Półautomatyczna metoda wykrywania różnic grupowych w protomózgowych przednich przyśrodkowych klastrach neuronów dopaminergicznych w mózgu Drosophila

Podsumowanie

Protokół ten przedstawia półautomatyczną metodę ilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych w dużym protocerebralnym przednim klastrze przyśrodkowym Drosophila . Zaprojektowane specjalnie do wykrywania i porównywania różnic między grupami eksperymentalnymi a kontrolnymi, to podejście zmniejsza poleganie na ręcznym liczeniu i stanowi praktyczne narzędzie do analiz na poziomie grupowym.

Streszczenie

Drosophila melanogaster pełni rolę potężnego organizmu modelowego do badania chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Parkinsona (PD), głównie poprzez analizę degeneracji neuronów dopaminergicznych (DA) oraz związanych z nimi deficytów lokomocji. Historycznie ilościowa ocena utraty neuronów DA w mózgu muchy ograniczała się do mniejszych, łatwo policzalnych klastrów, w tym protomózgowych tylnych (PPM) klastrów oraz protomózgowych tylno-bocznych (PPL). Dla porównania, znacznie większy protomózgowy przedni klaster przyśrodkowy (PAM), obejmujący ponad 100 neuronów, stanowi poważne wyzwanie dla liczenia ręcznego, co prowadzi do jego niedoreprezentacji w badaniach ilościowych. Do tej pory zgłaszane badania nadal opierają się na pracochłonnych ręcznych liczeniach za pomocą konfokalnych stosów Z, które są czasochłonne i podatne na zmienność. Aby wypełnić tę lukę metodologiczną, opracowaliśmy półautomatyczny pipeline analizy obrazów z wykorzystaniem otwartoźródłowego narzędzia Labkit. Protokół ten umożliwia efektywną ilościową ilościową względem grup neuronów tyrozynowo-hydroksylazy (TH) w klastrze PAM w ramach tej samej partii eksperymentalnej. Metoda rozpoczyna się od standardowego barwienia immunofluorescencyjnego i obrazowania konfokalnego, po czym następuje szczegółowy, krok po kroku przewodnik segmentacji i analizy. To podejście rozwiązuje wąskie gardło kwantyfikacji klastrów PAM i zapewnia praktyczny sposób wykrywania różnic między grupami w podatności neuronów DA w modelach neurodegeneracji. Relatywna rzadkość badań nad Parksonem Infarsynowym w klastrze PAM odzwierciedla historyczną barierę techniczną, a nie brak biologicznego znaczenia. Przezwyciężając tę barierę, nasza metoda otwiera drzwi do systematycznego badania podatności neuronów PAM w PD oraz ich potencjalnego związku z objawami nieruchowymi.

Wprowadzenie

Mucha octowa, Drosophila melanogaster, jest popularnym organizmem modelowym do badania genetycznych i molekularnych podstaw chorób neurodegeneracyjnych, w szczególności choroby Parkinsona (PD)¹. Zachowane szlaki sygnałowe neuronów, zaawansowany zestaw narzędzi genetycznych oraz krótki czas życia sprawiają, że jest wyjątkowo odpowiedni do badania podatności neuronów zależnej od wieku oraz do przeprowadzania wysokoprzepustowych badań genetycznych i farmakologicznych ^2,3. Centralnym elementem tych badań jest analiza neuronów dopaminergicznych (DA), których selektywna degeneracja jest patologiczną znakiem rozpoznawczym PD⁴. W mózgu Drosophila neurony DA są zorganizowane w odrębne, genetycznie identyfikowalne skupiska ^5,6. Progresywna utrata neuronów DA w określonych klastrach, widoczna przez immunodymatikowanie TH i ilościowa za pomocą mikroskopii, stanowi główny funkcjonalny odczyt do oceny postępu choroby i interwencji neuroprotekcyjnych w modelach eksperymentalnych ^7,8. Dlatego wiarygodne ilościowe określenie utraty neuronów DA jest niezbędne do przełożenia mocy genetyki Drosophila na istotne wyniki badań nad Parkinsonem.

Tradycyjnie ilościowa analiza utraty neuronów DA koncentrowała się na barwieniu immunobarwnym za pomocą hydroksylazy tyrozyny (TH) małych klastrów, w tym protomózgowych klastrów tylnych (PPM) oraz protomózgowych klastrów tylno-bocznych (PPL), przy czym każdy klaster zawiera mniej niż 10 komórek łatwo przeliczalnych przez oko⁷. Ręczne wyliczanie za pomocą konfokalnych stosów Z, choć pracochłonne, jest ugruntowaną metodą dla tych klastrów w wielu badaniach PD z użyciem Drosophila ^9,10,11. Dla porównania, ręczne liczenie protomózgowego przedniego klastra przyśrodkowego (PAM), największej grupy neuronów DA w mózgu muchy, składającej się z ponad 100 komórek, stanowi długoletni metodologiczny wąski gardło i uniemożliwia jego uwzględnienie w większości badań PD^{9, 10, 11}. Pomimo kluczowej roli neuronów PAM w procesie uczenia się, pamięci i motywacji, to ograniczenie spowodowało ich względną niedostateczną reprezentację w ilościowych analizach neurodegeneracji 12,13,14,15. Co istotne, nawet najnowsze badania nadal opierają się na tym nieefektywnym podejściu ręcznego liczenia, podkreślając uporczywą i niezaspokojoną potrzebę standaryzowanego, zautomatyzowanego rozwiązania w ramach obszaru¹³.

Aby wypełnić tę krytyczną lukę, opracowaliśmy półautomatyczny pipeline analizy obrazów, który umożliwia efektywną grupową ilościową ilościowość neuronów TH-dodatnich (TH⁺) w klastrze PAM w ramach eksperymentu. Protokół ten wykorzystuje otwartoźródłową, opartą na uczeniu maszynowym wtyczkę Labkit w platformie Fiji/ImageJ oraz oprogramowanie do przetwarzania obrazów 3D^16,17. Podstawowy workflow wymaga od użytkownika anotacji reprezentatywnego podzbioru obrazów w celu wytrenowania modelu klasyfikacji pikseli, który następnie jest stosowany do eksperymentalnych zbiorów danych z barwieniem TH w procesach wsadowych, a następnie do tworzenia i klasyfikacji punktów jądrowych względem regionu TH⁺. To podejście łączy automatyzację z nadzorem ekspertów: zmniejsza obciążenie i zmienność wynikającą z w pełni ręcznych liczeń, jednocześnie zachowując wkład badacza do kierowania algorytmem i przeglądu wyników.

Celem tego artykułu jest dostarczenie naukowcom krok po kroku protokołu do efektywnej względnej ilościowej ilościowej neuronów DA klastrowej PAM do porównań grupowo-względnych w ramach eksperymentu. Demonstrujemy cały proces pracy, od sekcji mózgu, barwienia immunofluorescencyjnego i obrazowania konfokalnego, po szczegółowy proces analizy obrazów z wykorzystaniem metody półautomatycznej. Poprzez standaryzację tego kluczowego etapu ilościowego, protokół ten ma na celu umożliwienie społeczności badawczej konsekwentnego włączania dużego klastra PAM do analiz. Ta półautomatyczna metoda została zaprojektowana specjalnie dla klastra PAM i nie ma zastosowania do innych klastrów dopaminergicznych ani do neuronów TH-dodatnich w płatach wzroku. Ta metoda może ułatwić badania na poziomie partii podatności neuronów DA klastrów PAM oraz dalsze badania plastyczności synaptycznej, neurodegeneracji i przesiewowych badań terapeutycznych z wykorzystaniem modelu Drosophila .

Protokół

1. Przygotowanie próbki i obrazowanie konfokalne

1. Hodowla muchów i kolekcjonowanie
   1. Krzyżowo rodzicielskie muchy o pożądanych genotypach w celu wygenerowania eksperymentalnego potomstwa. Po ekondycji zbieraj 20–30 much na fiolkę świeżej żywności. Utrzymuj muchy zgodnie z projektem eksperymentalnym użytkownika aż do osiągnięcia pożądanego wieku eksperymentalnego.
2. Przygotowanie do sekcji
   1. Przygotuj naczynie do sekcji, napełniając pokrywkę 30 mm miski Petriego do połowy wysokości silikonowym elastomerem Sylgard. Napełnij miskę 1x solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS). Dodaj 450 μL utrwalacza zawierającego 1x PBS i 4% paradehydu (PFA) w rurce mikrowirówki o pojemności 0,6 mL, a następnie umieść ją na lodzie.
   2. Znieczulaj 10–20 much impulsem CO₂ o sile 5–10 sekund, a następnie natychmiast przenosi je na 60 mm szalkę Petriego umieszczoną na lodzie, aby utrzymać nieruchomość.
      UWAGA: PFA jest toksyczna i podejrzewa się o czynnik rakotwórczy. Trzymaj się w kapturze z parami, rękawiczkach, fartuchu laboratoryjnym i goglach ochronnych. Utylizacja odpadów zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi materiałów niebezpiecznych.
3. Rozparcie i fiksacja mózgu muchy
   1. Chwyć muchę za nasadę skrzydła za pomocą kleszczy i zanurz ją brzuszną stroną do góry w misce do rozwarstwienia wypełnionej PBS. Przebij tułów drobną szpilką do sekcji, aby zakotwiczyć muchę na poduszce Sylgard.
   2. Ustawij ciało poziomo (np. głowa w lewo, odwłok w prawo). Trzymaj podstawę trąbki jedną kleszczyą, a drugą usuń całą trąbkę, tworząc otwór między oczami złożonymi.
   3. Chwyć odsłonięte krawędzie oka dwoma kleszczami i bardzo powoli rozchylaj je symetrycznie, odsłaniając mózg, zachowując jednocześnie jego połączenie z brzusznym sznurem nerwowym.
   4. Usuń pęcherzyki tchawicowe i tłuszcz otaczający mózg. Przetnij brzuszny sznur nerwowy, aby uwolnić mózg i pozwolić mu osiąść na naczyniu z przednią stroną skierowaną do góry.
      UWAGA: Jeśli ustabilizowany mózg pokazuje połowę brzuszną umieszczoną wyżej niż grzbietową (rysunek 1B,C), użyj kleszczy, aby delikatnie docisnąć uniesioną część.
   5. Nawilż końcówkę pipety P10 0,1% Triton X-100, aby zapobiec przyleganiu rozciętego mózgu do wewnętrznej ściany końcówki. Za pomocą tego wstępnie zwilżonego końcówki przenieś każdy rozcięty mózg do rurki zawierającej utrwalający, a następnie przejdź do kolejnej sekcji sekcji. Po przeniesieniu wszystkich mózgów odwróć rurkę 5 razy i umieść ją poziomo na lodzie na 30 minut. Inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę z mieszaniem.
   6. Pozwól mózgom osadzić się na dnie przez 1 minutę. Myj mózgi przez 3 x 10 minut roztworem do płukania zawierającym 1x PBS i 0,1% Triton X-100 (PBST) z mieszanką. Przechowuj mózgi w PBS zawierającym 0,1% azydu sodu w temperaturze 4 °C lub przeprowadzić immunodawizację.
4. Immunobarwienie
   1. Barwić mózgi w 300 μL pierwotnego roztworu barwiącego przeciwciała zawierającego 1x PBS, 0,1% Triton X-100, 5% normalnego surowicy koziego, 0,1% azyku sodu oraz przeciwciało przeciw królikom (rozcieńczenie 1:500) przez 2 dni w temperaturze 4 °C z mieszanką. Myj mózgi przez 3 x 10 minut metodą PBST.
   2. Barw mózgi w roztworze przeciwciał wtórnych zawierających 1x PBS, 0,1% Triton X-100, 5% normalnego serum dla koz, 0,1% azyku sodu oraz anty-rabbit Alexa Fluor 635 przez 2 dni w temperaturze 4 °C. Mózgi raz umyj PBST.
   3. Inkubować mózgi w PBST z dodatkiem 4',6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI) (rozcieńczenie 1:1 000) przez 2 godziny w RT, a następnie myć mózgi w PBST przez 2 godziny. Przechowuj mózgi w temperaturze 4 °C przez noc lub przechodź do montażu.
5. Montaż
   1. Załaduj 0,5 mL montantu do strzykawki 1 mL wyposażonej w igłę o cienkim rozstawie. Stwórz komorę montażową, przyklejając do szklanej szkiełki dwa równoległe paski przezroczystej taśmy klejącej, pozostawiając szczelinę o sześcinie 3 mm (rysunek 1A,D).
      UWAGA: Ostre igły stanowią zagrożenie przebiciem. Zawsze obchodz się z nimi ostrożnie, w razie potrzeby zrób nakręcanie jedną ręką i natychmiast wyrzucaj zużyte igły do zatwierdzonego pojemnika na ostre przedmioty.
   2. Przenieś mózgi do czystej szalki Petriego za pomocą skróconej końcówki P200. Usuń nadmiar płynu otaczającego mózg i wylej 10 μL montantu na mózgi. Delikatnie wymieszaj mózgi z mountantem.
   3. Rozłóż trzy krople montantu wzdłuż szczeliny na zamku i rozłóż równomiernie na szczelinę. Przenieś i umieść mózgi wzdłuż centralnej linii szczeliny za pomocą pipety P10 (rysunek 1A).
   4. Ustaw mózgi równomiernie wzdłuż osi osi szczeliny, tak że przednia strona skierowana jest do góry. Powoli zakrywaj tę szczelinę pokrywką. Naciskaj kciukami kciukami blisko krawędzi pokrywy przez 3 sekundy, aby zapewnić solidny kontakt.
   5. Umieść preparat poziomo w teczce na wysuwanie, aby utwardził się przez noc w RT w ciemności, a następnie w 4 °C do długotrwałego przechowywania.
6. Obrazowanie konfokalne
   1. Włącz system mikroskopu konfokalnego i odczekaj 15 minut na stabilizację laserową. Zlokalizuj mózgi w jasnym polu za pomocą obiektywu 10x, następnie przełącz się na obiektyw immersyjny 100x i przejdź do klastra PAM w trybie live view.
   2. Sreguluj etap XY, aby zlokalizować jeden klaster PAM w centrum obrazowania. Podgląd przez Z, aby potwierdzić granice i orientację. Dostosuj cyfrowy zoom i orientację, aż klaster PAM dopasuje się do ramki obrazowania po przekątnej.
   3. Ustaw górną i dolną pozycję stosu. Ustaw rozmiar kroku Z na 0,34 μm, a rozdzielczość obrazu na 512 x 512. Ustaw otwór na pin na tryb automatyczny. Ustaw tabelę wyszukiwania wyświetlacza (LUT) na wskaźnik nasycenia.
   4. Dostosuj moc lasera i wzmocnienie detektora kanału TH do minimalnej ilości rozproszonych, dyskretnych punktów w neuronach PAM. Dostosuj ustawienia kanału DAPI , aby uzyskać jasny, czysty sygnał jądrowy bez nasycenia.
      UWAGA: Optymalny współczynnik powiększenia jest różny. Różnice w kurczeniu się tkanek mogą występować pomiędzy eksperymentalnymi partiami oraz między poszczególnymi mózgami w obrębie tej samej partii.
   5. Pobieranie i zapisywanie obrazów w formacie raw z 12-bitowym lub 16-bitowym w folderze wejściowym (np. D:\Confocal\images). Wróć do trybu na żywo, zresetuj zoom i przeglądaj szczelinę, aby znaleźć kolejny mózg bez przełączania na niższe powiększenie.
      UWAGA: Na tym etapie nie zapisuj, nie eksportuj ani nie konwertuj głównych plików danych do formatu .tif przetworzonego. Zachowanie oryginalnych surowych metadanych jest niezbędne do dalszego przetwarzania obrazów.

2. Przetwarzanie i ilościfikacja obrazów

1. Konwertowanie plików obrazowych i rozdzielanie kanału TH
   1. Konwertowanie surowych obrazów znajdujących się w folderze wejściowym do formatu zgodnego z oprogramowaniem do analizy obrazów 3D, korzystając z powiązanego konwertera plików (Tabela materiałów). Umieść przekonwertowane pliki w folderze z konwersją (np. D:\Confocal\converted)
   2. Otwórz Fidżi i przejdź do pliku | Nowy | Scenariusz. W edytorze skryptów kliknij Plik | Otwórz plik makro ImageFolder_Split_ChannelAndSaveMacro_UltimateDepth.ijm (Plik uzupełniający 1). Kliknij Run na dole okna edytora (jeśli przycisk jest ukryty, kliknij małą trójkątną ikonę, aby go pokazać).
   3. W oknie konfiguracji kliknij Przeglądaj i wybierz przekonwertowany folder. W sekcji Konwencja Nazewnictwa wybierz opcję 3. W sekcji Kanał do eksportu wybierz indeks kanału odpowiadający TH. Kliknij OK , aby podzielić kanał TH w grupę; eksportowane stosy TH będą automatycznie zapisywane w folderze kończącym się na ChannelSplitOut.
2. Szkolenie klasyfikatora Labkit
   1. Przygotowanie zbioru danych treningowych
      1. Wybierz 20 reprezentatywnych stosów, które rejestrują zakres intensywności sygnału i wariacji tła próbek z folderu stosu TH. Skopiuj wybrane pliki do folderu wyboru (np. D:\Confocal\selection).
      2. Uruchom makro Fiji ImageFolder_UniCropZStack_ToThinestLayers.ijm (Plik Uzupełniający 2). Po wywołaniu zaznacz folder zawierający obrazy treningowe. Makro przycina każdy stos do tej samej liczby wycinków Z i łączy stosy w plik time-lapse TIFF do treningu.
   2. Interaktywne szkolenie klasyfikatora pikseli
      1. Uruchom Labkit za pomocą wtyczek Fiji | Zestaw laboratoryjny | Otwórz aktualny obraz z zestawem laboratoryjnym (tabela materiałów). Na pasku kliknij przycisk 3D Box , aby przełączyć się na tryb Slice View i nawigować przez Z-slice (suwak po prawej stronie) i próbki (suwak na dole).
      2. Naciśnij S , aby otworzyć panel Jasności i Kontrastu oraz dostosować suwak Max , aby optymalnie zobaczyć neurony TH⁺ . Ustaw odpowiedni rozmiar pędzla (np. 5 pikseli). Kliknij Ustawienia , aby rozwinąć panel narzędzi. Zachowaj domyślne tryby wyświetlania (Fused, Source, Nearest).
      3. Kliknij Rysuj. W panelu Etykietowanie zaznacz Tło i narysuj kilka obszarów niekomórkowych; podświetl pierwszy plan i narysuj wnętrze kilku neuronów TH⁺ .
      4. Przybliżaj i oddalaj pole za pomocą Ctrl + Shift + Przewijanie. Przejdź do innych Z-slice'ów za pomocą pionowego suwaka oraz do innych próbek treningowych za pomocą dolnego suwaka. Powtarzaj rysowanie kilka razy, aby zapewnić solidne szkolenie klasyfikatora.
      5. Kliknij klasyfikację pikseli. Kliknij Start Training triangle , aby rozpocząć trening i leniwe przewidywanie, które później dostarcza informacje zwrotne segmentacyjne w czasie rzeczywistym podczas nawigacji między próbkami, przekrojami lub pozycjami (kliknięcie prawym przyciskiem myszy i przeciągnięciem) w dowolnym momencie.
      6. Kliknij Rysuj, aby dodać adnotacje poprawiające tam, gdzie przewidywanie jest niedokładne, z opcjonalnym przełączaniem widoczności predykcji i etykiety w panelu Źródła oraz przeprogramowanie. Iteruj, aż klasyfikator niezawodnie odróżni neurony TH⁺ od tła, następnie zapisz klasyfikator za pomocą Segmentacji | Zapisz Klasyfikator przed zamknięciem Labkit.
3. Segmentacja zestawów laboratornych
   1. Otwórz losowy obraz z folderu TH stack na Fidżi. Uruchom Labkit i kliknij Usuń wszystko, a następnie załaduj wstępnie wytrenowany klasyfikator przez Segmentację | Otwórz Klasyfikator , aby segmentować obraz. Wizualnie sprawdź jakość, aby zweryfikować uogólnialność klasyfikatora, a następnie zamknij okno.
   2. Powtórz wersję 2.3.1 na kilku innych losowych obrazach. Zamykaj okno po każdej inspekcji, z wyjątkiem ostatniej.
   3. Stwórz folder wyjściowy Labkit (np. D:\Confocal\LabkitOut). Rozpocznij przetwarzanie wsadowe za pomocą obrazów segmentów wsadowych > Inni. Ustaw Input Directory do folderu TH stack i Output Directory do folderu wyjściowego Labkit, a następnie kliknij OK , aby rozpocząć przetwarzanie wsadowe.
   4. W przyszłych eksperymentach z tym samym przeciwciałem TH i porównywalnymi ustawieniami konfokalnymi pomiń 2.2 i ponownie użyj poprzedniego klasyfikatora.
      UWAGA: Udostępniamy również wstępnie wytrenowany klasyfikator do celów testowych (Plik Uzupełniający 3).
4. Tworzenie plamek DAPI i ilościowa ilościowość neuronów TH⁺
   1. Umieść XT_Jove_Labkit_TH.m (Plik Uzupełniający 4) do folderu skryptów (np. D:\scripts). Otwórz oprogramowanie 3D i przejdź do File | Preferencje, a następnie wybierz Narzędzia niestandardowe. W panelu folderów XTension kliknij Dodaj ... aby wybrać folder skryptu i kliknij OK.
   2. Dla każdego przekonwertowanego pliku skrypt automatycznie wykonuje następujące operacje sekwencyjne.
      UWAGA: Ta sekcja wyjaśniająca nie zawiera działań dla użytkownika, ale jest niezbędna do przejścia do kolejnych kroków.
      1. Kanał DAPI jest przetwarzany przez odejmowanie tła i filtr Gaussa, aby ułatwić optymalną identyfikację punktów DAPI.
      2. Maska segmentacji Labkit jest udoskonalana poprzez odzumianie i wypełnianie dziur, a następnie dołączana jako kanał maski do zbioru danych. Z kanału maski konstruuje się udoskonalony obiekt powierzchni TH. Obiekt powierzchni TH generuje dodatkowo udoskonaloną maskę, aby nadpisać kanał maski.
      3. Kanał transformacji odległości jest tworzony z powierzchni TH, gdzie woksele wewnątrz powierzchni ustawia się na 0, a woksele poza powierzchnią przypisuje się wartości zmiennoprzecinkowe reprezentujące ich euklidesową odległość do najbliższej powierzchni TH.
      4. Użyj profilu intensywności każdego miejsca DAPI w kanale transformacji odległości jako metryki identyfikacji neuronów TH⁺ . Punkty DAPI znajdujące się w regionach TH⁺ lub blisko nich mają niskie wartości odległości. To kryterium pomaga wykryć fałszywie negatywne wyniki, takie jak rzeczywiste jądra neuronów DA znajdujące się tuż obok, ale tuż obok niedoskonałego obszaru pierwszego planu przewidzianego przez Labkit.
   3. Ręczna optymalizacja jakości do tworzenia spotów DAPI
      1. Otwórz losowy sample z przekonwertowanego folderu w oprogramowaniu 3D. Przejdź do edycji | Właściwości obrazu i sprawdź, czy rozmiar woksela Z w panelu współrzędnych wynosi 0,340 μm. Jeśli nie, ręcznie zmień na 0,340 μm.
      2. Zastosuj odejmowanie tła do kanału DAPI, klikając Przetwarzanie obrazu | Progowanie | Odejmowanie tła. W dialogu zaznacz tylko kanał DAPI, ustaw Filter Width na 3 i kliknij OK. Powtórz ten krok jeszcze raz, a następnie wykonaj trzecie powtórzenie z szerokością filtra równą 1.
      3. Zastosuj wygładzanie Gaussa, klikając Przetwarzanie obrazu | Wygładzanie | Filtr Gaussa. Zaznacz tylko kanał DAPI, ustaw Filtr Width na 0.2 i kliknij OK.
      4. W scenie Surpass kliknij Dodaj nowe miejsca, aby uruchomić kreator tworzenia plamek. Wybierz kanał DAPI i wprowadź szacowaną średnicę XY 1,2 μm. Podążając za czarodziejem, dodaj filtr "Jakość powyżej" i dostrojaj próg, aż uzyska on solidne pojedyncze miejsce dla każdego jądra.
      5. Powtórz kroki 2.4.3.1–2.4.3.4 na kilku losowo wybranych próbkach i sfinalizuj wartości progowe, które działają niezawodnie w różnych próbkach.
   4. Otwórz skrypt XT_Jove_Labkit_TH.m (Plik Dodatkowy 4) w edytorze tekstu, aby zmodyfikować następujące parametry zdefiniowane przez użytkownika.
      1. Ustaw ims_Folder na ścieżkę przekonwertowanego folderu; ustaw LabkitOut_Folder na ścieżce folderu wyjściowego Labkit. Ustaw Ch_DAPI na indeks kanałów DAPI dla wszystkich plików w przekonwertowanym folderze (np. 1, jeśli DAPI jest pierwszym kanałem, 2, jeśli DAPI jest drugim kanałem).
      2. Set reVoxelSizeX, reVoxelSizeY, reVoxelSizeZ. Jeśli rozmiary wokseli są poprawne w Właściwościach Obrazu (patrz krok 2.4.3.1), pozostawić odpowiedzi jako puste nawiasy []. W przeciwnym razie należy ręcznie wpisać odpowiednie wartości (np. odpowiednio 0,130, 0,130, 0,340), które zostaną zastosowane do wszystkich plików w przekonwertowanym folderze.
   5. Sfinalizuj parametry tworzenia spotów.
      1. Dostosuj wiele wersji parametrów w tablicy komórek SpotsParameterAss , gdzie każdy wiersz określa jedną wersję. Obejmuje to zdefiniowanie szacowanej średnicy XY (μm) dla wykrywania punktów DAPI w lewej części każdego wiersza oraz definiowanie ciągu filtrów składających się z filtrów kryteriów w prawej części każdego wiersza, zawierających próg(y) jakości z kroku 2.4.3.4 i/lub prog intensywności na udoskonalonym kanale maskowym od kroku 2.4.2.2 lub kanał transformowany przez odległość od kroku 2.4.2.3.
      2. Ustaw "Intensity Center Ch=aSizeC+1" powyżej 0.5, aby zachować tylko punkty, których geometryczny środek znajduje się w kanale maski TH z 2.4.2.2 (wartość wokselu > 0.5). Jest to najbardziej bezpośrednie i rygorystyczne kryterium dla filtrowania punktowego TH⁺ DAPI.
      3. Ustaw "Intensity Mean Ch=aSizeC+2" poniżej [próg], aby zachować miejsca, których średnia intensywność w kanale transformacji odległości z kroku 2.4.2.3 spada poniżej określonego progu. Dolne progi wybierają miejsca umieszczone wewnątrz lub bardzo blisko powierzchni TH; wyższe progi obejmują miejsca stopniowo coraz dalej. Pozwala to na empiryczną kalibrację akceptowalnej bliskości dla przypisania TH⁺ .
      4. Przykład z prekonfiguracji:
         SpotsParameterAss = {
         1.2, ['"Jakość" powyżej 94,5,"Centrum intensywności Ch=aSizeC+1" powyżej 0.5'];
         1,2, ['"Jakość" powyżej 94,5,"Średnia intensywność Ch=aRozmiarC+2" poniżej 0,0001'];
         1,2, ['"Jakość" powyżej 94,5,"Średnia intensywności Ch=aSizeC+2" poniżej 0,001'];
         1.2, ['"Jakość" powyżej 94,5,"Średnia intensywność Ch=aSizeC+2" poniżej 0.01'];
         ... więcej kombinacji filtrów jest dostępnych w piśmie.
         };
      5. W przyszłych eksperymentach z użyciem tych samych przeciwciał TH i ustawień konfokalnych ponownie wykorzystaj wcześniejsze kombinacje parametrów. Usuń te słabe kombinacje, które powodują znaczne odchylenie liczby spot od rzeczywistych liczb, co zmniejsza niepotrzebne obciążenie obliczeniowe.
   6. Tworzenie punktów wsadowych
      1. Zapisz wszystkie powyższe modyfikacje w skrypcie XT_Jove_Labkit_TH.m. Otwórz nowe okno oprogramowania 3D. Kliknij menu Przetwarzanie obrazu | PAM_TH_processing wykonać skrypt w partii.
      2. Początkowo obserwuj przez kilka minut, że dla każdej kombinacji filtrów skrypt tworzy obiekt Spots nazwany tak, aby odzwierciedlał jego parametry, a pliki z przetworzonego folderu są przetwarzane i zapisywane jako kopie w nowym folderze wyjściowym z przyrostkiem "processed". Potem zostaw komputer bez nadzoru.
      3. Po jego zakończeniu zostanie wygenerowany arkusz kalkulacyjny. Obserwuj pierwszą kolumnę zawierającą nazwy plików oraz kolejne kolumny zawierające liczbę punktów DAPI odpowiadającą każdej kombinacji filtrów, z nagłówkami kolumn wskazującymi szacowaną średnicę XY i użyty ciąg filtrów .
   7. Walidacja po procesie
      1. Po zakończeniu etapu 2.4.6 ręcznie otwórz kilka losowych plików z folderu "processed" i przejrzyj różne obiekty Spots w nakładce z oryginalnym kanałem TH. Na podstawie wizualnej inspekcji wybierz jeden lub dwa optymalne filtry, które dają najwierniejsze odzwierciedlenie prawdziwej liczby neuronów TH⁺ . Eksportuj odpowiadające kolumny z arkusza kalkulacyjnego do dalszej analizy statystycznej i przygotowania danych.
      2. Aby skorygować błędy w liczbie spotów w preferowanych kombinacjach filtrów, wybierz odpowiadający obiekt(y) Spots w scenie Surpass i kliknij zakładkę Edytuj . Ręcznie usuwaj błędne miejsca lub dodawaj pominięte miejsca, gdy to konieczne, naciskając Shift i klikając na ekran. Zapisz aktualizacje za pomocą Zapisz jako/Eksportuj jako/Zapisz tak, aby nadpisać odpowiadający plik w folderze "przetworzony" o tej samej nazwie pliku.
         UWAGA: Nie usuwaj, nie dodawaj, nie zmieniaj nazwy ani nie przesuwaj/przesuwaj żadnych obiektów Spots — edytuj tylko preferowane Spots. Nie są wymagane żadne modyfikacje scenariusza; Wystarczy ponownie uruchomić skrypt, aby natychmiast wygenerować zaktualizowany arkusz kalkulacyjny odzwierciedlający ręczne poprawki. Dla spójności albo nie pozostawić żadnego edytowanego, albo edytuj preferowany obiekt(y) Spots dla wszystkich próbek w eksperymencie.

Wyniki

Surowe dane zebrane z oprogramowania zostały zdeponowane w publicznym repozytorium i są dostępne pod adresem DOI: 10.5281/zenodo.19814348. Aby zademonstrować zastosowanie tego półautomatycznego pipeline'u ilościowego, zastosowaliśmy go do dobrze ugruntowanego modelu Drosophila z PD wykorzystującym panneuronalną ekspresję ludzkiej α-synukleiny (nSyb-QF2>QUAS-SNCA). Loty sterujące miały wyłącznie sterownik nSyb-QF2 . Oba genotypy były starzone w temperaturze 29 °C przez 3 tygodnie, po czym mózgi zostały rozłożone, immunobarwione pod kątem TH i zobrazowane pod kątem klastra MAM. Jak pokazano na Rysunku 3E, półautomatyczny potok wykrył istotny spadek liczby neuronów PAM TH⁺ u much ekspresujących α-synukleinę w porównaniu z grupą kontrolną (test Studenta t, p < 0,0001), co pokazuje, że metoda ta może uchwycić różnice zależne od genotypu w obrębie tej samej partii eksperymentalnej. Poniższe sekcje opisują konfigurację montażu (rysunek 1), interfejs treningowy Labkit (rysunek 2) oraz kroki przetwarzania obrazu (rysunek 3), które umożliwiają tę ilościowość.

Rysunek 1 ilustruje narastającą konfigurację rozciętych mózgów Drosophila oraz jej wpływ na obrazowanie klastrów PAM. Po rozwarstwieniu mózgi czasami wykazują wygięcie lub przechylanie tkanki przylegającej do przeciętej brzusznej struny nerwowej. To uniesienie w brzusznej części mózgu zmienia perspektywę pod stereoskopotem, prowadząc do zmienionej projekcji stereotypowej bruzdy w konturze grzbietowym oraz różnicy w względnej perspektywie brzusznych punktów orientacyjnych. (Rysunek 1B,C). Ta deformacja często występuje w momencie, gdy mózg zostaje odłączony od ciała. Takie odkształcenie wpływa na orientację klastra PAM podczas montażu, co w konsekwencji wpływa na wymaganą głębokość stosu Z (rysunek 1C,D). W optymalnych warunkach montażowych jednowarstwowy separator taśmy klejącej tworzy odpowiedni ucisk na centralnej części mózgu, powodując, że klaster PAM umieszczony na grzbiecie przyjmuje poziomą orientację tuż obok pokrywy. Ta konfiguracja daje stosy Z po 15–25 fragmentów w odstępach 0,34 μm (rysunek 1D). W innym stanie klaster PAM zachowuje pochyloną pozycję, co wymaga głębszych stosów Z (rysunek 1D). Podobnie zastosowanie dwuwarstwowego dystansu taśmy nie zapewnia odpowiedniej kompresji, pozostawiając klaster PAM w jego rodzimym, pochylonym układzie i również zwiększając głębokość stosu Z (Rysunek 1D). Rysunek 1E przedstawia reprezentatywne boczne widoki rzutów Z barwionych TH zarówno w optymalnie ustawionych, jak i pochylonych warunkach.

Rysunek 2 przedstawia interfejs użytkownika Labkit oraz reprezentatywny przepływ szkoleń. Mając tylko kilka rzadkich notacji bazgrołów na jednej próbce (rysunek 2A), początkowy klasyfikator pikseli już generuje zadziwiająco rozsądną segmentację (rysunek 2B). Jednak kluczowe jest podkreślenie, że tak minimalna adnotacja jest niewystarczająca do zapewnienia solidnej, uniwersalnej wydajności na całym zbiorze danych. Do wygenerowania klasyfikatora, który niezawodnie segmentuje neurony TH⁺ na całym zbiorze danych potrzebne jest znacznie bardziej iteracyjne oznaczanie — obejmujące wiele wycinków Z, próbek i wariantów barwienia. Co istotne, wiele obrazów treningowych jest łączonych wzdłuż wymiaru czasowego (klatkowego), a nie układanych wzdłuż osi Z. Ten projekt zachowuje integralność przestrzenną każdej pojedynczej objętości mózgu, zapewniając, że jądra filtrów 3D działają wyłącznie wewnątrz — a nie pomiędzy — próbkami biologicznymi. Gdyby próbki były natomiast układane pionowo w jeden gruby stos Z, Z-kroje na granicach między sąsiadującymi próbkami stałyby się przestrzennie ciągłe, powodując, że woksele z różnych mózgów byłyby traktowane jako sąsiednie struktury, co zwiększałoby ryzyko niepotrzebnych ręcznych korekt (Rysunek 2C). Konkatenacja wzdłuż osi czasu zapobiega takim zanieczyszczeniam próbkami krzyżowymi, jednocześnie umożliwiając efektywne, wielopróbkowe szkolenie w jednej sesji Labkit.

Rysunek 3 ilustruje proces post-processing oraz ostateczną ilościowość. Maski segmentacyjne Raw Labkit (Rysunek 3A) zawierają liczne małe, fałszywie pozytywne plamki i wewnętrzne dziury. Po zastosowaniu operacji morfologicznego zagłębiania i wypełniania dziur (Rysunek 3B) konstruuje się wygładzoną powierzchnię TH, która służy do wygenerowania udoskonalonej maski binarnej (Rysunek 3C). Poprawa osiągnięta dzięki temu udoskonaleniu jest przedstawiona jako nakładka porównująca początkową i końcową maskę (Rysunek 3D, górny). Co istotne, niektóre obszary neuritów bogate w TH są czasami zachowywane w finalnej masce; jednak te obszary są niemal zawsze pozbawione jąder barwionych DAPI, co przyczynia się do znikomej liczby neuronów. Zaawansowani użytkownicy mogą dodatkowo dostosować parametry morfologiczne w dostarczonym skrycie przetwarzania partii, aby precyzyjnie dopracować eliminację takich pozostałości. Rysunek 3D (dolny) pokazuje ostatnie plamy DAPI (magenta) nałożone na kanał TH (zielony) z projekcji maksymalnej intensywności. Rysunek 3D ujawnia również rzadki typ fałszywie pozytywnego wyniku, który okazjonalnie obserwujemy w naszym pipeline: jądro barwione DAPI, znajdujące się w obszarze neurytu bogatym w TH, może być błędnie sklasyfikowane jako plamka TH⁺, gdy sygnał neurytowy silnie nakłada się na jądro. Jednak, jak pokazano na Rysunku 3C, jądra DAPI-dodatnie w pobliżu neurytów są zazwyczaj rzadkie. Co więcej, nieliczne sygnały DAPI obecne w pobliżu takich obszarów neurytów często pozostają poprawnie klasyfikowane jako prawdziwe ujemne (czyli nie liczone jako TH⁺), ponieważ nie są błędnie identyfikowane przez rurociąg. Rysunek 3E pokazuje praktyczną użyteczność metody: 3-tygodniowe muchy nSyb-QF2>SNCA wykazują istotny spadek liczby neuronów PAM TH⁺ w porównaniu do kontroli nSyb-QF2 przy wielu filtrach (test t-ucznia, s. < 0,0001). Chociaż bezwzględne liczby punktów mogą się różnić w zależności od różnych kombinacji filtrów i metoda nie osiąga idealnej dokładności pojedynczej plamki, względna różnica między grupami eksperymentalnymi a kontrolnymi pozostaje wyraźna. Dla wielu testowanych filtrów statystyczny wynik porównania grup jest w dużej mierze zachowany między filtrami w ramach tej samej partii eksperymentalnej. W związku z tym wynik należy interpretować jako porównawczy odczyt w ramach partii, a nie bezbłędną bezbłędną liczbę neuronów PAM.

Rysunek 1. Rozwarstwienie mózgu Drosophila i konfiguracja montażu. (A) Schematyczny schemat zespołu mocującego mózg. Żółte paski symbolizują dystansy z taśmy klejącej. Powiększony schemat mózgu wskazuje przybliżoną lokalizację klastra PAM (fioletowy). (B) Schematy przekroju bocznego odpowiadające płaskocie przerywanej w A, przedstawiające dwie powszechne morfologie mózgu po rozwarstwieniu: optymalnie umieszczone (górne) i pochylone (dolne). (C) Dwa rozcięte mózgi much oglądane pod stereoskosem: optymalnie ustawione (lewo) kontra przechylone (prawe). Żółte strzałki wskazują stereotypowy bruzdę wzdłuż konturu grzbietowego. Niebieskie krewki łączą dwa odpowiadające sobie punkty orientacyjne po lewej i prawej stronie brzusznej połowy. Niebieskie strzałki podkreślają wynikającą zmianę względnej perspektywy tych brzusznych punktów orientacyjnych. Pasek skali = 500 μm. (D) Schematyczna ilustracja pokazująca, jak morfologia mózgu i grubość odstępu taśmy (jednowarstwowa vs. podwójna) wpływają na pionowe położenie klastra PAM, a co za tym idzie na wymaganą głębokość stosu Z. (E) Reprezentatywne boczne widoki (projekcja Y) konfokalnych stosów Z barwionych TH z optymalnie ustawionych (górnych) i zdeformowanych (dolnych) stanów montażowych. Pasek skali = 5 μm. Skrót: PAM = protomózgowy przedni przyśrodkowy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2. Szkolenia z zestawów laboratoryjnych i interaktywna segmentacja. (A) Graficzny interfejs użytkownika w Labkit. Adnotacje (bazgroły) są prezentowane w dwóch klasach: pierwszy plan (czerwony) i tło (niebieski). (B) Wynik segmentacji generowany bezpośrednio po treningu bazgrołów pokazanych w A. Czerwony oznacza kolor pierwszego planu; niebieski oznacza kolor tła. Skala = 5 μm. (C) Przesłuch między sąsiednimi Z-przekrojeniami. Pojedyncze obrazy mitochondriów znakowanych fluorescencyjnymi białkami z różnych mózgów much były łączone wzdłuż osi Z. Fragmenty 1 i 3 są identycznymi kopiami tego samego obrazu, natomiast fragmenty 2 i 4 pochodzą z różnych mózgów. Żółte strzałki, przebieg przewidywania z fragmentu 2 do fragmentu 1. Zielone strzałki, przewidzienie przebijające się z przekroju 4 do wycinka 3. Pasek skali = 3 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Rysunek 3. Postprocessing masek segmentacyjnych Labkit oraz kwantyfikacji neuronów TH⁺. (A) Surowa maska binarna Labkit (cyjan, górny) i nakładana na oryginalny kanał TH (dolny). Zwróć uwagę na obfite małe plamki i niepełne wypełnienie ciał komórek neuronalnych. (B) Maska po morfologicznym odmurzywaniu i wypełnianiu dziur (magenta, górna); nakład kanał TH (dolny). (C) Udoskonalona maska binarna (czerwona, górna) z wygładzonej powierzchni TH dla B i ponownego maskowania; nakład kanał TH (dolny). (D) Górna: Nakładka surowych (cyjanowych) i rafinowanych (czerwonych) masek, podkreślająca obszary skorygowane przez postprocessing. Dolna: Projekcja maksymalnej intensywności pokazująca ostatnie plamy DAPI (magenta) nałożone na kanał TH (zielony). Należy zauważyć, że dwa miejsca w prawym górnym rogu pochodzą z przeciwległego klastra PAM. Do ilustracji użyto filtra 4. (E) Walidacja ilościowa w modelu choroby Parkinsona z użyciem wielu kombinacji filtrów. Trzytygodniowe muchy nSyb-QF2>SNCA (model PD) wykazują istotne zmniejszenie liczby neuronów PAM TH⁺ w porównaniu do kontroli nSyb-QF2 w wielu filtrach (góra). Surowe dane są dostępne w arkuszu kalkulacyjnym (na dole). filtr 1: 1,2, ['"Jakość" powyżej 94,5,"Średnia intensywność Ch=aRozmiarC+2" poniżej 0,0001']; filtr 2: 1,2, ['"Jakość" powyżej 94,5, "Średnia intensywności Ch=aSizeC+2" poniżej 0,001']; filtr 3: 1,2, ['"Jakość" powyżej 94,5,"Średnia intensywność Ch=aSizeC+2" poniżej 0,01']; filtr 4: 1,2, ['"Jakość" powyżej 94,5,"Średnia intensywności Ch=aRozmiarC+2" poniżej 0,05']; filtr 5: 0,6, ['"Jakość" powyżej 94,5,"Średnia intensywność Ch=aSizeC+2" poniżej 0,001']; filtr 6: 0,6, ['"Jakość" powyżej 94,5,"Średnia intensywności Ch=aSizeC+2" poniżej 0,01']; filtr 7: 0,9, ['"Jakość" powyżej 94,5,"Średnia intensywności Ch=aRozmiarC+2" poniżej 0,01']; n = 57 mózgów (kontrola), n = 65 mózgów (PD); Test t-ucznia, p < 0,0001 (****). Muchy hodowano w temperaturze 29 °C. Paski łusek = 5 μm (A–D). Dane są przedstawione jako średnie ± SD. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Plik uzupełniający 1. Makro Fiji do rozdzielania kanału TH z przekonwertowanych plików obrazów i zapisywania stosów wyjściowych.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2. Makro Fiji do przycinania treningowych stosów Z do wspólnej głębokości Z-slice i łączenia ich do pliku time-lapse TIFF do treningu klasyfikatorów Labkit.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3. Pretrenowany klasyfikator Labkit używany do testowania workflow segmentacji PAM TH.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4. Skrypt MATLAB do przetwarzania wsadowego mask Labkit, generowania plam DAPI, stosowania kombinacji filtrów oraz eksportu liczby neuronów TH⁺ .Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Ilościowa identyfikacja neuronów DA w klastrze PAM Drosophila historycznie stanowiła poważne wyzwanie. Przedstawiamy tutaj półautomatyczny workflow, który integruje klasyfikację pikseli opartą na uczeniu maszynowym z oprogramowaniem do analizy obrazów, aby rozwiązać ten długoletni problem. Metoda ta umożliwia wykrywanie na poziomie partii zmienności neuronów TH⁺ w klastrze PAM w grupach tego samego eksperymentu, wspierając badania porównawcze w modelach choroby Parkinsona¹⁸.

Wybierając optymalny filtr dla danego eksperymentu, użytkownicy mogą wybrać filtr najlepiej odpowiadający wizualnej inspekcji surowych obrazów lub odwołać się do podanego zakresu i/lub średniej liczby neuronów PAM typu dzikiego w literaturze^12,13. Jednak należy zachować ostrożność: tylko dwa badania odnotowały liczbę klastrów PAM, z których żadne nie jest związane z PD, a zgłoszone wartości wykazują znaczną niespójność. Ponadto odchylenie standardowe może wzrastać wraz z wiekiem, co dodatkowo komplikuje porównania w badaniach krzyżowych. Dlatego odniesienia oparte na literaturze powinny być używane jedynie jako ogólny przewodnik, a nie jako absolutny standard. Uznajmy, że ten potok nie daje bezbłędnych bezbłędnych liczb bezbłędnych (Rysunek 3D). Jednak dopóki porównania ograniczają się do grup w ramach tej samej partii eksperymentalnej (czyli nie łączą danych między różnymi partiami w jednym wykresie), metoda ta może być użyta do wykrywania względnych różnic między genotypami lub warunkami leczenia w obrębie partii.

Z naszego doświadczenia wynika, że przeciwciała wtórne sprzężone z AF488 należy unikać ze względu na wysokie tło, a AF546 ze względu na wyższe tłumienie sygnału wzdłuż osi Z. Stwierdziliśmy również, że dokładna inkubacja i płukanie DAPI są kluczowe dla uzyskania wysokiego stosunku sygnału do szumu oraz wyraźnych sygnałów jądrowych, co bezpośrednio wpływa na wydajność automatycznej segmentacji. DAPI jest do tego zastosowania preferowane od Hoechst, ponieważ preferencyjne barwienie heterochromatyny generuje jaśniejsze i wyraźniej zdefiniowane plamy jądrowe, co ułatwia dokładniejsze wykrywanie.

Dyskusja dotycząca typowych trybów awarii

Awarie związane z przebarwieniami. Umiejętność sekcji jest kluczowym czynnikiem wpływającym na jakość danych. Klaster PAM znajduje się powierzchownie i łatwo ulega uszkodzeniu przy usunięciu dwóch pęcherzyków tchawicowych oraz tłuszczu grzbietowego w tym obszarze. Kleszcze należy obchodzić ostrożnie, aby nie przebić lub nie ucisnąć obszaru PAM. Odkształcenie brzuszne często występuje w momencie przecięcia nerwu brzusznego, powodując przechylanie lub zwijanie mózgu po położeniu na szklanym szkiełku; ta deformacja może zostać trwale ustabilizowana po inkubacji PFA. Użytkownicy powinni eksperymentować z kątami kleszczy podczas przecinania, aby znaleźć optymalną technikę. Jeśli po rozwarstwieniu zaobserwuje się przechylenie, delikatny nacisk na podniesiony obszar może odwrócić deformację (co jest akceptowalne, jeśli skompresowany obszar nie jest interesującym obszarem).

Niepowodzenia w segmentacji. Słaba segmentacja zwykle wynika z niewystarczającej różnorodności danych treningowych. Klasyfikator Labkit musi być trenowany na reprezentatywnym zestawie obrazów obejmujących pełen zakres jakości barwienia w danej partii, w tym najlepsze, przeciętne i najsłabsze. Podczas iteracyjnej korekty priorytetowo przypisuj fałszywie pozytywne i fałszywie negatywne wyniki, co do których jesteś pewien. Unikaj korekcji niejasnych lub niepewnych regionów, ponieważ może to wprowadzać klasyfikator w błąd i pogorszyć wydajność.

Awarie wykrywania punktów. Optymalizacja parametrów wymaga systematycznego badania niewielkiego podzbioru reprezentatywnych próbek. Testuj różne szacowane średnice plamki i próg filtrów jakościowych, a nawet typy filtrów wykraczających poza filtr "Jakość powyżej" stosowany w tym protokole. Kreator tworzenia miejsc oferuje różne opcje filtrowania (np. intensywność). Użytkownicy są zachęcani do dostosowywania progów i typów filtrów do swojego konkretnego zbioru danych oraz do przeprowadzania empirycznego dostrojenia przed przetwarzaniem wsadowym.

Dlaczego ręczne liczenie neuronów klastrowych PAM pozostaje wyjątkowo trudne? Klaster PAM wykazuje unikalne cechy anatomiczne i barwiące, które czynią tradycyjne ręczne metody liczenia niewystarczającymi. Po pierwsze, immunofluorescencja TH w cytosolu neuronów dopaminergicznych Drosophila głównie oznacza cienki cytoplazmatyczny pierścień otaczający dużą, niezabarwioną pustkę jądrową. W konsekwencji jądro barwione DAPI oraz przedział cytoplazmatyczny TH⁺ wykazują minimalne nakładanie się przestrzenne. Ten fundamentalny brak kolokalizacji wyklucza bezpośrednią strategię klasyfikacji "plamki DAPI w masce TH". Po drugie, klaster PAM składa się z ponad 100 gęsto upakowanych neuronów ułożonych w trójwymiarową, winogronową architekturę. Podczas przechodzenia przez konfokalne stosy Z, neurony stopniowo pojawiają się i znikają — niektóre wchodzą do płaszczyzny, inne wychodzą — tworząc wysokie obciążenie poznawcze i znaczną zmienność między obserwatorami. Najnowsze badanie ilościowe neuronów PAM DA opierało się na ręcznym liczeniu za pomocą wtyczki ImageJ. Chociaż całkowicie odpowiednie dla mniejszych klastrów, takich jak PPM1/2 czy PPL1, to podejście staje się zbyt pracochłonne w przypadku klastra PAM, szczególnie w badaniach wymagających dziesiątek lub setek próbek.

Dlaczego architektura losowego lasu Labkita jest szczególnie dobrze przystosowana do segmentacji neuronów TH? Labkit implementuje klasyfikator pikseli oparty na losowym lesie, który jest wyjątkowo dobrze przystosowany do specyficznych wyzwań obrazów klastrowych PAM barwionych TH. Algorytm oblicza kompleksowy wektor cech dla każdego piksela, stosując kaskadę filtrów transformacji, w tym rozmycia Gaussa, różnicę Gaussowskich, gradientową wartość Gaussa, Laplace'a Gaussa oraz wartości własne Hessja—każda z nich oceniana na wielu skalach sigma (1, 2, 4, 8). To wieloskalowe wyodrębnianie cech skutecznie oddaje cechy tekstury i krawędzi, które odróżniają wnętrze jądra od tła zewnątrzkomórkowego. Co ważne, ponieważ losowe lasy wymagają rzędów wielkości mniej danych treningowych niż podejścia do głębokiego uczenia, użytkownicy mogą iteracyjnie udoskonalać klasyfikator za pomocą rzadkich notacji bazgrołów na zaledwie 20–40 reprezentatywnych obrazach. Każda iteracja dodaje nowe drzewa decyzyjne do zespołu, które wspólnie głosują o klasyfikacji każdego piksela. Proces ten z natury uwzględnia zmienność warunków barwienia i obrazowania w poszczególnych partiach – co jest kluczową zaletą biorąc pod uwagę zmienność biologiczną charakterystyczną dla krzyżowań genetycznych Drosophila i badań nad starzeniem. Dzięki temu podejściu można wykryć utratę neuronów TH⁺ w modelach Parkinsona ekspresujących α-synukleinę, a wpływ wzmacniaczy genetycznych i supresorów na liczbę neuronów klastrowych PAM można porównać w ramach eksperymentalnej partii.

Co ważne, dla celów treningowych, przycięte stosy są łączone wzdłuż wymiaru czasu, a nie wzdłuż osi Z. Ten wybór projektowy jest kluczowy dla optymalnego treningu klasyfikatora. Klasyfikacja pikseli 3D według Labkit uwzględnia informacje wokselowe na kolejnych Z-krocach, co jest niezbędne do dokładnego rozdzielenia cienkiego, cytoplazmatycznego pierścienia TH definiującego morfologię neuronów PAM. Jeśli poszczególne próbki byłyby zamiast tego układane pionowo w pojedynczy, ultragruby stos Z, wycinki Z na granicach między sąsiadującymi próbkami stałyby się przestrzennie spójne w stosie. W konsekwencji woksele należące do różnych próbek biologicznych byłyby traktowane jako sąsiednie struktury w obrębie tej samej trójwymiarowej objętości. Podczas interaktywnego treningu bazgroł narysowany w pobliżu takiej granicy może przypadkowo uchwycić cechy z dwóch różnych próbek jednocześnie, co wprowadza w błąd klasyfikator (rysunek 2B, strzałki). Co więcej, fałszywie pozytywne sygnały pochodzące z jednej próbki mogą przenikać do objętości sąsiedniej próbki, co skutkuje błędnymi korygującymi bazgrołami, które propagują się w kolejnych iteracjach treningowych, generując drzewa decyzyjne kodujące biologicznie bezsensowne reguły. Łączenie próbek wzdłuż osi czasu zachowuje integralność przestrzenną każdej pojedynczej objętości, pozwalając jądrom filtrów 3D działać wyłącznie wewnątrz — a nie pomiędzy — próbkami biologicznymi, jednocześnie umożliwiając efektywne, wielopróbkowe treningi w jednej sesji Labkit.

Rozważania metodologiczne i ograniczenia

Kilka ważnych zastrzeżeń zasługuje na omówienie. Po pierwsze, protokół ten jest zoptymalizowany specjalnie pod klaster PAM i może nie uogólniać się na inne klastry DA (np. PPM1/2/3, PPL1) ani na neurony TH⁺ w płatach nerwu wzrokowego. Region PAM korzysta z stosunkowo rzadkiej gęstości DAPI, z jądrami dobrze rozdzielonymi w przestrzeni trójwymiarowej, co umożliwia solidne i jednoznaczne wykrywanie punktów DAPI. W przeciwieństwie do tego, ten workflow nie jest łatwo przenoszalny do innych klastrów DA, takich jak PPL1 czy PPM1/2. W tych regionach neurity częściej są zestawione lub nakładają się na jądra komórek nie-DA barwione DAPI. Biorąc pod uwagę bardzo niską bazową liczbę neuronów DA w tych małych klastrach (często mniej niż 10 komórek na klaster), nawet kilka błędnych klasyfikacji może prowadzić do proporcjonalnie dużych błędów, co czyni tę metodę mniej wiarygodną w takich zastosowaniach. Po drugie, immunobarwienie TH również oznacza neuryty i projekcje aksonalne w neuropilu. Pomimo korekcyjnych adnotacji podczas treningu, te światłowody czasami generują silne sygnały TH i mogą być błędnie klasyfikowane jako pierwszy plan przez klasyfikator. Jednak te obszary w klastrze PAM są niemal zawsze pozbawione jąder barwionych DAPI; w związku z tym woksele fałszywie dodatnie w obszarze klastra PAM bogatym w neurity przyczyniają się minimalnie do końcowej liczby neuronów. Po trzecie, klasyfikacja pikseli Labkit działa na lokalnych cechach tekstur w skończonym sąsiedztwie (domyślne jądra filtrów reagują na około 16 × 16 okien). Taki projekt zapewnia efektywność obliczeniową i umożliwia segmentację interaktywną w czasie rzeczywistym, ale oznacza również, że klasyfikator nie może wykorzystać globalnego kontekstu anatomicznego. W konsekwencji rzadkie artefakty lub nieprawidłowości w barwieniu, które znacząco odbiegają od zestawu treningowego, mogą wymagać indywidualnej kuracji. Wreszcie, opisany tutaj potok przetwarzania wsadowego — integrujący segmentację Labkit z detekcją punktów DAPI i transformacją odległości — generuje wiele kanałów wyjściowych i kombinacji filtrów. Użytkownicy powinni systematycznie weryfikować optymalne parametry filtrów dla swoich specyficznych warunków eksperymentalnych, zamiast bezkrytycznie przyjmować domyślne progi przedstawione w tym protokole.

Przyszłe zastosowania

Poza modelem PD przedstawionym tutaj, ten półautomatyczny pipeline można bezpośrednio zastosować do dowolnego modelu Drosophila obejmującego kwantyfikację neuronów DA klastrów PAM, w tym badania uczenia się i pamięci, motywacji, regulacji snu oraz neurodegeneracji związanej z wiekiem. Konkretnie, zdolność przetwarzania partii tej metody może czynić ją odpowiednią do: (1) Średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych testów leków: Testowanie wielu związków neuroprotekcyjnych w różnych dawkach staje się bardziej wykonalne bez proporcjonalnego zwiększenia wysiłku ręcznego liczenia. (2) Badania genetyczne modyfikujące: Ilościowe określenie liczby neuronów PAM w setkach krzyżowań genetycznych (np. linie RNAi, linie nadekspresji) w celu identyfikacji wzmacniaczy lub supresorów toksyczności α-synukleiny. (3) Badania starzenia się podłużnie: Śledzenie utraty neuronów PAM w wielu punktach czasowych przy zmniejszonym obciążeniu ręcznym liczeniem. Co więcej, proces segmentacji oparty na Labkit nie ogranicza się do barwienia TH; przy odpowiednim przeszkoleniu można go dostosować do ilościowego określenia innych populacji neuronów w mózgu Drosophila , pod warunkiem, że dzielą one dwie kluczowe cechy z klastrem PAM: stosunkowo niską gęstość jąder barwionych DAPI oraz minimalne zakłócenia wynikające z barwienia neurytowego. Poza Labkit i używanym tutaj oprogramowaniem 3D, ogólna logika tego pipeline'u — klasyfikacja pikseli oparta na uczeniu maszynowym, następnie detekcja punktów i transformacja odległości — może być implementowana w innych wspieranych platformach analizy obrazów 3D, co zwiększa jego dostępność i elastyczność dla szerszej społeczności badawczej.

Podsumowując, przedstawiamy półautomatyczny workflow wykrywania różnic grupowych w liczbie neuronów TH⁺ w klastrze PAM. Łącząc klasyfikację pikseli opartą na Labkit z detekcją punktową i transformacją odległości, metoda ta umożliwia porównanie liczby neuronów TH⁺ między grupami eksperymentalnymi i kontrolnymi w obrębie tej samej partii, jednocześnie zmniejszając obciążenie ręcznym liczeniem wraz ze wzrostem wielkości próby. Skalowanie od dziesiątek do setek próbek proporcjonalnie zwiększa czas obliczeniowy, ale dodatkowy wysiłek ręczny ogranicza się głównie do organizacji plików i kontroli jakości. Chociaż klaster PAM nie zyskał dotąd większego zainteresowania w badaniach nad Parkinsonem, wynika to głównie z ograniczeń technicznych, a nie z biologicznej nieistotności. Dzięki praktycznemu narzędziu do ilościowego określania, nasz protokół w przyszłości ułatwi badanie, czy i jak neurony PAM ulegają degeneracji w modelach Parkinsonowej oraz zbada ich potencjalny wkład w objawy niemotoryczne, takie jak deficyty węchowe i spadek motywacji. Przewidujemy, że protokół ten ułatwi badania porównawcze na poziomie partii dopaminergicznej neurodegeneracji, plastyczności synaptycznej oraz przesiewowego przesiewu leków neuroprotekcyjnych w systemie modelowym Drosophila .

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu 3D - Bitplan Imaris 8.0+	Instrumenty Oksfordzkie	http://www.bitplane.com/	Oprogramowanie do analizy obrazu 3D użyte w tym badaniu
4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	62248
D. melanogaster: nSyb-QF2	Centrum Hodowla Drosophila w Bloomington	51960
D. melanogaster: nSyb-QF2>QUAS-SNCA	Centrum Hodowla Drosophila w Bloomington	600605
DOWSIL SYLGARD 184	Tat Lee Engineering Pte Ltd	https://www.tatlee.com.sg/
Dumont pęseta Styple 3C Dumoxel, 0,04/0,08 mm	Nauki o mikroskopii elektronowej	72680-D (0203-3C-PO)
FV3000 konfokalny	Olympus	https://www.olympus-global.com/
Przeciwciało przeciwkozłowe przeciw IgG (H+L) z krzyżową adsorbacją przeciwkozą, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244
ImageJ/Fiji (1.53q)	Fidżi/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/
Zestaw laboratoryjny	Fidżi/ImageJ	https://imagej.net/plugins/labkit/
Sworznie do drobnych sworzni, stal nierdzewna, średnica 0,15 mm	Austerlitz	https://mothandbeetle.com/products/austerlitz-stainless-steel-minutens.html
Normalne serum koziego, liofilizowane ciało stałe	Sigma-Aldrich	566380
Oprogramowanie do obliczeń numerycznych - Python	Python	3.8+
Oprogramowanie do obliczeń numerycznych - Matlab	Matematyka	R2016a+	Oprogramowanie do obliczeń numerycznych użyte w tym badaniu
Etoksylan oktylfenolu (Triton X-100)	Bio-rad	1610407
Roztwór paraformaldehydu 4% w PBS	Santa Cruz Biotechnology	SC-281692
Misa do hodowli komórek polistyrenowych	Nest Scientific	706001
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36934
Królicza antytyrozynowa hydroksylaza (TH)	Pel Freeze	P40101-0
Azyd sodu	Sigma-Aldrich	S2002
Stereoscope	Olympus	SZ51
Sterican Einmalkan ü len 27 G grau 0,40 x 12 mm	Sterican	D-34209
Strzykawka, 1 mL	Terumo	DVR-5175
Przezroczysta taśma klejąca	3M Scotch 600, czyste	600