepatology. 62 (3), 964-967 (2015).
  19. Minami, Y., et al. Liver lipophagy ameliorates nonalcoholic steatohepatitis through extracellular lipid secretion. Nat Commun. 14 (1), 4084(2023).
  20. Makiyama, T., et al. Behavior of intracellular lipid droplets during cell division in Huh7 hepatoma cells. Exp Cell Res. 433 (2), 113855(2023).
  21. Makiyama, T., Higashi, S., Sakane, H., Nogami, S., Shirataki, H. γ-taxilin temporally regulates centrosome disjunction in a NEK2A-dependent manner. Exp Cell Res. 362 (2), 412-423 (2018).
  22. Aizawa, R., Ibayashi, M., Mitsui, J., Tsukamoto, S. Lipid droplet formation is spatiotemporally regulated in oocytes during follicular development in mice. J Reprod Dev. 70 (1), 18-24 (2024).
  23. Ohsaki, Y., Maeda, T., Fujimoto, T. Fixation and permeabilization protocol is critical for the immunolabeling of lipid droplet proteins. Histochem Cell Biol. 124 (5), 445-452 (2005).
  24. Helps, N., Luo, X., Barker, H., Cohen, P. Nima-related kinase 2 (NEK2), a cell-cycle-regulated protein kinase localized to centrosomes, is complexed to protein phosphatase 1. Biochem J. 349 (Pt 2), 509-518 (2000).
  25. O'Regan, L., Blot, J., Fry, A. M. Mitotic regulation by nima-related kinases. Cell Div. 2, 25(2007).
  26. Xie, K., et al. MDT-28/PLIN-1 mediates lipid droplet-microtubule interaction via DLC-1 in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 9 (1), 14902(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dynamika kropel lipidowychmikroskopia fluorescencyjnasynchronizacja cyklu kom rkowegowizualizacja mitozybarwienie lipid w oboj tnychprzebudowa organellimetabolizm energetycznyprogresja cyklu kom rkowego

Powiązane artykuły