Oksydacja Fentona wspierana witaminą C poprawia utlenianie Helicobacter pylori in vitro

Podsumowanie

Badanie to zbadało, jak witamina C modyfikuje zachowanie kinetyczne reakcji Fentona w warunkach in vitro. Sonda chemiczno-barwnikowa i testy bakteryjne wykazują, że kontrolowane dawkowanie witaminy C zmienia utleniające zachowanie reakcji i wiąże się ze zwiększoną aktywnością przeciwbakteryjną przeciwko Helicobacter pylori w uproszczonym systemie modelowym.

Streszczenie

Helicobacter pylori zakażenie pozostaje głównym globalnym obciążeniem zdrowotnym, a rosnąca częstość występowania oporności na antybiotyki podkreśla potrzebę alternatywnych strategii przeciwbakteryjnych. W niniejszym badaniu zbadano, czy dawkowanie witaminy C może modulować utlenianie Fentona i wzmacniać utleniającą aktywność przeciwbakteryjną przeciwko H. pylori w warunkach kwaśnych in vitro. Aktywność utleniającą oceniono na podstawie dekoloryzacji pomarańczowej kwasowej 7 jako pośredniego wskaźnika chemicznego oraz za pomocą testu fluorescencyjnego z kwasem tereftalowym jako względnego wskaźnika tworzenia produktów związanych z rodnikami hydroksylowymi w reakcjach żelazo-nadtlenek uzupełnionych witaminą C. Skuteczność przeciwbakteryjną oceniono poprzez ekspozycję standaryzowanych zawiesin H. pylori w solance zawierającej mocz pokarmowy o pH 3 na nadtlenek wodoru i żelazo dwuwalencyjne z dodatkiem lub bez stopniowego uzupełnienia witaminy C, z następującą po tym liczbą jednostek tworzących kolonie. Suplementacja witaminą C zmieniała wyniki utleniania i była związana z większymi spadkami liczby żywych bakterii w porównaniu z konwencjonalną chemią Fentona. Eksperymenty ratunkowe z użyciem deferoksaminy i tiomocznika osłabiły aktywność przeciwbakteryjną, co potwierdza hipotezę, że aktywność przeciwbakteryjna jest związana z utlenianiem z udziałem żelaza i rodników. Barwienie fluorescencyjne na żywo/martwe oraz mikroskopowe badanie skaningowe dostarczyły jakościowych obserwacji wzrokowych zgodnych z wynikami liczby jednostek tworzących kolonie (CFU). Wszystko to wskazuje, że kontrolowane dawkowanie witaminy C może modulować utleniające reakcje oparte na Fentonie i zwiększać aktywność przeciwbakteryjną przeciwko H. pylori w uproszczonym, kwaśnym modelu in vitro.

Wprowadzenie

H. pylori, Gram-ujemna bakteria o spiralnym kształcie należąca do rodzaju Helicobacter, została wskazana przez badania zdrowia populacyjnego jako występująca na dużą skalę infekcja w różnych rejonach geograficznych, płciach i grupach wiekowych, ze światową wskaźnik zakażeń wynoszącym około 50%¹. Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem (IARC) sklasyfikowała H. pylori jako karcynogen grupy 1, podkreślając jego silny związek z rakiem żołądka i chłoniakiem tkanki limfatycznej związanym z błoną śluzową (MALT). Obecnie kliniczne leczenie infekcji H. pylori opiera się głównie na stosowaniu terapii farmakologicznych. Najbardziej dokładnie badanymi składnikami są inhibitory pompy protonowej (PPI), które hamują wydzielanie kwasu żołądkowego; związki bizmutu, które zwiększają skuteczność antybiotyków; oraz antybiotyki takie jak amoksycylina, klarytromycyna i metronidazol. Jednak monoterapia okazała się niewystarczająca do całkowitego wyeliminowania bakterii, co prowadziło do szerokiego stosowania terapii skojarzonych, powszechnie nazywanych terapią potrójną. Takie podejście zwykle składa się z PPI, klarytromycyny i albo amoksycyliny albo metronidazolu, stosowanych przez około dwa tygodnie³. Wraz ze wzrostem częstości występowania opornych na antybiotyki szczepów H. pylori, skuteczność terapii potrójnej znacznie spadła, co zaowocowało przyjęciem terapii poczwórnej łączącej PPI, bizmut i dwa antybiotyki³. Niemniej jednak, te schematy nadal zasadniczo polegają na antybiotykach, a oporność na antybiotyki pozostaje głównym wyzwaniem w zarządzaniu klinicznym^4,5. W związku z tym, poszukiwanie alternatywnych, niezależnych od antybiotyków strategii przeciwbakteryjnych przyciąga coraz większe zainteresowanie.

Oprócz bezpośrednich efektów patologicznych, infekcja H. pylori została również związana ze zmianami w homeostazie mikroelementów w żołądku. Badania kliniczne i epidemiologiczne wskazują na zmniejszone stężenie witaminy C w soku żołądkowym i surowicy osób zakażonych⁶, co może być związane z zapaleniem błony śluzowej, upośledzoną sekrecją lub zwiększoną oksydacyjną konsumpcją^7,8,9. Równocześnie, infekcja H. pylori została powiązana z niedoborem żelaza poprzez wiele mechanizmów, w tym zmniejszoną kwasowość żołądka, upośledzoną absorpcję żelaza z pokarmu oraz rywalizacją bakterii o dostępne żelazo¹⁰. Te obserwacje podkreślają złożone środowisko biochemiczne towarzyszące infekcji H. pylori i podkreślają znaczenie procesów związanych z redoks i żelazem w kwaśnych warunkach żołądkowych.

Reaktywne formy tlenu (ROS) zyskały znaczne zainteresowanie w badaniach przeciwdrobnoustrojowych ze względu na ich właściwości utleniające. ROS odnoszą się do klasy chemicznie czynnych cząsteczek powstających podczas częściowego redukowania tlenu, takich jak anion nadtlenku (O₂•⁻), nadtlenek wodoru (H₂O₂), pojedynczy tlen ( ¹O₂) i rodniki hydroksylowe (•OH), między innymi. W systemach biologicznych ROS są szeroko zaangażowane w normalny metabolizm fizjologiczny i są niezbędne do różnorodnych działań regulacyjnych komórek¹¹. Warto zauważyć, że liczne badania wykazały, że nadmiar ROS może uszkodzić błony komórkowe bakterii poprzez peroksydacje lipidów, prowadząc do zmian w strukturze i funkcji błony, a ostatecznie do unieczynniania bakterii¹². Zgodnie z tym, przeciwdrobnoustrojowe podejścia oparte na ROS przyciągnęły zainteresowanie jako potencjalna ścieżka badań nad nieantybiotykowymi działaniami przeciwbakteryjnymi przeciwko H. pylori^13,14,15,16. Wśród różnych metod wytwarzania ROS, reakcja Fentona zyskała znaczną uwagę ze względu na jej wysoce efektywne wytwarzanie rodników. Reakcja Fentona to zaawansowany proces utleniania¹⁷, w którym jony żelaza(II) (Fe²⁺) reagują z H₂O₂ w warunkach kwaśnych, tworząc rodniki hydroksylowe (•OH), które posiadają silny potencjał utleniający i mogą utleniać wewnątrzkomórkowe biocząsteczki.

Fe²⁺ +H→Fe³⁺+•OH+OH^-

Fe³⁺ + H→Fe²⁺+•OOH+ H⁺

H₂O→OH+•OOH+H₂O

Sprecyzowane, przy pH

Protokół

Oświadczenie etyczne
Niniejsze badanie było in vitro badaniem bakteryjnym i nie obejmowało udziału ludzkich uczestników, zwierząt laboratoryjnych lub materiałów pochodzących od pacjentów. Dlatego nie było wymagane zatwierdzenie przez komitet etyczny instytucjonalny ani aprobata etyki w zakresie eksperymentów na zwierzętach.

Ocena degradacji AO7 w układzie Fentona wspomaganego witaminą C
Aby ocenić wpływ witaminy C na obserwowalne zachowanie oksydacyjne reakcji Fentona, degradację pomarańczowo-żółtego kwasu (AO7) wykorzystano jako pośrednią chemiczną miarę aktywności oksydacyjnej. Niniejsze badanie nie kwantyfikuje konkretnych gatunków reaktywnego tlenu. Przygotowano 100 ml roztworu AO7 o stężeniu 5 mg/l i skorygowany pH roztworu na 3. Dodano H₂O₂ i FeSO₄ do końcowych stężeń 2,2 mM i 0,055 mM, odpowiednio. Dodano witaminę C, albo jako pojedynczą dawkę na początku reakcji, albo według trzystopniowego schematu dawkowania. W eksperymencie dawki-odpowiedź zastosowano współczynniki molowe Vc: Fe²⁺⁺ równe 0, 0,12, 0,24, 0,48, 2, 4, 6 i 8, co odpowiadało końcowym stężeniom witaminy C wynoszącym 0, 0,0066, 0,0132, 0,0264, 0,110, 0,220, 0,330 i 0,440 mM, odpowiednio, gdy FeSO₄ stosowano w stężeniu 0,055 mM. W przypadku warunków trzystopniowego dodawania podzielono tę samą łączną ilość witaminy C na trzy równe części i dodawano po jednej części w 3, 5 i 7 min po rozpoczęciu reakcji. Na przykład, przy współczynniku Vc:Fe²⁺⁺ równym 0,48, dodawano witaminę C w ilości 0,0088 mM na jedną część, co dawało końcową łączną koncentrację 0,0264 mM.

Przez 10 min ciągle mieszano roztwór reakcyjny w ciemności, utrzymując temperaturę poniżej 30 °C. Pobrany próbki 2 ml przed i po reakcji. Zmierano absorpcję przy 483 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis i obliczono wskaźnik degradacji AO7 według równania 1:

Wskaźnik degradacji (%) = [(A₀ - A_t) / A₀] x 100% (1)

Tutaj A₀ oznacza absorpcję próbki przed reakcji, a A_t absorpcję po reakcji.

Ocena sygnału fluorescencyjnego związanego z ·OH przy użyciu sondy TA
Aby ocenić sygnał fluorescencyjny związany z rodnikami hydroksylowymi w tych samych warunkach kwaśnych in vitro, które zastosowano w badaniach przeciwbakteryjnych, utworzono bezkomórkowy układ chemiczny za pomocą tereftalanu disodu (TA, 1 mM) jako sondy fluorescencyjnej. Niniejsze badanie wykorzystano jako względny wskaźnik tworzenia produktu związanego z ·OH i nie interpretowano jako bezwzględnego pomiaru generacji rodników hydroksylowych. Uwzględniono siedem grup: (1) próbka ślepą (1 mM TA tylko w buforze reakcyjnym), (2) tylko H₂O₂, (3) tylko Fe²⁺⁺, (4) tylko Vc (stopniowo), (5) konwencjonalne Fenton (Fe²⁺⁺ + H₂O₂), (6) Fenton wspomagany witaminą C z jednorazową dawką Vc (Fe²⁺⁺ + H₂O₂ + Vc, jednorazowo) i (7) Fenton wspomagany Vc z dawkowaniem stopniowym (Fe²⁺⁺ + H₂O₂ + Vc, stopniowo). W warunkach stopniowego dodawania Vc dodawano go w 3, 5 i 7 min po rozpoczęciu reakcji w równych częściach, podczas gdy w warunkach jednorazowego dodawania Vc dodawano tę samą łączną ilość Vc jako jednorazową dawkę.

Pobrano części w ciągu 10-minutowego okresu reakcji, natychmiast zasadowo alkalizowano za pomocą NaOH, aby wygasić dalsze reakcje rodnikowe i ustabilizować fluorescencje, i przechowywano w temperaturze 4 °C przed pomiarem. Intensywność fluorescencji pochodnego TA mierano za pomocą czytnika płytek (Ex/Em: 315/425 nm). Generację rodników wyrażano jako intensywność fluorescencji po odjęciu próbki ślepej i używano jako względnego wskaźnika generacji rodników. Przeprowadzono co najmniej trzy niezależne eksperymenty, a dane przedstawiono jako profile przebiegu czasowego i porównania wartości końcowych po 10 min.

Ocena działania przeciwbakteryjnego poprzez liczenie kolonii
H. pylori szczepy przechowywano w temperaturze -80 °C w bulionie mózgowo-sercowym (BHI) z 25% glicerolem. Szczep podstawowy użyty do głównego badania liczenia kolonii, badania ratunkowego, badania zakłóceń macierzy i barwienia fluorescencyjnego żywych/martwych oraz badania mikroskopii skaningowej elektronowoej był H. pylori G27. Przed każdym eksperymentem

Wyniki

Ocena degradacji AO7 w układzie Fentona wspomaganego witaminą C
Degradacja AO7 została wykorzystana jako chemiczny wskaźnik, aby zbadać, jak witamina C wpływa na obserwowalne zachowanie utleniające reakcji Fentona w warunkach kwasowych. W przypadku braku witaminy C konwencjonalny układ Fentona prowadził do częściowej degradacji AO7 w ciągu 10 minut. Gdy dodany został Fe2+ do reakcji, stopień degradacji barwnika wzrósł, a efekt zależał od proporcji molowej pomiędzy witaminą C i Fe2+. Przy stosunkowo...

Dyskusja

Niniejsze badanie zbadano, czy dawkowanie witaminy C może modulować zachowanie oksydacyjne i wyniki przeciwbakteryjne układu opartego na Fentonie w zdefiniowanych kwaśnych warunkach in vitro. W badaniach chemicznych i mikrobiologicznych, stopniowe suplementowanie witaminą C zmieniało obserwowalne zachowanie reakcji i było związane z większą aktywnością przeciwbakteryjną wobec H. pylori niż konwencjonalna reakcja Fentona w badanych warunkach. Co ważne, system ten należy interpretować jako uproszczony kwa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Acid Orange 7 (AO7)	Aladdin Reagent (Shanghai) Co., Ltd.	O113230	Używany jako modelowy barwnik do badania degradacji AO7.
Bovine serum albumin (BSA)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	B885114	Używany do badania interferencji matrycowej.
Brain Heart Infusion (BHI) broth powder	Sichuan Hapyear Bio-engineering Co., Ltd.	N/A	Używany do hodowli bakterii i przechowywania kriogenicznego.
Columbia blood agar plates (5% sheep blood)	Changde Bkmam Biotechnology Co., Ltd.	110701028.0	Używany do hodowli bakterii i wyliczenia CFU.
Critical point dryer (EM CPD300)	Leica Microsystems	EM CPD300	Używany do przygotki próbek SEM po stopniowym odwodnieniu w alkoholu.
Deferoxamine (DFO)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	D873692	Używany jako chelator żelaza w badaniu ratunkowym.
Disodium terephthalate	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	D835937	Używany jako sonda fluorescencyjna TA do wykrywania sygnałów związanych z •OH.
Ethanol, absolute	Sigma-Aldrich	E7023	Używany do przygotki stopniowego szeregu alkoholi do odwodnienia próbek SEM.
Fluorescence microscope (DMi8)	Leica Microsystems	DMi8	Używany do fluorescencyjnego obrazowania żywych/martwych komórek.
Glutaraldehyde solution	Sigma-Aldrich	G5882	Używany do fiksacji próbek bakterii przed badaniem SEM.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Używany do przechowywania kriogenicznego bakterii w bulionie BHI.
GraphPad Prism 10	GraphPad Software, LLC	Prism 10	Używany do analizy statystycznej i sporządzania wykresów.
Helicobacter pylori strain ATCC 26695	American Type Culture Collection (ATCC)	700392	Dodatkowy szczep referencyjny używany do ograniczonej walidacji międzyszczepowej.
Helicobacter pylori strain ATCC 43504	American Type Culture Collection (ATCC)	43504	Dodatkowy szczep referencyjny używany do ograniczonej walidacji międzyszczepowej.
Helicobacter pylori strain G27	Center of Infectious Diseases, West China Hospital, Sichuan University	N/A	Główny szczep używany do liczenia kolonii, badania ratunkowego, badania interferencji matrycowej, barwienia żywych/martwych komórek i SEM.
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009	Używany jako substrat nadtlenek w badaniach reakcji Fentona.
Iron(II) sulfate monohydrate (FeSO4·H2O)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	F904376	Używany jako źródło jonów żelaza(II) w reakcji Fentona.
Microplate reader (Synergy H1)	Agilent BioTek	Synergy H1	Używany do pomiaru fluorescencji pochodzącej z TA (Ex/Em = 315/425 nm).
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Sigma-Aldrich	P4417	Używany do rozcieńczania/neutralizacji po zabiegu przed wysiewem i płukaniem próbek.
Physiological saline (0.9% sodium chloride solution)	Millipore	567442	Używany do zawiesiny bakterii i przygotowania kwaśno-solnego modelu mocznika.
Scanning electron microscope (INSPECT F)	FEI Company	INSPECT F	Używany do analizy morfologii bakterii.
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	Używany do alkalizacji alikwotów badań TA i stabilizacji fluorescencji.
Sputter coater (EM ACE200)	Leica Microsystems	EM ACE200	Używany do nałożenia cienkiej warstwy złota przed obrazowaniem SEM.
SYTO 9/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit	Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd.	MX4234	Używany do fluorescencyjnego barwienia bakterii żywych/martwych.
Thiourea	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	T81602	Używany jako łapacz rodników w badaniu ratunkowym.
Urea	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	U820349	Używany do przygotowania kwaśno-solnego modelu mocznika.
UV-Vis spectrophotometer (UV-2600i Plus)	Shimadzu Corporation	UV-2600i Plus	Używany do pomiaru absorpcji AO7 przy 483 nm.
Vitamin C (L-ascorbic acid)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	A800295	Używany jako reduktor w systemie Fentona wspomaganym witaminą C.