Trójwymiarowa immunolokalizacja w mejocytach kukurydzy

Podsumowanie

Ten protokół immunolokalizacji w komórkach mejotycznych kukurydzy płci męskiej utrzymuje trójwymiarową integralność komórek podczas mejozy. Umożliwia dynamiczne śledzenie lokalizacji wewnątrzkomórkowej do trzech niezależnych przeciwciał w zachowanym materiale po fiksacji paraformaldehydem, oprócz DAPI, które barwi DNA.

Streszczenie

Podczas profazy I mejozy fizyczna konfiguracja chromosomów różni się znacznie w różnych fazach rozwojowych, na szczęście te specyficzne dla fazy konfiguracje pozwalają na prawidłową identyfikację każdego z tych klasycznych etapów mejozy, które są odpowiednio znane jako leptoten (np. ‘cienkie nici’), zygoten (np. ‘sparzone nici’), pakiten (np. ‘grubkie nici’), diploten (np. ‘podwójne nici’) i diakineza (np. ‘ruch odpychania’). Wizualna analiza kilku zjawisk cytogenetycznych, które występują podczas profazy I, takich jak rekombinacja, parowanie i synapsis, wymaga wysoce niezawodnych technik immunolokalizacji. W przeciwieństwie do tradycyjnych technik rozciągania i miażdżenia, które tłumią wszystkie informacje subkomórkowe i subjądrzaste, opisany tutaj 3D procedurę konserwacji pozwala na zachowanie kluczowych białek mejotycznych w ich naturalnych subkomórkowych miejscach (cytoplazmatycznych, jądrowych i subjądrzaste: euchromatyna, heterochromatyna i nukleolus). W związku z tym, protokół ten opisuje, jak skutecznie fiksować antery mejotyczne, wycinanie i uwalnianie mejocytów z anter oraz wykonywanie jednoczesnej immunolokalizacji trzech kluczowych białek w mejocytach męskich kukurydzy.

Wprowadzenie

Mejoza to kluczowy proces regulujący transmisję cech u roślin modelowych i roślin uprawnych; dlatego proste metody mikroskopiczne, które umożliwiają spójne i wiarygodne wizualizowanie lokalizacji białek, ułatwiają zrozumienie, jak te cechy mogłyby być przenoszone bardziej efektywnie. Niestety, wizualizację lokalizacji białek wewnątrz meiocytów znacznie różniła się w zależności od stosowanej techniki^1,2. Dlatego celem protokołu jest zapewnienie prostej, powtarzalnej metody, która eliminuje artefakty podczas obserwacji meiocytów. Od dawna uznaje się, że obserwacja chromosomów mejotycznych jest delikatnym procesem, który ułatwia rozgniatanie komórek poprzez proste tłoczenie lub jeszcze bardziej niszczącą technikę rozprzestrzeniania^3,4,5. W Arabidopsis thaliana naukowcy powszechnie stosując metody rozprzestrzeniania, które wykorzystują utrwalacz Carnoy’a (3:1 mieszanina alkoholu i kwasu octowego) wraz z różnymi detergentami takimi jak Lipsol, Tween-20 i TritonX-100, a także mieszankami enzymów zawierającymi celulazę, pektynazę i cytohelikazy, aby rozdzielić komórki i umożliwić efektywną immunolokalizację na małych chromosomach^1,2. Te techniki zamieniają 3D konformację chromosomu na 2D, umożliwiając szybkie obserwowanie całości sztucznie rozproszonych chromosomów na pojedynczym obrazie. Niektóre cechy chromosomów, które przetrwają te drastyczne traktowania, mogą być widoczne; jednak często nie reprezentują typowe zachowanie komórek i chromosomów in vivo⁶. Szybkie i bardzo szerokie wykrywanie do dwóch przeciwciał jest możliwe z 2D technikami rozprzestrzeniania w różnych gatunkach roślin, w tym w kukurydzy^7,8,9,10,11.

Mimo to, mimo wygody starszych 2D technik, teraz uznaje się, że niektóre zjawiska są wrażliwe na niszczące metody i nie mogą być obserwowane, jeśli komórka, jądro lub chromosomy są uszkodzone podczas rozprzestrzeniania lub tłoczenia. Na przykład ruch białka RAD50 z cytoplazmy do jądra podczas etapu leptoteny, lub podczas sprzęgania centromerów (leptonema/zygonema), został wykryty tylko w całych 3D meiocytach¹². W tym miejscu, czytelnikom oferowany jest szczegółowy 4-dniowy protokół 3D, który wykorzystuje łączki utrwalone w 4% paraformaldehydzie do immunolokalizacji trzech kluczowych białek w męskich meiocytach kukurydzy, zachowując tym samym ich integralność strukturalną. W porównaniu z podobną metodologią 3D immunolokalizacji kukurydzy⁸, dodaliśmy praktyczne uwagi i porady dotyczące rozwiązywania problemów dla badaczy. Ten protokół przyniesie korzyści pracy biologów roślin i hodowców roślin zainteresowanych badaniem różnych procesów mejotycznych, takich jak kontrola rekombinacji mejotycznej przez kompleks synaptonemacyjny.

Protokół

OSTROŻNIE: Obsługuj formaldehyd i akryloamid z zachowaniem należytej ochrony osobistej i używając kaptura chemicznego; oba są toksyczne (akryloamid jest również neurotoksyczny przed polimeryzacją). Wszystkie materiały użyte w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Fiksacja pylników kukurydzy w celu zachowania struktury mejocytów

1. Użyj roślin kukurydzy w fazie V13 z kwiatostanami wciąż rosnącymi wewnątrz łodygi. Podczas tygodnia fiksacji pylników mejotycznych, noś rękawiczki i delikatnie naciśnij spuchniętą łodygę w punkcie pęcznienia, aby sprawdzić, czy jest wystarczająco miękka do otwarcia.
   UWAGA: Ten protokół fiksacji i immunolokalizacji można zastosować zarówno do kukurydzy, jak i pąków kwiatowych Arabidopsis thaliana (mniej niż 400 µm). Ale w przypadku kukurydzy, w zależności od użytej odmiany i pory roku (wiosną jest szybszy wzrost), wymaga to około 8 tygodni od posadzenia dla odniesienia do odmiany inbredowej B73, ale tylko 6 tygodni dla odmiany kwitnącej wcześnie A344.
2. Przygotowanie buforów.
   UWAGA: Dzień przed fiksacją chemiczną, przygotuj następujące roztwory robocze, rób to starannie i poprawnie etykietuj wszystkie butelki.
   1. Przygotuj 100 mL 10x Buforu A (BA) z solami, dodając 4,53 g PIPES (Piperazyna-N,N'-bis(2-etanosulfonowa kwasu) w końcowej koncentracji 150 mM), 5,96 g KCl (końcowa koncentracja 800 mM), 1,17 g NaCl (końcowa koncentracja 200 mM), 0,74 g EDTA (końcowa koncentracja 20 mM), 0,19 g EGTA (końcowa koncentracja 5 mM) oraz 90 mL H₂O, najpierw dostosuj pH do 6,8-7 za pomocą KOH, a następnie dostosuj objętość do 100 mL.
   2. Wreszcie, przefiltruj sterylnie za pomocą jednorazowego sterylnego filtra Rapid-Flow z PES o porach 0,45 µm (przechowuj w 4 °C, ale nie zamrażaj; możesz przechowywać przez kilka miesięcy).
   3. Przygotuj:
      -50 mM PIPES (pH dostosowany do 7 za pomocą KOH).
      - zasoby sperminy w stężeniu 0,4 M (wcześniej rozpuszczone w 50 mM PIPES, dostosuj pH do 7 za pomocą KOH, przechowuj alikwoty 50 µL w -20 °C).
      - zasoby spermidyny w stężeniu 0,4 M (rozpuszczone w 50 mM PIPES, z pH dostosowanym do 7 za pomocą KOH, przechowuj mrożone alikwoty 125 µL w -20°C).
      - zasoby Ditiotreitolu (DTT) 1 M (rozpuszczone w 0,01 M octanie sodu, do pH 5,2, przechowuj mrożone alikwoty 100 µL w -20 °C).
      - sorbitol 2 M, przechowuj w 4 °C.
3. Przygotuj 50 mL 2x Buforu A (BA), na lodzie, używając 10 mL 10x Buforu A (przechowywanego w 4 °C), 50 µL sperminy (0,4 M w 50 mM PIPES, z pH dostosowanym do 7 za pomocą KOH), 125 µL spermidyny (0,4 M w 50 mM PIPES, z pH dostosowanym do 7 za pomocą KOH), 100 µL DTT (1 M w 0,01 M octanie sodu, pH 5,2) energicznie wymieszaj, aby się rozpuścić; i nie podgrzewaj.
   1. Następnie dodaj 16 mL 2 M sorbitolu. Dostosuj końcową objętość do 50 mL sterylną wodą. Filtr-sterylizuj za pomocą jednorazowego sterylnego filtra Rapid-Flow i przechowuj w 4 °C.
4. Przygotuj komorę wilgotną z 5-10 zwilżonych ręczników papierowych umieszczonych w plastikowym pudełku. Upewnij się, że pokrywa dobrze się zamyka. Usuń wszelką nadmiarową wodę.
5. Następnie, umieść na tacy następujące przedmioty: komorę wilgotną, brzytwę, drobne kleszcze (uprzednio wysterylizowano 70% etanolem), małą butelkę sterylnej wody i taśmę maskującą. Przenieś tacę i jej zawartość do roślin kukurydzy sprawdzonych w kroku 1.1.
6. Użyj brzytwy, aby otworzyć spuchniętą łodygę na poziomie kwiatostanu. Główne gałęzie kłosów, jak również boczne gałęzie kwiatostanu, mogą być używane do zbioru mejotycznych kwiatów.
   UWAGA: Te gałęzie kłosów zawierają kwiaty, które są interesujące do zbierania mejotycznych pylników. Każdy kwiat zawiera sześć pylników, a 3 górne, większe są zwykle używane do analizy. Przybliżona wielkość i kolor pylników koreluje z każdym etapem mejozy. Prawie przezroczyste pylniki o długości około 1 mm znajdują się na etapie leptotenu, przezroczyste pylniki o długości 1,5 mm znajdują się na etapie zygotenu, białawe pylniki o długości 2 mm znajdują się na etapie pakytenu, a żółtawe pylniki o długości > 2 mm mogą zawierać mejocyty na etapie diplotenu, tetradach i ziarnach pyłku, które kończą gametogenzę. Należy pamiętać, że inna korelacja długość

Wyniki

Używając tego protokołu, możemy jednocześnie obserwować wzorce lokalizacji trzech kluczowych białek mejotycznych w kukurydzy (Rysunek 1). Białko mejotyczne ABSENCE OF FIRST DIVISION 1 (AFD1) jest homologiem podjednostki alfa-Kleisin REC8 kompleksu kohezyny mejotycznej. ASYNAPTIC 1 (ASY1) to kluczowy element osiowy, podczas gdy ZYPPER1 (ZYP1) to element poprzeczny kompleksu synaptonemalnego¹⁵. Barwienie DAPI pokazuje wyraźne jądro i barwienie chromatiny, umożliwiając r...

Dyskusja

To protokół oferuje kluczowe zalety w stosunku do innych, ponieważ zachowuje istotne trójwymiarowe dane dotyczące ładowania białek chromosomowych mejotycznych. Te cechy nie mogą być zachowane przy użyciu regularnych technik rozciągania^1,2. Niemniej jednak, ten protokół ma dwie ograniczenia: jest powolny i wymaga dużej techniki w porównaniu z regularnymi technikami rozciągania wykonywanymi w ciągu jednego dnia. W przeciwieństwie do tego, nasz protokół wymaga czter...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1.5 mL microtubes Axygen	Corning	MCT-150-C
15 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
50 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6 well plate Falcon polystyrene microplate	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B
Acetic acid, 60%	Thermo Fisher Scientific	A38-212
Acrylamide 30%  and bis-acrylamide solution, 29:1	Biorad	1610157
Aluminum fold	Reynolds	U07211R0
Amonium Persulfate (APS)	Merck	A3678
Binocular stereomicroscope	NA	NA
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	A9418
DAPI	Merck	D9542
DelltaVision microscope	Olympus	NA
Distilled H2O	NA	NA
Disposable Filter Units with PES filters of 0.45 μm pore	Thermo Fisher Scientific/Nalgene	09-740-63B
Fine forceps FST Dumont SS	Fine Science Tools	11200-33
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed  anti-rat labelled by AlexaFluor647	Invitrogen	A-21247
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-rabbit labelled by AlexaFluor568	Invitrogen	A-21428
goat (IgG H+L) highly cross-adsorbed anti-guinea pig labelled by AlexaFluor488	Invitrogen	A-11073
Gloves	Merck	Z412392
Growing chambers / greenhouse / or field	NA	NA
DTT	Merck	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
Masking tape 3M	Fisher Scientific	19-047-259
Maize seeds	NA
Microscope 22 x 22 mm-1,5 glass coverslips	Fisher Scientific	12-542-B
Microscope 22 x 22 mm-H coverslips	Deckgläser, Zeiss	474030-9020-000
Microscopic glass slides	Fisher Scientific	22-230-900
Microscope slide box	Fisher Scientific,	03-448-9
Micropipets P20, P200, P1000	Merck	CLS4069
NaCl	Merck	S7653
Nail polish	Electron Microscopy Science	72180
Paper towels	Merck	Z188956
Parafilm	Merck	P7668
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Grade	15710
PBS	Merck	P4474
Plastic box with lid	Tupperware	NA
Poly-L-Lysine	Merck	P4707
Primary antibodies (rat anti-ZmAFD1, rabbit anti-ZmASY1, guinea-pig anti ZmZYP1)	NA
Prolong Antifading	Molecular Probes	P36934
Petri dish (D x H: 35 mm x 10 mm	Corning	351008
Petri dish regular size	Merck	P5731
PIPES	Merck	P1851
Pipet tips (0.5-10 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT300
Pipet tips (200 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT200Y
Pipet tips (1000 uL) sterile	Merck/Corning	AXYT1000BRS
Razor blade - single edged	Fisher Scientific	12-640
Rocking platform shaker	NA	NA
Spermine	Merck	85590
Spermidine	Merck	S2626
Sorbitol	Merck	S8143
Tween-20	Merck	P9416
Triton X-100	Fisher Scientific	9002-93-1
Ultra pure Acrylamide	Invitrogen	15512023
Vacuum