Obsługa tuneli i wzbogacanie środowiska dla wielokrotnej całkowitej pletyzmografii u myszy

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedury dotyczące zarządzania tunelami i wzbogacania środowiska dla wielokrotnej całociowej pletyzmografii w celu zmniejszenia zmienności oddechowej związanej ze stresem podczas długotrwałych badań na myszach.

Streszczenie

Powtarzana całociała pletyzmografia (WBP) jest szeroko stosowana do długotrwałej oceny funkcji oddechowych u myszy. Jednak stres wywołany manipulacją może wpływać na zmienność fizjologiczną, która komplikuje efekty leczenia i zmniejsza powtarzalność eksperymentu. Tradycyjne metody manipulacji za ogon mogą powodować długotrwałe reakcje stresu i słabe przyzwyczajenie podczas wielokrotnych sesji, co potencjalnie może wpływać na wyniki eksperymentu. Ten protokół opisuje uszlachetnione metody manipulacji i chowu, integrujące manipulację tunelową i wzbogacanie środowiska dla wielokrotnych sesji WBP. Sześć myszy dzikiego typu 129S1/SvImJ (3 samce, 3 samice) otrzymało manipulację tunelową i ciągłą stymulację środowiskową przez 10 tygodni trwania badania. Zwierzęta przeszły wielokrotne sesje WBP, a okresy aklimatyzacji analizowano na poziomie początkowym, wczesnym, środkowym i późnym etapie badania. Częstotliwość oddechów podczas początkowego umieszczenia w komorze (fpoczątkowa, 0–2 min) oraz stabilna wartość początkowa (fpoczątkowa, 8«10 min) zostały zmierzone, aby ocenić wzorce aklimatyzacji w czasie. Obserwowano progresywne zmiany w czasie trwania badania w zastosowanych warunkach. Średnia początkowa częstotliwość oddechów zmniejszyła się z 345 ± 111 SD oddechów/min na poziomie początkowym do 267 ± 43 SD oddechów/min podczas późnych sesji, cowartowane z obniżeniem współczynnika zmienności (32% do 16%). Podstawowe pomiary oddechów zmniejszyły się również z 255 ± 67 do 193 ± 43 oddechów/min (p = 0.033), co jest zgodne z poprawą stabilności pomiarów w późniejszych sesjach. Obserwacje behawioralne wykazały spokojną aklimatyzację z minimalnym oddawaniem kału, moczami lub drażliwością. Ten protokół zapewnia praktyczne podejście dla laboratoriów wykonujących wielokrotne oceny oddechowych u myszy. Manipulacja tunelowa i wzbogacanie środowiska były związane z progresywną aklimatyzacją i zmniejszeniem zmienności oddechowej podczas długotrwałych badań WBP.

Wprowadzenie

Pletyzmografia całego ciała (WBP) umożliwia nieinwazyjną ocenę czynności oddechowych u świadomych, nieograniczonych szczurów i stała się niezastąpionym narzędziem do badań podłużnych w fizjologii oddechowej, toksykologii inhalacyjnej i modelowaniu chorób^1,2. Główne zalety tej techniki, w tym jej nieinwazyjność i przydatność do powtarzanych pomiarów, sprawiają, że jest ona szczególnie wartościowa do śledzenia zmian oddechowych w trakcie postępu choroby, interwencji terapeutycznych lub przebiegu narażenia. Glaab i Braun² podkreślają, że nieinwazyjna pletyzmografa ciała bez głowy jest niezawodną metodą powtarzanych pomiarów czynności płuc u świadomych myszy, dostarczając istotnych narzędzi do badań translacyjnych nad chorobami dróg oddechowych, w tym nowo pojawiającymi się infekcjami dróg oddechowych. Jednak jakość i reprodukowalność pomiarów WBP zależy krytycznie od osiągnięcia niskich stanów częstotliwości oddechu zgodnych z cichym zachowaniem, co może być naruszone przez stres wywołany obsługą. Stres związany z obsługą jest dobrze rozpoznaną, ale często niedocenianą przyczyną zmienności eksperymentalnej, która może pomieszać pomiary fizjologiczne i zakłócić jakość danych. Standardowa praktyka laboratoryjna zazwyczaj obejmuje obsługę za ogon, w której myszy są chwytane za ogon w celu transportu i manipulacji^3,4.

Standardowa praktyka laboratoryjna zazwyczaj obejmuje obsługę za ogon, w której myszy są chwytane za ogon w celu transportu i manipulacji. Gouveia i Hurst³ wykazali, że obsługa za ogon wywołuje niepokój u myszy, a myszy obsługiwane za ogon wykazywały podwyższone zachowania przypominające niepokój w labiryncie plus w porównaniu z kontrolą obsługiwaną tunelem. Ta reakcja niepokoju wiąże się ze zmienionymi parametrami fizjologicznymi. Rasid i in.⁴ wykorzystali WBP do ilościowego określenia efektów oddechowych rutynowych procedur laboratoryjnych, stwierdzając, że unieruchomienie i obsługa znacząco zmieniają objętość minutową w sposób zależny od płci, przy czym efekty utrzymują się do 24 godzin po zabiegu. Wielkość i czas trwania tych efektów spowodowanych obsługą podkreślają, że pomiary oddechowe uzyskane wkrótce po obsłudze za ogon mogą odzwierciedlać fizjologię ostrej reakcji na stres, a nie stabilną funkcję linii bazowej.

Szersza literatura na temat stresu związanego z unieruchomieniem i obsługą ujawnia wpływy wykraczające poza natychmiastowe reakcje behawioralne. Buynitsky i Mostofsky⁵ przejrzeli rozległe efekty stresu związanego z unieruchomieniem na procesy fizjologiczne, immunologiczne, endokrynologiczne i rozwojowe, podkreślając, że zakłócenia związane ze stresem są często niedostatecznie udokumentowane w artykułach badawczych. W szczególności w przypadku badań oddechowych problem jest zaostrzony przez konieczność powtarzanych pomiarów. Każde zdarzenie związane z obsługą może resetować reakcję na stres, ograniczając progresywne przyzwyczajenie i powodować niekonsekwentne pomiary linii bazowej w kolejnych punktach czasowych. DeLorme i Moss¹ porównali podejścia do pletyzmografu unieruchomionego i nieskrępowanego u myszy o znanych różnicach fizjologicznych między szczepami, stwierdzając, że chociaż nieskrępowane systemy jednokomorowe zapewniły lepszą analizę reaktywności dróg oddechowych, wyzwanie polegające na uzyskaniu reprodukowalnych pomiarów linii bazowej pozostało.

Obsługa tunelowa, w której myszy dobrowolnie wchodzą do tunelu w celu transportu, stała się udowodnioną alternatywą, która znacznie zmniejsza niepokój związany z obsługą. Skuteczność tej metody została wykazana w wielu szczepach i kontekstach eksperymentalnych. Gouveia i Hurst³ wykazali, że myszy obsługiwane tunelem wykazywały większą chęć do interakcji z obsługującymi i mniejsze zachowania przypominające niepokój w testach labiryntu plus w porównaniu z myszami obsługiwanymi za ogon, a korzyści obserwowano nawet wtedy, gdy tunele były nieznane. Co ważne, te korzyści przekraczają natychmiastowy okres po obsłudze. Sensini i in.⁶ zbadali wpływ techniki obsługi i częstotliwości obsługi w różnych płciach, stwierdzając, że częsta obsługa za ogon zmniejszała zachowania związane z dobrem, takie jak kopanie nor, i zwiększała zachowania przypominające rozpacz u samców, podczas gdy obsługa tunelowa była preferowana przez obie płcie i kojarzona była z bardziej pozytywnymi zachowaniami podejścia i mniejszą liczbą reakcji obronnych. Ponadto Davies i in.⁷ wykazali, że korzyści z nieobsługi za ogon utrzymują się podczas złożonych procedur. Myszy narażone na obsługę za ogon przez cały czas ich pobytu w laboratorium, w tym podczas procedur unieruchomienia, wykazywały zwiększoną reaktywność na bodźce środowiskowe i zmniejszoną łatwość obsługi w porównaniu z myszami obsługiwanymi wyłącznie metodą chwytania lub tunelową.

Poza wyborem metody obsługi, systemat

Protokół

Przeprowadzać wszystkie procedury zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Zastosowania (Protokół IACUC nr 23-103) na Uniwersytecie w Miami. Mieć myszy w warunkach akredytowanej przez AAALAC hodowlni z warunkami środowiskowymi utrzymywanymi zgodnie ze standardami instytucjonalnymi.

1. Wybór zwierząt i warunki udzielania schronienia

1. Wybierz i przygotuj zwierzęta do badania
   1. Wybierz zwierzęta z ustanowionego kolonii hodowlanej lub uzyskaj je od komercyjnego dostawcy. W tym badaniu użyj sześciu dzikich 129S1/SvImJ myszy (3 samce, 3 samice).
   2. Utrzymuj zwierzęta w warunkach SPF (wolne od określonych patogenów) w akredytowanej przez AAALAC placówce z rutynowym monitorowaniem zdrowia przeprowadzanym zgodnie ze standardami instytucjonalnymi.
   3. Potwierdź, że zwierzęta mają około 6 miesięcy (młode dorosłe) na początku badania.
      UWAGA: Myszy w tym badaniu miały wcześniejsze narażenie na manipulację tunelem jako część rutynowej hodowli. W przypadku myszy niedoświadczonych, wdrożyć okres kondycjonowania przed rozpoczęciem sesji WBP (zobacz Krok 3.2).
2. Rozpocznij procedury eksperymentalne, gdy myszy osiągną wiek odpowiedni dla celów badania. W tym badaniu myszy miały około 6 miesięcy (młode dorosłe) na początku sesji WBP. Dla powtarzalności użyj myszy w określonym zakresie wiekowym (np. ±1 miesiąc) i podaj konkretne użyte wieki, ponieważ wiek może wpływać na podstawowe parametry oddechowe i kinetyki przyzwyczajania.

2. Protokół wzbogacania środowiska

1. Dostarczaj stałego materiału do gniazdowania
   1. Umieść jeden ściśnięty kwadrat z bawełny (około 5 cm × 5 cm, ~2,5 g) w każdej klatce przy każdej wymianie klatki.
   2. Przenosimy większość istniejącej struktury gniazda bez uszkodzeń do nowej klatki podczas wymian klatki, używając obu rąk.
   3. Jeśli nagromadzony materiał do gniazdowania przekracza około 10 g (około dwukrotną pierwotną masę), usuń najstarsze i najbardziej zagęszczone części od dołu, zachowując zewnętrzną strukturę kopuły.
   4. Dodaj jeden świeży kwadrat z bawełny (5 cm × 5 cm) do czystej klatki, aby wspierać ciągłą budowę i utrzymanie gniazda.
   5. Wymień materiał do gniazdowania tylko wtedy, gdy jest widocznie mokry (zanieczyszczenie moczem obejmujące >25% powierzchni) lub jeśli gniazdo zostało zniszczone i nie zostało odbudowane w ciągu 48 godzin (Rysunek 1A i 1C).
      UWAGA: Zachowaj strukturę gniazda, aby zminimalizować stres związany ze zmianami klatki i utrzymać spójne wskazówki olfaktywne i dotykowe w całym badaniu. Jakość gniazda służy jako wskaźnik dobrostanu zwierząt i stanu zdrowia¹³.
2. Oceniaj budowę gniazda co tydzień, stosując następującą standaryzowaną procedurę
   1. Przy każdej wymianie klatki, przenieś nienaruszone gniazdo ostrożnie na czystą powierzchnię, używając obu rąk bez zakłócania struktury.
   2. Zdrój gniazdo z góry, z kamerą umieszczoną 30-40 cm prostopadle do powierzchni, aby wizualizować ogólną strukturę i formowanie krateru.
   3. Zdrój gniazdo z boku na wysokości gniazda, aby udokumentować integralność ścian i cechy kopuły.
   4. Oceniaj gniazdo używając standaryzowanej 5-punktowej skali Deacon¹³, gdzie 1 = materiał do gniazdowania w dużej mierze nienaruszony i 5 = gniazdo w kształcie kopuły z wyraźnym kraterem. Zobacz Rysunek 1A–1C dla przykładów gniazda ocenionej na 5 punktów.
   5. Ostrzeżnie przenieś gniazdo z powrotem do czystej klatki.
      UWAGA: Cotygodniowe zdjęcia gniazda zapewniają obiektywne dokumentowanie jakości gniazda w całym badaniu. Pogorszenie budowy gniazda może wskazywać na chorobę, stres lub inne zagrożenia dla dobrostanu wymagające uwagi weterynaryjnej.
3. Dostarczaj obrotowe wzbogacenia zmieniane co tydzień
   1. Wybierz jeden przedmiot wzbogacający i umieść go w klatce. Użyj rozdrobnionego papieru (zwykły biały papier, porcja wielkości garści), ręczników papierowych (2-3 arkusze, bezzapachowe, białe, złożone lub pomięte) lub schronień papierowych (kartonowe rurki lub małe pudełka).
   2. Zmieniaj przedmioty wzbogacające co tydzień zgodnie z wcześniej ustaloną kolejką (np. Tydzień 1: rozdrobniony papier; Tydzień 2: ręczniki papierowe; Tydzień 3: kartonowa rurka; Tydzień 4: powtórz) aby utrzymać zarządzalną nowość.
      UWAGA: Cotygodniowa zmiana zapewnia nowość bez przeciążania mys

Wyniki

Zastosowanie tego protokołu dotyczącego obsługi tuneli i wzbogacania środowiska u sześciu dzikich myszy 129S1/SvImJ (3 samce, 3 samice) w 10-tygodniowym przekrojowym badaniu WBP wykazało postępującą habituację i poprawę stabilności fizjologicznej. Pomiary częstości oddechu były wykonywane podczas powtarzanych sesji WBP przeprowadzanych w regularnych odstępach czasowych, a dane analizowane z czterech faz badania: Bazowa (tydzień 0), Wczesna faza badania (tygodnie 2–3), Połowa badania (tygodnie 5–7) i Późna faza badania (t...

Dyskusja

To protokoll opisuje zintegrowane podejście łączące szybowe prowadzenie, wzbogacanie środowiska i wielokrotne ekspozycję w kontekście długotrwałego WBP. W tych warunkach pomiary częstości oddechowej wykazały stopniową stabilizację w kolejnych sesjach, co jest zgodne ze zmniejszonym pobudzeniem i postępującą habituacją. Kilka czynników implementacji wydaje się istotne dla pomyślnego wykonania protokołu. Po pierwsze, prowadzenie szybami powinno być wprowadzone przed rozpoczęciem procedur eksperymentalnych. W niniejszym bad...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aspen Chip Bedding	Lab Supply	Aspen 323	Podstawa z wiórów drzewnych z drzewa Aspen. Autoklawizowane przed użyciem; ułożone na głębokość około 1 cm na podłodze klatki.
Autoklawowana woda	Dostarczona przez obiekt	Nie dotyczy	Autoklawowana woda komunalna dostarczana ad libitum poprzez standardowe butelki z wodą.
Rura z kartonu	Generowane w obiekcie	Nie dotyczy	Prosta kartonowa rolka papieru toaletowego. Stosowany jako obracany element wzbogacający i schronienie.
Crink-I-Nest (Niebieskie)	The Andersons / Lab Supply	CNKR	Materiał wzbogacający z niszczonego papieru. Gamma-promieniowane. Dostarczane jako obracające się wzbogacenie na zasadzie na przemian co tydzień.
FinePointe Software	Data Sciences International	Brak numeru katalogowego	Oprogramowanie do rejestracji i analizy danych oddechowych, wersja 3.0. Używane do zbierania danych WBP i obliczania parametrów.
Stelaż indywidualnie wentylowanych klatki (IVC)	Allentown	EP5000E	Stelaż IVC z pakietem wydechowym, pojemność 140 klatki. Dwustronna, wysoko-gęstościowa konstrukcja z automatycznymi połączeniami wentylacyjnymi.
Niebieskie Żywienie dla gryzoni	Envigo	T.2918.15	Standardowa niebieska dieta dla gryzoni. Dostarczane ad libitum poprzez koszyk z drutu.
Tunel do transferu myszy	Braintree Scientific	TRANS-TUBE 100X50MM	Przejrzysty tunel z poliwęglanu, długość 100 mm i średnica wewnętrzna 50 mm. Można autoklawować i ponownie używać. Używany do procedur transferu zwierząt o niskim poziomie stresu.
Nestlets (Niebieskie)	Lab Supply	IRR	Skompresowane bawełniane kwadraty do gniazdowania (około 5 cm × 5 cm, około 2,5 g każdy). Gamma-promieniowane. Dostarczane jako stały element wzbogacający; jeden na klatkę.
Niebieskie Rękawice nitrylowe bez proszku	Kimberly-Clark	KC500	Fioletowe nitrylowe rękawice do badań bez proszku. Noszone podczas wszystkich procedur związanych z kontaktem ze zwierzętami.
Niewzolona gaza	Pivetal	21295040	Niesterylizowany, niewzolona gaza, 4-warstwowa, 10,16 cm × 10,16 cm. Używany jako materiał wzbogacający.
Ręcznik papierowy	Tork (Essity)	MB 540A	Biały papierowy ręcznik wielokrotnego użytku. Używany jako obracający się materiał wzbogacający.
Kamera ze smartfonu	Apple	Brak numeru katalogowego	Kamera ze smartfonu iPhone. Używane do cotygodniowej dokumentacji oceny gniazd.
System całkowitego pletyzmografii ciała	Data Sciences International	10222C (2-miejscowy); 770621 (4-miejscowy)	System całkowitego nieograniczającego pletyzmografii ciała marki FinePointe FP Series dla myszy. Dostępny w konfiguracjach 2-miejscowych i 4-miejscowych.