Artykuł badawczy

Transkryptomowa identyfikacja kandydatów biomarkerów związanych z układem renina-angiotensyna oraz testowanie zewnętrzne modelu diagnostycznego nadciśnienia

DOI:

10.3791/71252

⸱

22 czerwca 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lanzhou University, 2Department of Cardiovascular Medicine, Affiliated Hospital of Gansu Medical College, 3Department of Nephrology, Affiliated Hospital of Gansu Medical College, 4Department of Cardiology, First Hospital of Lanzhou University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystując publiczne zbiory danych transkryptomu krwi, w niniejszym badaniu zidentyfikowano kandydujące biomarkery związane z układem renina-angiotensyna (RAS) dla nadciśnienia. Bioinformatyka i uczenie maszynowe pozwoliły na wyodrębnienie osiem-genowej sygnatury, która została przetestowana w niezależnej kohorcie opartej na krwi, łącząc zmiany transkryptomowe RAS z sygnaturami immunologicznymi i zapalnymi, które wymagają dalszej walidacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsza praca miała na celu zidentyfikowanie kandydujących biomarkerów transkryptomowych krwi związanych z układem renina-angiotensyna (RAS), związanych z nadciśnieniem, skonstruowanie zewnętrznie przetestowanego kandydackiego modelu diagnostycznego oraz zweryfikowanie wybranych genów w modelowaniu komórek endotelialnych indukowanych Ang II. Przeanalizowano dwa publiczne zestawy danych mikroarray, GSE75360 i GSE74144. Analizę różnicowej ekspresji przeprowadzono za pomocą limma, następnie wykonano analizę wzbogacania GO/KEGG, prerankowaną GSEA, analizę infiltracji immunologicznej CIBERSORT, analizę interakcji białko-białko oraz konstrukcję sieci regulacyjnej, a także wybór cech oparty na uczeniu maszynowym przy użyciu regresji logistycznej i lasu losowego. Model regresji logistycznej oparty na wybranych genach został opracowany w GSE75360 i przetestowany zewnętrznie w GSE74144. Weryfikacja eksperymentalna została przeprowadzona w komórkach HUVEC indukowanych Ang II za pomocą qRT-PCR, western blotting, ELISA oraz assayów CST3/FURIN loss- i gain-of-function, po których wykonano analizy CCK-8, Transwell, zapalne, stresu oksydacyjnego oraz funkcji endotelialnych. W GSE75360 zidentyfikowano 173 różniczkowo eksponowane geny, w tym 18 różniczkowo eksponowanych genów związanych z RAS. Osiem kandydujących genów, LRP1, CTSD, MTHFR, AUTS2, FURIN, CST3, FCER1G i TBXAS1, zostało wybranych przez skomponowane analizy uczenia maszynowego. Analizy wzbogacania i infiltracji immunologicznej wskazały, że te geny były głównie związane z podpisami immunologicznymi i zapalnymi. Model ośmiu genów wykazał wysoką dyskryminację w GSE75360 i zachował umiarkowaną wydajność w GSE74144. W komórkach HUVEC traktowanych Ang II większość kandydujących genów była nadekspresowana na poziomie mRNA, a CST3, FURIN i TBXAS1 zostały dalsze zweryfikowane na poziomie białka. Modulacja CST3 i FURIN zmieniła nadciśnienie wywołane przez Ang II, wiarygodność komórek endotelialnych, migrację, ekspresję markerów zapalnych/adhezyjnych, akumulację ROS oraz funkcjonalne wyniki związane z eNOS/NO. Niniejsze badanie zidentyfikowało kandydujące biomarkery związane z RAS oraz podpisy immunologiczne w nadciśnieniu i opracowało zewnętrznie przetestowany kandydacki model diagnostyczny. Wyniki in vitro wspierają funkcjonalną istotność CST3 i FURIN w reakcjach endotelialnych indukowanych przez Ang II, co wymaga dalszej walidacji klinicznej i mechanyzmu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie koncentruje się na nadciśnieniu, przewlekłej chorobie układu krążenia, która występuje na całym świecie1. Nadciśnienie znacznie zwiększa ryzyko poważnych powikłań zdrowotnych, w tym zdarzeń układu krążenia i krążenia mózgowego, a także uszkodzenia nerek. Stwarza to poważne zagrożenie dla jakości życia pacjentów i ich długowieczności, powodując znaczne obciążenie społeczne i ekonomiczne2,3. Obecnie diagnoza i leczenie nadciśnienia opierają się głównie na monitorowaniu ciśnienia krwi i lekach przeciwnadciśnieniowych. Jednak ze względu na złożoność i niejednorodność przyczyn nadciśnienia, wielu pacjentów nie reaguje adekwatnie na obecne leczenie, a stratyfikacja oparta na informacjach molekularnych pozostaje ograniczona4,5. W związku z tym istnieje potrzeba identyfikacji kandydujących biomarkerów i sygnatur transkryptomowych związanych z nadciśnieniem, unikając jednocześnie nadinterpretacji wyników opartych na badaniach krwi jako ostatecznych mechanizmów na poziomie tkankowym.

W ostatnich latach układ renina-angiotensyna (RAS) zyskał znaczną uwagę w patogenezie i progresji nadciśnienia6. Istniejące badania wykazały, że nieprawidłowa ekspresja genów związanych z RAS jest ściśle związana z zaburzeniami regulacji ciśnienia krwi i uszkodzeniem narządów docelowych, jednak dokładne sieci molekularne i kluczowe czynniki regulacyjne nie są w pełni zrozumiałe7. Ponieważ nadciśnienie jest coraz częściej rozpoznawane jako zaburzenie związane z dysregulacją naczyniową, immunologiczną i zapalną, komórki krwi obwodowej i białe krwinki dostarczają dostępnych tkanek surogatowych, które mogą uchwycić ogólnoustrojowe zmiany transkryptomowe związane z RAS8. W niniejszym badaniu zestaw genów związanych z RAS został opracowany na podstawie wyszukiwań w GeneCards i PubMed, obejmując zarówno kanoniczne geny szlaku RAS, jak i geny zgłoszone w literaturze jako funkcyjnie związane z sygnałami RAS.

To badanie wykorzystuje dwa publicznie dostępne zestawy danych mikroarray (GSE75360 i GSE74144), stosując metodologie bioinformatyczne i uczenia maszynowego do analizy transkryptomowej. Określone metody obejmują analizę różnicową limma, analizy wzbogacenia GO/KEGG/GSEA, analizę infiltracji immunologicznej CIBERSORT, budowę sieci PPI oraz selekcję kluczowych genów i budowę oraz ocenę modelu diagnostycznego opartego na regresji logistycznej. Zalety tych metod polegają na ich zdolności do analizy dużych zestawów danych transkryptomowych, zewnętrznego testowania wyników w różnych zestawach danych oraz integracji uzupełniających podejść analitycznych do budowy kandydujących modeli. Zakładaliśmy, że profile transkryptomowe komórek krwi mogą identyfikować kandydujące biomarkery związane z RAS, związane z nadciśnieniem i sygnaturami immunologicznymi. Dlatego naszym celem było zidentyfikowanie kandydujących genów związanych z RAS, scharakteryzowanie ich funkcyjnego kontekstu i skonstruowanie zewnętrznie przetestowanego kandydującego modelu diagnostycznego, a nie ustanowienie ostatecznych mechanizmów molekularnych lub gotowego do użycia klinicznego narzędzia diagnostycznego precyzyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
```html

Przegląd przepływu pracy analitycznej

Ogólny projekt analizy transkryptomicznej i opartej na uczeniu maszynowym przedstawiono na Rysunku 1, obejmującym kluczowe kroki: zbieranie genów związanych z układem renina-angiotensyna (RASRG); przesiewanie genów RASRDEG różnicująco ekspresowanych w zbiorach danych nadciśnienia; analizę wzbogacenia funkcjonalnego (GO/KEGG/GSEA); analizę infiltracji immunologicznej (CIBERSORT); budowę sieci interakcji białko-białko (PPI) i sieci regulacyjnych; wybór kluczowych genów oparty na uczeniu maszynowym (regresja logistyczna, las losowy [RF]); oraz ocenę modelu diagnostycznego nadciśnienia. Pełna lista oprogramowania, baz danych i narzędzi internetowych użytych w tej pracy znajduje się w Tabeli Materiałów.

Pobieranie danych

Zbiory danych nadciśnienia GSE753608 i GSE74144 (Homo sapiens) zostały uzyskane za pomocą pakietu R GEOquery9 z bazy danych GEO10. GSE75360 pochodzące z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (platforma: GPL10558) obejmowało 10 próbek nadciśnienia i 11 próbek kontrolnych; GSE74144 pochodzące z leukocytów (platforma: GPL13497) obejmowało 14 próbek nadciśnienia i 8 próbek kontrolnych (Tabela 1). Białko-kodujące RASRG (1264) zostały początkowo zidentyfikowane za pomocą GeneCards11 (słowo kluczowe: "Renin-Angiotensin System") i PubMed (słowo kluczowe: "Renin-Angiotensin System")12,13. Przecięcie tych RASRG z genami w GSE75360/GSE74144 dało 1159 końcowych RASRG14. Dwa zbiory danych były przetwarzane osobno, ponieważ zostały wygenerowane na różnych platformach mikroarray. Adnotacja sond została przeprowadzona zgodnie z odpowiednimi plikami adnotacji platformy GPL, a znormalizowane macierze ekspresji genów zostały wykorzystane do dalszych analiz. Wykresy pudełkowe zostały wykorzystane do porównania dystrybucji ekspresji przed i po normalizacji.

Różnicująco ekspresowane geny związane z nadciśnieniem i reninem-angiotensyną

Próbki w zbiorze danych GSE75360 zostały sklasyfikowane do grupy nadciśnienia i grupy kontrolnej. Do przeprowadzenia analizy różnicowej ekspresji genów pomiędzy dwoma grupami zastosowano oprogramowanie limma14, a różnicująco ekspresowane geny (DEG) zidentyfikowano na podstawie progu |logFC| > 0,45 i wartości p < 0,05. Wyniki tej różnicowej analizy zostały zwizualizowano za pomocą wykresów wulkanu (utworzone za pomocą pakietu R ggplot2).

Aby uzyskać RASRDEG, DEG spełniające powyższy próg (|logFC| > 0,45, wartość p < 0,05) zostały skrzyżowane z genami związanymi z RAS (RASRG), a wynik przecięcia przedstawiono za pomocą diagramu Venna. Następnie, wzorce ekspresji zidentyfikowanych RASRDEG zostały zwizualizowane jako mapa cieplna za pomocą pakietu R pheatmap, a lokalizacja chromosomowa RASRDEG została przedstawiona za pomocą map chromosomów utworzonych za pomocą pakietu R RCircos15.

Walidacja różnicująco ekspresowanych genów i analizy krzywej ROC

Aby analizować różnice w ekspresji RASRDEG między nadciśnieniem/kontrolą w GSE7536016, skonstruowano wykres intergrupowy, a za pomocą pakietu R pROC wykreślono krzywe ROC i obliczono AUC (0,5–0,7: niska dokładność; 0,7–0,9: umiarkowana; >0,9: wysoka) dla skuteczności diagnostycznej RASRDEG.

Analiza korelacji

Analiza korelacji Spearmana została przeprowadzona na ekspresji RASRDEG w GSE75360; wyniki zostały zwizualizowane za pomocą mapy cieplnej (pakiet R ggplot2) (|r| < 0,3: brak/słaba korelacja; 0,3–0,5: słaba; 0,5–0,8: umiarkowana; >0,8: silna).

Analiza wzbogacenia GO i KEGG

GO (Gene Ontology, wersja 2024, http://geneontology.org/) to szeroko stosowane źródło dużej skali wzbogacenia funkcjonalnego, obejmujące trzy domeny: procesy biologiczne (BP), komponenty komórkowe (CC) i funkcje molekularne (MF)17. KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, wersja 109.0, 2024, https://www.genome.jp/kegg/) przechowuje dane na temat genomów, bioszlaków, chorób i leków18.

RASRDEG zostały poddane analizie adnotacji GO i wzbogacenia ścieżek KEGG za pomocą pakietu R clusterProfiler19. Metoda testu wzbogacenia: test hipergeometryczny; metoda korekcji wielokrotnych testów: metoda Benjamini-Hochberg (BH). Kryterium przesiewania: skoreguowana wartość p < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczyszczanie zestawów danych dotyczących nadciśnienia

Aby zapewnić wiarygodność dalszych analiz, zestawy danych GSE75360 i GSE74144 zostały najpierw poddane adnotacji sond i normalizacji danych za pomocą pakietu R limma. Rozkłady wartości ekspresji genów przed i po normalizacji są przedstawione w Dodatkowym pliku 1—Dodatkowa Figura S1A-D, przy czym pomarańczowy kolor reprezentuje próbki nadciśnienia, a niebieski kontrolę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nadmierna ciśnienie krwi jest złożonym zaburzeniem układu krążenia, w którego rozwoju biorą udział dysregulacja układu renina-angiotensyna-aldosteron (RAS), aktywność immunologiczno-zapalna, uszkodzenie naczyń i dysfunkcja śródbłonka32. W niniejszym badaniu po raz pierwszy zastosowano publiczne dane transkryptomiczne z krwi i metody uczenia maszynowego w celu zidentyfikowania kandydatów na biomarkery związanych z RAS oraz stworzenia zewnętrznie przetestowanego modelu diagnostycznego. Następnie uzu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zadeklarowania.

Wkład autorów:

Koncepcja i projekt pracy: Bai J, Wang Y;

Zbieranie danych: Yang X X, Du L, Shi J H, Li X X, Bai M;

Superwizja: Bai J, Wang Y;

Analiza i interpretacja danych: Yang X X, Du L, Shi J H, Li X X, Bai M;

Analiza statystyczna: Bai J, Wang Y, Bai M;

Przygotowanie manuskryptu: Bai J, Wang Y;

Krytyczna rewizja manuskryptu: wszyscy autorzy;

Zatwierdzenie ostatecznej wersji manuskryptu: wszyscy autorzy.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie: Fundusz Innowacji Projektu Wydziału Edukacji Wyższej Departamentu Edukacji Prowincji Gansu (nr 2026B-268)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-well cell culture platesZastosowanie do testów żywotności komórek CCK-8
Angiotensin II (Ang II)Stosowany do wywołania uszkodzenia śródbłonka w HUVEC przy 100 nM przez 48 h
Roztwór antybiotykówDodany do pożywki do hodowli komórek śródbłonkowych zgodnie z instrukcjami dostawcy
Zestaw do oznaczania białka BCAStosowany do określania stężenia białka do blotowania Western
Zestaw do liczenia komórek Kit-8 (CCK-8)Stosowany do oceny żywotności/proliferacji HUVEC
Środek do wykrywania chemiluminescencjiStosowany do wizualizowania pasm białkowych na blotach Western
ChIPBase v2.0Sun Lab / Zasób badańN/ABaza danych używana do pobierania relacji czynnik transkrypcyjny-cel dla genów kluczowych
CIBERSORTStanford University / Newman LabN/AAlgorytm dekonwolucji komórek odpornościowych stosowany do oszacowania obfitości 22 typów komórek odpornościowych
clusterProfiler (pakiet R)BioconductorN/APakiet R stosowany do analiz GO, KEGG i GSEA
Kombajn CO2 do hodowli komórekStosowany do hodowli HUVEC w 37 °C z 5% CO2
Comparative Toxicogenomics Database (CTD)NC State University / Mount Desert Island Biological LaboratoryN/ABaza danych stosowana do przewidywania interakcji gen-lek
Pełna pożywka do hodowli komórek śródbłonkowychStosowany do hodowli HUVEC
Stanowisko komputerowe z dostępem do internetuKażda standardowa platforma obliczeniowa do badańN/AStosowany do pobierania danych, przetwarzania wstępnego, analizy statystycznej i wizualizacji
Zestaw ELISA dla CST3Stosowany do wykrywania wydzielanego CST3 w nadstanowie kultury komórkowej
Plasmid przelewowy z nadekspresją CST3 (oe-CST3)Stosowany do eksperymentów nadekspresji funkcji CST3 w HUVEC
CytoscapeCytoscape ConsortiumN/AOprogramowanie stosowane do wizualizowania sieci regulacyjnych mRNA-miRNA, mRNA-TF i mRNA-lek
Sonda fluorescencyjna DCF/Środek do badania ROSStosowany do wykrywania poziomu ROS wewnątrzkomórkowego
Plasmid kontrolny z pustym wektorem (oe-NC)Stosowany jako kontrola nadekspresji
Płodowe surowica wołowaSuplement dodany do pożywki do hodowli komórek śródbłonkowych
Plasmid przelewowy z nadekspresją FURIN (oe-FURIN)Stosowany do eksperymentów nadekspresji funkcji FURIN w HUVEC
GeneCardsWeizmann Institute of ScienceN/ABaza danych stosowana do kuracji genów związanych z RAS
GeneMANIAUniversity of TorontoN/ANarzędzie internetowe stosowane do identyfikacji funkcjonalnie powiązanych genów
Baza danych GEONCBIN/APubliczna baza danych stosowana do dostępu do zestawów danych GSE75360 i GSE74144
GEOquery (pakiet R)BioconductorN/APakiet R stosowany do pobierania zestawów danych GEO
ggDCA (pakiet R)Źródło CRAN / GitHub używane przez autorówN/APakiet R stosowany do analizy krzywych decyzyjnych
ggplot2 (pakiet R)CRANN/APakiet R stosowany do wizualizacji danych
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)Model komórkowy stosowany w eksperymentach z uszkodzeniem śródbłonka wywołanym Ang II
limma (pakiet R)BioconductorN/APakiet R stosowany do normalizacji i analizy różnicowej ekspresji
MSigDBBroad InstituteN/ABaza danych zestawów genów stosowanych do GSEA
Negatywny kontrolny siRNA (si-NC)Stosowany jako kontrola knockdown
Zestaw do oznaczania tlenku azotuStosowany do pomiaru poziomu NO w nadstanowie kultury
pheatmap (pakiet R)CRANN/APakiet R stosowany do generowania map ciepła
Pierwotne przeciwciało przeciwko CST3Stosowany do blotowania Western
Pierwotne przeciwciało przeciwko FURINStosowany do blotowania Western
Pierwotne przeciwciało przeciwko GAPDHStosowany jako kontrola ładowania blotu Western
Pierwotne przeciwciało przeciwko TBXAS1Stosowany do blotowania Western
pROC (pakiet R)CRANN/APakiet R stosowany do generowania krzywych ROC i obliczania AUC
PubMedU.S. National Library of MedicineN/ABaza danych literatury stosowana do uzupełnienia kuracji genów związanych z RAS
Membran PVDFStosowany do transferu białka na blot Western
Prymery qRT-PCRStosowany do wykrywania kandydatów genów i markerów zapalnych/śródbłonkowych
Oprogramowanie RR Foundation for Statistical ComputingN/AŚrodowisko komputerowe statystyczne stosowane do wszystkich analiz
randomForest (pakiet R)CRANN/APakiet R stosowany do selekcji cech przez las losowy
RCircos (pakiet R)CRAN / zasób związany z BioconductorN/APakiet R stosowany do wizualizacji lokalizacji chromosomowej RASRDEG
Zestaw do odwrotnej transkrypcjiStosowany do syntezy DNA komplementarnego
Puffer RIPA

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hypertension BiomarkersTranscriptomic AnalysisDifferential ExpressionImmune InfiltrationMachine Learning ModelEndothelial Cell ModelGene ValidationProtein Interaction NetworkLogistic Regression

Powiązane artykuły